Góp phần nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi (Multiplex) trong phân loại Escherichia Coli gây tiêu chảy doc

TCNCYH 22 (2) - 2003
Góp phần nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi
(multiplex) trong phân loại Escherichia coli gây tiêu chảy

Trần Trí Tuệ
1
, Lê Văn Phủng
2
1
Trung tâm Y tế dự phòng Lào cai
2
Đại học Y Hà Nội

Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR đa mồi trong xác định các chủng E. coli gây tiêu
chảy đã đợc nghiên cứu chi tiết. Sự phân bố của 300 chủng E. coli phân lập từ các bệnh phẩm:
phân (150), nớc tiểu (40), máu (30), dịch mật (40), mủ (40) cũng đã đợc xác đinh bằng PCR đa
mồi dùng trong tiêu chảy.
ADN đợc tách chiết từ các chủng E. coli và các chủng chuẩn khác thuộc Enterobacteriaceae,
sau đó tiến hành phản ứng PCR với 8 cặp mồi. Kết quả nh sau:
1. Độ nhạy của phản ứng PCR đa mồi (8 cặp) so với chủng chuẩn là 100%.
2. Độ đặc hiệu của phản ứng PCR với 8 cặp mồi đã chọn từ các vi khuẩn: Citrobacter freundii,
Salmonella typhi, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Edwasdsiella
tarda, Escherichia coli ATCC 25922 là 100%.
3. Không phân biệt đợc EIEC với Shigella bằng phản ứng PCR với bộ mồi đã thiết kế cho EIEC
Jal.
4. Các chủng E. coli gây tiêu chảy đợc phân lập từ trẻ em khoẻ mạnh là 10% (EAEC 6,7%; EHEC
0,66%; EIEC 1,33%; EPEC 0%; ETEC 1,33%).
5. Các chủng E. coli gây tiêu chảy đợc phân lập từ mủ, dịch mật, máu, nớc tiểu là 1,33% và có
sự phân bố không đồng đều theo vị trí gây bệnh.

I. Đặt vấn đề
Tiêu chảy là một bệnh khá phổ biến ở các
nớc trên thế giới, đặc biệt tại các nớc đang
phát triển. Tỷ lệ mắc và tử vong do tiêu chảy
rất cao ở trẻ em. Theo ớc tính của Tổ chức Y
tế thế giới (WHO), hàng năm có trên 1 tỷ lợt
trẻ em dới 5 tuổi bị tiêu chảy với gần 5 triệu
trẻ tử vong [5]. ở nớc ta, tiêu chảy là nguyên
nhân quan trọng gây suy dinh dỡng, là nguyên
nhân gây tử vong đứng hàng thứ 2 ở trẻ em (chỉ
xếp sau nhiễm khuẩn đờng hô hấp).
Nhiều tác nhân vi sinh vật khác nhau có thể
gây ra tiêu chảy, trong đó Escherichia coli
thờng chiếm tỷ lệ cao. Theo nghiên cứu của
các tác giả trên thế giới tỷ lệ E. coli gây tiêu
chảy ở trẻ em từ 21-60%, còn ở Việt Nam tỷ lệ
này là 23,4 - 44,8% [1, 2, 3, 7, 9, 10].
Nhiều phơng pháp chẩn đoán E. coli gây
tiêu chảy đã đợc áp dụng. Ngay từ những năm
40, ngời ta đã sử dụng phơng pháp định type
huyết thanh. Sau này các phơng pháp chẩn
đoán khác nh ELISA, thử độc tính trên nuôi
cấy tế bào, các tính chất sinh hoá, sự ly giải bởi
phage đã đợc áp dụng. Song, chúng cũng đều
là các phơng pháp gián tiếp và đòi hỏi các kỹ
thuật phức tạp, nên ít đợc ứng dụng trong
phân loại các E. coli gây tiêu chảy.
Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của
sinh học phân tử, nhiều phơng pháp chẩn đoán
mới đã ra đời cho phép phát hiện đợc các gien

đặc hiệu, quyết định khả năng gây bệnh của E.
coli, trong đó 2 phơng pháp, PCR và lai ADN,
đợc áp dụng phổ biến nhất.

5
TCNCYH 22 (2) - 2003
ở Việt Nam, việc chẩn đoán E. coli gây tiêu
chảy, chỉ sử dụng phơng pháp quai ruột và
định type huyết thanh và cũng chỉ dừng lại ở
ETEC (Enterotoxingenic E. coli) và EPEC
(Enteropathogenic E. coli), EIEC
(Enteroinvasive E. coli), EHEC
(Enterohaemorrhagic E. coli). PCR chẩn đoán
E. coli trên thế giới đã đợc dùng phổ biến
nhng các tác giả đều chỉ dùng đơn thuần một
cặp mồi cho một phản ứng, do vậy tốn kém vật
liệu và thời gian. Bởi vậy, việc nghiên cứu áp
dụng một kỹ thuật phù hợp với nhiều cặp mồi,
nhằm phát hiện nhiều loại E. coli gây tiêu chảy
trong một phản ứng là hết sức cần thiết và có ý
nghĩa thiết thực. Trớc tình hình đó chúng tôi
tiến hành nghiên cứu đề tài nhằm mục tiêu:
1. Tìm hiểu độ nhạy và độ đặc hiệu của
phản ứng PCR đa mồi trong xác định E. coli
gây tiêu chảy.
2. Tình hình phân bố các chủng E. coli có
khả năng gây tiêu chảy phân lập từ phân, máu,
nớc tiểu, mủ và mật.
II. Đối tợng, vật liệu và phơng
pháp nghiên cứu

1. Đối tợng
- Chủng E. coli mẫu gồm: ETEC ATCC
35401, EHEC ATCC 43890, EHEC ATCC
43889, EPEC ATCC 43887, EIEC ATCC
43893, EAEC ATCC 130C2 do Viện
Karolinska Thụy Điển cung cấp.
- Chủng chuẩn của họ vi khuẩn đờng ruột:
- Chủng Shigella flexneri, Shigella boydii,
Shigella dysenteriae, Citrobacter freundii,
Salmonella typhi, Proteus vulgaris, Klebsiella
pneumoniae, Enterobacter aerogenes,
Edwardsiella tarda, Escherichia coli ATCC
25922 do Trung tâm lu trữ nguồn gene vi sinh
vật gây bệnh, bộ môn Vi sinh vật trờng Đại
học Y Hà Nội cung cấp.
- Chủng E. coli từ bệnh phẩm: phân (150),
nớc tiểu (40), máu (30), mật (40), mủ (40) đã
đợc xác định bằng các phơng pháp thông
thờng.
2. Vật liệu
- Môi trờng nuôi cấy vi khuẩn: Sorbitol
Mac Conkey, DCA.
- Môi trờng dùng trong chẩn đoán gồm:
KIA, ure-indol, mannitol - di động, Citrat
Simmons.
- Môi trờng cấy vi khuẩn chuẩn bị cho tách
chiết ADN: thạch thờng đĩa.
- Sinh phẩm, máy móc dùng trong PCR:
+ 8 cặp mồi đặc hiệu để phát hiện 5 loại
E.coli gây tiêu chảy: LT l-LT r, STI2 l-STI2 r,

VT1 l-VT1 r, VT2 l-VT2 r, eae u-eae l, SHIG
1-SHIG 2, bfp2 u-bfP2 l, EA L-EA U.
+ Máy ly tâm lạnh (Beckman Avanti TM
30), máy điều nhiệt tự động Thermal Cycler
(Eppendorf Đức), bộ điện di ngang (Advance
Co.LTD, Nhật Bản), máy chụp ảnh gel và phim
ảnh Kodak cỡ 667.
3. Phơng pháp

- Từ các chủng E.coli mẫu, các chủng thuộc
họ vi khuẩn đờng ruột đã kể ở trên và các
chủng vi khuẩn, bệnh phẩm đợc tách chiết
ADN bằng nhiệt theo quy trình của Viện
Krolinska Thụy Điển.
- Sau đó tiến hành chạy phản ứng PCR đa
mồi (8 cặp mồi) với chu kỳ nh sau: 1 chu kỳ
96
o
C/4"; 30 chu kỳ: 94
o
C/20", 50
o
C/20",
72
o
C/10"; 1 chu kỳ: 72
o
C/7" giữ ở 4
o
C.

- Sản phẩm của phản ứng PCR đa mồi đợc
tiến hành điện di trên thạch agarose 1,5%. Từ
các chủng E.coli mẫu để xác định độ nhạy, các
chủng vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đờng ruột
để xác định độ đặc hiệu còn các chủng từ bệnh
phẩm để xác định tình hình phân bố các chủng
E. coli gây tiêu chảy.

6
TCNCYH 22 (2) - 2003
III. Kết quả
1. Độ nhạy của phản ứng PCR đa mồi














Hình 1: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ 5 chủng E.coli mẫu
1. Chứng âm 2. EIEC (320 bp) 3. EHEC (130, 298, 376 bp) 4. ETEC (147, 322 bp)
5. EAEC (630 bp) 6. EPEC (367, 376 bp) 7. Thang ADN chuẩn
2. Độ đặc hiệu của PCR đa mồi

Hình 2: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đa mồi với các vi khuẩn
có quan hệ di truyền gần gũi với E. coli

1. Chứng âm 2. Edwardsiella tarda 3. K. pneumoniae 4. P. vulgaris
8




2030
(bp)
1636
1018

506,517
396
344
298
220
201
154
134
9
10
1 2 3 4 5 6 7


2036 (bp)
1636

1018



506, 517

396
344
298
220
201

154

7
TCNCYH 22 (2) - 2003
5. C. Freundii 6. S. typhi
7. E. coli ATCC 25922
8. Chứng dơng ETEC (147, 322 bp)
9. . Chứng dơng EAEC (630 bp)
10. Thang ADN chuẩn
3. E. coli gây bệnh ở đờng tiêu hoá
Bảng 1: Kết quả phát hiện các chủng E.
coli có khả năng gây tiêu chảy phân lập từ
phân trẻ em < 5 tuổi (n = 150)
Tên chủng PCR (+) %
EAEC 10 6,7
EHEC 1 0,66
EIEC 2 1,33
EPEC 0 0

ETEC 2 1,33
Tổng cộng
15 10
4. E. coli có khả năng gây tiêu chảy có mặt
ở ngoài đờng tiêu hoá
Bảng 2: Kết quả phân loại các chủng E. coli
có khả năng gây tiêu chảy phân lập từ các bệnh
phẩm ngoài đờng tiêu hoá (n = 150)
Tên chủng PCR (+) %
EAEC
2 1,3
EHEC 0 0
EIEC 0 0
EPEC 0 0
ETEC 0 0
Tổng cộng 2 1,3
IV. Bàn luận
Về độ nhạy của phản ứng PCR đa mồi: kết
quả độ nhạy của phản ứng PCR đa mồi của các
chủng E. coli mẫu là 100%. Mặc dù sử dụng
nhiều cặp mồi hơn song chúng tôi thấy rằng
không có hiện tợng ức chế lẫn nhau giữa các
cặp mồi trên. Kết quả của chúng tôi phù hợp
với kết quả nghiên cứu của các tác giả trớc
nh Katsuaki Hoshino Or Jan Olsvik, Akioabe,
Sandrinsa Tacyphipps mặc dù chúng tôi sử
dụng nhiều cặp mồi hơn. Chúng tôi cũng tiến
hành thử nghiệm độ lặp lại (100 lần) với các
chủng E. coli mẫu. Kết quả độ lặp lại của PCR
trong các chủng E. coli mẫu là 100% (trừ

EIEC). Nh vậy độ tin cậy của kết quả này rất
cao.
PCR đa mồi cũng đợc dùng để xác định
các chủng E. coli có khả năng gây tiêu chảy từ
các bệnh phẩm lâm sàng. Các chủng này đã
đợc xác định bằng phơng pháp PCR đơn mồi
là chắc chắn có gien gây bệnh, chúng đợc coi
nh những chủng chuẩn. Kết quả của chúng tôi
cho thấy bằng phơng pháp PCR đa mồi có khả
năng phát hiện tất cả các chủng này. Với kết
quả này, chúng ta có thể áp dụng kỹ thuật trên
để chẩn đoán nhanh, chính xác các chủng E.
coli có khả năng gây tiêu chảy.
Về độ đặc hiệu của PCR đa mồi: PCR đa
mồi cũng đợc dùng để tiến hành thử nghiệm
độ đặc hiệu với 7 chủng vi khuẩn thuộc họ vi
khuẩn đờng ruột, chúng có mối quan hệ chặt
chẽ với E. coli có khả năng gây tiêu chảy về
nhiều mặt. Xét về mặt di truyền học, chất liệu
di truyền của chúng tơng đối giống với E. coli
gây tiêu chảy. Thậm chí chủng thử nghiệm là
E. coli ATCC 25922 giống hệt E. coli gây tiêu
chảy về hình thái, tính chất sinh vật hoá học,
kháng nguyên và tính chất di truyền không
mấy khác biệt, vậy mà, độ đặc hiệu của phản
ứng PCR đa mồi vẫn là 100%. Tiến hành thử
nghiệm lặp lại, độ đặc hiệu cho kết quả 100%.
Nh vậy với độ đặc hiệu cao, PCR đa mồi là
phơng pháp chẩn đoán E. coli gây tiêu chảy
đáng tin cậy, rất hữu ích khi đa vào áp dụng

thực tế chẩn đoán.
Tiến hành xác định độ đặc hiệu của phản
ứng PCR với các chủng Shigella thì thấy rằng
không thể phân biệt đợc các chủng Shigella
với E. coli bằng PCR với các cặp mồi đã thiết
kế cho EIEC. Kết quả này phù hợp với nghiên
cứu của các tác giả trên thế giới vì Shigella và
EIEC rất giống nhau về mặt di truyền học. Để
phân biệt chúng cần phải thiết kế một số cặp
mồi đặc hiệu hơn.
E. coli gây bệnh ở đờng tiêu hoá: Kết quả
nghiên cứu của chúng tôi thấy rằng tỷ lệ E. coli
có khả năng gây tiêu chảy ở đờng tiêu hoá là
10%. Kết quả này tơng đơng với nghiên cứu

8
TCNCYH 22 (2) - 2003
của các tác giả khác thuộc các nớc lân cận
nh Lào 11%, ân Độ 9%, Tây Thái Lan 7%,
nông thôn Israel 11% [4, 6, 8, 10] tuy hơi cao
hơn so với kết quả nghiên cứu của một số tác
giả trong nớc nghiên cứu trớc đây nh:
Hoàng Tiến Mỹ 1,6%; Nguyễn Phơng Lan
3,5%; Hoàng Thu Thuỷ 5% [1, 2, 3]. Trong
nghiên cứu của chúng tôi tỷ lệ nhiễm EAEC là
cao nhất 6,7%, đây là một tác nhân gây bệnh
mới đợc quan tâm gần đây. Tuy nhiên theo
kết quả nghiên cứu của các tác giả trong nớc
và các nớc lân cận nh Lào, Thái Lan [8, 10]
thì cha phát hiện đợc các trờng hợp nhiễm

EAEC nào. Trái lại tỷ lệ này đặc biệt cao ở các
nớc Châu Mỹ 15-31% [7, 9].
Chúng tôi không phát hiện đợc 1 trờng
hợp nhiễm EPEC nào, điều này không có nghĩa
là chủng vi khuẩn này không gây bệnh ở Việt
Nam mà có thể do cỡ mẫu của chúng tôi còn
nhỏ nên cha phản ánh tình hình gây bệnh của
vi khuẩn này. Chúng tôi cũng phát hiện đợc tỷ
lệ nhiễm EHEC là 0,66%, đây là chủng vi
khuẩn ít gặp ở Châu âu, Bắc Mỹ thì ngày nay
đã xuất hiện ở trẻ khoẻ mạnh ở Việt Nam.
Chúng tôi cũng tiến hành nghiên cứu tỷ lệ
E. coli gây tiêu chảy ở 3 cộng đồng dân c
khác nhau nh Sa Pa (Lào Cai), Thanh Trì (Hà
Nội), Cát Bà (Hải Phòng) với 50 mẫu. Kết quả
cho thấy: tỷ lệ E. coli có khả năng gây tiêu
chảy ở 3 cộng đồng dân c là khác nhau. Tại Sa
Pa tỷ lệ E. coli có khả năng gây tiêu chảy là
20%, cao hơn hẳn Thanh Trì 6% và Cát Bà 4%.
Sự khác nhau này có ý nghĩa thống kê
(p<0,05). Tuy nhiên sự khác biệt giữa tỷ lệ E.
coli gây tiêu chảy ở Cát Bà và Thanh Trì không
có ý nghĩa thống kê (p<0,05).
E. coli có khả năng gây tiêu chảy có mặt ở
ngoài đờng tiêu hoá : tỷ lệ phân lập đợc E.
coli gây tiêu chảy ở ngoài đờng tiêu hóa là
1,33%, thấp hơn E. coli gây bệnh ở đờng tiêu
hoá với 1 tỷ lệ có ý nghĩa thống kê (p<0,05).
Chúng tôi phát hiện đợc một chủng EAEC
phân lập từ nớc mật và một chủng EAEC phân

lập từ mủ. Điều này gợi ý cho chúng ta thấy
rằng các chủng E. coli ngoài khả năng gây tiêu
chảy còn có khả năng gây bệnh ở những nơi
khác. Tỷ lệ E. coli gây tiêu chảy gây bệnh ở
ngoài đờng tiêu hóa thấp hơn E. coli gây bệnh
ở đờng tiêu hóa với một tỷ lệ có ý nghĩa thống
kê (p < 0,05).
V. Kết luận
Qua nghiên cứu chúng tôi có một số kết
luận sau:
1. Độ nhạy của phản ứng PCR đa mồi (8 cặp) với
các chủng chuẩn là 100%.
2. Độ đặc hiệu của phản ứng PCR 8 cặp mồi đã chọn
với các vi khuẩn Citrobacter freundii, Salmonella
typhi, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae,
Enterobacter aerogenes, Edwardsiella tarda,
Escherichia coli ATCC 25922 là 100%.
3. Không phân biệt đợc EIEC với Shigella bằng
phản ứng PCR với cặp mồi (đã thiết kế cho
EIEC) ial.
4. Tỷ lệ E. coli gây tiêu chảy phân lập ở trẻ
khoẻ mạnh là 10% trong đó EAEC 6,7%;
EHEC 0,66%; EIEC 1,33%; EPEC 0%; ETEC
1,33%. Có sự phân bố không đồng đều giữa 3
địa phơng đó là: Sa Pa 20%, Thanh Trì 6%,
Cát Bà 4%.
5. Tỷ lệ E. coli gây tiêu chảy phân lập từ mủ,
mật, nớc tiểu và máu là 1,33% và có sự phân
bố không đồng đều giữa các vị trí gây bệnh:
mủ 2,5%, mật 2,5%, máu 0%, nớc tiểu 0%.

Cảm ơn: Công trình này đợc thực hiện
tại Labo trung tâm Y sinh học và Bộ môn Vi
sinh Y học trờng Đại học Y Hà Nội.
Tài liệu tham khảo
1. Nguyễn Phơng Lan, Nguyễn Thị Kim Tiến,
Lê Xuân Sơn (1998), Tác nhân vi sinh vật trong
tiêu chảy kéo dài của trẻ dới 5 tuổi tại cộng
đồng. Tạp chí Vệ sinh phòng dịch,2 (36): 50.
2. Hoàng Tiến Mỹ (1997), Khảo sát các vi
khuẩn thờng gây tiêu chảy cấp ở mọi lứa tuổi
và tính kháng thuốc. Luận án Tiến sỹ Y khoa,
Trờng Đại học Y dợc TP. Hồ Chí Minh.
3. Hoàng Thu Thủy (1988), Góp phần nghiên
cứu các chủng Escherichia coli gây tiêu chảy

9
TCNCYH 22 (2) - 2003
cấp ở trẻ em tại Hà Nội. Luận án Phó tiến sỹ y
học, Viện Vệ sinh dịch tễ.
4. Bhan MK, Raj P, Levine MM (1989),
Enteroaggregative Escherichia coli associated
with persistent diarrhea in a cohort of rural
children in India. J. Infect Dis, 159(6): 1061- 4.
5. Jan Holmgren and Ann- Mari Svennerholm
(1992), Bacterial enteric infection and vaccine
development. Gastroenterology Clinics of north
America, 21(2): 283-302.
6. Lerman Y., Slepon R., Cohen D (1994),
Epidemiology of acute diarrhea disease in
children in a high standard of living rural

settlement in Israel. J. Pediatrics infect. Dis,
13(2): 116-22.

7. Paniagua M., Espinoza ., Ringman M
(1997), Analysis of incidence of infection with
enterotoxigenic Escherichia coli in a
prospective cohort study of infant diarrhea in
Nicarago. J. Clin. Microbiol, 35 (6): 1404 -
1410.
8. Peter Echeverria, Charles W.Hoge (1994),
Etiology of diarrhea in a rural community in
Western Thailand: Importance of enteric vruses
and enterovirulent Escherichia coli". J.
infect. Dis, 169: 916-9.
9. Quiroga M, Oviedo P (2000), Asymptomatic
infections by diarrheagenic Escherichia coli in
children from Misiones, Argentina, During the
first twenty months of their lives. Rev. Isnt.
Med. Trop. Saopaulo, 42 (1): 9-15.
10. Yamashiro T, Nakasone N, Higa N (1998),
Etiological study of diarrheal patients in
Vientiane, Lao Peoples Democratic Republic.
J. Clin. Microbiol, 36(8): 2195-9.
Summary
study on multiplex PCR in diagnosis
of diarrhea-causing E. coli
The study used 300 E. coli strains isolated from specimens: stool (150), urine (40), blood (30),
billiary fluid (40), pus (40) to find sensitivity and specificity of multiplex PCR in diagnosis of E.
coli strains causing diarrhea and distribution of E. coli which have ability causing diarrhea in these
specimens.

DNA was extracted from E. coli control strains, reference strains belong to Enterobacteiaceaer
and E. coli strains from Karolinska Institute (Sweden) and then carrying out multiplex (8 primer
pairs) PCR reaction. The results were showed as following:
1. Sensitivity of multiplex PCR (8 pairs) with standard strains was 100%.
2. Specificity of the PCR with the bacteria such as: Citrobacter freundii, Salmonella typhi,
Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter, Edwasdsiella tarda, Escherchia coli ATCC
25922 was 100%.
3. Unable to differentiate EIEC with Shigella by PCR reaction with the primer-pairs designed
for EIEC jal.
4. Percentage of E. coli strains causing diarrhea isolated from healthy children was 10%
(EAEC 6,7%; EHEC 0,66%; EIEC 1,33%; EPEC 0%; ETEC 1,33%). Having unbalance distribution
among 3 studied areas: Sapa 20%, Thanh Tri 6%, Cat Ba 4%.
5. Percentage of E. coli strains causing diarrhea isolated from pus, billiary fluid, blood, urine
was 1,33%.


10