Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của polysaccharide tách chiết từ cordyceps sinensis nuôi cấy

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM
SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

THÀNH ĐỒN TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO NGHIỆM THU

Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của
polysaccharide tách chiết từ Cordyceps sinensis
ni cấy
Chủ nhiệm đề tài: ThS. Huỳnh Thư

CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 05/ 2016


ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM
SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

THÀNH ĐỒN TP. HỒ CHÍ

MINH

BÁO CÁO NGHIỆM THU

Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của
polysaccharide tách chiết từ Cordyceps sinensis
ni cấy

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

ThS. Huỳnh Thư

CƠ QUAN QUẢN LÝ

CƠ QUAN CHỦ TRÌ

(Ký tên/đóng dấu xác nhận)

(Ký tên/đóng dấu xác nhận)

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 05/ 2016


MỤC LỤC
Trang
Mục lục

i

Tóm tắt

iii

Abstract

iv

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

v

Danh mục các bảng

vi

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

vii

Phần mở đầu

1

Đặt vấn đề

3

Chương 1 – Tổng quan tài liệu

4

1.1. Giới thiệu về Cordyceps sinensis

4

1.1.1. Giới thiệu chung

4

1.1.2. Các hoạt chất chính

5

1.1.2.1. Cordycepin

5

1.1.2.2. Acid cordycepic

6

1.1.2.3. Nucleotide

6

1.1.2.4. Ergosterol

6

1.1.2.5. Protein và acid amin

6

1.1.2.6. Polysaccharide

7

1.2. Tổng quan các nghiên về polysaccharide ở Cordyceps

7

Chương 2 – Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

12

2.1. Thiết bị - Hóa chất

12

2.1.1. Thiết bị

12

2.1.2. Hóa chất

12

2.2. Phương pháp nghiên cứu

12

2.2.1. Khảo sát quy trình tách chiết polysaccharide

12

2.2.1.1. Khảo sát quy trình chiết nước nóng

13

2.2.1.2. Khảo sát quy trình tách chiết exopolysaccharide thơ

13

2.2.2. Phương pháp phân tách các phân đoạn polysaccharide bằng sắc ký lọc gel 14


2.2.2.1. Phương pháp định lượng polysaccharide

15

2.2.2.2. Phương pháp định lượng protein

16

2.2.3. Phương pháp khảo sát khả năng bắt gốc tự do ABTS

18

2.2.4. Phương pháp nuôi cấy tế bào

19

2.2.5. Phương pháp gây độc tế bào

19

Chương 3 – Kết quả và biện luận

22

3.1. Kết quả phân tách polysaccharide

22

3.1.1. Quy trình tách chiết polysaccharide thơ

22

3.1.1.1. Quy trình tách chiết polysaccharide thơ từ dịch ni cấy

24

3.1.1.2. Quy trình tách chiết polysaccharide thơ từ sinh khối

25

3.1.2. Kết quả tách phân đoạn polysaccharide bằng sắc ký lọc gel

25

3.2. Khả năng bắt gốc tự do ABTS

28

3.3. Khả năng gây độc tế bào HepG2

30

Chương 4 – Kết luận và đề nghị

32

4.1. Kết luận

32

4.2. Đề nghị

32

Tài liệu tham khảo

33

Phụ lục


TÓM TẮT
Cordyceps sinensis là một loại dược liệu cổ truyền quý hiếm được sử dụng để trị
nhiều bệnh. Nhiều nghiên cứu khoa học đã chứng minh Cordyceps sinensis chứa
nhiều hoạt chất và hoạt tính sinh học q. Trong đó, polysaccharide từ Cordyceps
sinensis cũng đã được nghiên cứu là sở hữu nhiều hoạt tính sinh học, đặc biệt là khả
năng kháng oxy hóa. Vì thế, nghiên cứu này của chúng tơi nhằm xác định khả năng
bắt gốc tự do ABTS và khả năng gây độc tế bào HepG2 của IPS và EPS tách chiết từ

Cordyceps sinensis. Kết quả cho thấy cả IPS và EPS là phức hợp polysaccharideprotein. Đề tài đưa ra được quy trình tách chiết polysaccharide với hiệu suất là 12.7
%, tách chiết các phân đoạn polysaccharide. Từ hai polysaccharide thơ là EPS và IPS
thơ, nhóm nghiên cứu tách chiết được các phân đoạn gồm EPS-1, EPS-2 và IPS-1,
IPS-2. Hoạt tính kháng oxy hóa của EPS cao hơn IPS, giá trị IC50 của EPS thô và
phân đoạn EPS-2 là 2.688,80 ± 19,83 µg/ml và 1.885,90 ± 2,90 µg/ml. Đồng thời, chỉ
có EPS thơ có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào HepG2 (IC50 = 15,59 ± 0,17
µg/ml). Do đó, EPS từ Cordyceps sinensis có tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực thực
phẩm, đặc biệt là thực phẩm chức năng.


ABSTRACT
Cordyceps sinensis is one of well-known traditional medicine for treatment of a
wide variety of diseases. Besides, researches demonstrated that polysaccharides
isolated from Cordyceps sinensis have useful biological activities, especially the
potential antioxidant. Hence, this study demonstrated on ABTS free radical
scavenging activity and HepG2 cytotoxicity of IPS and EPS isolated from Cordyceps
sinensis. Consequently, both EPSs and IPSs were mixtures of peptidepolysaccharide. The research indicated two procedures of polysaccharide extraction.
From two crude polysaccharides including crude EPS and IPS, the research
fractionated EPS-1, EPS-2 and IPS-1, IPS-2. The IC50 value of crude EPS and EPS2 fraction were 2,688.80 ± 19.83 µg/ml and 1,885.90 ± 2.90 µg/ml, respectively,
which were lower than that of IPSs as well as EPS-1 fraction. Furthermore, the only
crude EPS exhibited HepG2 cell growth inhibitory ability (IC50 = 15.59 ± 0.17 µg/ml)
among the samples. Taken together, the EPSs exhibited greater antioxidant activity
than the IPSs. Thus, the EPSs could be considered as antioxidant food additives and
functional feed.


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
A

Absorbance

ABTS

2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt

CS

Cordyceps sinensis

dd

dung dịch

DPPH

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

EPS

Exopolysaccharide

IC50

Inhibitory concentration

IPS

Endopolysaccharide

OD

Optical density

PBS

Phosphate-buffered saline

RNS

Reactive nitrogen species

ROS

Reactive oxygen species

SRB

Sulforhodamine B


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1 Thành phần các monosaccharide của polysaccharide tách chiết từ
Cordyceps sinensis tự nhiên và nuôi cấy nhân tạo

10

Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm thực hiện sắc ký lọc gel Sephadex G–200

14

Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm dựng đường chuẩn saccharose

15

Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm dựng đường chuẩn albumin

17

Bảng 3.1. Khối lượng polysaccharide từ 100 ml dịch nuôi cấy được tủa

22

Bảng 3.2. Kết quả đường chuẩn polysaccharide

26

Bảng 3.3. Kết quả đường chuẩn protein

26

Bảng 3.4. Bộ số liệu về khả năng kháng oxy hóa của polysaccharide tách chiết từ
Cordyceps sinensis

28

Bảng 3.5. Tỷ lệ gây độc tế bào (%) của polysaccharide ở nồng độ thử nghiệm 100
µg/ml lên dòng tế bào HepG2

30


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Trang
Hình 1.1. Vịng đời của Cordceps sinensis

4

Hình 1.2. Cordyceps sinensis (trái) và Cordyceps militaris (phải)

5

Hình 1.3. Cấu tạo phân tử của cordycepin

6

Hình 2.1. Sơ đồ khảo sát quy trình tách chiết polysaccharide thơ

13

Hình 2.2. Phản ứng định lượng polysaccharide

15

Hình 2.3. Phản ứng định lượng protein

17

Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn sự tương quan tuyến tính giữa giá trị OD490 và nồng độ
saccharose chuẩn

26

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn sự tương quan tuyến tính giữa giá trị OD595 và nồng độ
albumin chuẩn

27

Hình 3.3. Phân đoạn polysaccharide: (a) Phân đoạn IPS; (b) Phân đoạn EPS

28

Hình 3.4. Biểu đồ thể hiện khả năng bắt gốc tự do ABTS

30

Biểu đồ 3.3. Khả năng gây độc tế bào

31


MỤC LỤC
Trang
Mục lục

i

Tóm tắt

iii

Abstract

iv

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

v

Danh mục các bảng

vi

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

vii

Phần mở đầu

1

Đặt vấn đề

3

Chương 1 – Tổng quan tài liệu

4

1.1. Giới thiệu về Cordyceps sinensis

4

1.1.1. Giới thiệu chung

4

1.1.2. Các hoạt chất chính

5

1.1.2.1. Cordycepin

5

1.1.2.2. Acid cordycepic

6

1.1.2.3. Nucleotide

6

1.1.2.4. Ergosterol

6

1.1.2.5. Protein và acid amin

6

1.1.2.6. Polysaccharide

7

1.2. Tổng quan các nghiên về polysaccharide ở Cordyceps

7

Chương 2 – Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

12

2.1. Thiết bị - Hóa chất

12

2.1.1. Thiết bị

12

2.1.2. Hóa chất

12

2.2. Phương pháp nghiên cứu

12

2.2.1. Khảo sát quy trình tách chiết polysaccharide

12

2.2.1.1. Khảo sát quy trình chiết nước nóng

13

2.2.1.2. Khảo sát quy trình tách chiết exopolysaccharide thơ

13

2.2.2. Phương pháp phân tách các phân đoạn polysaccharide bằng sắc ký lọc gel 14
i


2.2.2.1. Phương pháp định lượng polysaccharide

15

2.2.2.2. Phương pháp định lượng protein

16

2.2.3. Phương pháp khảo sát khả năng bắt gốc tự do ABTS

18

2.2.4. Phương pháp nuôi cấy tế bào

19

2.2.5. Phương pháp gây độc tế bào

19

Chương 3 – Kết quả và biện luận

22

3.1. Kết quả phân tách polysaccharide

22

3.1.1. Quy trình tách chiết polysaccharide thơ

22

3.1.1.1. Quy trình tách chiết polysaccharide thơ từ dịch ni cấy

24

3.1.1.2. Quy trình tách chiết polysaccharide thơ từ sinh khối

25

3.1.2. Kết quả tách phân đoạn polysaccharide bằng sắc ký lọc gel

25

3.2. Khả năng bắt gốc tự do ABTS

28

3.3. Khả năng gây độc tế bào HepG2

30

Chương 4 – Kết luận và đề nghị

32

4.1. Kết luận

32

4.2. Đề nghị

32

Tài liệu tham khảo

33

Phụ lục

ii

TÓM TẮT
Cordyceps sinensis là một loại dược liệu cổ truyền quý hiếm được sử dụng để trị
nhiều bệnh. Nhiều nghiên cứu khoa học đã chứng minh Cordyceps sinensis chứa
nhiều hoạt chất và hoạt tính sinh học q. Trong đó, polysaccharide từ Cordyceps
sinensis cũng đã được nghiên cứu là sở hữu nhiều hoạt tính sinh học, đặc biệt là khả
năng kháng oxy hóa. Vì thế, nghiên cứu này của chúng tơi nhằm xác định khả năng
bắt gốc tự do ABTS và khả năng gây độc tế bào HepG2 của IPS và EPS tách chiết từ
Cordyceps sinensis. Kết quả cho thấy cả IPS và EPS là phức hợp polysaccharideprotein. Đề tài đưa ra được quy trình tách chiết polysaccharide với hiệu suất là 12.7
%, tách chiết các phân đoạn polysaccharide. Từ hai polysaccharide thơ là EPS và IPS
thơ, nhóm nghiên cứu tách chiết được các phân đoạn gồm EPS-1, EPS-2 và IPS-1,
IPS-2. Hoạt tính kháng oxy hóa của EPS cao hơn IPS, giá trị IC50 của EPS thô và
phân đoạn EPS-2 là 2.688,80 ± 19,83 µg/ml và 1.885,90 ± 2,90 µg/ml. Đồng thời,
chỉ có EPS thơ có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào HepG2 (IC50 = 15,59 ±
0,17 µg/ml). Do đó, EPS từ Cordyceps sinensis có tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực
thực phẩm, đặc biệt là thực phẩm chức năng.

iii


ABSTRACT
Cordyceps sinensis is one of well-known traditional medicine for treatment of a
wide variety of diseases. Besides, researches demonstrated that polysaccharides
isolated from Cordyceps sinensis have useful biological activities, especially the
potential antioxidant. Hence, this study demonstrated on ABTS free radical
scavenging activity and HepG2 cytotoxicity of IPS and EPS isolated from Cordyceps
sinensis. Consequently, both EPSs and IPSs were mixtures of peptidepolysaccharide. The research indicated two procedures of polysaccharide extraction.
From two crude polysaccharides including crude EPS and IPS, the research
fractionated EPS-1, EPS-2 and IPS-1, IPS-2. The IC50 value of crude EPS and EPS2 fraction were 2,688.80 ± 19.83 µg/ml and 1,885.90 ± 2.90 µg/ml, respectively,

which were lower than that of IPSs as well as EPS-1 fraction. Furthermore, the only
crude EPS exhibited HepG2 cell growth inhibitory ability (IC50 = 15.59 ± 0.17 µg/ml)
among the samples. Taken together, the EPSs exhibited greater antioxidant activity
than the IPSs. Thus, the EPSs could be considered as antioxidant food additives and
functional feed.

iv


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
A

Absorbance

ABTS

2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt

CS

Cordyceps sinensis

dd

dung dịch

DPPH

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

EPS

Exopolysaccharide

IC50

Inhibitory concentration

IPS

Endopolysaccharide

OD

Optical density

PBS

Phosphate-buffered saline

RNS

Reactive nitrogen species

ROS

Reactive oxygen species

SRB

Sulforhodamine B

v


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1 Thành phần các monosaccharide của polysaccharide tách chiết từ
Cordyceps sinensis tự nhiên và nuôi cấy nhân tạo

10

Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm thực hiện sắc ký lọc gel Sephadex G–200

14

Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm dựng đường chuẩn saccharose

15

Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm dựng đường chuẩn albumin

17

Bảng 3.1. Khối lượng polysaccharide từ 100 ml dịch nuôi cấy được tủa

22

Bảng 3.2. Kết quả đường chuẩn polysaccharide

26

Bảng 3.3. Kết quả đường chuẩn protein

26

Bảng 3.4. Bộ số liệu về khả năng kháng oxy hóa của polysaccharide tách chiết từ
Cordyceps sinensis

28

Bảng 3.5. Tỷ lệ gây độc tế bào (%) của polysaccharide ở nồng độ thử nghiệm 100
µg/ml lên dòng tế bào HepG2

30

vi


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Trang
Hình 1.1. Vịng đời của Cordceps sinensis

4

Hình 1.2. Cordyceps sinensis (trái) và Cordyceps militaris (phải)

5

Hình 1.3. Cấu tạo phân tử của cordycepin

6

Hình 2.1. Sơ đồ khảo sát quy trình tách chiết polysaccharide thơ

13

Hình 2.2. Phản ứng định lượng polysaccharide

15

Hình 2.3. Phản ứng định lượng protein

17

Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn sự tương quan tuyến tính giữa giá trị OD490 và nồng độ
saccharose chuẩn

26

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn sự tương quan tuyến tính giữa giá trị OD595 và nồng độ
albumin chuẩn

27

Hình 3.3. Phân đoạn polysaccharide: (a) Phân đoạn IPS; (b) Phân đoạn EPS

28

Hình 3.4. Biểu đồ thể hiện khả năng bắt gốc tự do ABTS

30

Biểu đồ 3.3. Khả năng gây độc tế bào

31

vii


PHẦN MỞ ĐẦU
1. Tên đề tài/dự án: Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của polysaccharide tách
chiết từ Cordyceps sinensis nuôi cấy
Chủ nhiệm đề tài/dự án: Huỳnh Thư
Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học và Cơng nghệ Trẻ
Thời gian thực hiện: 12 tháng
Kinh phí được duyệt: 80 triệu đồng
Kinh phí đã cấp: 40 triệu đồng theo Thơng báo số ....................../TB-SKHCN
2. Mục tiêu:
2.1.

Mục tiêu tổng quát:

Cung cấp dữ liệu khoa học cụ thể về hoạt tính kháng oxy hóa của
polysaccharide, làm cơ sở cho việc tận dụng nguồn polysaccharide ứng
dụng trong y học và thực phẩm.

2.2.

Mục tiêu cụ thể:

- Khảo sát quy trình thu nhận và tách phân đoạn polysaccharide từ dịch môi
trường và sinh khối Cordyceps sinensis ni cấy.
- Phân tích thành phần polysaccharide có trong Cordyceps sinensis ni cấy.
- Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của polysaccharide ly trích.
3. Nội dung:
3.1.

Nội dung thực hiện giai đoạn 1:
Công việc dự kiến

Công việc đã thực hiện

Nội dung 1:
Khảo sát quy trình tách chiết polysaccharide thơ từ

Đã hồn thành

Cordyceps sinensis nuôi cấy
Nội dung 2:
Tách phân đoạn các polysaccharide từ polysaccharide

Đã hồn thành

thơ
Nội dung 3:
Đánh giá khả năng kháng oxy hóa của polysaccharide

tách chiết từ Cordyceps sinensis ni cấy bằng phương
-1-

Đã hoàn thành


pháp bắt gốc tự do ABTS
Nội dung 4:
Khảo sát khả năng gây độc tế bào HepG2 của

Đã hoàn thành

polysaccharide tách chiết từ Cordyceps sinensis ni cấy

3.2.

Nội dung cịn lại
Cơng việc dự kiến

Nội dung 5:

Cơng việc đã thực hiện
Đã hồn thành

Viết báo cáo tổng kết

-2-


ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, các nhân tố bất lợi như ô nhiễm môi trường, tia tử ngoại, hóa chất
độc hại, sức ép cuộc sống công nghiệp,… đã làm gia tăng đáng kể số lượng gốc
tự do hoạt động trong cơ thể gây ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến sức
khỏe con người. Việc phát sinh quá nhiều các gốc tự do có thể gây ra sự biến đổi
các base của nucleotide dẫn đến đứt gãy DNA, gây biến đổi các chuỗi acid amin,
tấn công các phân tử lipid gây ra phản ứng chuỗi oxy hóa lipid là nguyên nhân
của hàng loạt bệnh nghiêm trọng hiện nay như ung thư, xơ gan, rối loạn tim
mạch, đái tháo đường, Parkinson, Alzheimer, thối hóa hệ thần kinh, teo cơ…
Do đó, việc tìm ra các hoạt chất có khả năng kháng oxy hóa chính là chìa khóa
then chốt để giải quyết các vấn đề trên. Trong nghiên cứu này, chúng tôi hướng
đến đối tượng Cordyceps sinensis (tên gọi dân gian là Đông Trùng Hạ Thảo),
một loại dược liệu vô cùng quý hiếm trong việc bồi bổ sức khỏe cũng như chữa
trị nhiều bệnh nan y được sử dụng hàng ngàn năm qua.
Ở các báo cáo trước, nhóm nghiên cứu chúng tơi đã chứng minh các cao
chiết từ các chủng Cordyceps sp. phân lập tại Việt Nam có hoạt tính kháng oxy
hố và có khả năng bảo vệ tế bào HepG2 chống lại sự phá huỷ của các tác nhân
oxy hoá; đồng thời, các cao chiết này cũng chứa một lượng nhất định thành phần
polysaccharide. Mặt khác, các nghiên cứu trong và ngoài nước đã khẳng định
polysaccharide chính là thành phần quyết định hoạt tính kháng oxy hố của
Cordyceps. Một vấn đề đặt ra là trong q trình ni cấy lỏng, nhà sản xuất chú
trọng lấy sinh khối Cordyceps mà chưa quan tâm nhiều đến dịch ni cấy, và có
thể nhận thấy rằng trong dịch ni cấy Cordyceps chứa một lượng lớn
exopolysaccharide. Do đó, trong nghiên cứu này, nhóm quyết định tách chiết và
đánh giá hoạt tính kháng oxy hố của các phân đoạn polysaccharide từ sinh khối
và dịch nuôi cấy Cordyceps sinensis. Từ đó, lên kế hoạch cho việc ứng dụng đối
tượng Cordyceps sinensis trong việc phòng và chữa các bệnh liên quan đến
stress oxy hoá.

-3-

1.1. Giới thiệu về Cordyceps sinenis
1.1.1 Giới thiệu chung
Phân loại khoa học
 Giới: Nấm
 Ngành: Ascomycota
 Lớp: Sordariomycetes
 Bộ: Hypocreales
 Họ: Cordcipitaceae
 Chi: Cordyceps
Tên Cordyceps bắt nguồn từ tiếng Latin là “cord” và “ceps” nghĩa là “thân”
và “đầu”. Đây là một loài nấm ký sinh trên ấu trùng hay kén của các loại côn trùng,
biết đến như một loại đông dược quý có giá trị cao trong y học cổ truyền Trung Hoa
hơn 300 năm và một vài nước châu Á khác. Chúng phân bố nhiều ở vùng núi và cao
nguyên, với độ cao trung bình 3500-5000m so với mặt nước biển, thường được tìm
thấy chủ yếu ở Tây Trạng, Tứ Xun (Trung Quốc), Ấn Độ, Việt Nam…[1],[2].

Hình 1.1 Vịng đời của Cordceps sinensis [3]
Cơ chế xâm nhiễm của Cordyceps: vào mùa đông, nấm bắt đầu xâm nhiễm
vào cơ thể ấu trùng, vào các mô, sinh trưởng và phát triển trên cơ thể vật chủ và giết
chết vật chủ. Đến mùa hè ấm áp, nấm bắt đầu mọc ra khỏi ấu trùng và vươn lên
-4-


khỏi mặt đất phát triển thành dạng cây và phát tán bào tử. Hiện nay có hai chủng
được biết đến nhiều nhất là Cordyceps sinensis (Đông Trùng Hạ Thảo) và
Cordyceps militaris (Nhộng Trùng Thảo) [2].

Hình 1.2. Cordyceps sinensis (trái) và Cordyceps militaris (phải) [4]
1.1.2 Các hoạt chất chính

1.1.2.1 Cordycepin
Cordycepin (3’-deoxyadenosine) là một purine alkaloid có cấu trúc tương tự
như adenosine nhưng mất một oxy ở vị trí 3’ phần đường ribose. Nhờ vào cấu trúc
đặc biệt này mà cordycepin có khả năng tham gia vào quá trình phiên mã RNA,
ngăn chặn sự tổng hợp mạch RNA. Bằng cách biến đổi thành 5’- mono, di và
triphosphat,

cordycepin

sẽ

ức

chế

hoạt

động

của

ribose-phosphat

pyrophosphokinase và 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphat aminotransferase trong
quá trình sinh tổng hợp purin và/hoặc tổng hợp các acid nucleic, do đó nó có hoạt
tính kháng khối u, kháng di căn và kháng khuẩn [5].

-5-

Hình 1.3. Cấu tạo phân tử của cordycepin [4]
1.1.2.2 Acid cordycepic
Acid cordycepic (D – mannitol) là một đồng dạng của acid quinic với cấu
trúc tinh thể có dạng acid 1,3,4,5 – tetrahydroxy cyclohexane – 1 – carboxylic, đóng
vai trị quan trọng trong hoạt động kháng oxy hóa, trung hịa các gốc tự do, được sử
dụng trong điều trị ho và lợi tiểu …[5]
1.3.2.3. Nucleotide
Nucleotide gồm: adenosine, uridine và guanosine. Hàm lượng nucleotide
trong Cordyceps nuôi cấy cao hơn hẳn Cordyceps tự nhiên, điều này có thể liên
quan đến hoạt động biến dưỡng nhanh trong q trình ni cấy. Nucleotide có vai
trị quan trọng trong việc chống khối u, phóng thích các tín hiệu dẫn truyền thần
kinh, chống co giật [5].
1.3.2.4. Ergosterol
Ergosterol là tiền chất quan trọng của vitamin D2. Các ergosterol và các chất
đồng dạng của chúng có hoạt tính kháng virus, điều hoà tim mạch, điều trị bệnh
thận do giảm immunoglobin A [5]…
1.3.2.5. Protein và các acid amin
Hàm lượng protein trong Cordyceps vào khoảng 29,1 – 33%, bao gồm 18
acid amin: acid aspartic, threonine, serine, acid glutamic, proline, glycine, valine,
methionine, isoleucine, leucine, tyrosine, phenylalanine, lysine, histidine, cystine,
cysteine and tryptophan. Trong đó thì arginine, glutamate, tryptophan và tyrosine là
có dược tính cao nhất [5].

-6-


1.1.2.6. Polysaccharide
Polysaccharide chiếm 3-8% trong tồn bộ trọng lượng khơ và được xem là
hoạt chất chính góp phần tạo nên hoạt tính sinh học của Cordyceps, được chia làm
hai loại dựa vào vị trí của chúng trong nấm: polysaccharide nội bào và

polysaccharide ngoại bào hay còn gọi là exopolysaccharide – EPS. Polysaccharide
tham gia tích cực trong việc ngăn chặn sự hình thành và lây lan các khối u, gây ức
chế hoạt động của các gốc tự do, kích thích và điều hòa miễn dịch, tham gia phản
ứng viêm, kháng oxy hóa…Trong đó hoạt tính kháng oxy đang được quan tâm và
nghiên cứu nhiều nhất. Polysaccharide hiện diện ở thành tế bào và tham gia vào cấu
trúc thành phần trong tế bào chất của Cordyceps [5].
EPS là polymer có trọng lượng phân tử cao bao gồm dư lượng đường,
thường được tổng hợp trong tế bào và tiết ra môi trường xung quanh. Vi sinh vật, vi
khuẩn và nấm tổng hợp nhiều loại polysaccharide đa chức năng bao gồm
polysaccharide nội bào, các polysaccharide cấu trúc và polysaccharide ngoại bào.
EPS thường bao gồm các monosaccharide và một số nhóm thể khơng carbohydrate
[6]. Thành phần và cấu trúc monome của EPS thường được đánh giá bằng cách
phân tích thí nghiệm khác nhau của EPS chưa bị tác động thủy phân hay thủy phân
một phần EPS hoặc các dẫn xuất của chúng. Nói chung những nghiên cứu được
phân tích qua sắc ký giấy, sắc ký lỏng hiệu năng cao, sắc ký khí - lỏng, sắc ký khối
phổ khí – lỏng và quang phổ 1D và 2D. Thành phần EPS của nấm khác nhau từ
đường tinh khiết để các loại đường này kết hợp với một đơn vị thứ hai như protein,
phosphat, sulfat hay amin. Các loại đường khác nhau được tìm thấy trong EPS của
nấm như glucose, mannose, galactose, xylose, fructose và rhamnose. Điều đó cho
thấy rằng EPS bao gồm những đơn vị monosaccharide giống nhau nhưng nó được
tổng hợp bởi các lồi nấm khác nhau có khối lượng phân tử khác nhau. Đó cũng là
nguyên nhân dẫn đến sự khác nhau về chiều dài chuỗi hay cấu trúc phân nhánh [7].
1.2. Tổng quan các nghiên cứu về polysaccharide ở Cordyceps
Các nghiên cứu trong và ngồi nước đã khẳng định polysaccharide chính là
thành phần quyết định hoạt tính kháng oxy hố của Cordyceps; đặc biệt, một số

-7-


nghiên cứu đã cho thấy rằng dịch nuôi cấy Cordyceps cũng chứa một lượng lớn

exopolysaccharide có hoạt tính sinh học.
- Theo Kiho và cộng sự (1986), các hợp chất polysaccharide ở Cordyceps là một
galactomannan nhiều nhánh. Những hợp chất này bao gồm D – mannose và D – 20
galactose với tỷ lệ 3:5, và chứa một tỷ lệ nhỏ của protein. Nó là một cấu trúc phân
nhánh gồm các liên kết (1 – 6) và (1 – 2) liên kết các gốc α – D – mannopyranosyl ở
mạch chính, có các liên kết đa dạng giữa các monosaccharid kế cận tạo thành các
cấu trúc xoắn và vòng nhỏ [8].
- Năm 2003, Li và cộng sự đã thu nhận CPS–1 một polysaccharide có trọng
lượng phân tử khoảng 210 kDa bằng sắc ký trao đổi ion. Chế phẩm này có hoạt tính
kháng oxy hóa mạnh, chứa glucose, mannose và galactose theo tỷ lệ mol 1 : 0,6 :
0,75. [9]
- Năm 2005, Zhang và cộng sự đã nghiên cứu tác động của exopolysaccharide
của dịch nuôi cấy Cordyceps sinensis lên chuột mang khối u ác tính B16, và chứng
minh exopolysaccharide này có khả năng điều hòa miễn dịch và kháng khối u [10].
- Năm 2005, Kim và Yun cho biết hàm lượng exopolysaccharide của Cordyceps
sinensis trong môi trường nuôi cấy gồm 20g/l sucrose, 25g/l bột bắp, 0,78g/l CaCl2,
0,73g/l MgSO4.7H2O tại 200C ở pH 4,0 là 4,1g/l. Năm 2006, Wu và cộng sự đã
phân tách polysaccharide có trọng lượng phân tử trung bình 83 kDa từ Cordyceps
sinensis và chứng minh nó đóng vai trị tích cực trong hoạt động điều hòa miễn
dịch, tăng cường các kháng thể IgG, IgG1và IgG2 trong máu [11].
- Năm 2006, Lo và cộng sự đã chứng minh ở Cordyceps sinensis, hàm lượng
polysaccharide trong dịch nuôi cấy cao gấp 5 lần trong sợi nấm; đồng thời, cả dịch
nuôi cấy lẫn sinh khối nấm đều có tiềm năng trong việc ngăn ngừa bệnh đái tháo
đường, ứng dụng làm thực phẩm chức năng, bổ sung dinh dưỡng; kết quả nghiên
cứu còn cho thấy hoạt tính chống tăng đường huyết của dịch ni cấy và sinh khối
nấm tương tự như trong quả thể nấm tự nhiên [12].
- Dong và Yao (2008) đã tiến hành khảo sát và đánh giá khả năng kháng oxy hóa
của polysaccharide chiết xuất từ dịch nuôi cấy Cordyceps sinensis thông qua sáu thí
nghiệm trên mơ hình in vitro, bao gồm ức chế sự peroxide hóa acid linoleic, khả
-8-

năng bắt gốc tự do DPPH, superoxide anion, hydroxyl, đánh giá năng lực khử và
khả năng tạo phức với ion sắt. Kết quả thu được rằng polysaccharide có hiệu quả
cao trong việc ức chế q trình peroxide hóa acid linoleic, khả năng bắt gốc tự do
superoxide anion và hydroxyl tốt hơn so với butylated hydroxytoluen, ức chế hơn
80% gốc tự do DPPH và giảm hoạt động tạo phức với ion sắt [13].
- Wang và cộng sự (2009) đã chứng minh khả năng chống oxy hóa của
polysaccharide phân đoạn 1 từ việc chạy sắc ký lọc gel ở nấm Cordyceps sinensis,
thông qua các thí nghiệm như khả năng bắt gốc tự do hydroxyl, năng lục khử, khả
năng bắt sắt, khả năng bắt gốc tự do superoxide cũng như ức chế hydrogen peroxide
[14].
- Yan và cộng sự (2010) đã nghiên cứu và phân tích về exopolysaccharide từ
nấm Tolypocladium sp. (EPS-1A) chiết xuất từ Cordyceps sinensis, khối lượng
phân tử của EPS-1A sau khi tinh sạch là 40 kDa, chứa các monosaccharid như
galactose, mannose và glucose tương ứng theo tỉ lệ 1:3,6:15,2 [15].
- Năm 2011, Chen và cộng sự đã chứng minh polysaccharide trích ly từ
Cordyceps sinensis làm giảm hàm lượng malodialdehyd (MDA) và tăng hoạt tính
của enzyme superoxid dismutase (SOD) cũng như glutathion peroxydase trong gan
và não chuột mang khối u H22 [16].
- Lin và cộng sự (2012) đã nghiên cứu hoạt tính của exopolysaccharide từ
Cordyceps militaris SU5 – 08, kết quả cho thấy rằng EPS có khả năng bắt gốc tự do
hydroxyl, superoxide anion và DPPH. Từ đó có thể kết luận rằng EPS của
Cordyceps militaris SU5 – 08 là một chất kháng oxy hóa và tăng cường phản ứng
miễn dịch tiềm năng [17].
- Thành phần các monosaccharid của các polysaccharid được tách chiết từ
Cordyceps sinensis tự nhiên cũng như nuôi cấy nhân tạo đã được nghiên cứu rộng
rãi trong khoảng 30 năm trở lại đây, được tổng kết trong bảng 1.2. Qua đó cho thấy,
polysaccharide trong Cordyceps sinensis thường được tạo thành từ các đơn phân
gồm glucose, mannose và galactose. Thành phần mạch chính polysaccharide của

Cordyceps sinensis trong tự nhiên thì mannose chiếm đa số, nhưng đối với
Cordyceps sinensis nuôi cấy nhân tạo thì thành phần mạch chính polysaccharide có
-9-