nghiên cứu nhân nhanh giống địa hồng hoàng Sapa

Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh
1. Phần 1: Mở đầu
1.1. Đặt vấn đề
Cùng với sự phát triển của nền kinh tế. Nghề trồng hoa cây cảnh đã đem
lại hiệu quả kinh tế cao, góp phần chuyển dịch cơ cấu kinh tế nông nghiệp. Sản
xuất hoa lan mang lại nhiều lợi nhuận bởi giá trị kinh tế và thẩm mỹ của nó. Nó
đã thực sự trở thành sản phẩm chiếm u thế trên thị trờng, thúc đẩy sản xuất kinh
doanh đặc biệt ở các nớc nh Thái Lan, Singapo, Malaixia... ở Thái Lan, kim
ngạch xuất khẩu hoa lan cắt cành năm 1991 đạt 30 triệu USD, Singapore mỗi
năm thu lợi nhuận từ lan cắt cành 10 triệu USD. Kim ngạch xuất khẩu hoa lan
trên thế giới hàng năm đạt 1,8 tỷ USD [13].
Việt Nam là một quốc gia có hệ thống rừng với độ che phủ lớn, khí hậu
nhiệt đới ẩm gió mùa phù hợp nhu cầu sinh thái của các loài lan. Mặt khác nớc
ta nằm trong trung tâm khởi nguồn của nhiều loài lan quý, có tiềm năng to lớn
nguồn cây dại và quỹ gen phong phú. Các vùng nh Sapa, cao nguyên Mộc Châu,
Ba Vì, Đà Lạt... thích hợp cho sự phát triển nhiều loài lan phục vụ công tác
chọn tạo giống cây trồng. Tuy nhiên chúng ta còn gặp những khó khăn bởi thiên
tai diễn biến bất thờng, nạn khai thác rừng tràn lan, nhiều loài lan quý có nguy
cơ tuyệt chủng, hệ sinh thái tài nguyên ngày càng cạn kiệt.
Địa lan hồng hoàng (Cymbidium iridioides) mặc dù số lợng ít nhng với
vẻ đẹp tự nhiên là loài có hoa tự dài nhất, hoa to và bền, màu sắc nâu tím, cánh
môi vàng sẫm, số lợng hoa trên chùm có thể lên tới 15,5 hoa, nó đã thực sự thu
hút ngời tiêu dùng trong và ngoài nớc. Nhng khả năng đậu quả trong tự nhiên
lại rất thấp. Việc nghiên cứu tìm ra nhân giống in - vitro cho loài địa lan này
còn cha đợc nghiên cứu đầy đủ. Để khôi phục phát triển lan bản địa nhằm bảo
tồn nguồn gen phục vụ cho lai tạo lan rừng trong tơng lai, tạo ra nhiều loài đặc
hữu ở Việt Nam là một vấn đề cấp thiết cần nghiên cứu giải quyết. Xuất phát từ
yêu cầu thực tế trên, chúng tôi triển khai nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu nhân
K9 Khoa Công nghệ sinh học
1
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh

nhanh giống địa lan Hồng hoàng Sapa (cymbidium iridioides) bằng phơng
pháp nuôi cấy mô tế bào .
1.2. Mục đích yêu cầu đề tài
1.2.1. Mục đích
Xác định đợc một số khâu kỹ thuật chính trong quy trình nhân giống địa
lan bản địa, trên cơ sở đó xây dựng kỹ thuật trồng nhân giống và công nghệ
nhân nhanh giống địa lan bản địa Hồng hoàng Sapa (Cymbidium iridioides)
1.2.2. Yêu cầu của đề tài
Giai đoạn nhân nhanh in - vitro
- Nghiên cứu của việc bổ sung khoai tây vào môi trờng đến sự nảy mầm
của hạt.
- Nghiên cứu nhân nhanh bằng phơng pháp cắt lát mỏng.
- Nghiên cứu ảnh hởng của các chất điều tiết sinh trởng.
- Nghiên cứu ảnh hởng của nớc dừa đến chất lợng của chồi
Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh
- Nghiên cứu ảnh hởng của than hoạt tính đến quá trình ra rễ.
- Nghiên cứu ảnh hởng của - NAA đến quá trình ra rễ.
Giai đoạn sau nuôi cấy in vitro
- Nghiên cứu ảnh hởng của xử lý giá thể của cây ở giai đoạn vờn ơm.
- Nghiên cứu ảnh hởng của biện pháp che tối khi cây đa ra vờn ơm.
- Nghiên cứu ảnh hởng của một số dinh dỡng đến sự sinh trởng và phát triển
của cây ở giai đoạn vờn ơm.
K9 Khoa Công nghệ sinh học
2
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh
2. Phần 2. Tổng quan tài liệu
2.1. Sơ lợc về cây hoa lan
2.1.1. Nguồn gốc, vị trí trong hệ thống phân loại thực vật
Cây hoa lan orchidaceae thuộc họ phong lan orchidaceae, bộ lan orchidales,
lớp một lá mầm Monocotyledoneae. Cây lan đợc biết đến đầu tiên ở phơng

Đông, theo Bretchacider thì từ đời vua Thần Nông (2800) trớc công nguyên, lan
rừng này đợc dùng làm thuốc chữa bệnh. Sau đó cùng với vẻ đẹp và tác dụng
chữa bệnh. Robut Bron (1773 1858) là ngời đầu tiên đã phân biệt rõ ràng
giữa họ lan và các họ khác [1, 2, 3, 4, 9, 10, 23]. Joanlind (1979 1985) là ng-
ời đặt nền tảng hiện đại cho môn học về lan. Năm 1836, ông công bố sắp xếp
các tông họ lan (A tabuler view of the Tribes of orchidalr) tên của họ lan do ông
đa ra đựơc dùng cho đến ngày nay (Trần Hợp 1990) [10]. Họ lan có mặt ở
hầu hết các vùng trên trái đất, nhng có khoảng 4/5 tập trung ở những vùng nhiệt
đới [20], nó đứng thứ hai sau họ cúc, khoảng 15000-35000 loài, phân bố từ 68
độ vĩ bắc

cho đến 56 vĩ độ nam. Tuy nhiên, phân bố chính của họ này là ở trên
các vĩ độ nhiệt đới, đặc biệt là châu Mỹ và Đông Nam á (Mau RFL 1983)
[23]. Cây lan biết đến đầu tiên ở Trung Hoa là kiến lan, đó là Cymbidium
ensifonymum là một loài bán địa lan. ở châu Âu bắt đầu để ý đến phong lan từ
thế kỷ 18 sau Trung Quốc đến hàng chục thế kỷ và cũng nhờ các thuỷ thủ thời
bấy giờ mà phong lan đã đi khắp các miền của địa cầu, lúc đầu là Vanny sau đó
đến Bạch cập, Hạc đính rồi kiến lan, lan chính thức gia nhập vào ngành hoa
cây cảnh trên thế giới 400 năm nay.
ở Việt Nam, có lẽ ngời đầu tiên khảo sát về lan ở Việt Nam là Gioalas
Noureiro nhà truyền giáo Bồ Đào nha, ông đã mô tả cây lan ở Việt Nam lần
đầu tiên vào năm 1789 trong cuốn Flora cochin chinensis gọi tên các cây lan
trong cuộc hành trình đến Nam phần Việt Nam là aerides, phaius và
sarcopodium mà đã đợc Ben tham và Hooker ghi lại trong cuốn Genera
K9 Khoa Công nghệ sinh học
3
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh
plante rum (1862 1883) (Nguyễn Hữu Huy, Phan Ngọc Cấp 1995) [11],
chỉ sau khi ngời Pháp đến Việt Nam thì mới có những công trình nghiên cứu đ-
ợc công bố đáng kể là F. Gagne Pain và A. Gui Ilaumin mô tả 70 chi gồm 101

loài cho cả 3 nớc Đông Dơng trong bộ thực vật Đông Dơng chí (Flora
Genera Indochine) do H. Leconte chủ biên xuất bản từ những năm 1932
1934.
2.1.2. Đặc tính thực vật học của địa lan
Lan cũng giống nh các loại thực vật khác, có 6 bộ phận: rễ, thân, lá, hoa,
quả, hạt. theo tác giả Trần Hợp (1990) [10] cây lan đợc mô tả nh sau:
2.1.2.1. Rễ lan
Nhìn chung, họ lan bao gồm các cây thân thảo, sống lâu năm, sống ở đất,
vách đá vôi sống phụ, sống hoại. Đối với địa lan khi sống ở đất, chúng thờng có
củ giả, rễ mập, xum xuê phụ (bì sinh) rễ bò dài hay ngắn. Chúng phát triển thân
rễ nạc dài, ngắn mập hay mảnh mai (tuỳ thuộc vào từng loài) đa cơ thể bò đi xa
hay chụm lại thành các bụi dày. Hệ rễ cũng nhỏ, đan thành búi, ngợc lại ở các
loài phong lan có kích thớc lớn hay trung bình, hệ rễ khí sinh phát triển rất
phong phú, mọc rất dài và mập, khoẻ, vừa giữ cho cơ thể khỏi bị gió làm lung
lay và làm nhiệm vụ hấp thu dinh dỡng. ở một số loài lan có thân, lá kém phát
triển hệ rễ phát triển dày đặc và kiêm nhiệm luôn cả vai trò quang hợp. Rễ có
dạng dẹt, bò rất dài, màu xanh nh lá. Đặc biệt các loài phong lan sống hoại bộ
rễ có hình dạng, cấu trúc khá độc đáo, có thể dài đến vài chục mét, nó có khảo
năng leo bò cao.
2.1.2.2. Thân cây
Thân rất ngắn hay kéo dài, đôi khi phân nhánh, mang lá hay không mang
lá. Theo M.E.Pfizer (1882) [10] phong lan có 2 loại thân, mà đa số thuộc loại
sinh trởng hợp trụ (nhóm không thân). Thân này gồm hệ thống của nhiều nhánh
lâu năm, với bộ phận nằm ngang, bò dải trên giá thể hay ẩn sâu trong lòng đất.
Ngợc lại, rất ít khi gặp các loài phong lan sinh trởng đơn trục (nhóm có thân),
K9 Khoa Công nghệ sinh học
4
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh
cơ thể khó có khả năng duy trì đợc t thế thẳng đứng, nó phải nhờ đến các rễ
chống đỡ để vơn cao, ở các loài phong lan sống phụ, có nhiều đoạn phình lớn,

tạo thành củ giả. Đó là bộ phận dự trữ nớc và chất dinh dỡng để nuôi cây trong
hoàn cảnh khô hạn khi sống bán trên cao. Đa số củ giả đều có màu xanh bóng,
nên cùng với lá nó cũng làm nhiệm vụ quang hợp.
2.1.2.3. Lá lan
Có thể phân lá lan thành 3 loại: lá đứng, lá nửa đứng, lá cong rũ. Hầu hết
các loại địa lan đều là cây tự dỡng, là xơng chế tạo chất dinh dỡng bằng
quang hợp, do đó nó phát triển rất đầy đủ hệ thống lá. Lá mọc đơn độc, hoặc
xếp dày đặc ở gốc, hay xếp cách đề đặn trên thân, trên củ giả. Hình dáng lá thay
đổi từ loại lá mọng nớc, nạc, dài hình kim, hình trụ dài, tiết diện tròn hay có
rãnh, đến loại lá hình phiến mỏng, dài, những lá dới sát gốc thờng tiêu giảm đi
chỉ còn những bẹ không có phiến lá hay giảm hẳn thành các vảy. Các loài địa
lan có số lá trên nhánh biến động rất lớn: lá trên nhánh ít phải kể đến Đông lan
(2,6 lá/ nhánh). trong khi đó Bạc lan (Cerythrostylum) có số lá/ nhánh rất lớn
(9,1 lá/ nhánh). Độ dày và độ rộng của lá cũng rất khác nhau, lá dài phải kể đến
Bích ngọc (Cymbidium dayamum): 1cm. Thanh ngọc (Cymbidiumensifolium)
40- 80 cm.
Về màu sắc, phiến lá thờng có màu xanh bóng nh các chi Lan kiếm
(Cymbidium. SW), chi lan Bầu rợu (Calanthe R.Br), có loài có màu xanh đậm
nh Hạc Đính Vàng (P. flavum).
2.1.2.4. Hoa lan
Cấu tạo của hoa lan phong phú và đa dạng. Ta có thể gặp nhiều loài mà
mỗi mùa chỉ có một đoá hoa nở hoặc có nhiều cụm hoa mà mỗi cụm chỉ đơm
một bông. Mặc dù muôn hình muôn vẻ nhng nếu ta quan sát hoa của bất kỳ cây
lan nào cũng có một tổ chức đồng nhất của hoa mẫu 3 là một kiểu hoa đặc trng
của lớp một lá mầm, nhng đã biến đổi rất nhiều để hoa có đối xứng qua một mặt
phẳng.
K9 Khoa Công nghệ sinh học
5
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh
Mầm hoa của địa lan đợc hình thành từ đốt thứ 3, thứ 4 ở gần đáy của

các giả hành, hoa đứng thẳng hay cong thờng dài và mang nhiều hoa, chồi hoa
thờng xuất hiện bên dới giả hành, trong các nách lá, tách các bẹ già đâm ra bên
ngoài. Thông thờng, mỗi giả hành chỉ cho hoa một lần. Chồi hoa thờng xuất
hiện đồng thời với chồi thân, nhng chồi hoa no tròn hơn, còn chồi thân hơi dẹp.
Các lá đầu tiên ở chồi thân mọc đâm ra hai phía hình đuôi cá, còn ở chồi hoa
các lá bao hoa luôn ôm chặt quanh phát hoa.
Cọng phát hoa không phân nhánh, dựng đứng hay buông thõng. Chiều
dài của phát hoa từ 10 cm đến hơn 100cm. Cành hoa mang từ vài đến vài chục
búp hoa xếp luân phiên nhau theo đờng xoắn ốc. Búp hoa khi đã đủ lớn bắt đầu
dang xa khỏi cọng hoa. Thoạt nhìn hoa Cymbidium có 5 cánh gần giống nhau,
thực ra chỉ có 2 cánh hoa ở bên trong, còn lại là 3 lá đài ở bên ngoài, có cấu trúc
và màu sắc giống cánh hoa. Cánh hoa thứ 3 chuyên hoá thành cánh môi, màu
sắc sắc sỡ hơn xẻ thành 3 thuỳ tạo ra dạng nửa hình ống. Hai thuỳ bên ôm lấy
trụ, thuỳ thứ 3 có dạng bầu hay nhọn tạo thành hình đáy thuyền, làm chỗ đậu
cho côn trùng khi đến đậu hút mật và thụ phấn cho hoa. Giữa 2 cánh môi có 2
gờ dọc song song màu vàng.Tận cùng bên trong có đĩa mật và đôi khi có tuyến
tiết mồ hôi. Hoa Cymbidium lỡng tính nhị đực và nhị cái cùng gắn chung trên
một trụ nhị, nhuỵ hình bán trụ hơi cong về phía trớc. Nhị ở trên cùng mang 2
khối phấn màu vàng có gót dính nh keo. Khối phấn đợc đậy bởi một nắp màu
trắng ngà rễ mở dời chứa khối phấn của trục hợp nhuỵ cách với muỗm nhuỵ bởi
một cái gờ nổi lên. Cấu trúc này trong tự nhiên hoa Cymbidium chỉ thụ phấn đ-
ợc nhờ côn trùng. Sau khi hoa thụ phấn, hoa xoay dần về vị trí cũ, bầu noãn
phình to lên tạo thành quả.
2.1.2.5. Quả lan
Quả của cây địa lan thuộc loại quả nang, nở ra theo 3-6 đờng nứt dọc, có
dạng từ quả dài (Vanilla) đến dạng hình trụ ngắn phình ở giữa. Khi chín quả nở
ra và mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phần đỉnh và phía gốc. ở một số loài quả
K9 Khoa Công nghệ sinh học
6
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh

chín nở theo 1-2 khía dọc, thậm chí không nứt ra mà hạt chỉ ra khỏi vỏ quả khi
vỏ này bị mục nát.
2.1.2.6. Hạt lan
Hạt lan rất nhiều nhỏ li ti kích thớc hạt vô cùng nhỏ với khối lợng toàn bộ
hạt trong một quả bằng 1/10-1/1000 mg trong đó không khí chiếm 76-96% thể
tích của quả. Do đó hạt lan hầu nh không có khối lợng. Hạt chỉ cấu tạo từ một
khối cha phân hoá, trên một mạng lới nhỏ xốp chứa đầy không khí. Phải trải
qua 2-18 tháng hạt mới chín. Phần lớn hạt thờng chết vì khó gặp nấm cộng sinh
cần thiết để nảy mần. Do đó hạt nhiều có thể theo gió bay rất xa, nhng hạt nảy
mần thành cây lại hiếm. Chỉ ở trong những khu rừng già ẩm ớt, vùng nhiệt đới
mới đủ điều kiện cho hạt lan nảy mầm.
2.1.3. Đặc điểm thực vật của địa lan Hồng hoàng Sapa
Địa lan Hồng hoàng (Hoàng lan) tên khoa học là Cymbidium iridioides,
có giả hình tròn dài, lá song đính, phiến hình gơm, dài 30-90 cm , rộng 2-3cm,
mầu xanh đậm. Chùm dài hơn lá, hoa to rộng đến 10 cm, màu lục vàng hay
vàng, môi thuỳ cạnh chóp nhọn, thuỳ giữa có đốm sậm hay vàng, bìa rất dúm có
lông. Nang dài từ 8-10cm [9].
Lá dài gần 70 cm hoa nở vào tháng 4, tháng 6, số lá trung bình / nhánh là
5,1. Loại địa lan này chỉ đẻ một lần/ năm, đẻ hai đợt mầm trong năm, tháng 3- 4
và tháng 9-10, những mầm đẻ vào tháng 9-10 thờng là mầm sinh trởng phát
triển kém, còi cọc, những mầm này khó có khả năng cho hoa. Tốc độ sinh trởng
về chiều cao của địa lan chậm, nhanh nhất là tháng thứ 6 mới đạt chiều cao tối
đa [14].
2.1.4. Yêu cầu về ngoại cảnh của cây lan
Để sinh trởng và phát triển tốt chúng vẫn cần có các yếu tố ngoại cảnh
nh nơi xuất xứ. Muốn nuôi dỡng tốt hoa lan trớc tiên chúng ta cần tìm hiểu đặc
tính sinh trởng của nó.
K9 Khoa Công nghệ sinh học
7
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh

2.1.4.1. Nhiệt độ
Yêu cầu nhiệt độ của các loài lan do nguồn gốc phát sinh và sự phân bố
tự nhiên trong quá trính sinh trởng, phát triển đã quy thành các nhóm lan. Vì
vậy căn cứ vào điều kiện khí hậu những vùng xuất xứ các loài lan trên thế giới
đợc chia thành 3 nhóm chính là nhóm lan ôn đới, nhóm lan cận nhiệt đới và
nhóm lan nhiệt đới. Trong đó giống địa lan (Cymbidium) đợc xếp vào nhóm lan
ôn đới, chúng đợc phân bố từ vĩ độ 28
0
-40
0
[19].
Nhìn chung, nhiệt độ ảnh hởng đến cả quá trình sinh trởng của cây, nhng
ở giai đoạn phát dục của mầm hoa thì nhiệt độ ảnh hởng là lớn nhất. Thời kỳ
phát dục khác nhau thì chịu ảnh hởng của nhiệt độ là khác nhau, trong tháng 7-
tháng 8 ở các nớc nhiệt đới có nhiệt độ cao thì mầm hoa sẽ đợc hình thành vào
buổi tối, nhiệt độ dao động quanh 15
0
C rất thuận lợi cho quá trình phát dục
mầm hoa, nhng nhiệt độ lớn hơn 20
0
C thì hoa nở chậm. Những mầm hoa hình
thành sau tháng 10 gặp nhiệt độ ban đêm cao thi nở hoa càng nhanh. Khi hình
thành mầm hoa, cây gặp nhiệt độ lớn hơn 30
0
C trong thời gian dài sẽ dẫn đến
khô héo, rụng hoa.
2.1.4.2. ẩm độ
Độ ẩm cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hởng tới cây lan. Trớc hết, về
nguyên tắc, chúng ta cần phân biệt ba loại ẩm độ:
- Độ ẩm của vùng: Là độ ẩm của khu vực rộng lớn, nơi mà ta thiết lập

vờn lan. ẩm độ này do điều kiện địa lý, địa hình nói chung quy định.
- Độ ẩm của vờn: Là ẩm độ của chính vờn lan, độ ẩm này có thể cải
tạo theo ý muốn của ngời trồng lan.
- Độ ẩm trong chậu trồng lan: Gọi là ẩm độ cục bộ, do cấu tạo của giá
thể, thể tích chậu, số lần tới quyết định. ẩm độ này phụ thuộc hoàn toàn
vào kỹ thuật của ngời trồng lan. Đối với Địa lan thì ẩm độ này trong
khoảng 50 - 70% [7].
K9 Khoa Công nghệ sinh học
8
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh
2.1.4.3. ánh sáng
Nh chúng ta đều biết, sự phát triển của cây tăng theo tỷ lệ với cờng độ
ánh sáng và thời gian chiếu sáng đến mức độ nhất định và khi vợt mức độ đó nó
sẽ ngừng tăng trởng. Do đó cần đặc biệt chú ý tới ánh sáng cho tất cả các loại
cây lan. Cần thiết phải làm giàn che nắng cho cây, tùy thuộc vào từng loài mà
có chế độ che nắng cho thích hợp. Tuyệt đối không để cho ánh nắng trực tiếp
chiếu vào cây, kể cả những tia nắng xiên. Khi chuyển chậu, thì phải chuyển
sang chỗ có ánh nắng nhiều hơn, nhng không quá 60% độ nắng. Tận dụng ánh
nắng buổi sáng, hạn chế ánh nắng buổi chiều. Nếu cần, che hoàn toàn ánh nắng
buổi tra, từ 12 giờ đến 14-15 giờ vào những ngày quá nắng. Đặc biệt đối với
những cây lan dới 2 tháng thì việc điều chỉnh cờng độ và thời gian chiếu sáng
trong ngày phải thực hiện chu đáo và linh hoạt phải cho chúng làm quen dần với
ánh nắng ngày càng tăng đến mức chúng có thể chịu đựng nổi [22].
2.1.4.4. Dinh dỡng
ở các nớc công nghiệp trồng lan phát triển, ngời ta dùng nhiều loại phân
bón, trong đó ngoài 3 chất chủ yếu là N (đạm), P (lân) và K (kali), ngời ta còn
bổ sung các nguyên tố đa lợng, vi lợng thích hợp với lan.
Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu vấn đề dinh dỡng cho lan rất kỹ. Họ
khuyên nên bón nhiều N khi cây phát triển và khi kết thúc thời kỳ phát triển thì
nên bón nhiều P và K. Bón nhiều lần thật loãng bao giờ cũng tốt hơn bón ít lần

đậm đặc.
Đối với cây lan từ trong ống nghiệm tới khi ra hoa thì mỗi thời kỳ phát
triển chúng cần có một chế độ dinh dỡng khác nhau đợc các nhà khoa học chia
ra làm các giai đoạn:
- Lan con từ trong ống nghiệm đến 3 tháng tuổi: Thời kỳ này đợc dùng chủ
yếu là đạm, lân và kali có dùng nhng rất loãng.
- Lan từ 4-10 tháng tuổi: Tỷ lệ phân bón (N:P:K = 3:1:1).
- Lan từ 10 tháng tuổi đến 24 tháng tuổi. Tỷ lệ phân bón (N:P:K = 2:2:2).
K9 Khoa Công nghệ sinh học
9
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh
- Lan từ 24 tháng tuổi cho tới khi ra hoa. Tỷ lệ phân bón (N:P:K = 1:2:3).
Ngoài ra, chế độ dinh dỡng còn tùy thuộc vào các yếu tố khác. Nếu ánh
sáng đầy đủ, cây đợc quang hợp tốt thì cần nhiều chất dinh dỡng hơn chỗ thiếu
ánh sáng. Thông thờng, ngời ta xem màu sắc của lá và sự phát triển của bộ rễ và
thân cây để quyết định nên tăng hay giảm liều lợng sử dụng N : P : K.
Về phân hữu cơ, các tác giả nớc ngoài giới thiệu rất nhiều các loại khác
nhau, kể cả máu khô, ốc ngâm, bột xơng. Có ngời dùng phân bò, phân chim bồ
câu ngâm nớc và vài ngày sau, khi chu trình lên men sắp kết thúc thì lấy ra lọc
kỹ và pha loãng với nớc, cho thêm P và K với tỉ lệ 1/1000 (1g cho hoà tan trong
1 lít nớc) và tới cho lan. Ngoài ra có thể dùng phân chim cút, nhng với tỉ lệ bằng
1/3 phân bò vì tỉ lệ đạm trong phân chim cút cao hơn nhiều.
Đó là những loại phân hữu cơ đối với lan đã trởng thành. Còn đối với lan
con, khi dùng phải thận trọng hơn nhiều, vì lá và rễ của lan con còn quá yếu.
Rất dễ sinh bệnh. Nếu dùng phải lọc kỹ (bằng cát) và đợc diệt trùng bằng hóa
chất.
Cũng nh khi dùng phân vô cơ, ta cần tới hết sức loãng, cây dễ tiếp thu,
đồng thời phòng bệnh cả cho cây [20].
Khi có bệnh, phải chữa cho cây khỏi bệnh rồi mới tiếp tục bón phân.
2.1.4.5. Độ thông gió

Lan rất sợ các luồng gió chớng. Nếu ở chỗ thờng xuyên có những luồng
gió (thí dụ gió mùa Đông Bắc ở miền Bắc, gió Lào ở Nghệ Tĩnh, Thanh Hóa),
lan sẽ chết rất nhanh. Nhng nếu ở nơi không khí tù hãm, ngột ngạt, lan cũng
không lớn và không trổ bông đợc.
ở bất cứ lứa tuổi nào, lan cũng cần đợc thoáng gió. Điều này cũng giải
thích là ở trong rừng ít khi ngời ta tìm thấy lan ở dới thấp (trừ địa lan ở xứ lạnh).
Lan thờng sống cheo leo trên các vách đá, hoặc bám chót vót trên các ngọn cây
cao. Độ thoáng gió là một trong những đặc tính quan trọng về sinh thái của cây
lan [10].
K9 Khoa Công nghệ sinh học
10
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh
2.2. Tình hình sản xuất hoa lan trong và ngoài nớc
2.2.1. Tình hình sản xuất hoa trên thế giới
Hiện nay sản xuất hoa trên thế giới đang phát triển một cách mạnh mẽ và
đã trở thành một ngành thơng mại có lợi nhuận cao. Sản xuất hoa đã mang lại
lợi ích to lớn cho nền kinh tế các nớc trồng và xuất khẩu hoa. Diện tích trồng
hoa trên thế giới ngày càng đợc mở rộng và không ngừng tăng lên. Năm 1989
tổng giá trị về hoa, cây cảnh thế giới đạt 1,8 tỷ đô la tới năm 1996 giá trị sản l-
ợng đạt 20 tỷ đô la trong đó Nhật 3,731 tỷ, Hà Lan 3,558 tỷ, Mỹ 3,720 tỷ (theo
trung tâm xuất khẩu của Liên hợp quốc ITC) [12].
Các nớc có ngành sản xuất và kinh doanh xuất khẩu hoa Lan đã và đang
chiếm lĩnh thị trờng là Thái Lan, Nhật Bản, Indoniaxia, Hà Lan, Hungary, Anh,
Bungary, Costarica, Đan Mạch, Bỉ, Italia, Pháp. Có nhiều tạp chí về hoa lan đợc
xuất bản, nhiều cuộc hội thảo về hoa đợc tổ chức. Trớc đây việc nuôi trồng và
xuất khẩu chủ yếu là lan rừng nên gây nguy cơ khoảng 13 loài tuyệt chủng.
Ngày nay việc trồng lan đã trở thành quy mô công nghiệp, ngời ta xuất khẩu lan
đạt tới số lợng hàng trăm ngàn giò, hàng vạn cành lan trong một năm đáp ứng
nhu cầu ngày càng cao của thị trờng.
Các nớc Châu á với u thế về tự nhiên cũng đang phát triển mạnh mẽ

ngành trồng hoa mà trong đó trồng hoa lan là một ngành đợc chú ý phát triển.
Có 15 nớc xuất khẩu hoa lan, đáng chú ý là: Hồng Kông, ấn Độ, Indonesia,
Thái Lan với sản lợng hoa cắt xuất khẩu đạt 68,2 triệu đô la, chủ yếu tiêu thụ
trong nớc có khoảng 50% dùng xuất khẩu. Các nớc ở Châu Phi, Châu Đại Dơng
cũng đang chú ý phát triển ngành kinh tế có nhiều lợi nhuận này [13].
2.2.2 Tình hình sản xuất hoa lan ở Việt Nam
Việt Nam với điều kiện khí hậu nóng ẩm rất thuận lợi cho việc phát triển
nghề trồng hoa, cây cảnh trở thành một ngành công nghiệp. Tuy nhiên do cha đ-
ợc đầu t thích đáng nên ngành trồng hoa nói chung và ngành trồng lan nói riêng
vẫn cha phát triển đúng với tiềm năng của nó.
K9 Khoa Công nghệ sinh học
11
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh
Từ năm 1980 Việt Nam đã xuất khẩu lan sang Liên Xô, Tiệp Khắc. Năm
1987 ở thành phố Hồ Chí Minh có các vờn lan quốc doanh và t nhân cùng với
sự ra đời của nhiều hội hoa lan, cây cảnh. Nhiều cơ sở nghiên cứu cũng ra đời.
Theo số liệu điều tra bớc đầu tính đến năm 1986 trong thành phố có
khoảng 15 gia đình có vờn lan với số lợng từ 1000-7000 chậu. Đến năm 1987 ở
thành phố Hồ Chí Minh đã có vờn Quốc doanh và t nhân: Vờn lan T78, vờn lan
Hàng không dân dụng. Kể từ năm 1980 năm nào thành phố cũng tổ chức hội
hoa xuân... Mới đây thành phố Hồ Chí Minh dự kiến giai đoạn 2005-2006 thực
hiện đầu t 20 ha nuôi trồng hoa lan và 20 ha trồng cây kiểng( dự án đầu t và
phát triển hoa, cây kiểng tại thành phố Hồ Chí Minh tháng 7 năm 2005) [6].
Tại Viện Sinh học Nông nghiệp thuộc Đại học Nông nghiệp I Hà nội đã
cho ra hàng vạn cấy giống hoa lan có giá trị kinh tế nh: Hồ điệp
(Phalaenopsis), cát lan(Cattleya), lan thái(Dendrobium)... Ngoài ra viện còn
làm cố vấn kỹ thuật, chuyển giao quy trình nuôi trồng một số giống lan có hiệu
quả kinh tế ở các tỉnh nh Hải Phòng, Bắc Giang, Lạng Sơn...
Hiện nay sở công nghệ và môi trờng của tất cả các tỉnh thành phố phía
Bắc đều có phòng nuôi cấy mô tế bào, chức năng chính là để phục vụ cho

nghiên cứu khoa học, một phần sản xuất giống cung cấp cho thị trờng trong đó
có hoa lan. Ví dụ, Hải Phòng xây dựng khu nông nghiệp công nghệ cao (xã Mỹ
Đức, huyện An Lão) với mục tiêu cụ thể: Sản xuất 300.000 cây giống hoa lan
bằng công nghệ của Viện Công nghệ Sinh học - Trờng Đại học Nông nghiêp 1
và của Hiệp hội hoa lan Thái Lan (xây dựng khu nông- lâm nghiệp công nghệ
cao tại trung tâm phát triển lâm nghiệp Hải Phòng năm 2003[7].
Một số nơi ở Việt Nam nh thành phố Hồ Chí Minh, Hà nội (có nhiệt độ
trung bình 23,5
0
C tổng lợng ma 1674 mm nhiệt độ tối cao 42,8
0
C. Tháng trung
bình lạnh nhất 13,7
0
C, biên độ nhiệt độ ngày 6,1
0
C) thích hợp phát triển các loài
lan nhiệt đới, Sapa (nằm ở độ cao 1570 m nhiệt độ trung bình 15,2
0
C lợng ma
2833mm rải đều trong năm. Nhiệt độ thấp nhất 5,9
0
C, cao nhất 29,8
0
C. Biên độ
nhiệt độ ngày đêm trung bình 6,2
0
C), Đà Lạt (nằm ở độ cao 1513 m, nhiệt độ
K9 Khoa Công nghệ sinh học
12

Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh
trung bình 18,2
0
C lợng ma1865 mm. Nhiệt độ cao nhất 31,5
0
C, nhiệt độ trung
bình tháng thấp nhất 24,6
0
C, biên độ ngày trung bình trong năm 8,9
0
C) [21] rất
hấp dẫn cho phát triển các loài lan ôn đới.
Nớc ta có các vùng tiểu khí hậu rất thuận lợi cho phát triển cả 3 loại lan:
nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới. Đây là một điều kiện rất tốt cho phát triển
nghề trồng lan.
2.3. Các nghiên cứu về nhân giống địa lan bằng phơng pháp nuôi cấy mô tế
bào
2.3.1. Cơ sở khoa học của biện pháp nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô
tế bào
Tế bào là đơn vị sinh lý của sinh vật. Vì vậy ở các sinh vật đơn bào sống
độc lập, tất cả các chức năng đều tập trung ở trong tế bào duy nhất ấy. Tế bào
ấy có tính toàn năng, nghĩa là có khả năng sống và phát triển. Đối với một cây
nguyên vẹn (một sinh vật đa bào) thì nguồn gốc của nó cũng khởi đầu từ một tế
bào duy nhất, đó là hợp tử hay trứng. Mặc dù phát triển từ một hợp tử, nhng khi
nó phân chia và chuyên hoá thành mô, các cơ quan thì các tế bào ấy lại trở lên
khác nhau về hình dạng và chức vụ. Trong trờng hợp này các tế bào đó không
biểu hiện đợc tính toàn năng vì chúng chịu ảnh hởng từ các tế bào khác. Nếu
ảnh hởng ấy bị vô hiệu hoá thì mỗi tế bào lại hoạt động nh một tế bào non trẻ,
nghĩa là phân chia, tăng trởng tạo ra cơ quan và phát triển thành cây hoàn chỉnh.
Nh vậy, khi tách tế bào ra khỏi cơ thể một sinh vật đa bào thì tế bào ấy có khả

năng sinh sống và sinh sản hay không? Để trả lời câu hỏi này, nhiều nhà khoa
học đã tách tế bào ra khỏi cơ thể đa bào và nuôi trong môi trờng dinh dỡng nhân
tạo. Phơng pháp nuôi cấy mô tế bào bắt đầu từ phơng pháp nuôi cấy tế bào này.
Hiện nay phơng pháp nhân giống này đã đợc áp dụng nhiều trên loại cây trồng
trong đó có hoa lan. Đây là phơng pháp duy nhất hiện nay có thể nhân giống lan
trên quy mô công nghiệp, các cây con đợc sản xuất hoàn toàn giống nhau từ
một cây bố, mẹ ban đầu [24, 25, 26, 27, 28].
K9 Khoa Công nghệ sinh học
13
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh
2.3.2. Một số nghiên cứu tiêu biểu
Geroges Morel(1956) đã nghiên cứu thành công phơng pháp nuôi cấy mô
tế bào của cây lan. Phơng pháp này để công bố trên tạp chí A. O. S (American
Orchid Society, 1960) và giống lan đầu tiên Morel áp dụng là Cymbidium. Năm
1963 Donol E. Vimbex cũng nghiên cứu thành công trên giống Cymbidium nh-
ng lại nuôi cấy mô phân sinh đỉnh trên môi trờng lỏng.
Năm 1996, Yonco Sagaw và T .Shoji nuôi cấy mô phân sinh đỉnh và mô
phân sinh bên của Cymbidium trên cùng một lúc hai môi trờng lỏng và đặc. Nh
vậy, giống địa lan (Cymbidium) là nền tảng cho việc nhân giống bằng nuôi cấy
mô tế bào thực vật. Khả năng ứng dụng rễ thấy nhất của phơng pháp nuôi cấy
mô tế bào thực vật là nhân nhanh giống và phục tráng giống trong cây trồng.
Morel (1960) đã nhận thấy Meristem của một loài địa lan có rất ít hoặc không
có virus. Đồng thời ông cũng thành công trong kỹ thuật tạo protocorm, khi nuôi
cấy Meristem, các protocorm đợc cắt và nuôi cấy tiếp tục sẽ thu đợc các
protocorm mới. Nếu trong điều kiện nhất định, nó sẽ hình thành các cây địa lan
con mới và là những cây sạch virus.
ở nớc ta, năm 1999 có Nguyễn Xuân Linh, Phạm Thị Liên, Phùng Thị
Thanh Thuỷ, Lê Đức Thảo nghiên cứu về loài Hạc Đĩnh Nâu. Năm 2001 Phạm
Thị Liên đã nghiên cứu đánh giá và phát triển một số giống địa lan miền Bắc.
Hiện nay đã có nhiều Viện nghiên cứu, Sở Khoa học Công nghệ của nhiều tỉnh

nh: Lạng Sơn, Nghệ An, Nam Định đã xây dựng các phòng nuôi cấy mô. Tại
các Viện nghiên cứu hình thành những quy trinh nhân giống hoàn chỉnh với
những cây trồng cụ thể để chuyển giao cho các đơn vị, địa phơng, đồng thời
tham gia sản xuất lợng cây giống nhất định phục vụ kịp thời cho sản xuất. Tại
Viện Sinh học Nông nghiệp - Đại học Nông nghiệp1 Hà Nội là nơi nghiên cứu
đầu tiên về hoa lan. Năm 2005, Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Nga Xây
dựng quy trình nhân nhanh một số giống địa lan bản địa bằng công nghệ nuôi
cấy mô tế bào, Hoàng Thị Nga, Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh và
K9 Khoa Công nghệ sinh học
14
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh
cộng sự, Thuyết minh dự án Hoàn thiện công nghệ và sản xuất một số giống
hoa có giá trị kinh tế, chất lợng cao( Hoa đồng tiền, địa lan ) bằng công nghệ
nuôi cấy mô
2.4. Phơng pháp cắt lớp mỏng tế bào (Thin cell layers - TCL)
2.4.1. Khái niệm:
Hệ thống lớp mỏng tế bào đợc hình thành từ một hoặc một số lớp tế bào
là hệ thống thực nghiệm đợc giản hoá, trong đó sự tơng tác chèn ép giữa các cơ
quan cũng nh sự tơng tác qua lại giữa các mô, tế bào đợc duy trì ở mức tối
thiểu.
2.4.2. Một số nghiên cứu về phơng pháp cắt lớp mỏng tế bào
Phơng pháp lớp mỏng tế bào lần đầu tiên đợc mô tả trên cây thuốc lá
[nicotina tabacum] của tác giả Trần Thanh Vân (1973,1981), nghiên cứu về sự
phát sinh hình thái của chơng trình biệt hoá tế bào nh: chồi, rễ, hoa, mô sẹo dựa
vào các lớp tế bào cắt mỏng (3 6 lớp tế bào biểu bì) và sự thay đổi nồng độ
đờng cũng nh tỉ lệ auxin/xytokinin, phơng pháp này đã cho thấy hiệu quả đối
với khả năng phát sinh phôi vô tính của cây Brassi canapus và khả năng phát
sinh chồi của cây Begoniarex, Petrolium (Bùi Văn Lê, 1999). Phơng pháp cắt
lớp mỏng tế bào ngang đợc sử dụng ở những cây một lá mầm để tạo phôi vô
tính. Đối với cây Saivit pauliacae lát mỏng ngang kể từ cuống lá đều có khả

năng hình thành chồi. ở Việt Nam, những nghiên cứu về nuôi cấy lát mỏng tế
bào hiện còn là vấn đề khá mới. Tới nay chỉ có một số kết quả nghiên cứu của
một số tác giả nh: Trần Thanh Vân, Bùi Thị ánh Tuyết, Trần Duy Quý, Lê Thị
ánh Hồng đã sử dụng lớp mỏng ngang của cuống lá và cụm hoa của cây
Saivitpaulia Vononvhawindhl. ở viện Sinh học Nông nghiệp 1 Hà Nội cũng có
một số nghiên cứu lát mỏng tế bào trên cây phong lan, trên cây dứa
K9 Khoa Công nghệ sinh học
15
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh
2.5. Kĩ thuật cắt lớp mỏng tế bào (tcl)
2.5.1. Phơng pháp TCL kinh điển
Theo Trần Thanh Vân (1973, 1974, 1983, 1986) thì lớp mỏng tế bào đợc
cắt theo chiều dọc hoặc chiều ngang từ những cơ quan khác nhau với kích cỡ rất
nhỏ (từ vài micro đến 1 mm x 5mm) và số tế bào giảm đi cho phép TCL bộc lộ
tính đồng nhất với các phân tử DNA ngoại lai từ quá trình cài lồng gen. Cắt lớp
mỏng tế bào theo chiều dọc (itcl đợc sử dụng khi phân loại tế bào ( tế bào mô
rộng, biểu bì, tế bào tợng tầng, tế bào nhu mô) ITCL có thể cắt từ thân, gân lá,
cuống lá, lá mầm cắt lớp mỏng tế bào theo chiều ngang (tTCL) cũng có thể sử
dụng cơ quan khác nh phiến lá, rễ, cơ quan của hoa thân, mô sinh đỉnh. Với
mục đích là để hình thành mô phân sinh đỉnh. Hình thành mô sẹo hoặc tái sinh
chồi. Cơ chất của môi trờng cấy thờng làm đặc hoặc lỏng. Một số loài thử
nghiệm thành công khi sử dụng TCL là cây thuốc lá, cà chua, lan hồ điệp. Dụng
cụ chứa là ống nghiệm hoặc đĩa peptri có kích thớc sao cho phù hợp với thể tích
môi trờng nuôi cấy và thể tích không khí để cung cấp dinh dỡng cho mẫu cấy.
2.5.2. Phơng pháp TCL cải tiến
Sử dụng tổ hợp tiền chất trên chất ức chế để nghiên cứu động lực của các
con đờng sinh tổng hợp khác nhau và để làm giảm mức tối thiểu sự biến đổi nội
tạng của nhân tố môi trờng cũng nh tính gắn kết của vật liệu sinh học. Phơng
pháp cải tiến đợc Richard (1987) thực hiện bằng việc sử dụng các đĩa giếng
gồm 24 đĩa với kích thớc 1,6 cm để làm vật liệu chứa. Mỗi đĩa đựng một thể

tích môi trờng xác định sao cho tỉ lệ thể tích không khí trên thể tích môi trờng
thích hợp. Một màng nhựa mỏng có kích thớc đàn hồi đã cách li mỗi cá thể theo
trật tự để ngăn ngừa sự thay đổi giữa các đĩa riêng biệt và sự nhiễm vi sinh vật.
Đĩa đợc bịt kín với hai lớp màng (urgo) phơng pháp này có u điểm là sự phân bố
ngẫu nhiên các mẫu cấy TCL trong mỗi đĩa. Nhờ đó giảm đợc kích cỡ của của
các đĩa giếng và lát mỏng tiếp xúc đợc với các điều kiện đồng nhất của môi tr-
ờng (ánh sáng, nhiệt độ, CO
2
, O
2
) dẫn đến giảm sự biến động.
K9 Khoa Công nghệ sinh học
16
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh
2.6. Quy trình kỹ thuật về nuôi cấy mô tế bào
Theo Georger (1993) quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm các bớc:
Bớc 0: chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Trớc khi tiến hành nhân giống in - vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ
(cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt là
bệnh virus và ở giai đoạn sinh trởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều
kiện môi trờng thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả
trớc khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm tăng khả năng sống và sinh
trởng của mẫu in - vitro.
Bớc 1: Nuôi cấy khởi động
Là giai đoạn khử trùng đa mẫu vào nuôi cấy in - vitro. Giai đoạn này cần
đảm bảo các yêu cầu: tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trởng
tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây.
Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn , đỉnh chồi nách và sau đó là đỉnh chồi hoa
và cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá, chồi ngọn, chồi nách đợc sử dụng để nhân
nhanh các cây: măng tây, dứa, khoai tây, thuốc lá, hoa cúc ..

Bớc 2: Nhân nhanh
Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số
lợng thông qua con đờng: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô
tính. Vấn đề này phải xác định đợc môi trờng và điều kiện ngoại cảnh thích hợp
để có hiệu quả là cao nhất. Theo nguyên tắc chung môi trờng có nhiều
xitokynin sẽ kích thích tạo chồi. Chế độ nuôi cấy thờng là 25- 27
0
C và 16 giờ
chiếu sáng/ ngày, cờng độ ánh sáng 2000- 4000 lux. Tuy nhiên đối với mỗi loại
đối tợng nuôi cấy đòi hỏi có chế độ nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh suplơ cần
quang chu kì chiếu sáng 9 giờ/ ngày, nhân nhanh phong lan phalenopsis ở giai
đoạn đầu cần che tối.
Bớc 3: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Để tạo rễ cho chồi, ngời ta chuyển chồi từ môi trờng nhân nhanh sang
môi trờng tạo rễ thờng đợc bổ sung một lợng nhỏ auxin. Một số chồi có thể phát
K9 Khoa Công nghệ sinh học
17
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh
sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trờng nhân nhanh giàu xytokinin sang môi
trờng không chứa chất điều tiết sinh trởng
Bớc 4: Thích ứng cây in - vitro ngoài điều kiện tự nhiên
Để đa cây từ ống nghiệm ra vờn ơm với tỉ lệ sống cao, cây sinh trởng tốt
cần đảm bảo một số yêu cầu:
+ Cây trong ống nghiệm đã đạt đợc những tiêu chuẩn hình thái nhất định( số lá,
số rễ, chiều cao cây).
+ Có giá thể tiếp nhận cây in - vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nớc.
+ phải chủ động điều chỉnh đợc ẩm độ, sự chiếu sáng của vờn ơm cũng
nh có chế độ dinh dỡng phù hợp [17].
2.7. Các vấn đề cần quan tâm trong nhân giống in - vitro
2.7.1. Tính bất định về mặt di truyền (genetic in stability)

Mục đích của nhân giống in - vitro là tạo ra quần thể cây đồng nhất (Tue-
to-type) với số lợng rất lớn. Tuy nhiên, trong một số trờng hợp phơng pháp này
cũng tạo ra những biến dị soma. Tần số biến dị cũng hoàn toàn khác nhau và
không lặp lại. Cây tạo ra do nuôi cấy tế bào mô sẹo có nhiều biến dị hơn so với
nuôi cấy chồi đỉnh. Dạng biến dị phổ biến là bạch tạng, sọc lá, sinh trởng của
cây bất thờng, hệ số nhân in - vitro cũng giảm sút. Nhiều cây khi trồng trên
đồng ruộng có số lá trên 100 lá vẫn cha ra hoa kết quả trong khi cây bình thờng
có thể xử lý ra hoa khi cây có mặt 40 lá.
2.7.2. Sự nhiễm mẫu (explantcontamination)
Các vi sinh vật nh nấm, vi khuẩn nói chung đều bị loại trừ khi khử trùng
mẫu đa vào nuôi cấy. Tuy nhiên một số loại vi khuẩn nh Agrobacterium,
Bacillus, Corylabactorium, Erwinnia và Pscudomnas có thể xâm nhập vào mô
dẫn, tồn tại trong mô và bắt đầu gây tác hại khi tế bào bắt đầu phân chia (sau 1
2 tuần nuôi cấy). Để khắc phục đợc hiện tợng trên, trớc hết cần phải lựa chọn
cây mẹ đúng tiêu chuẩn. Ngời ta cũng có thể sử dụng một số chất kháng sinh để
chống hiện tợng nhiễm khuẩn và nấm mốc. Nhng mô thực vật rất mẫn cảm với
K9 Khoa Công nghệ sinh học
18
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh
kháng sinh và có phản ứng lên kiểu di truyền do đó cần rất thận trọng khi sử
dụng kháng sinh. Chất kháng sinh thờng gây ra những huỷ hoại ở ti thể và lạp
thể nên có ảnh hởng đến di truyền tế bào chất.
2.7.3. Sự tiết độc tố từ mẫu cấy (Toxic compounds)
Trong nuôi cấy mô thờng quan sát thấy hiện tợng hoá nâu hay đen mẫu,
mẫu này có thể khuyếch tán trong môi trờng. Hiện tợng này là do mẫu nuôi cấy
có chứa nhiều chất tanin hoặc hydroxyphenol. Thí dụ các chất phenol:
encomicaxit và tyramine đã làm hoá nâu mẫu cây lan Cattleya khi nuôicấy. Các
phơng pháp phòng trừ sự hoá nâu:
+ Bổ sung than hoạt tính vào môi trờng nuôi cấy (0,1 - 0,3%) phơng pháp này
đặc biệt có hiệu quả trên các loài phong lan Phalenopsis, Cattleya và Aerides.

Tuy nhiên than hoạt tính có thể làm chậm quá trình nhân nhanh cây do hấp phụ
một số chất điều tiết sinh trởng và dinh dỡng cần thiết khác.
+ Bổ sung Poly Vinyl Pyrolidone (PVP) có tác dụng khử nâu hoá tốt.
+ Sử dụng mô non gây vết thơng nhỏ nhất khi khử trùng.
+ Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic và citric vài giờ trớc khi cấy.
+ Nuôi cấy mẫu trong môi trờng lỏng oxi thấp, không có ánh sáng (1 2 tuần).
+ Cấy chuyển mẫu liên tục sang môi trờng tơi trong 1 - 2 tuần.
2.7.4. Hiện tợng thuỷ tinh hoá (vitri fication, hyperhy dricity)
Trong quá trình nhân nhanh in - vitro thờng xuất hiện hiện tợng cây bị
thuỷ tinh hoá thân lá cây mọng nớc, trong suốt, cây rất khó sống khi đa ra
ngoài môi trờng do bị mất nớc rất mạnh. Hiện tợng này thờng xảy ra khi nuôi
cấy trong môi trờng lỏng hay môi trờng ít agar, sự trao đổi khí thấp. Cây bị thuỷ
tinh hoá thờng có hàm lợng lớp sáp bảo vệ thấp, cấu tạo có nhiều phân tử phân
cực nên dễ hấp thụ nớc. Cây in - vitro thờng có mật độ khí khổng cao, khí
khổng có dạng tròn chứ không elip, khí khổng mở liên tục trong quá trình nuôi
cấy nên khi đa ra môi trờng tự nhiên dễ mất nớc.
Để khắc phục hiện tợng thuỷ tinh hoá có thể tiến hành một số giải pháp:
K9 Khoa Công nghệ sinh học
19
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh
+ Giảm sự hút nớc của cây bằng cách tăng nồng độ đờng hoặc các chất gây áp
suất thẩm thấu cao.
+ Giảm nồng độ các chất chứa nitơ trong môi trờng.
+ Giảm sự sản sinh etylen trong bình nuôi cấy.
+ Xử lý axit absixic hoặc một số chất ức chế sinh trởng.
+ Tăng cờng độ ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng nuôi [17].
2.8. Quy trình trồng và chăm sóc cây Địa lan nhân bằng nuôi cấy mô
Tuy việc trồng lan trên thực tế không khó khăn lắm, nhng lan là một loài
hoa phát triển theo một nhịp điệu nghiêm ngặt trong đời sống của nó. Đối với
cây con sau giai đoạn ống nghiệm, dù là từ gieo hạt hay từ nuôi cấy mô, cho

đến khi trởng thành, chỉ cần chúng ta xử lý sai trong mỗi giai đoạn phát triển
của nó hay nói một cách khác là không phù hợp với sinh lý, sinh thái của nó có
thể làm cho chúng chết hàng loạt, hoặc chậm lớn, chậm ra hoa, thậm chí không
ra hoa.
Cây lan sau khi đã đợc nhân nhanh bằng phơng pháp in - vitro sẽ đợc đa
ra vờn ơm. Đây là giai đoạn chuyển cây con từ trạng thái sống dị dỡng sang
trạng thái sống hoàn toàn tự dỡng do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh
phù hợp để cây con có thể phát triển tốt nhất [20].
2.8.1. Giai đoạn lấy từ trong ống nghiệm ra
Đây là thời điểm mà ngời ta thờng ít chú ý. Nhng nếu không làm cẩn
thận, nó có thể ảnh hởng xấu đến việc phát triển của cây con sau này.
Việc lấy cây con ra phải thật nhẹ nhàng, tránh làm dập lá, gẫy rễ, nhất là
trong lúc rửa sạch hết thạch của môi trờng dinh dỡng còn bám vào rễ. Đối với
các giống nh Vanda, rễ to, cây cứng, làm sạch thạch dễ dàng hơn đối với những
cây quá mảnh mai nh Cymbidium, Dendrobium.
Đối với rễ của Cymbidium trong ống nghiệm có lông bám khá chắc thạch
của môi trờng dinh dỡng và rễ thờng đan với nhau nên phải tỉ mẩn, cẩn thận.
Phải rửa thật sạch thạch, tách riêng từng cây và loại bỏ những mô callus còn sót
nếu không cây sẽ bị nhiễm khuẩn khi đa ra ơm trong vờn [20].
K9 Khoa Công nghệ sinh học
20
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh
Sau khi rửa sạch cây, dùng nớc sạch có pha thêm một ít thuốc trừ nấm,
thuốc sát khuẩn với nồng độ loãng (khoảng 1g/lít) nhúng cây con vào mục đích
để trừ nấm hại cây con khi cây còn quá mảnh mai, yếu ớt [20].
2.8.2. Giai đoạn ở trong chậu chung
Giai đoạn ở trong chậu chung là giai đoạn khó khăn và quan trọng nhất
của việc trồng cây lan con. Rebecca Tyson Northen (nhà trồng lan ngời Mỹ)
trong cuốn Home Orchid Growing (1974) chỉ dẫn nh sau:
Lan con lấy từ ống nghiệm ra đợc cho vào dung dịch sát khuẩn, sau dùng

kẹp để gắp cây con vào trồng trong chậu chung. Chất liệu trồng là ba phần vỏ
thông xay nhuyễn, với một phần cát, hoặc tám phần Osmunda (một chất liệu
nh rễ dớn của ta) xay nhuyễn, một phần cát và một phần than vụn. Tất cả chất
liệu này đều đợc luộc kỹ để diệt nấm và diệt trùng.
Pha loãng dung dịch phân bón, một phần t muỗng cà phê phân bón với
một ga-lông (bằng 4,5 lít nớc) ngay tức khắc sau khi trồng phun vào cây. Đời
sống cộng đồng của chúng kéo dài một năm.
Water Richter (một nhà trồng lan nổi tiếng ngời Đức) trong cuốn
Orchideen, Pilezen, Vermehren, Zuchten thì viết nh sau: Để trồng cây từ
ống nghiệm ra ngời ta chuẩn bị chất nuôi cây gồm than bùn, than củi và cát với
tỉ lệ ngang nhau, hạt khá nhỏ, độ ẩm bình thờng. Đồ đựng là các chậu đất hoặc
đĩa, 1/3 phía dới ngời ta cho mảnh sành. Phía trên là các chất nuôi cây để
khoảng cách từ 2-3 cm.
Giai đoạn ở trong chậu chung đối với từng loại lan là khác nhau và chế
độ che sáng cũng khác nhau thờng tránh để ánh sáng trực tiếp chiếu vào cây.
Đánh giá cây con khỏe mạnh và có thể chuyển sang giai đoạn chậu con thì phải
đạt ở tiêu chuẩn sau đây:
- Giả banh và lá phải xanh, cứng, không còn quá mọng nớc nh khi mới lấy
ở ống nghiệm ra.
- Rễ còn nguyên vẹn, có màu trắng xanh, đầu rễ bắt đầu phát triển, nhú lên
xanh đậm rất đẹp.
K9 Khoa Công nghệ sinh học
21
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh
- Khi trồng vào chậu cây con sống bình thờng nh cây lớn (tất nhiên phải
che nắng thích hợp, tránh cho cây bị nắng quá làm cháy lá và không để ma
to làm long gốc).
2.8.3. Giai đoạn trồng vào chậu nhỏ
Sau khi cây trồng trong chậu chung ổn định một thời gian cần thiết phải
chuyển sang giai đoạn chậu nhỏ để cây phát triển tốt hơn. Giai đoạn này tùy

thuộc vào từng loại cây và tùy theo yêu cầu thực tế của cây mà tiến hành. Giai
đoạn này, cần có 2 thứ là chậu và chất liệu trồng.
+ Về chậu: Thờng dùng là chậu đất, chậu nhựa mềm, chậu nhựa cứng, đờng
kính khoảng 3 - 5 cm, chiều cao cũng vậy có lỗ thoát nớc ở dới.
Chậu cần đợc rửa sạch trớc khi trồng.
+ Về chất giữ cây: Có nhiều khuynh hớng và kinh nghiệm của ngời trồng. ở các
nớc ôn đới, ngời ta thờng dùng:
- Loại chất liệu sẵn có trong thiên nhiên nh osmuda, splagnum, than bùn,
than củi, cát, vỏ cây, đất .
- Loại chất liệu nhân tạo tổng hợp nh polystyren, polyuretan.
ở nớc ta, ngời ta sử dụng nhiều loại chất liệu nh: xơ dừa, than củi, rễ lục
bình, dớn... để trồng lan. Tuy nhiên đối với cây Cymbidium thì chất liệu trồng
rất đa dạng và cầu kỳ: đất trồng cây, cát, xỉ than, vỏ cây, vỏ dừa, xơ dừa, rễ d-
ơng xỉ, bã phân vi sinh, bã cà phê với một tỷ lệ pha trộn tùy theo kinh nghiệm
từng ngời trồng.
2.8.4. Giai đoạn thay chậu nhỏ và trồng vào chậu lớn
Việc chuyển chậu có thể thực hiện trong khoảng thời gian cây con đã ở
trong chậu nhỏ từ 10 - 24 tháng hoặc hơn. Khi chuyển cây không đợc căn cứ
vào tháng tuổi của cây ở trong giai đoạn chậu nhỏ mà phải căn cứ vào tình trạng
của từng cây mà quyết định. Nếu cây bé trồng vào chậu lớn, cây sẽ phát triển
chậm nhng nếu cây lớn trồng vào chậu bé thì cũng dẫn tới tình trạng tơng tự.
K9 Khoa Công nghệ sinh học
22
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh
Sau thời gian chuyển chậu đợc một tuần trở ra mới đợc bón các chất dinh
dỡng cho cây vì trong quá trình chuyển chậu, ít nhiều bộ rễ bị xây xát nhẹ, nếu
bón phân hóa học ngay, có thể làm hỏng bộ rễ. Duy trì cờng độ ánh sáng
40.000 lux, để trong 6 tháng đến 1 năm.
Sau đó, ta chuyển cây vào nơi có cờng độ ánh sáng khoảng 50.000 lux và
để trong 6 tháng thì cây bắt đầu ra hoa.

Có thể với một số cây Địa lan phát triển thành cụm lớn ta có thể chuyển
sang loại chậu to hơn nữa hoặc tách cụm thành những chậu bé hơn
2.9. Một số kỹ thuật trồng Địa lan cơ bản
2.9.1. Kĩ thuật trồng cây con vào chậu
Trớc khi trồng cần chuẩn bị:
+ Chậu đã đợc rửa sạch.
+ Giá thể phải đợc rửa sạch, khử trùng, chế biến theo công thức của từng ngời.
Nếu là các chất liệu nh than củi, vỏ cây, rễ cây dơng xỉ thì đợc chặt nhỏ kích th-
ớc khoảng 2-5 mm. Nếu là xơ dừa thì xé ra cho tơi và cắt thành đoạn khoảng
một đốt ngón tay. Xơ dừa đợc ngâm kĩ khoảng một tuần, rửa sạch rồi luộc kỹ và
sau đó rửa lại thật sạch nhiều lần cho hết chất chát. Sau đó phơi thật khô. Nên
chọn xơ dừa già vì xơ dừa già lâu mục.
Chọn những cục than to hoặc đá, mảnh sành kích thớc khoảng 2-3 cm,
đặt vào đáy chậu để giúp thoát nớc và thông thoáng bộ rễ, chiếm khoảng 1/3
dung tích. Sau đó đặt giá thể lên trên, khoảng 2 lớp mỏng rồi trồng cây con vào,
giữ cho cây đứng thẳng cho tiếp giá thể lên và chú ý đặt nhẹ nhàng cho rễ cây ở
hết bên dới giá thể và tránh làm gẫy và h hại rễ. Công việc này đòi hỏi làm phải
hết sức nhẹ nhàng và tỉ mỉ [12].
Khi cây mới đợc trồng vào chậu, lúc tới phải tránh làm lung lay, rễ vây
khó bám vào xơ dừa và than. Nếu trời ma quá to có thể làm cây long, nghiêng
ngả, đầu rễ bị h hại [20].
K9 Khoa Công nghệ sinh học
23
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh
2.9.2. Kỹ thuật chuyển chậu
Việc chuyển chậu cũng cần đợc chuẩn bị thật tốt nh khi trồng cây con
vào chậu nhỏ.
Về chậu: cần có kích thớc lớn ít nhất gấp 2,5 lần chậu con. Rửa sạch chậu.
Về giá thể: Đợc khử trùng là tốt nhất. Một số loại nh vỏ cây, vỏ dừa... kích thớc
cần lớn hơn khoảng 5-10 mm.

Khi chuyển chậu, nên dùng một chậu nhựa lớn, sạch. Đổ nớc có pha
thuốc diệt trùng, diệt nấm sẵn (tỉ lệ 1/1000). Mức nớc ngang với chiều cao của
chậu con. Xếp các chậu con vào chậu nớc thuốc sát trùng, để khoảng 10-15
phút. Diệt hết các rệp cây hoặc giá con từ các chậu bò ra (nếu có).
Khảng 15 phút sau rễ cây bám vào thành chậu đã bong ra hết, ta nhẹ
nhàng cầm cây sát gốc rút nhẹ lên, bộ rễ và giá thể sẽ long lên toàn bộ cả cụm,
đem rửa sạch bộ rễ. Để cây dới ánh nắng tán xạ khoảng 20 phút sau đó đem
trồng. Ta đặt cụm cây đó vào giữa chậu lớn, một tay giữ cây, một tay cho giá
thể vào tới sát miệng chậu. Kỹ thuật tới nớc cho cây
Tới nớc cho cây phải căn cứ trên hai nguyên tắc:
- Nhu cầu về nớc của cây mình trồng dựa trên sinh lý, sinh thái cụ thể
của chúng.
- Tình hình thực tế về khí hậu trong từng tuần, từng tháng của nơi mình
trồng lan (gồm khí hậu trong vùng và khí hậu của môi trờng, tức là khí hậu
của vờn lan).
Khi tới, cần hết sức nhẹ nhàng, tránh làm cây bị long gốc, rễ khó bám
vào giá thể và thành chậu, nên tới phun mù là tốt nhất.
2.9.3. Nớc tới cho lan
Đối với lan con, nớc tới phải thật sạch, nớc giếng, nớc ma là tốt nhất. Đối
với những nơi có hệ thống cống rãnh ngầm, bể phân tự hoại, ta không nên dùng
nớc giếng. Vùng có nhiều đá vôi, nớc giếng cũng không tốt cho lan. Cũng
không nên dùng nớc ma đầu mùa, vì trong không khí và nhất là mái nhà, máng
K9 Khoa Công nghệ sinh học
24
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Văn Thịnh
cha đợc rửa sạch, bản thân nớc ma trong thời gian đầu cũng chứa nhiều bụi và
vi khuẩn [15].
Nớc máy cũng rất tốt, nhng vì có thuốc sát trùng nên ngời ta khuyên
dùng nớc máy đựng trong bể chứa. Sau 24 giờ, các hóa chất nh Cl
2

đã bốc hơi
hết. Trong tự nhiên nớc thông thờng có pH trong khoảng từ 4-9. Có ngời
khuyên dùng axit oxalic, axit nitric 10%, axit citric để tạo nớc có độ hơi axit
nếu nớc có pH cao (pH khoảng 5 là tốt nhất).
2.9.4. Kỹ thuật thúc mầm cây
Đợc thực hiện vào mùa xuân sẽ cho hiệu quả cao hơn nếu thực hiện vào
mùa thu. Chọn những cây khỏe mạnh để thúc mầm. Có thể thực hiện một trong
hai biện pháp sau:
- Biện pháp cơ giới: Tách nhánh ép mầm. Đây là biện pháp tách cụm để
thúc cho mầm mới phát sinh. Kết quả cho thấy khi tách 2 nhánh/cụm sẽ cho
hiệu quả tốt.
- Biện pháp hóa học. Đây là biện pháp sử dụng các chất kích thích nh
BAP thấm bông đắp lên giả hành hoặc chọc nhỏ thẳng vào đỉnh sinh trởng từ
3- 4 lần cách nhau tuần/lần. Aspirin, KH
2
PO
4
, H
3
BO
3
... với nồng độ 1/1000
tới cho cây khoảng cách 2 lần/tuần.
2.9.5. Phòng trừ bệnh cho cây
Trên thực tế, khi chúng ta trồng những cây lan con từ trong ống nghiệm ra
(bằng phơng pháp nuôi cấy mô thực vật) là chúng ta đã loại đợc những bệnh
nguy hiểm nhất cho lan là các bệnh do virus [15].
Bình thờng, nếu chúng ta dùng nớc sạch tới cho lan, và tạo cho các cây
lan con một môi trờng riêng biệt, sạch sẽ không có điều kiện cho lan con bị lây
chéo các bệnh khác của lan lớn hoặc cây khác thì lan con sống khỏe mạnh cho

tới khi trởng thành. Tuy nhiên, để đảm bảo cho lan con không có bệnh, nhất là
các bệnh do nấm, chúng ta nên áp dụng chế độ phun thuốc phòng bệnh nấm cho
lan theo chế độ định kì tháng/lần.
K9 Khoa Công nghệ sinh học
25