Phát triển và ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi trong chẩn đoán E. coli gây tiêu chảy từ phân Đọc thêm thuvienykhoa.vn ppt

TCNCYH 23 (3) 2003
Phát triển và ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi
trong chẩn đoán E. coli gây tiêu chảy từ phân

Nguyễn Vũ Trung
1
, Lê Huy Chính
1
,
Lê Văn Phủng
1
, Andrej Weintraub
2

1
Bộ môn Vi sinh, Đại học Y Hà Nội,
2
Khoa Vi sinh -Miễn dịch -Bệnh học
Bệnh viện Huddinge, Viện Karolinska-Thuỵ Điển

Kỹ thuật PCR đa mồi lần đầu tiên đợc nghiên cứu thành công ở Việt nam bằng cách phối hợp
8 cặp mồi để chẩn đoán 5 loại E. coli gây tiêu chảy (ETEC, EHEC, EIEC, EPEC, EAEC) từ phân
trẻ em dới 5 tuổi bị tiêu chảy. Kỹ thuật này cho phép chẩn đoán chính xác 5 loại E. coli gây tiêu
chảy chỉ bằng một phản ứng PCR với độ nhạy và độ đặc hiệu gần 100% và tiết kiệm nguyên vật
liệu, thời gian gấp 5 lần so với tiến hành từng phản ứng PCR riêng biệt. Qua phân tích 310 bệnh
phẩm phân tiêu chảy, 90 chủng E. coli gây bệnh đã đợc phân lập chiếm 29,04% tổng số các bệnh
phẩm. Trong đó, EAEC là 58 chủng chiếm 18,71%, ETEC 2 chủng (0,65%), EPEC 24 chủng
(7,7%), và EIEC 6 chủng (1,94%).

i. Đặt vấn đề
Tiêu chảy là một vấn đề sức khoẻ toàn cầu.

Bệnh hay gặp ở trẻ em. ở các nớc đang phát
triển, có ít nhất 1 tỷ trờng hợp tiêu chảy hàng
năm và số tử vong là 5 đến 7 triệu. Trung bình
một năm một trẻ mắc 3,3 lần tiêu chảy. Tại
Việt Nam, một số nghiên cứu cho thấy, số lần
bị tiêu chảy trong một năm đối với một trẻ từ
2,2 6. Tại các nớc công nghiệp phát triển,
tiêu chảy vẫn còn phổ biến ở trẻ em, ngời già
và các khách du lịch đến các nớc đang phát
triển. Có nhiều nguyên nhân dẫn đến tiêu chảy.
Trong đó, vi khuẩn đóng vai trò quan trọng.
Trong số các vi khuẩn gây tiêu chảy, E. coli
hiện nay là căn nguyên nổi trội, thu hút đợc sự
quan tâm của các bác sĩ lâm sàng, nhi khoa, vi
sinh vì nó là căn nguyên của 1/3 số trờng hợp
tiêu chảy. Việc chẩn đoán gặp khó khăn vì các
triệu chứng lâm sàng không đặc hiệu. Có 5 loại
E. coli gây tiêu chảy, đợc phân loại theo các
cơ chế gây bệnh khác nhau dựa trên các gien
nằm trong tế bào vi khuẩn mã hoá cho các yếu
tố độc lực: Enteropathogenic E. coli (EPEC),
enterohemorrhagic E. coli (EHEC),
enterotoxigenic E. coli (ETEC), enteroinvasive
E. coli (EIEC) và enteroaggregative E. coli
(EAEC) [3, 4]. Hiện nay có bốn phơng pháp
đợc dùng để chẩn đoán các E. coli này:
Dựa vào các tính chất sinh vật hoá học.
Định týp huyết thanh.
Các thử nghiệm dựa trên những đặc
điểm về độc lực.

Các phơng pháp này hầu nh không thể
chẩn đoán đợc hoặc rất tốn kém.
Các phơng pháp sinh học phân tử:
+ Hiện nay chủ yếu là hai phơng pháp:
Mẫu dò ADN (ADN probe) và phản ứng chuỗi
(Pylymerase Chain Reaction - PCR). Tuy
nhiên độ nhạy của phơng pháp mẫu dò ADN

6
TCNCYH 23 (3) 2003
thấp, thao tác phức tạp và đòi hỏi một số lợng
lớn vi sinh vật trong bệnh phẩm.
+ PCR là kỹ thuật tổng hợp acid nucleic
trong ống nghiệm. Trong đó, một đoạn ADN
đợc nhân lên đặc hiệu. Trong kỹ thuật này, hai
đoạn oligonucleotid, đợc gọi là mồi, gắn đặc
hiệu vào đoạn ADN đích và đợc khuếch đại
theo một số chu kỳ đợc lặp đi lặp lại. Chu kỳ
này gồm việc làm tách hai sợi của đoạn ADN,
gắn hai oligonucleotid vào hai sợi này theo
nguyên tắc bổ sung và kéo dài đoạn
oligonucleotid dới tác động của enzym ADN
polymerase. Trong PCR, ADN đích đợc tăng
lên theo hàm số mũ sau mỗi chu kỳ. Sản phẩm
của PCR đợc phát hiện sau khi điện di trên
agarose, nhuộm bằng ethidium bromide và đọc
dới ánh sáng đèn cực tím.
PCR là phơng pháp đang đợc áp dụng
rộng rãi vì cho kết quả nhanh, chính xác, độ
nhạy và độ đặc hiệu cao. Hiện nay, trên thế

giới, PCR đang đợc nghiên cứu và ứng dụng
trong chẩn đoán E. coli gây tiêu chảy. Bình
thờng trong một phản ứng PCR, ngời ta dùng
một cặp mồi để khuếch đại một đoạn gien đặc
hiệu. Để chẩn đoán xem trong bệnh phẩm có 1
trong số 5 loại E. coli gây tiêu chảy cần ít nhất
6 PCR riêng rẽ. Nh vậy rất tốn kém. Vấn đề
đặt ra là làm sao xác định đợc vi khuẩn này
mà chỉ cần duy nhất 1 phản ứng PCR ? Nếu
vậy, chúng ta không những tiết kiệm đợc
nguyên vật liệu và thời gian mà còn tránh đợc
sự nhiễm trong kỹ thuật này. Vì vậy, chúng tôi
tiến hành nghiên cứu này nhằm hai mục tiêu:
1. Phát triển kỹ thuật PCR đa mồi trong
chẩn đoán E. coli gây tiêu chảy.
2. ứng dụng kỹ thuật này để chẩn đoán các
E. coli gây tiêu chảy từ phân trẻ em dới năm
tuổi bị tiêu chảy.
II. đối tợng và Phơng pháp
nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu. Đánh giá một nghiệm
pháp chẩn đoán và nghiên cứu mô tả.
PCR chẩn đoán E. coli gây tiêu chảy từ
bệnh phẩm phân. Chúng tôi sử dụng thờng
qui chẩn đoán E. coli gây tiêu chảy bằng PCR
theo thờng qui của Khoa Vi sinh lâm sàng,
Bệnh viện Huddinge, Viện Karolinska,
Stockholm, Thuỵ Điển. Bệnh phẩm phân sau
khi thu thập đợc cấy lên trên môi trờng cho
vi khuẩn đờng ruột, để ở 37

0
C sau 18-24 giờ.
Vi khuẩn trên đĩa môi trờng đợc hoà vào
dung dịch đệm phosphat, đun cách thuỷ ở
100
0
C trong 20 phút để phá vỡ màng tế bào vi
khuẩn. ADN của vi khuẩn đợc giải phóng. Ly
tâm dịch này với tốc độ 4000 vòng/phút trong
10 phút. Nớc nổi sau khi ly tâm dùng làm
ADN khuôn cho phản ứng PCR. Các cặp mồi
đợc thiết kế đặc hiệu với một số đoạn gen của
ETEC, EHEC, EPEC, EIEC, EAEC
(INTERACTIVA, Đan Mạch).
Sản phẩm của PCR sau đó đợc điện di trên
agarose 1,5% trong dung dịch đệm TAE để
tách biệt các ADN đã đợc khuếch đại. Nhuộm
gel sau khi điện di bằng Ethidium bromide và
nhìn dới đèn cực tím sẽ cho phép thấy đợc
các băng ADN đặc hiệu. So sánh các băng này
với các băng của ADN mẫu.
Đoạn
gen đích
Mồi Vi khuẩn Cỡ sản
phẩm
elt B
LTl-r ETEC 322 bp
est A
STI2l-r ETEC 147 bp
vt 1

VT1l-r EHEC 130 bp
vt 2
VT2l-r EHEC 298 bp
eae A
eae u-l EHEC/ EPEC 376 bp
ial
SHIG1-2 EIEC 320 bp
bfp A
bfpA2u-l EPEC 367 bp

7
TCNCYH 23 (3) 2003
pCVD EA1-2 EAEC 630 bp
Tiêu chuẩn tối thiểu:
ETEC: Có gen eltB và/hoặc estA
EHEC: Có gen vt1 và/hoặc vt 2. Có gen
eaeA,EHEC điển hình
EPEC: Có gen bfpA và eaeA
EIEC : Có gen ial
EAEC : Có gen pCVD
Taq polymerase, MgCl
2
và Buffer do Hãng
Perkin Elmer, Mỹ cung cấp.
Lấy bệnh phẩm, nuôi cấy phân lập, xác
định E. coli đợc tiến hành theo thờng qui.
Các chủng E. coli. 5 chủng E. coli gây tiêu
chảy chuẩn quốc tế, 238 chủng E. coli từ phân
đã đợc xác định bằng nhiều phơng pháp khác
nhau gồm 99 chủng gây tiêu chảy, 139 chủng

không gây tiêu chảy đợc cung cấp từ Khoa Vi
sinh lâm sàng của Bệnh viện Huddinge-Viện
Karolinska-Thuỵ Điển, Trung tâm kiểm soát
bệnh nhiễm trùng của Thuỵ Điển, Trung tâm
lu giữ chủng của Trờng Đại học Goterborg-
Thuỵ Điển, dự án nghiên cứu về E. coli gây
tiêu chảy giữa Thuỵ Điển và Nicaragua.
Bệnh phẩm phân. 310 mẫu phân từ trẻ
dới 5 tuổi bị tiêu chảy đợc thu thập ở 3 bệnh
viện tại Hà Nội.
III. Kết quả
1. Phát triển kỹ thuật PCR đa mồi.
Chúng tôi đã phối hợp thành công 8 cặp mồi
trong một phản ứng để chẩn đoán cùng một lúc
5 loại E. coli gây tiêu chảy trong phân.
PCR đơn mồi PCR đa mồi
1. Nớc cất : 11,5 àl
2. Đệm ì10 : 2,0 àl
3. dNTPs (1,25mM) : 1,6 àl
4. MgCl
2
25 mM : 1,2 àl
5. Mồi 2,5 àM : 1,6 àl
6. Taq 5 UI/ àl : 0,1 àl
7. ADN từ vi khuẩn : 2,0 àl
1 cặp mồi trong một phản ứng
Thể tích: 20,0 àl
1. Nớc cất : 6,7 àl
2. Đệm ì 10 : 2,0 àl
3. dNTPs (1,25mM) : 1,6 àl

4. MgCl
2
25 mM : 1,2 àl
5. Mồi 2,5 àM : 6,4 àl
6. Taq 5 UI/ àl : 0,1 àl
7. ADN từ vi khuẩn : 2,0 àl
8 cặp mồi trong một phản ứng
Thể tích: 20,0 àl


8
TCNCYH 23 (3) 2003
Bảng 1. Ưu điểm cuả PCR đa mồi
Thành phần
1 PCR 6 PCR PCR đa mồi Tiết kiệm
Nớc cất
11,1 àl 66,6 àl
6,3 àl 60,3 àl
Đệm
2,0 àl 12,0 àl
2,0 àl 10,0 àl
dNTPs
1,6 àl 9,6 àl
1,6 àl 8,0 àl
MgCl
2

1,6 àl 9,6 àl
1,6 àl 8,0 àl
Mồi

1,6 àl 9,6 àl
6,4 àl 3,2 àl
Taq polymerase
0,1 àl 0,6 àl
0,1 àl 0,5 àl
ADN mẫu
2,0 àl 12,0 àl
2,0 àl 10,0 àl
Thể tích
20,0 àl 120,0 àl
20,0 àl 100,0 àl
Qua bảng trên chúng tôi thấy, kỹ thuật PCR đa mồi cho phép tiết kiệm thời gian và nguyên vật
liệu (khoảng 5 lần) so với chạy riêng rẽ từng PCR.



1 2 3 4 5 6 7

1636
1018


506,517
396
344
298
220
201
154
134

Hình ảnh điện di kết quả PCR đa mồi với các chủng E. coli chuẩn (kích cỡ bp)
1. E. coli
2. EIEC 3. EHEC 4. ETEC 5. EAEC 6. EPEC 7. ADN mẫu
+ Kỹ thuật PCR đa mồi đợc thực hiện với các chủng E. coli chuẩn và cho kết quả rất tốt. Chúng
tôi đã thực hiện phản ứng này rất nhiều lần để kiểm tra độ ổn định của phản ứng trên các chủng E.
coli chuẩn quốc tế và các chủng đợc cung cấp, độ lặp lại là 100%.

9
TCNCYH 23 (3) 2003
Bảng 2. Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR đa mồi
E. coli
PCR
Gây tiêu chảy (n = 99) Không gây tiêu chảy (n = 139)
Tổng số
(n = 238)
Dơng tính 99 0 99
Âm tính 0 139 139
= 99 / 99 = 100%
Số E. coli gây tiêu chảy dơng tính với PCR đa mồi
Đ
ộ
nh
ạy
=
Tổng số E. coli gây tiêu chảy
Số E. coli không gây tiêu chảy âm tính với PCR đa mồi
Tổng số E. coli không gây tiêu chảy
= 139 /139 = 100%
Độ đặc hiệu =
Bảng 3. Phân bố các E. coli gây tiêu chảy phân lập đợc từ phân

ETEC EHEC EPEC EIEC EAEC n = 310
Số chủng 2 0 24 6 58 90
% 0,65 0 7,74 1,94 18,71 29,04
Bảng 3 cho thấy, khoảng 30% số các bệnh phẩm phân tiêu chảy có E. coli thuộc một trong 5 loại
E. coli gây tiêu chảy, trong đó chiếm đa số là EAEC.


Kết quả PCR một số chủng E. coli gây tiêu chảy từ phân
1636
1018


506, 517

396
344
298
220, 201
154, 134

1 2 3 4 5 6 7
1. ADN marker 2. EIEC 3. EPEC 4. ETEC 5. EAEC
6. Chứng (+) EIEC 7. Chứng (-) E. coli không gây tiêu chảy. Kích cỡ (bp)

10
TCNCYH 23 (3) 2003
Bảng 4: So sánh E. coli gây tiêu chảy xác định bằng PCR
với nuôi cấy phân lập (NCPL) từ 310 mẫu phân
ETEC EPEC EIEC EAEC Tổng
PCR 2 24 6 58 90

NCPL 0 0 0 0 0
Nếu chỉ dùng phơng pháp nuôi cấy phân lập đơn thuần, chúng ta không xác định đợc các
chủng E. coli gây tiêu chảy từ phân.
Bảng 5. Một số tính chất sinh vật hoá học chính của các chủng E. coli gây tiêu chảy
so sánh với các chủng E. coli không gây tiêu chảy
Lên men đờng
Hình thể
Gram
Lac Glu Sor
Di
động
Sinh
hơi
Sinh
urease
Sinh
H
2
S
Indole
E. coli*
TK (-) + + +/- +/- +/- - - +
E. coli**
TK (-) + + +/- +/- +/- - - +
*, E. coli gây tiêu chảy ; **, E. coli bình thờng trong đại tràng.
Qua bảng 5 chúng ta thấy không thể phân
biệt các E. coli gây tiêu chảy với các E. coli
thuộc thành phần khuẩn chí bình thờng bằng
các tính chất sinh vật hoá học thông thờng.
iv. Bàn luận

Cho đến nay, vẫn cha có dấu ấn đặc trng
nào dựa trên tính chất sinh vật hoá học cũng
nh kháng nguyên có thể dùng để phân biệt
các chủng E. coli gây bệnh với các chủng E.
coli thuộc vi hệ bình thờng trong đại tràng.
Nghiên cứu của các tác giả trên thế giới đều có
chung một nhân xét rằng PCR là phơng pháp
đơn giản, dễ thực hiện và có độ nhậy cao hơn
hẳn các phơng pháp khác. Độ nhậy và độ đặc
hiệu của phơng pháp này đạt tới 90-100% [2].
PCR giúp chẩn đoán một cách nhanh chóng các
tác nhân gây bệnh trên lâm sàng. Đối với chẩn
đoán E. coli gây tiêu chảy từ bệnh phẩm phân,
lúc đầu các tác giả dùng từng cặp mồi riêng rẽ
để phát hiện từng gien đích. Về sau, nhiều cặp
mồi đã đợc phối hợp để chẩn đoán một hoặc
nhiều loài E. coli gây tiêu chảy. Jan Olsvik và
Sandrinsa Tacyphipps đã thành công trong việc
dùng 2 cặp mồi LT
I
và ST
II
trong 1 phản ứng để
chẩn đoán ETEC với độ nhạy 100%. James B
và cộng sự sử dụng 4 cặp mồi trong một phản
ứng kết quả độ nhậy 98,9%. Akioabe đã phối
hợp 5 cặp mồi trong một phản ứng và kết quả
cho thấy độ nhậy 100% [2, 8] Kết quả nghiên
cứu của chúng tôi sử dụng 8 cặp mồi trong 1
phản ứng PCR có độ nhậy và độ đặc hiệu gần

100%. Qua nghiên cứu, chúng tôi thấy PCR đa
mồi dựa trên sự phối hợp 8 cặp mồi đảm bảo
đợc độ tin cậy về độ nhạy và độ đặc hiệu
trong chẩn đoán 5 loại E. coli gây tiêu chảy.
Ngoài ra, sử dụng 8 cặp mồi trong một phản
ứng giúp tiết kiệm về thời gian và nguyên vật
liệu gấp 5 lần so với dùng riêng rẽ từng cặp
mồi. Thêm nữa, khi giảm số lần tiến hành các
phản ứng PCR chúng ta sẽ làm giảm sự nhiễm
của phản ứng này. Một vấn đề đáng lo ngại của
kỹ thuật PCR.
Khi tiến hành kỹ thuật PCR đa mồi trên các
bệnh phẩm phân ở trẻ em dới 5 tuổi bị tiêu
chảy, chúng tôi đã phân lập đợc 90 chủng E.
coli gây bệnh chiếm 29,04% tổng số các bệnh
phẩm. Trong đó, EAEC là 58 chủng chiếm

11
TCNCYH 23 (3) 2003
18,71%. Điều đáng nói ở đây là, chúng tôi đã
phát hiện và phân lập đợc 4 loại E. coli gây
tiêu chảy với các tỷ lệ khác nhau. Nhiều nhất là
EAEC (18,71%) và ít nhất là ETEC (0,65%).
So với một số tác giả khác, nh tại ấn Độ tỷ lệ
E. coli gây tiêu chảy chiếm 29,5%, Thái Lan
21% thì tỷ lệ phân lập E. coli gây tiêu chảy của
chúng tôi cũng giống nh nhiều tác giả khác [6,
7]. Tuy nhiên, sự phân bố các loài E. coli gây
tiêu chảy trong nghiên cứu của chúng tôi có
khác so với một số tác giả. Điều này cũng

tơng tự nh nhiều nghiên cứu trên thế giới vì
tỷ lệ các vi khuẩn này phụ thuộc vào từng vùng
địa lý khác nhau.
Khi so sánh các tính chất sinh vật hoá học
chính của các chủng E. coli gây tiêu chảy với
các chủng E. coli thuộc thành phần khuẩn chí
bình thờng, chúng tôi thấy các đặc điểm này
giống nhau. Điều này càng khẳng định những
nghiên cứu trớc kia của các tác giả cho rằng,
không thể phân biệt các E. coli gây tiêu chảy
với các E. coli thờng bằng các tính chất sinh
vật hoá học và các đặc điểm về hình thể cũng
nh bắt màu Gram, đây là phơng pháp dùng
phổ biến hiện nay tại các khoa vi sinh của các
bệnh viện. Nh vậy, kỹ thuật PCR là một
phơng tiện chẩn đoán rất có hiệu quả các loại
E. coli này.
V. Kết luận
PCR đa mồi đã đợc phát triển thành công
trong chẩn đoán E. coli gây tiêu chảy.
Độ nhạy và độ đặc hiệu đạt gần 100%.
Sử dụng kỹ thuật PCR đa mồi trong chẩn
đoán E. coli gây tiêu chảy giúp tránh lây
nhiễm, tiết kiệm thời gian, nguyên vật liệu gấp
5 lần so với dùng PCR đơn mồi.
Kỹ thuật PCR đa mồi đã đợc ứng dụng
thành công trong chẩn đoán E. coli gây tiêu
chảy trong phân.
Tài liệu tham khảo
1. Hoàng Thu Thủy.: Góp phần nghiên cứu

các chủng Escherichia coli gây tiêu chảy cấp ở
trẻ em tại Hà Nội, Luận án Phó tiến sỹ y học,
Viện vệ sinh dịch tễ. 1988.
2. Akio Abe, Hiromi Obata, Shigeru
Matsushita, Sumio Yamada, Yasuo Kudoh.: A
sensitive method for the detection of
enterotoxigenic Escherichia coli by the
polimerase chain reaction using multiple
primer pairs, Zbl, Bakt. 1992, Vol 277: 170-
178.
3. Bardhan PK, Albert MJ, Alam NH.:
Small bowel and fecal microbiology in children
suffering from persistent diarrhea in
Bangladesh, J. Pediatr Gastroenterol Nutr.
1998, 26(1): 9-15.
4. James P. Nataro and James.B .Kaper.:
Diarrheagenic Escherichia coli, Clinical
Microbiol Revews. 1998, 4 :142-210.
5. Jan Holmgren and Ann- Mari
Svennerholm.: Bacterial enteric infection and
vaccine development, Gastroenterology Clinics
of North America. 1992, 21(2): 283-302.
6. Kamlakar U.P. Pathak. :
Enteropathogenic Escherichia coli diarrhea in
children and in young adults, India J. pathol.
Microbiol. 1995, Vol 38(2): 153-8.
7. Leutin B, K.Gleier, Peter Echeverria.:
Origin and characteristics of enteroinvasive
strain of Escherichia coli (EIEC) isolated in
Germany, Epidemiol. Infect. 1997, 118: 199-

205.
8. Okeke IN, Lamikaran A, Steinruck H,
Kaper JB.: Characterization of Escherichia coli
from cases of childhood diarrhea in provincial
Southwestern Nigeria, J. Clin. Microbiol. 2000,
Vol 38(1) : 7-12.


12
TCNCYH 23 (3) 2003
Summary
Development and application of multiplex PCR to
diagnose diarrheogenic EScherichia coli from feces
A multiplex PCR has been developed successfully for the first time by combining 8 pairs of primers
to diagnose 5 different types of diarrheogenic Escherichia coli (ETEC, EHEC, EIEC, EPEC,
EAEC) from fecal samples of children under 5 years old. The advantages of this technique are that
it allows to diagnose these pathogens with its sensitivity and specificity nearly 100%. In addition, it
can save reagents 5 times less than separate PCRs. 310 fecal samples from children with diarrhea
under 5 years old at 3 hospitals in Hanoi were analysed by the multiplex PCR. EAEC (18.7%) was
the most common causal agent, followed by EPEC (7.74%), EIEC (1.94%) and ETEC (0.65%). The
results suggest that a promissing application of multiplex PCR will be used to diagnose
diarrheogenic E. coli.

13