Xác định macker Satt 431 liên kết với gen kháng bệnh rỉ sắt (Phakopsora pachyrhizi Sydow) ở giống đậu tương ĐT2000 potx

kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 5/2008
37
Xác định macker Satt 431 liên kết với gen kháng bệnh rỉ sắt (
Phakopsora pachyrhizi

Sydow) ở giống đậu tương ĐT2000
Identification of SSR macker Satt 431 associated with rust resistance (
Phakopsora
pachyrhizi
Sydow) in cultivar DT 2000

Nguyễn Thị Bình
1
, Nguyễn Thị Thanh
Tuyết
1
,
Trần Thị Trường
2

Phạm Tùng Anh
3
, Glen Lee Hartman
3


Abtract

The soybean cultivar DT 2000 was identified to have a consistent and high
resistance level to soybean rust in field evaluations in Vietnam. In order to
utilize this resistance effectively for the marker-assisted selection (MAS) and

molecular breeding, a mapping QTL project was conducted on a F3 population
developed from the cross DT12 by DT 2000, and SSR marker Satt 431 on
linkage group J had an association with the resistance in the form of low area
under disease progress curve (AUPDC) and disease severity values. The finding
of the marker Satt 431 is significant and useful for MAS in breeding programs to
get rust resistant cultivars in Vietnam.

I. Đặt vấn đề
Cây đậu tương là cây trồng có giá trị
quan trọng thứ hai trong các cây họ
đậu. Tuy nhiên sản lượng vẫn còn thấp
so với nhu cầu tiêu dùng. Một trong
những yếu tố hạn chế năng suất là sâu
bệnh hại trong đó có bệnh gỉ sắt. Bệnh
gỉ sắt hại đậu tương do nấm
Phakopsora pachyrhizi Sydow, thuộc
họ Melampsoracea, bộ Uredinales, lớp
Urediniomycetes gây ra. Đây là loài ký
sinh chuyên tính (Green 1984). Nấm gỉ
sắt đậu tương đầu tiên được phát hiện ở
Nhật bản năm 1902. Bệnh lan rộng,
phổ biến ở hầu hết các vùng trồng đậu
trên thế giới. ở đông bán cầu bệnh có
thể làm giảm năng suất trung bình từ
10 – 30 %, có vùng năng suất giảm trên
50% (Bromfield 1980; Green 1984). ở
Việt nam có những vụ bị hại nặng mất
mùa đến 81% (Trung tâm đậu đỗ Định
Trường 1985).
Nghiên cứu tính kháng bệnh gỉ sắt

của tập đoàn đậu tương địa phương và
nhập nội, chúng tôi đã xác định được
một số giống kháng bệnh, trong đó có
giống đậu tương ĐT 2000 . Đây là một
giống có tính kháng bền vững qua

1. Viện Bảo vệ thực vật
2. Viện cây lương thực cây thực phẩm
3. Trư
ờng Đại học tổng hợp Illinois
-
kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 5/2008
38

nhiều vụ đánh giá. Với sự phát triển
mạnh trong một vài năm gần đây về
sinh học phân tử, việc xác định các
marker phân tử có ích phục vụ cho
chọn giống kháng bệnh là con đường
đi ngắn , có hiệu quả cho việc chọn tạo
giống mới kháng bệnh năng suất cao.
Vì vậy cần lập bản đồ gen kháng của
những giống kháng bệnh điển hình
như giống ĐT 2000, trên cơ sở tìm
kiếm các chỉ thị phân tử có liên kết
chặt với gen kháng. Phương pháp
macker phân tử giúp chọn giống đậu
tương kháng bệnh và có tiềm năng
năng suất cao nhanh và hiệu quả, đáp
ứng nhu cầu cấp bách của thực tiễn sản

xuất hiện nay.
II. Vật liệu
và phương pháp nghiên cứu
1.Vật liệu nghiên cứu
Quần thể F2, F3 của cặp lai ĐT12
và ĐT2000.
ADN cuả 154 cây thế hệ F2.
Các hoá chất để chiết tách ADN:
Tris - HCL, EDTA, NaCL, Ethanol
384 macker SSR: Các marker này
được chọn từ 20 nhóm liên kết và cách
nhau một khoảng cách là 20cM.
Các hoá chất và thiết bị phục vụ
nghiên cứu macker đa hình và thu thập
số liệu kiểu gen: máy chạy phản ứng
PCR, máy soi gel bằng tia UV, hoá
chất : agarose, ethidium bromide, Tag
polymerase, dNTPs, PCR buffer,
peptone
2. Phương pháp nghiên cứu
Tạo quần thể lai phương pháp lai hữu
tính.
Tách chiết ADN từ mẫu lá non thu
thập trên cây của giống bố mẹ ĐT 12 và
ĐT 2000, và ADN của các cây F2 theo
phương pháp CTAB (Keim et al, 1988).
Xác định các marker đa hình và thu
thập số liệu kiểu gen bằng phương pháp
công nghệ sinh học và được tiến hành
tại phòng thí nghiệm bệnh cây của khoa

Nông học trường Đại học tổng hợp
Illinois-Hoa kỳ.
Số liệu kiểu hình của quần thể F2
được thu thập bằng cách đánh giá mức
độ nhiễm bệnh và mức độ nhiễm bệnh
tích luỹ theo thời gian (chỉ số
AUDPC) của 12 cây F3 phát triển từ
hạt giống thu thập trên cây F2 tương
ứng. Thí nghiệm được thực hiện ở
vườn thực nghiệm của viện Bảo vệ
thực vật trong vụ Đông năm 2006.
Dùng phần mềm SAS để kiểm tra
tính phân bố chuẩn của số liệu về chỉ
số bệnh tích luỹ theo thời gian
(AUDPC) và mức độ nhiễm bệnh
trung bình của các dòng trong quần thể
lai F3. Sử dụng phần mềm MapQTL
để tìm marker có liên kết chặt với gen
kháng bệnh sử dụng số liệu kiểu gen
và kiểu hình của quần thể F2.
III. kết quả nghiên cứu
1. Kết quả tạo các quần thể lai
Dựa vào kết quả đánh giá tính
kháng bệnh gỉ sắt của tập đoàn đậu
tương địa phương và nhập nội đã tiến
hành từ năm 2000-2005, chúng tôi đã
tiến hành lai tạo được 3 tổ hợp lai giữa
giống ĐT 2000 và 3 giống nhiễm bệnh
kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 5/2008
39

nặng:
ĐT 12 x ĐT2000.
V74 x ĐT2000.
Williams x ĐT2000.
2. Kết quả xác định các marker đa
hình
Chiết tách ADN của 4 giống cây bố
mẹ: ĐT12, V74, Williams 82, ĐT2000
và hai giống đối chứng là PI 230970
và PI 437323, với hàm lượng 5000
g/l/cá thể, tiến hành thí nghiệm cho
bắt cặp lần lượt 384 marker SSR với
ADN của các giống bố mẹ để chọn
macker SSR đa hình. Marker nào cho
kết quả băng ADN của hai giống bố
mẹ lệch nhau thì macker đó là đa hình,
còn macker nào cho kết quả băng
ADN của giống bố mẹ chạy ngang
bằng nhau thì đó là marker không đa
hình (hình 1).

Hình 1. Marker SSR gây đa hình trên ADN của các bố mẹ
Chú thích: Băng ADN của 6 giống đậu tương bố mẹ thu được sau phản ứng
PCR với các marker SSR. Đối với mỗi marker, sáu mẫu ADN được sắp xếp theo
trình tự như sau: V 74, ĐT 2000, ĐT 12, Williams 82, PI 230 970, và PI 437323.
Hàng 1 (trên): Sử dụng 8 marker: trong đó marker 1(Satt 306), 2 (Satt 303), 3
(Satt 319), 4 (Satt 321) cho kết quả không gây đa hình đối với ADN của bố mẹ,
các marker còn lại: 5 (Sat 384), 6 (Sat 385), 7 (Satt 165), và 8 (Satt 276) cho kết
quả gây đa hình đối với ADN của bố mẹ.
Hàng 2 (dưới): Marker 6 (Satt 330) cho kết quả không gây đa hình đối với
ADN của bố mẹ. Các marker còn lại gây đa hình: 1 (Satt 300), 2 (Sat 217), 3
(Sat 271), 4 (Sat 294), 5 (Sat 406), 7 (Sat 409), và 8 (Satt 455).
1

2

3

4

5

6

7

8

1 2 3 4 5 6 7 8
kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 5/2008
40


Kết quả chọn được 140 macker đa
hình với ADN của các bố mẹ nói trên và
85 macker đa hình với ADN của cặp lai
ĐT12 và ĐT2000 thuộc 19 nhóm liên
kết (bảng 1). Trong đó nhiều nhất là các
macker ở nhóm D1b, ít nhất là nhóm
A2 và nhóm K.
Bảng 1. Các marker đa hình đối với cặp lai ĐT12 x ĐT2000 (2006 – 2007)
Nhóm
liên kết
Macker
Nhóm
liên kết
Macker
Nhóm
liên kết
Macker
Sat 217 D1b Sat 227 J Sat 339
Satt276 Satt 546 Sat 350
A1 Satt300 Sat 284 Sat 215
Satt 599 Sat 292 Sat 249
Sat 674

A2 Sat 250 D2 Sat 326 Sat 693
Sat 294 Sat 333
Satt 669 K Sat 293
Sat 406 Sat 325
B1 Sat 409 Satt 384 Sat 441
Sat 149 E Sat 381 Sat 431
Sat 172
Satt 070 Sat 380 L Sat 405
B2 Sat 083 Sat 156
Sat 189 F Satt 335 Sat 373
Sat 120 Sat 523
Sat 238 Sat 133
C1 Satt 294 Sat 154 M Sat 250
Satt 565 Sat 240 Sat 323
Sat 234 Sat 435
Sat 402 Sat 536
C2 Satt 129 G Sat 064 Sat 636
Satt 286 Sat 141
Satt 640 Sat 185 N Sat 091
Sat 358 Sat 660v
Sat 036
D1a Sat 106 H Sat 118 O Sat 242
Sat 160 Sat 158 Sat 274v
kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 5/2008
41
Nhóm
liên kết
Macker
Nhóm
liên kết

Macker
Nhóm
liên kết
Macker
Satt 408 Sat 049 Sat 291
Satt 436 Sat 279 Sat 477
Satt 603 Sat 478
I Sat 105
Sat 089 Sat 155
Sat 096 Sat 170
D1b Sat 139 Sat 614
Sat 189 Sat 700

3. Kết quả bước đầu tìm các
marker có liên kết chặt với gen
kháng bệnh gỉ sắt ở giống đậu tương
ĐT2000
* Thu thập số liệu kiểu gen
Dựa vào kết quả của phần 2 , 85
marker đa hình sẽ được tiến hành phản
ứng PCR với 154 mẫu ADN của các cá
thể trong 1 quần thể F2 thuộc tổ hợp lai
ĐT12 x ĐT2000. Các băng ADN đa
hình ở các cá thể này sẽ được ghi lại
thành số liệu kiểu gen:
- a là ký hiệu đối với cá thể có băng
ADN cao hơn .
- b là ký hiệu đối với cá thể có băng
ADN thấp hơn
- h là ký hiệu đối với cá thể có cả

băng ADN cao và băng ADN thấp.
* Thu thập số liệu kiểu hình
Chỉ số nhiễm bệnh ở giai đoạn sinh
trưởng R6 và chỉ số bệnh tích luỹ theo
thời gian AUDPC của của mỗi dòng
(12 cá thể) trong quần thể F3 là số liệu
kiểu hình đại diện cho mỗi cá thể trong
quần thể F2. Dùng phần mềm SAS để
kiểm tra tính phân bố chuẩn của số
liệu kiểu hình, kết quả được thể hiện
trên hình 2 và hình 3 cho thấy mức độ
nhiễm bệnh (severity) và chỉ số bệnh
tích luỹ theo thời gian (AUDPC) có sự
dao động lớn. Mức độ nhiễm bệnh và
chỉ số AUDPC đều có phân bố chuẩn,
như vậy số liệu của 2 tính trạng này có
sự phân bố bình thường (normal
distribution). Điều này cũng cho thấy
cả mức độ nhiễm bệnh và chỉ số
AUDPC đều là tính trạng số lượng
(qualitative trait) do nhiều QTL quy
định. Mức độ nhiễm bệnh của quần
thể F3 dao động trong khoảng 20 đến
75, chỉ số bệnh trung bình của các
dòng là 38. Chỉ số AUDPC trung bình
của các dòng là 492.8 và dao động
trong khoảng 255 đến 1109

Hình 2. Sự phân bố tính trạng chỉ số
bệnh tích luỹ theo thời gian của các
dòng lai của quần thể F3 (ĐT 12 x ĐT
2000)

Kết quả phân tích số liệu kiểu gen
và kiểu hình bằng phần mềm MapQTL
để tìm marker liên kết với gen kháng

0
5
10
15
20
25
0
0-50
51-100
101-150
151-200
201-250
251-300
301-350
351-400
401-450
451-500
501-550
551-600
601-650
651-700

701-750
751-800
801-850
851-900
901-950
951-1000
1001-1050
1051-1100
1101-1150
1151-1200
Area Under Disease Progress Curve (AUDPC)
Frequency
Chỉ số bệnh tích luỹ theo thời gian(AUDPC )
Tần
suất
kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 5/2008
42

ở giống đậu tương ĐT2000 cho thấy
đối với tính trạng kiểu hình của vết
bệnh TAN/RB (kháng / nhiễm),
marker Satt 619 thuộc nhóm liên kết
A1 đã có chỉ số LOD (chỉ số biểu hiện
mức độ liên kết có ý nghĩa đối với
gene được nghiên cứu) bằng 2.4. Vì
chỉ số LOD phải lớn hơn 2.5 mới cho
thấy marker liên kết có ý nghĩa với
gene quy định tính trạng nghiên cứu.
Tuy nhiên, chúng tôi vẫn nêu kết quả
này vì 2.4 là tương đối cao. Đây sẽ là

tiền đề cho nghiên cứu trong thời gian
tới, tiếp tục tìm kiếm ở các vùng lân
cận nằm quanh marker này để tìm ra
marker SSR cho chỉ số LOD cao hơn,
hoặc dùng các marker khác hiện đại và
chính xác hơn như SNP, nhằm tìm ra
marker liên kết với gen quy định tính
trạng kiểu vết bệnh.



Hình 3. Sự phân bố tính trạng mức độ
nhiễm bệnh trung bình của các dòng
lai F3 (ĐT 12 x ĐT 2000)
Bảng 3. Kết quả tìm các macker có liên kết chặt với gen
kháng bệnh gỉ sắt ở giống đậu tương ĐT2000
Tính trạng Marker SSR
Nhóm
liên kết
LOD
M
ức độ đa dạng của
các cá thể trong
quần thể %
Phản ứng với bệnh (RB,
TAN)
Satt 619 A1 2.4 8.6
Mức độ nhiễm bệnh Satt 431 J 5.7 19.6
Chỉ số bệnh tích luỹ theo
thời gian (AUDPC)

Satt431 J 4.4 14.4

Marker Satt 431 ở nhóm liên kết J
được phát hiện là có liên kết với (một
hoặc nhiều) gene quy định hai tính
trạng là mức độ nhiễm bệnh và
AUDPC với chỉ số LOD lần lượt là
5.7 và 4.4. Đây là 2 tính trạng thể hiện
tính kháng bệnh gỉ sắt ở giống đậu
tương ĐT2000. Như vậy bước đầu có
thể kết luận gen kháng bệnh gỉ sắt ở
giống đậu tương ĐT2000 thuộc nhóm
liên kết J.
Trên thế giới, các nhà khoa học đã
xác định được vị trí của gene kháng
bệnh Rpp1, Rpp2 và Rpp4. Rpp1 nằm
ở nhóm liên kết G và có liên kết chặt
với marker Sct_187 và cách marker
này 0.8 cM (Hyten et al. 2007). Rpp2
cũng đã xác định ở nhóm liên kết J (tài
liệu đang xuất bản). Gene liên kết với
tính trạng mức độ nhiễm bệnh và chỉ
số AUDPC của ĐT 2000 mà chúng tôi
tìm được liên hệ chặt với marker
Satt431 cũng ở nhóm liên kết J. Tuy
nhiên, do khoảng cách giữa hai
marker lớn hơn 20 cM nên đây có thể
là hai gene (QTL) khác nhau.
IV. kết luận và đề nghị
Tần

suất


Ch
ỉ số nhiễm bệnh trung b
ình

kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 5/2008
43
1. Kết luận
1.1. Đã tạo được 24 quần thể lai F2
và 2 quần thể F3 của 3 tổ hợp lai giữa
giống làm mẹ là giống đậu tương
ĐT12, Williams82, V74 nhiễm bệnh
gỉ sắt nặng và giống đậu tương
ĐT2000 kháng bệnh làm vật liệu
nghiên cứu.
1.2. Đã tuyển chọn được 85 macker
SSR gây đa hình ở ADN của giống bố
mẹ để nghiên cứu thu thập số liệu kiểu
gen ở các cá thể F2.
1.3. Xác định được gen kháng bệnh
gỉ sắt ở giống đậu tương ĐT 2000 nằm
ở nhóm liên kết J vì marker Satt 431 có
liên kết chặt với gen kháng thuộc nhóm
liên kết J.
2. Đề nghị
Cần nghiên cứu tìm thêm các
macker khác có liên kết với gen kháng
bệnh ở giống đậu tương ĐT2000 để

phục vụ chọn giống kháng bệnh.

Tài liệu tham khảo
1. Trung tâm Đậu đỗ Định Tường
1983. Bệnh gỉ sắt đậu tương(Phakopsora
pachyrhizi Sydow). Báo cáo khoa học
năm 1983.
2. Frederik, R., Synder,C., Peterson,
G., and Bonde, M. 2002. Polymeraza
chain reaction assays for the detection
and discrimination of the soyabean
rust pathogen P. Pachyrihizi and P.
Meibromiea. Phytopathology 92:217-
227.
3. Hartman, G. L., Miles, M. R., and
Fredrick, R. D., 2005. Breeding for
resistance to soybean rust. Plant Dis.
89:664-666.