LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP: " PHÁT HIỆN WHITE SPOT SYNDROME VIRUS (WSSV) TRONG MẪU THỨC ĂN DÙNG NUÔI VỖ TÔM SÚ BỐ MẸ (Penaeus monodon)" pot

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN







CAO CHÍ THUẬN








PHÁT HIỆN WHITE SPOT SYNDROME VIRUS (WSSV)
TRONG MẪU THỨC ĂN DÙNG NUÔI VỖ
TÔM SÚ BỐ MẸ (Penaeus monodon)







LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2009

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN








CAO CHÍ THUẬN







PHÁT HIỆN WHITE SPOT SYNDROME VIRUS (WSSV)

TRONG MẪU THỨC ĂN DÙNG NUÔI VỖ
TÔM SÚ BỐ MẸ (Penaeus monodon)





LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN





CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
TRẦN THỊ TUYẾT HOA
ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH




2009
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
LỜI CẢM TẠ
Xin chân thành cảm tạ Quý Thầy - Cô giảng viên Khoa Thủy Sản, trường Đại học
Cần Thơ đã tận tâm giảng dạy, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý
báu trong suốt thời gian em học tập tại trường.
Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn cô Trần Thị Tuyết Hoa giảng viên Bộ môn
Sinh học và Bệnh Thủy Sản thuộc khoa Thủy Sản - trường đại học Cần Thơ đã
tận tâm dìu dắt, hướng dẫn em hoàn thành luận văn tốt nghiệp, tạo điều kiện để

em có cơ hội học tập thêm những kiến thức thực tế.
Chân thành cảm ơn anh Đào Bá Cường và anh Mai Nam Hưng (lớp cao học khoá
14) đã nhiệt tình hỗ trợ cung cấp mẫu thu ở Bạc Liêu và Cà Mau năm 2009.
Xin cám ơn tập thể các bạn lớp Bệnh học thủy sản khóa 31 đã động viên, giúp đỡ,
và trao đổi kiến thức trong suốt thời gian học tập, làm luận văn tốt nghiệp tại
Khoa Thủy Sản.
Chân thành cảm ơn các anh, chị ở bộ môn Sinh học và Bệnh thủy sản đặc biệt là
chị Trần Việt Tiên và anh Hoàng Tuấn rất đã nhiệt tình hỗ trợ, giúp đỡ tận tình
trong suốt thời gian thực hiện luận văn.
Chân thành cảm ơn Ba, Mẹ và hai chị đã động viên trong suốt thời gian học Đại
học cũng như trong khoảng thời gian làm luận văn.
Xin chân thành cảm ơn và chúc Quý thầy cô và các anh, chị, bạn bè lời chúc sức
khỏe và thành công trong cuộc sống.






i
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
TÓM TẮT
Kể từ khi xuất hiện từ đầu những năm chín mươi thì bệnh đốm trắng đã trở thành
một trong những bệnh nguy hiểm hàng đầu trong nghề nuôi tôm trên toàn thế
giới. Tính chất nguy hiểm của bệnh là không chỉ gây chết trên diện rộng trong
thới gian ngắn với phổ loài cảm nhiễm rất rộng vì vậy việc phát hiện WSSV trên
các loài mới là rất có ý nghĩa trong việc phòng chống sự lan truyền mầm bệnh. Vì
thế đề tài: “Phát hiện white spot syndrome virus (WSSV) trong mẫu thức ăn dùng
nuôi vỗ tôm sú bố mẹ” được thực hiện nhằm phát hiện thêm các loài vật mẫn cảm
mới và đánh giá sự nhiễm WSSV trên các loài có khả năng đưa mầm bệnh vào hệ

thống nuôi này.
Việc phát hiện WSSV trên các mẫu thức ăn tươi sống được thực hiện với qui
trình PCR của Kimura et al.1996 (Trần Thị Phương Trang tối ưu tháng 5 năm
2009) và bộ kít IQ2000 của công ty Farming Intelligene Technology Corporation,
Đài Loan. Việc khẳng định những ảnh hưởng của WSSV trên các mẫu thứ ăn này
ở cấp đô mô, tế bào được thực hiện bằng phương pháp mô học. Thành phần các
loại thức ăn thu được ở Bạc Liêu là nhiều hơn Cà Mau nhưng tỉ lệ nhiễm trong
các mẫu ở Cà Mau (59 %) là cao hơn ở Bạc Liêu (54 %). Kết quả PCR của kít
IQ2000 cho thấy các mẫu nhiễm WSSV chỉ ở mức độ nhẹ. Kết quả mô học trên
một số ốc mượn hồn cho thấy sự ảnh hưởng của WSSV trên tế bào của mô liên
kết dạ dày. Từ đó hoàn toàn có thể khẳng định sự nhiễm WSSV trên các mẫu thức
ăn tươi sống trong các trại sản xuất giống thu từ Bạc Liêu và Cà Mau.









ii



PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
MỤC LỤC

Trang
LỜI CẢM TẠ ……………………………………………………………… i

TÓM TẮT………………………………………………………………… …ii
DANH SÁCH BẢNG……………………………………………………… v
DANH SÁCH HÌNH………………………………………………………… vi
PHẦN I: GIỚI THIỆU……………………………………………………… 1
PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU…………………………………… 2
2.1.1 Sơ lược về tình hình nuôi tôm trên thế giới…………………… …… …2
2.1.2 Ở Việt Nam……………………………… ………………………… ….2
2.2 Sơ lược về bệnh đốm trắng……………………………………… …….….3
2.2.1 Dấu hiệu bệnh lý……………… …………………………………………3
2.2.2 Phổ loài cảm nhiễm………………………… ……………………………4
2.2.3 Phương thức lan truyền…………………………… ……………………5
2.2.4 Phương pháp chẩn đoán – phát hiện bệnh 6
2.2.5 Cách phòng bệnh 6
2.2.6 Một số các nghiên cứu phát hiện WSSV ………………………………….7
PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…… ……… ….9
3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện……………………………………….…….9
3.2 Vật liệu nghiên cứu…………………………………………………… ….9
3.2.1 Mẫu vật……………………………………………………………… … 9
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
3.2.2 Dụng cụ hóa chất………………………………………………… …….9
3.3 Phương pháp nghiên cứu……………………………………………… .……9
3.3.1 Phương pháp chiết tách ADN dựa theo kit IQ2000 – WSSV của công ty
Farming Intelligene Technology Corporation, Đài
Loan……………………………………………………………………… ……10
3.3.2 Phương pháp PCR phát hiện WSSV (Kimura et al. 1996)……………….11
3.3.3 Phương pháp PCR phát hiện WSSV theo kit IQ2000–WSSV (công ty
Farming Intelligene Technology Corporation, Đài Loan)…………………… 14
3.3.5 Phương pháp mô học…… ……………………………………… …… 15
3.3.6 Phương pháp phân tích và xử lý thống kê ………………………… ……17
PHẦN IV

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Tình hình sử dụng thức ăn tươi sống nuôi vỗ tôm sú bố mẹ tại hai tỉnh Bạc
Liêu và Cà Mau……………………………………………………… ……18
4.2 Xác định sự nhiễm WSSV ở các mẫu thức ăn…………………… 19
4.2.1 Sự nhiễm WSSV ở mẫu ốc mượn hồn………… ………………………19
4.2.2 Sự nhiễm WSSV ở mẫu mực…………………………………………….21
4.2.3 Sự nhiễm WSSV trên tôm tít………………… ………….…………… 22
4.2.4 Xác định sự nhiễm WSSV trong các mẫu thức ăn tươi sống với kít WSSV-
IQ2000 ……………………………………………………………………… 23
4.2.5 Xác định sự nhiễm WSSV trong mẫu thức ăn với phương pháp mô học 24
4.3.1 Xác định tỉ lệ nhiễm WSSV ở các mẫu thức ăn tại Bạc Liêu……………25
4.2.3 Xác định tỉ lệ nhiễm WSSV ở các mẫu thức ăn tại Cà Mau…………… 27

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
PHẦN V
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT……………………………………………………28
5.1 Kết luận…………………………………………………………… …… 28
5.2 Đề xuất…………………………………………………………………… 28
TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………… 29

iv
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 3.1 Trình tự đoạn mồi của Kimura et al. 1996
Bảng 3.2 Trình tự đoạn mồi của gen nội chuẩn (Csiro, 2008)
Bảng 3.3 Thành phần hóa chất tham gia phản ứng bước 1
Bảng 3.4 Thành phần hóa chất sử dụng cho phản ứng bước 2
Bảng 4.1 Kết quả về các loại thức ăn tươi sống được sử dụng trong các trại sản
xuất tôm sú giống tại Bạc Liêu và Cà Mau
Bảng phụ lục A: Câu hỏi điều tra thông tin trại giống
Bảng B.1 Thành phần hóa chất sử dụng trong qui trình PCR của Kimura et al
(1996) được tối ưu bởi Trần Thị Phương Trang (2009).
Bảng C.1 Dung dịch cố định Davidson/AFA
Bảng C.2 Dung dịch nhuộm Haematoxylin
Bảng C.3 Dung dịch Eosin/Phloxine

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
DANH SÁCH HÌNH
Hình 4.1 Các mẫu ốc thu được từ các trại sản xuất giống tôm sú ở Bạc Liêu và
Cà Mau
Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR ốc mượn hồn, mực và tôm tít
Hình 4.3 Các mẫu mực dùng trong các trại sản xuất giống tại Bạc Liêu
Hình 4.4 Mẫu tôm tít dùng cho tôm mẹ tại Bạc Liêu
Hình 4.5 Kết quả điện di các mẫu chạy PCR với bộ kit IQ2000
Hình 4.6 Tế bào liên kết dạ dày của ốc mượn hồn nhiễm WSSV (H&E, 100X)
Hình 4.7 Cơ quan ống gan tụy của ốc mượn hồn (H&E, 40X)
Hình 4.8 Tỉ lệ nhiễm WSSV trong các mẫu thu từ Bạc Liêu









vi
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
1
PHẦN I
GIỚI THIỆU
Nghề nuôi trồng thủy sản của Việt Nam nói chung và Đồng Bằng sông Cửu
Long (ĐBSCL) nói riêng đã và đang phát triển mạnh, là một trong những ngành
kinh tế mũi nhọn của cả nước. Trong đó cá tra, cá ba sa và tôm sú là một trong
những đối tượng nuôi chính và chiếm ưu thế trong ngành nuôi thủy sản của cả
nước. Tuy nhiên trong những năm qua cùng với sự phát triển quá ồ ạt, tự phát,

thiếu quy hoạch nhất là sự thiếu nhận thức đúng về môi trường và dịch bệnh của
người dân nên tình hình dịch bệnh diễn biến phức tạp, gây thiệt hại không nhỏ
cho người nuôi. Đây là nguyên nhân chính làm cho nghề nuôi trồng thủy sản
không ổn định và thiếu bền vững.
Có nhiều bệnh gây tổn thất lớn cho nghề nuôi tôm nói chung và cho tôm sú nói
riêng được biết đến như bệnh đầu vàng (Yellow Head Virus-YHV), bệnh còi
(Monodon Baculovirus- MBV) đặc biệt là bệnh đốm trắng (White Spot
Syndrome Virus-WSSV) là một bệnh rất nguy hiểm do gây tỉ lệ chết cao, lây lan
nhanh và đặc biệt phổ loài cảm nhiễm rộng. Tất cả các loài tôm he đều có thể bị
cảm nhiễm loại virut này, các loài cua, còng trong ao nuôi hay thậm chí ấu trùng
của côn trùng thủy sinh cũng có thể mang mầm bệnh và là nguồn lây bệnh nguy
hiểm. Do vậy việc nghiên cứu về phổ loài cảm nhiễm nhằm giúp kiểm soát và
khống chế bệnh này là rất cần thiết khi mà công tác chữa trị hầu như không
mang lại hiệu quả. Vì vậy đề tài “Phát hiện white spot syndrome virus (WSSV)
trong mẫu thức ăn dùng nuôi vỗ tôm sú bố mẹ” được thực hiện.
Mục tiêu của đề tài
Tìm hiểu về khả năng nhiễm WSSV trong các mẫu thức ăn tươi sống dùng trong
các trại sản xuất giống tôm sú ở khu vực Cà Mau và Bạc Liêu.
Nội dung của đề tài
- Xác định sự nhiễm WSSV ở các mẫu thức ăn tươi sống.
- Xác định tỉ lệ nhiễm WSSV ở các mẫu thức ăn tại Cà Mau.
- Xác định tỉ lệ nhiễm WSSV ở các mẫu thức ăn tại Bạc Liêu.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
2
PHẦN II
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Sơ lược về tình hình nuôi tôm trên thế giới
Hiện nay, trên thế giới có 2 khu vực nuôi tôm lớn bao gồm: các nước Châu Mỹ
La Tinh khu vực Đông Bán Cầu - gồm các nước Nam và Đông Nam Á. Trong
đó, Đông Nam Á được xem là nơi đứng đầu thế giới về nuôi trồng và xuất khẩu

tôm biển, chiếm khoảng 80 % sản lượng tôm nuôi trên thế giới, gồm các nước
như: Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Indonesia, Nhật Bản, Đài Loan,Việt Nam
(trích dẫn bởi Lý Ngọc Hà, 2008). Theo FAO (2006), châu Á có 9 trong tổng số
10 quốc gia đứng đầu về nuôi trồng thủy sản trên thế giới.
Cùng với sự phát triển mạnh mẽ nghề nuôi tôm thế giới là sự bùng phát và sự
tàn phá của dịch bệnh. Năm 1988, Đài Loan đã bị thiệt hại nặng nề, tiếp đó là
Indonesia năm 1992, Trung Quốc năm 1993, Ấn Độ năm 1994, Thái Lan 1997
và Ecuado năm 1999, Mehico năm 1999-2000, Pháp và Iran năm 2002, Brazil
2005 (C M Escobedo-Bonilla et al. 2008).
2.2 Ở Việt Nam
Nghề nuôi tôm ở Việt Nam bùng phát vào những năm đầu của thập niên 90 khi
Chính phủ ban hành Nghị quyết 09, cho phép chuyển đổi một phần diện tích
trồng lúa, làm muối năng suất thấp, đất hoang hoá sang nuôi trồng thuỷ sản.
Diện tích nuôi tôm đã tăng từ 250.000 ha năm 2000 lên đến 478.000 ha năm
2001 và 540.000 ha năm 2003. Chỉ trong vòng 1 năm sau khi ban hành Nghị
quyết 09, đã có 235.000 ha gồm 232.000 ha ruộng lúa, 1.900 ha ruộng muối và
1.200 ha diện tích đất hoang hoá ngập mặn được chuyển đổi thành ao nuôi tôm.
Cho đến nay, diện tích nuôi tôm ở Việt Nam vẫn tiếp tục tăng, tuy nhiên tốc độ
đã có phần chững lại (
&news-ID=6471106). Tổng kim ngạch xuất khẩu toàn ngành tính đến ngày
14/11/2008 đã chạm mức 4 tỉ USD. Trong mười tháng đầu năm 2008, xuất
khẩu cả nước đạt 1.054.600 tấn trị giá 3,828 tỉ USD tăng 39,4 % về lượng và
24,4 % về giá trị so với cùng kỳ năm ngoái (tạp chí thủy sản Việt Nam, 2009).
Trong khoảng năm 1993-1994, bệnh đốm trắng đã được ghi nhận ở Việt Nam,
đặc biệt là từ tháng 3 năm 1993 bệnh đã làm thiệt hại cho nghề nuôi tôm ở hầu
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
3
hết các tỉnh ĐBSCL (trích dẫn bởi Nguyễn Trường Quang, 2004). Trong những
năm gần đây, bệnh đốm trắng xuất hiện thường xuyên ở các khu vực nuôi tôm
ven biển Việt Nam. Hầu hết các ao bị nhiễm đốm trắng sẽ gây chết hàng loạt và

tổn thất lớn. Tính đến tháng 5 năm 2004, tổng diện tích hồ tôm bị nhiễm bệnh
đốm trắng ở miền trung lên đến 10.272 ha, nặng nhất là Thừa Thiên Huế (hơn
823/2.700 ha), kế đó là Quảng Nam (60/2.300 ha), ở Quảng Ngãi (139/4.000 ha)
và Bình Định (250/1.500 ha) (Http://nhanong.net/?nn=view&action=showid&id
=134 3).
Báo cáo kết quả nuôi trồng thủy sản năm 2003 của ngành đã cho biết: cả nước
có 546.757 ha nuôi tôm nước lợ thương phẩm, trong đó diện tích có tôm nuôi bị
bệnh và chết là 30.083 ha. Các tỉnh, thành ven biển từ Ðà Nẵng đến Kiên Giang
có tới 29.200 ha tôm nuôi bị chết nhiều, chiếm 97,06% diện tích có tôm bị chết
trong cả nước. Các bệnh xảy ra cũng tương tự, chủ yếu là bệnh đốm trắng
(WSSV), bệnh MBV (Monodon Baculovirus), bệnh do vi khuẩn Vibrio, bệnh do
ký sinh trùng, do dinh dưỡng và gần đây xuất hiện thêm bệnh phân trắng, teo
gan ở một vài nơi như Sóc Trăng, và các tỉnh nam sông Hậu khác (Http://www
khuyennongvn.gov.vn/g-ttdh/ca-mau-xuat-hien-tinh-trang-tom-the-chan-trang-
nhiem-benh-va-chet/view). Theo báo cáo năm 2008 của ngành nông nghiệp các
tỉnh, dịch bệnh đã xảy ra trên 120.000 ha, trong đó Cà Mau 58.000 ha, Kiên
Giang 40.000 ha, Bạc Liêu 19.000 ha…(Http://thuysan.kiengianggov.vn/index2
.jsp?menuId=455&articleId=2243.)
2.3 Sơ lược về bệnh đốm trắng
2.3.1 Dấu hiệu bệnh lý
Dấu hiệu lâm sàng khi tôm nhiễm WSSV là xuất hiện những đốm trắng dưới vỏ,
và cũng có trường hợp chuyển sang màu đỏ khi tôm gần chết (Hình 2.1). Tôm
nhiễm WSSV xuất hiện đốm trắng có đường kính từ 0.5 – 2 mm, đôi khi kèm
theo hiện tượng đỏ thân. Tôm yếu, bỏ ăn, dạt bờ, thường xuất hiện ở thời điểm 1
– 2 tháng sau khi nuôi. Tỉ lệ chết cao và nhanh, trong vòng 3 – 10 ngày tôm chết
hầu hết trong ao nuôi (100 %). Ngoài ra, khi môi trường nuôi xấu bệnh sẽ dễ
xuất hiện hơn (trích dẫn bởi Trần Thị Tuyết Hoa, 2006). Cơ quan đầu tiên và
cũng là cơ quan đích mà WSSV tấn công là lớp biểu mô, bao gồm: biểu mô dưới
vỏ, biểu mô dạ dày và biểu mô mang. Biểu hiện vi thể khi tôm nhiễm WSSV là
sự hoại tử của các tế bào biểu mô (Lightner, 1996). Hình thức hoại tử của các tế

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
4
bào biểu mô là tạo thể vùi trong nhân phì đại. Thể vùi WSSV bắt màu hồng của
Eosin và cả màu tím của Haematoxylin, ở giai đoạn đầu thể vùi bắt màu tím của
Haematoxylin và có vùng sáng xung quanh nhưng dần về sau, khi chuyển sang
tế bào Cowdry type A thì chúng sẽ bắt màu hồng của Eosin.
Theo Lightner 1996, thể vùi là dấu hiệu bệnh lý đặc trưng dùng trong việc chẩn
đoán bệnh đốm trắng. Khi xâm nhập vào cơ thể tôm, WSSV tạo các thể vùi
trong nhân của tế bào mang, biểu bì ruột, dạ dày, biểu bì dưới vỏ, cơ quan
lymphoid, tim, tuyến râu (Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003).

A B
Hình 2.1 Dầu hiệu bệnh lý của bệnh đốm trắng (Bùi Quang Tề, 2006)
A. Nhân tế bào biểu bì dạ dày tôm bệnh trương to, có thể vùi WSSV.
B. Dấu hiệu bên ngoài của bệnh đốm trắng
2.3.2 Phổ loài cảm nhiễm:
WSSV thường gây bệnh trên tôm giống và tôm trưởng thành ở các khu vực nuôi
tôm thâm canh và quảng canh. Là loài virút gây tỉ lệ chết cao và có phổ loài cảm
nhiễm rộng, trên 40 loài động vật giáp xác tự nhiên, có độc lực với hầu hết các
loài tôm có giá trị kinh tế (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004).
Từ khi xuất hiện (năm 1992) WSSV đã là mối đe dọa lớn cho nghề nuôi tôm thế
giới. Tác nhân này đã lây lan cho các loài tôm nuôi chủ lực ở các nông trại và
hầu hết các giáp xác mười chân. Cho đến nay có: (i) 18 loài tôm he nuôi và
hoang dã bị nhiễm WSSV (Fennero- penaeus chinensis, F. indicus, F. mergui-
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
5
ensis, Litopenaeus setiferus, L. Sty- liro- stris, Marsupenaeus japonicus,
Metapenaeus ensis, Penaeus monodon, P. penicillatus, Parapenaeopsis
stylifera, Solenocera indica, Trachypenaeus cur- virostris ) (Wongteerasupaya
et al. 1996; Durand et al 1997; Lu et al. 1997; Chou et al 1998, Lightner et al

1998; Park et al. 1998; (ii) có 8 loài tôm mang bị nhiễm WSSV (Alpheus sp,
Callianassa sp, Exopala-emon orientalis ) (Hameed et al. 2000; Shi et al.
2000; Pramod-Kiran et al. 2002); (iii) 7 loài tôm hùm nhiễm WSSV (Panulirus
homarus, P. longipes, P. ornatus ) (Chang et al. 1998; Rajen-dran et al. 1999);
(iv) 7 loài tôm nước ngọt nhiễm WSSV (Astacus astacus, A. Leptodactylus,
Cherax destructor ) (Wang et al. 1998; Corbel et al. 2001; Jiravanichpaisal et
al. 2001; Edgerton 2004; Jirava nichpaisal et al. 2004) (trích dẫn bởi C M
Escobedo_Bonilla et al (2008)). Số lượng các loài cua bị nhiễm loài virut này là
rất lớn, khoảng 38 loài như: Atergatis integerrimus, Calappa philarigus,
Callinectes lophos, Cancer pagurus Carcinus maenas, Charybdis annula-
ta (Lo et al. 1996; Kanchanaphum et al. 1998; Kou et al. 1998; Hameed et al.
2003 trích dẫn bởi C M Escobedo_Bonilla et al (2008)). Ngoài ra còn có: (i) 6
loài giáp xác không thuộc bộ mười chân cũng được phát hiện nhiễm WSSV:
Sergestoidea, Acetes sp, Cirripedia Balanus sp…(Supamattaya et al. 1998; Otta
et al.1999; Hossain et al. 2001); (ii) các loài thuộc ngành hàm tơ và luân trùng
cũng có thể nhiễm như chaetognata và Rotifera (Yan, Dong, Huang et al. 2004;
Ramirez-Douriet et al. 2005; Yan, Dong, Huang & Zhang 2007); cả nhóm giun
nhiều tơ như Marphysa sp (Supak et al. 2005; Vijayan et al. 2005) hay một số
loài côn trùng thủy sinh như Coleoptera Ephydridae (Lo et al. 1996b, Flegel
1997; Ramirez-Douriet et al. 2005) (trích dẫn bởi C M Escobedo_Bonilla et al
(2008)) cũng được xác định là nhiễm WSSV. Trong số đó có nhiều loài bị
nhiễm mãn tính và có thể nhiễm trong điều kiện gây cảm nhiễm một số khác thì
có thể bị nhiễm trong tự nhiên. Nhiều loài mang virut đốm trắng với tư cách như
là một tác nhân cơ học ví dụ như trong trường hợp của giun nhiều tơ (C M
Escobedo_Bonilla et al, 2008).
2.3.3 Phương thức lan truyền
Bệnh đốm trắng lây truyền qua đường nằm ngang. Virút lây từ các giáp xác
khác (tôm cua, chân chèo) nhiễm bệnh đốm trắng từ môi trường bên ngoài ao
hoặc ngay trong ao nuôi tôm. Hiện tượng ăn lẫn nhau dẫn đến bệnh lây lan càng
nhanh hơn trong ao có tôm bị bệnh. Có thể một số loài chim nước đã ăn tôm bị

bệnh đốm trắng từ ao khác và bay đến ao nuôi đã mang theo các mẩu thức ăn
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
6
thừa rơi vào ao nuôi (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004). Bệnh đốm trắng không có khả
năng lây truyền qua đường thẳng đứng vì các noãn bào (trứng) phát hiện chúng
nhiễm virus đốm trắng thì chúng không thành thục được. Nhưng trong quá trình
đẻ trứng của tôm mẹ có thể thải ra các virút đốm trắng từ trong buồng trứng của
chúng, do đó ấu trùng tôm dễ dàng nhiễm virút ngay từ giai đoạn sớm (Bùi
Quang Tề, 2006).
2.3.4 Phương pháp chẩn đoán – phát hiện bệnh
Với những thiệt hại đáng kể do virút gây ra đã có không ít nhà khoa học nghiên
cứu về tác nhân gây bệnh này với nhiều phương pháp từ truyền thống đến hiện
đại, có thể chia thành các mức độ sau:
- Dự chuẩn
Quan sát chung: bệnh đốm trắng có thể được biểu hiện trước vài ngày với dấu
hiệu là ngừng ăn, tôm sắp chết lờ đờ gần bờ, xuất hiện những đốm trắng dưới vỏ
hoặc thân tôm thường biến đỏ.
Có thể dùng phương pháp làm tiêu bản ép nhanh để chẩn đoán bệnh.
Nhưng đây không phải là những dấu hiệu đặc trưng chỉ có ở bệnh do WSSV gây
ra nên việc kiểm khẳng định bằng những phương pháp khác là rất cần thiết (trích
dẫn bởi Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007).
- Kiểm khẳng định
Việc khẳng định nhiễm WSSV có thể được tiến hành bằng phương pháp PCR
(bước đơn hoặc Nested PCR), kỹ thuật lai tại chổ, lai Western, kính hiển vi điện
tử (TEM) hay phương pháp mô học hoặc có thể kết hợp nhiều phương pháp
(Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007)(C M Escobedo-Bonilla, 2008).
2.3.5 Cách phòng bệnh
Theo Bùi Quang Tề (2006), cách phòng bệnh đốm trắng tốt nhất là chọn tôm bố
mẹ có chất lượng tốt, không vận chuyển tôm với mật độ cao, không nên dùng
thức ăn tươi sống, nguồn nước nuôi và nước thải phải qua xử lý, ngăn chặn giáp

xác vào ao bên cạnh đó việc cải tạo kỹ ao nuôi và tránh gây sốc, quản lý môi
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
7
trường nuôi cũng rất cần thiết và quan trọng trong quá trình nuôi (Trần Thị
Tuyết Hoa, 2004)
Nghiên cứu khả năng phòng bệnh đốm trắng cho tôm thông qua phương pháp
cho ăn vacxin được tạo ra từ protein vỏ của WSSV cũng đã được thử nghiệm.
Cụ thể, tôm sú (Penaeus monodon) được cho ăn thức ăn viên áo bên ngoài 1 lớp
vi khuẩn không hoạt động biểu hiện 2 loại protein vỏ của WSSV là VP19 và
VP28. Vacxin chứa VP28 cho thấy tỉ lệ chết của tôm thấp hơn có ý nghĩa khi so
sánh với lô đối chứng (vi khuẩn chỉ chứa vector rỗng). Còn thông qua phương
pháp ngâm thì tỉ lệ sống 61 %. Trong hiện tại, động vật không xương sống
không có hệ thống đáp ứng miễn dịch nhưng kết quả này cho thấy đáp ứng miễn
dịch đặc hiệu và khả năng bảo vệ có thể được tạo ra ở Penaeus monodon kháng
lại với WSSV (Witteveldt et al. 2004).
2.3.6 Một số các nghiên cứu phát hiện WSSV
Lo et al (1999) đã nghiên cứu mối quan hệ của virut gây bệnh đốm trắng ở
những vùng địa lý khác nhau và nhiều vật chủ khác nhau gồm: Trung Quốc (P.
Chinesis), Ấn Độ (P.monodon), Thái Lan (P.monodon), Mỹ (Orconectes punc-
timanus), Thái Lan (P.vannamei) gây nhiễm thực nghiệm, Nam California (P.
vannamei), Texas (P. Vannamei). Sử dụng phương pháp lai tại chỗ, PCR và
phân loại bằng enzyme để tiến hành kiểm tra thì thấy những mẫu nhiễm virut
đốm trắng từ những vùng địa lý khác nhau có quan hệ gần gũi với nhau trừ
những mẫu được thu ở Texas.
Theo Lo et al (1996) thì virut đốm trắng được tìm thấy trên các loài tôm khác
nhau ở các nước khác nhau của châu Á. Việc phát hiện WSSV có thể được thực
hiện bằng phản ứng PCR một bước hoặc PCR 2 bước. Trong thí nghiệm, họ thử
đưa vào phản ứng PCR hai bước với đoạn mồi chuyên biệt để thử độ nhạy trong
việc phát hiện WSSV và chất lượng của đoạn ADN chiết tách được kiểm tra
bằng 2 đoạn mồi của 18S rRNA của họ mười chân. Khi sử dụng hai phương

pháp này họ đã thành công trong việc phát hiện WSSV trên tôm nuôi, tôm đánh
bắt từ tự nhiên, các loài cua và cả các một số loài động vật chân đốt khác.
Với mỗi nhóm đối tượng trên họ có phương pháp phát hiện WSSV khác nhau.
Đối với các loài trong nhóm mười chân đươc nuôi như tôm sú (P. monodon),
tôm he Nhật (P. japonicus), tôm thẻ đuôi đỏ (P. penicillatus), tôm càng xanh
(Macrobrachium rosenbergii) và cua bùn có dấu hiệu đốm trắng được thu từ
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
8
những vùng địa lý khác nhau với những giai đoạn khác nhau, vào những mùa
khác nhau ở Đài Loan. Mẫu thu được trữ trong nitơ lỏng -70
0
C cho đến khi
dùng kỹ thuật PCR để kiểm tra. ADN của chúng được chiết tách theo qui trình
của Lo et al (1996) đã được tối ưu sau một số nghiên cứu. Kết quả khi phân tích
những mẫu tôm lớn đánh bắt từ tự nhiên bằng phương pháp PCR bước 2 cho
thấy tỉ lệ nhiễm với WSSV của tôm sú (P. monodon) là 50/66 mẫu; tôm he Nhật
(P. japonicus) là 14/23 mẫu; tôm rằn (P. semi- sulcatus) là 2/32 mẫu và tôm thẻ
đuôi đỏ (P. penicillatus) là 3/27 mẫu. Kết quả nghiên cứu mô học cũng tìm thấy
những thể vùi nội nhân WSSV tồn tại trong tế bào của mang, dạ dày, cơ quan
lymphoid và chân bơi. Riêng tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii thì
cũng cho kết quả dương tính với WSSV ở PCR 2 bước nhưng nhóm tác giả
không đề cập đến tỉ lệ nhiễm. Các mẫu tôm dại, cua dại, côn trùng thủy sinh và
nhóm giáp xác mười chân thu từ nông trại tôm đang bùng phát bệnh đốm trắng
cũng cho kết quả dương tính với WSSV. Nhộng của côn trùng thủy sinh
(Ephydridae) nhiễm với tỉ lệ là 8/10 mẫu, họ mười chân là 4/6 mẫu, tôm mang
(Palaemonidae) là 12/15 mẫu và mẫu cua dại (Helice tridens) là 5/11 mẫu.
Nghiên cứu mô học không được thực hiện trên nhóm đối tượng này cũng cho
thấy các thể vùi nội nhân của các cơ quan có nguồn gốc ngoại phôi bì và trung
phôi bì.
S. K. Otta et al. 1999 đã dùng kỹ thuật PCR để phát hiện WSSV trên các loài

giáp xác nuôi và hoang dại ở Ấn Độ. Trong nghiên cứu này thì tôm hậu ấu trùng
và tôm bố mẹ được kiểm tra với hai đoạn mồi là WSSV PJ dành cho tôm he
Nhật (P. japonicus) và WSSV PM dành cho tôm sú (P. monodon). Kết quả
dương tính với WSSV bằng phương pháp nested PCR trên các mẫu tôm hậu ấu
trùng là 28/58 mẫu: (i) Trên nhóm có dấu hiệu bên ngoài khỏe như: tôm giống là
3/3 mẫu, các mẫu tôm lứa đang nuôi thì không bị nhiễm (0/2 mẫu) trong khi
mẫu tôm hoang dại từ tự nhiên nhiễm 1/1 mẫu; các mẫu tôm mẹ là 3/3 mẫu và
mẫu artemia là 1/1 mẫu, mẫu cua (Scylla serrata) nhiễm 3/20 mẫu, mẫu cua
Sesarma oceanica nhiễm 1/10 mẫu, Charybdis lucifera là 2/5 mẫu và Matuta
planipes là 2/2 mẫu, còn lại các mẫu cua có dấu hiệu bình thường như Chary-
bdis cruciata, Portunus sanguinolentus, Doclea gracilipes, Macrophthalmus
sulcatus, Pseudograpsus intermedius thì cho kết quả âm tính với số lượng mẫu
kiểm tra khác nhau (ii) Trên nhóm có dấu hiệu bệnh như: tôm giống có dấu hiệu
đốm trắng nhiễm 1/1 mẫu, mẫu tôm mẹ là 7/7 mẫu, các mẫu cua (Scylla serrata)
thì nhiễm với tỉ lệ 1/1 mẫu.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
9
PHẦN III
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện
Thời gian nghiên cứu: tháng 04-07/2009
Địa điểm: Phòng thí nghiệm – Bộ môn Sinh học và bệnh thủy sản - Khoa
Thủy Sản trường ĐHCT
3.2 Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Mẫu vật
Mẫu thức ăn tươi sống (ốc mượn hồn -147 mẫu, mực - 5 mẫu, tôm tít -3 mẫu)
được thu từ các trại sản xuất giống ở Bạc Liêu (15 trại) và Cà Mau (18 trại).
3.2.2 Dụng cụ hóa chất
Dùng trong kỹ thuật PCR
Dụng cụ: que nghiền, đầu col (xanh, vàng, trắng), máy Vortex, máy ly tâm, máy

ủ, máy sấy chân không, máy PCR, bộ điện di, thiết bị chụp ảnh gel, tủ lạnh, lò vi
sóng, cân điện tử, micropipette các loại, ống eppendorf chuyên dùng trong PCR
(1,5 ml; 0,5 ml; 0,2 ml), bộ kit IQ2000-WSSV…
Hoá chất: Nitơ lỏng, nước đá, dung dịch đệm TAE 0.5X, agarose, Ethidium
Bromide, nước cất, ethanol, chloroform, nước Javel…
Dùng trong nghiên cứu mô
Dụng cụ: bộ tiểu phẩu, kính hiển vi, lame, lamelle, lọ đựng mẫu, khay nhựa,
máy đúc khối, máy cắt mẫu, máy chụp ảnh, máy xử lý…
Hoá chất: Cồn tuyệt đối, Davidson’s AFA, nước cất, parafin, sáp ong, keo
Enterlan, Xylen, dung dịch 2% Potassium, dung dịch 1% acid-alcohol, thuốc
nhuộm Haematoxylin và Eosin…

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
10
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp chiết tách ADN (bộ chiết tách CTAB-DTAB của công ty
Farming Intelligene Technology Corporation, Đài Loan)
Chuẩn bị mẫu: cho khoảng 20mg mẫu vào ống eppendorf (1,5 ml) chứa 600µl
dung dịch DTAB. Nghiền mẫu bằng que nghiền tiệt trùng.
Ủ mẫu đã chuẩn bị ở 75
0
C trong 5 phút, sau đó làm lạnh đến nhiệt độ phòng.
Lắc đều mẫu, ly tâm nhẹ, sau đó thêm 0,7 ml Chloroform, lắc đều 20 giây và ly
tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút.
Chuyển phần dung dịch trong ở trên sang ống eppendorf 1,5 ml mới, thêm 100
µl CTAB Solution và 900 µl nước cất, lắc đều sau đó ủ ở 75
0
C trong 5 phút.
Làm lạnh xuống nhiệt độ phòng và ly tâm 12.000 vòng/phút trrong 10 phút.
Bỏ phần nước trong ở trên, hòa tan phần còn lại bằng 150 µl Dissolve solution,

ủ ở 75
0
C trong 5 phút, sau đó làm lạnh ở nhiệt độ phòng.
Ly tâm 12.000vòng/phút trong 5 phút. Chuyển phần dung dịch trong phía trên
sang eppendorf mới chứa 300 µl methanol 95%.
Lắc đều, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút. Rửa ADN với 200 µl ethanol
70%, để lắng xuống. Làm khô ADN và hòa tan trong TE buffer. Bảo quản ADN
ly trích tạm thời trong ngăn đá của tủ lạnh sau đó trữ ở -80
0
C .







PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
11
3.3.2 Phương pháp PCR phát hiện WSSV (Kimura et al. 1996)
Qui trình PCR phát hiện WSSV được thực hiện với các đoạn mồi do Kimura et
al (1996) thiết kế và được Trần Thị Phương Trang tối ưu (2009). Đoạn mồi có
trình tự như sau:
Bảng 3.1 Trình tự đoạn mồi của Kimura et al. 1996
Tên mồi Trình tự

P1 5
’
-ATC-ATG-GCT-GCT-TCA-CAG-AC-3
’

P2 5
’
-CGC-TGG-AGA-GGA-CAA-GAC-AT-3
’

P3 5
’
-TCT-TCA-TCAGAT-GCT-ACT-GC-3
’

P4 5
’
-TAA-CGC-TAT-CCA-GTA-TCA-CG-3
’

Việc kiểm tra chất lương ADN ly trích được thực hiện dựa vào đoạn mồi đặc
hiệu cho giáp xác mười chân có trình tự như sau:
Bảng 3.2 Trình tự đoạn mồi của gen nội chuẩn (Csiro, 2008)
Tên mồi Trình tự
20a2 5’-ACT-TCC-CCC-GGA-ACC-CAA-AGA-CT-
3’
20s9 5’-GGG-GGC-ATT-CGT-ATT-GCG-A-3’
Phản ứng PCR được thực hiện qua hai bước với thành phần hóa chất và điều
kiện phản ứng như sau:





PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

12
PCR bước 1: thể tích phản ứng 20 µl
Thành phần hóa chất qui trình PCR phát hiện WSSV như sau:
Hóa chất Nồng độ
PCR buffer (5X) 1 X
MgCl
2
(25mM) 1,5 mM
dNTP (10nm) 200 µM
P1 (mồi xuôi) 20 pmol
P2 (mồi ngược) 20 pmol
Taq DNA polymerase (5U) 1,5 U
20a2 10 pmol
20s9 10 pmol
Nước cất tiệt trùng
ADN chiết tách
Bảng 3.3 Thành phần hóa chất tham gia phản ứng bước 1
Chu kỳ nhiệt của phản ứng
01 chu kỳ: 94
0
C trong 5 phút
Sau đó 30 chu kỳ
94
0
C trong 30 giây
55
0
C trong 30 giây
72
0

C trong 30 giây
01 chu kỳ:72
0
C trong 5 phút
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
13
PCR bước 2: thể tích phản ứng là 20 µl, sử dụng sản phẩm của PCR bước 1 là 1
µl, và thành phần hóa chất giống như bước một nhưng đoạn mồi là P3 và P4 và
nồng độ MgCl
2
cũng thay đổi nhưng với điều kiện phản ứng như bước 1.
Bảng 3.4 Thành phần hóa chất sử dụng cho phản ứng bước 2
Hóa chất Nồng độ
PCR buffer (5X) 1 X
MgCl
2
(25mM) 1 mM
dNTP (10 nm) 200 µM
P3 (mồi xuôi) 20 pmol
P4 (mồi ngược) 20 pmol
Taq DNA polymerase (5U) 1,5 U
20a2 10 pmol
20s9 10 pmol
Nước cất tiệt trùng
Sản phẩm bước 1
Điện di
Chuẩn bị bản thạch (gel): đun nóng dung dịch đệm TAE 0.5X với agarose 1,5%
(1,5 g/100ml) cho tới khi agarose tan hoàn toàn. Sau đó để nguội (50
0
C) và

nhuộm gel với 2 µl Ethidium Bromide cho bản gel nhỏ (40 ml-12 hay 15 giếng)
hoặc 4 µl cho bảng gel lớn (120 ml- 40 giếng), lắc đều hòa tan dung dịch, đổ
dung dịch agarose từ từ vào khay đựng gel. Thường bề dày của gel chỉ cần cao
hơn đáy của lược khoảng 0,3-0,5 cm, bề dày của gel không quá 0,8 cm.
Sau đó cẩn thận cho mẫu, thang ADN, đối chứng âm, đối chứng dương vào
trong từng giếng. Sau đó điện di với dóng điện 90 V trong khoảng thời gian 45
phút.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
14
Đọc kết quả: kết quả điện di được ghi nhận với thiết bị chụp ảnh gel (Vilber
Loumart). Căn cứ vào thang ADN 1 kb plus (Invitrogen) để xác định trọng
lượng phân tử của sản phẩm PCR. Những mẫu nhiễm WSSV xuất hiện vạch
tương ứng 570 bp (base pair – bp). Mẫu chiết tách tốt sẽ xuất hiện vạch nội
chuẩn tại vị trí 240 bp.
3.3.3 Phương pháp PCR phát hiện WSSV theo kit IQ2000–WSSV (công ty
Farming Intelligene Technology Corporation, Đài Loan)
- Chuẩn bị các chất phản ứng
Bước 1: 8µl/phản ứng, bao gồm các chất
- First PCR Premix 7,5 µl
- IQzyme ADN polymerase 2U/µl 0,5 µl
Bước 2: 15µl/phản ứng, bao gồm các chất
- Nested PCR Premix 14 µl
- IQzyme ADN polymerase 2U/µl 01 µl
- Điều kiện phản ứng
PCR bước 1: 94
0
C trong 2 phút, 94
0
C trong 20 giây, 62
0

C trong 20 giây, 72
0
C
trong 30 giây. Lặp chu kỳ trên 15 lần. Sau đó, ở 72
0
C trong 30 giây, 20
0
C trong
30 giây.
PCR bước 2: 94
0
C trong 20 giây, 62
0
C trong 20 giây, 72
0
C trong 30 giây. Lặp
chu kỳ trên 30 lần. Sau đó, ở 72
0
C trong 30 giây, 20
0
C trong 30 giây.
- Điện di: được thực hiện theo các bước đã được mô tả ở phần điện di mục 3.3.2.
- Đọc kết quả: Những mẫu dương tính theo bộ kit IQ2000 – WSSV hiện vạch
tương ứng 296 bp và/hoặc 550 bp.Vạch nội chuẩn tương ứng 848 bp.


PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
15
3.3.4 Phương pháp mô học
Phương pháp thực hiện theo qui trình đang được áp dụng tại phòng thí nghiệm

mô – Khoa Thuỷ Sản - Trường Đại Học Cần Thơ. Mẫu sau khi được cố định,
tiến hành:
Cắt tỉa định hướng: cắt các phần phụ không cần thiết sau đó cho vào khuôn
nhựa xử lý mẫu.
Xử lý mẫu: qui trình xử lý mẫu mô (>= 5mm) được cài đặt trong máy xử lý mô
(Program 4) theo các bước:
- Cồn 80
o
trong 60 phút
- Cồn 95
o
trong 60 phút
- Cồn 95
o
trong 60 phút
- Cồn 100
o
trong 1giờ 30 phút
- Cồn 100
o
trong 1giờ 30 phút
- Cồn 100
o
trong 1giờ 30 phút
- Xylen trong 2 giờ
- Xylen trong 2giờ
- Xylen trong 2giờ
- Paraffin + xylen (1:1) trong 2 giờ 30 phút
- Paraffin + sáp ong (1:1) trong 2 giờ
- Paraffin + sáp ong (7:3) trong 2giờ

Đúc khối: sau khi xử lý, chuyển khuôn nhựa chứa mẫu sang máy đúc khối. Mẫu
mô sẽ được đặt trong một khung cố định bằng inox và tiến hành đúc khối bằng
paraffin nóng chảy ở 65
o
C. Định hướng mẫu mô cho đúng, cẩn thận cho paraffin
nóng chảy vào khuôn. Để đảm bảo mẫu được giữ đúng vị trí thì cho khuôn đúc
qua khu vực làm lạnh nhanh để cố định. Khi mẫu mô được tẩm vào trong
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
16
paraffin, đặt khuôn nhựa có ký hiệu mẫu lên trên. Tiếp theo đặt khuôn mẫu qua
ngăn làm lạnh nhanh để paraffin rắn lại, sau đó tách paraffin khỏi khuôn.
Cắt lát mẫu mô: trước khi tiến hành cắt mẫu, phải điều chỉnh độ dày của lát cắt.
Có thể bắt đầu bằng những lát cắt 10-12 µm. Sau khi đã cắt bằng mặt khối mẫu
và đạt đến vị trí mong muốn, điều chỉnh độ dày của lát cắt bằng 4 µm.
Dán lát cắt vào phiến kính: Chuẩn bị một cốc nước ấm (40-50
o
C), lát cắt sẽ
được thả nổi trong cốc này. Sau khi lát cắt giãn thẳng trong cốc nước ấm, nhúng
phiến kính vào ngay bên dưới lát cắt. Cẩn thận đính một đầu lát cắt vào phiến
kính, điều chỉnh lát cắt đúng hướng, từ từ rút phiến kính ra khỏi nước, lát cắt sẽ
được dán vào phiến kính.
Sau khi dán lát cắt, tiến hành làm khô tiêu bản bằng cách sấy khô trên bàn sấy ở
nhiệt độ 45-60
o
C qua đêm (hoặc ít nhất 4 giờ) để lát cắt thẳng ra và khô.
Nhuộm màu: Tiêu bản được nhuộm màu Haematoxylin và Eosin (H&E) gồm
các bước như sau:
- Xylen trong 5 phút (lặp lại 3 lần)
- Cồn 100
o

trong 5 phút (lặp lại 2 lần)
- Cồn 70 trong 2 phút
- Haematoxylin trong 1 phút
- 1% acid-alcohol 10 giây (nhúng 1 lần)
- Rửa nước trong 1 phút
- Potassium trong 5 phút
- Eosin trong 2 phút
- Cồn 95
o
trong 2 phút
- Cồn 100
o
trong 2 phút
- Cồn 100
o
trong 2 phút
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version