Báo cáo " THU NHẬN VÀ BIỆT HOÁ TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ TUỶ XƯƠNG CHUỘT (Mus musculus var. Albino) " ppt

Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
332
THU NHẬN VÀ BIỆT HOÁ TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ
TUỶ XƯƠNG CHUỘT (Mus musculus var. Albino)
Trương Định, Trương Hải Nhung, Phạm Văn Phúc, Phan Kim Ngọc
ĐH Khoa học Tự nhiên TPHCM
MỞ ĐẦU
Tuỷ xương chứa một nguồn tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cell-MSC)
dồi dào. Các tế bào MSC này được thu nhận và nuôi cấy trong môi trường DMEM/F12
(Sigma), 10% FBS (Invitrogen). Sau khoảng 10 ngày nuôi cấy, các tế bào MSC tăng
sinh mạnh và chiếm 70-80% diện tích bề mặt đáy bình Roux (25 cm
2
, Nunc), tiến hành
cấy chuyền với trypsin/EDTA (Sigma) 0,25% nhằm cung cấp chất din h dưỡng và không
gian phát triển cho tế bào MSC.
Tế bào MSC là tế bào gốc đa năng, chúng có khả năng biệt hoá th ành rất nhiều kiểu
tế bào chức năng khác nhau. Chúng có thể biệt hoá th ành tế bào xương khi nuôi trong
môi trường DMEM/F12, 10% FBS có bổ sung dexamethasone, glycerol phosphate,
ascorbate, EGF (nhân tố tăng trưởng biểu mô); thành tế bào mỡ khi nuôi trong môi
trường DMEM/F12, 10% FBS có bổ sung isobutyl -methylxanthine, dexamethasone,
insulin, indomethacin; thành tế bào giống tế bào thần kinh khi nuôi trong môi trường
DMEM/F12, 10% FBS có bổ sung dịch chiết não chuột.
Tế bào gốc nói chung và tế bào gốc trung mô nói riêng hiện đang là mối quan tâm
hàng đầu của nhiều nhà khoa học và những thầy thuốc lâm sàng bởi khả năng đặc biệt
duy nhất của chúng đó là khả năng biệt hoá thành nhiều kiểu tế bào khác nhau trong cơ
thể, như xương, sụn, mỡ, tế bào thần kinh Thêm vào đó chúng là một nguồn tế bào
đầy hứa hẹn cho việc cấy ghép và sinh dược phẩm, chúng cũng phục vụ như là một mô
hình tối ưu của sự phát triển của động vật có xương sống.
Trong các nghiên cứu về sự biệt hoá, các tế bào MSC biệt hoá thành xương, sụn và mỡ
được sử dụng nhiều nhất như là bằng chứng cụ thể về tiềm năng biệt hoá của tế bào gốc.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Thu nhận tuỷ xương chuột
Chuột (Mus musculus var. Albino) bị giết bằng cách kéo gi ãn đốt sống cổ, sau đó
thu nhận hai xương đùi và xương cẳng chân. Các khúc xương được rửa bằng dung dịch
PBSA hai lần. Dùng kéo và kẹp tách bỏ mô cơ bám trên các đoạn xương. Cuối cùng, tuỷ
xương được thu nhận bằng cách: dùng ống kim với mũi kim 26 G có chứa sẵn môi
trường nuôi cấy, chọc xuyên vào tuỷ xương và dội rửa hai lần.
Phần IV: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT
333
Nuôi cấy chọn lọc tế bào gốc trung mô
Hỗn hợp tế bào có trong tuỷ xương bao gồm tế bào gốc tạo máu, tế bào máu trưởng
thành và tế bào gốc trung mô. Tuy nhiên, chỉ có tế bào gốc trung mô mới có khả năng
bám dính vào bề mặt nhựa của bình Roux. Sau vài lần thay môi trường, ta có thể loại bỏ
được tất cả các tế bào tạp nhiễm, chỉ còn lại duy nhất tế bào gốc trung mô. Tiến hành
như sau: huyền phù tế bào tuỷ xương sau khi thu nhận được nuôi trong bình Roux với
mật độ 1.104 tế bào/cm
2
ở điều kiện 37
0
C, 5% CO
2
. Sau 24 giờ, các tế bào gốc trung mô
bắt đầu bám trên bề mặt bình Roux, thay môi trường để loại bỏ các tế bào không bám,
tiếp tục nuôi đến khi tế bào đạt mật độ 70-80% bình Roux với chế độ thay môi trường là
3 ngày/lần.
Cấy chuyền tăng sinh
Khi mật độ tế bào MSC trong bình nuôi đạt khoảng 70-80%, tiến hành cấy
chuyền tăng sinh nhằm cung cấp không gian v à chất dinh dưỡng cho tế bào MSC
tăng sinh và phát triển đạt hiệu quả cao. Tiến hành như sau: đổ bỏ môi trường cũ và
rửa tế bào với 4-5ml PBS-gentamycin (10 IU/ml) hai lần. Sau đó, đổ bỏ dịch rửa và
bổ sung 4-5ml trypsin/EDTA 0,25%. Sau 15 giây, ti ến hành đổ bỏ dung dịch enzyme

nhưng vẫn chừa lại khoảng 1ml và tiếp tục ủ trong tủ ấm 37
0
C trong 2-3 phút. Sau
đó, lắc nhẹ bình Roux để tách tế bào ra khỏi bề mặt đáy. Sau khi tế bào tròn lên và
tách ra khỏi bề mặt nuôi, trung hoà trypsin thừa bằng 10-11ml môi trường DMEM
10% FBS. Huyền phù tế bào đó được chia đều cho 3 bình Roux mới.
Biệt hoá tế bào gốc trung mô
Biệt hóa tế bào gốc trung mô thành tế bào tạo mỡ bằng môi trường nuôi
DMEM/F12 10% FBS bổ sung hỗn hợp 1 μM dexamethasone, 200 μM indomethacin,
1,7 μM insuline, 500 μM isobutyl-methylxanthine (tất cả đều của Sigma). Sự biệt hóa
được ghi nhận khi quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại X20, X40 thấy có sự xuất
hiện các giọt mỡ nhỏ. Ngoài ra, các tế bào mỡ còn được xác định dựa vào phương pháp
nhuộm với thuốc nhuộm Sudan black (Merck) l à thuốc nhuộm lipid, nó chỉ hòa tan
trong lipid và tạo màu đen.
Biệt hoá thành tế bào xương: Các tế bào MSC được nuôi trong môi trường
DMEM/F12 10% FBS với 100 nM dexamethasone, 50 μg/ml L-ascorbic acid 2-
phosphat (AsAP) và 100 mM β-glycerolphosphate (tất cả đều của Sigma). Sau 7-14
ngày, đánh giá sự biệt hoá thông qua khả năng tích tụ của calcium trong chất nền với
phương pháp nhuộm với thuốc nhuộm Alizarin Red (Sigma).
Biệt hoá thành tế bào giống tế bào thần kinh: Môi trường biệt hoá tế bào gốc trung
mô thành tế bào thần kinh là môi trường DMEM/F12 10% FBS, bổ sung 10% dịch chiết
não chuột. Xác định tế bào thần kinh sau khi được biệt hoá bằng hình dạng đặc trưng
của chúng.
Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
334
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. Nuôi cấy chọn lọc tế bào MSC
Sau 24 giờ nuôi cấy, tế bào MSC có hiện tượng bám trên bề mặt bình Roux, trong
khi các tế bào tạo máu vẫn trôi lơ lửng trong dịch huyền phù tế bào.
Hình 1. Kết quả nuôi cấy chọn lọc MSC. (a) Tế bào MSC vừa mới thu nhận; (b) Tế bào MSC sau 24 giờ nuôi

cấy, các tế bào MSC bắt đầu bám dính vào bề mặt bình nuôi; (c) Tế bào MSC sau 72 giờ nuôi cấy, các tế bào
MSC bắt đầu trải dài hình dạng và tăng sinh; (d) Hình ảnh các tế bào MSC sau 240 giờ nuôi cấy, hầu hết các tế
bào MSC lúc này đã có dạng hình thoi đặc trưng và tăng sinh mạnh. (Độ phóng đại X20)
Sau 48 giờ, loại bỏ môi trường cũ và thay môi trường mới nhằm cung cấp chất dinh
dưỡng cho sự phát triển của tế bào MSC. Khi thay môi trường, đồng thời loại bỏ được
những tế bào chết cũng như các tế bào tạo máu còn lơ lửng trong môi trường cũ. Với lần
thay môi trường đầu tiên, không tiến hành rửa tế bào vì khả năng bám dính của tế bào
MSC vào bề mặt bình Roux vẫn còn yếu. Sau 72 giờ, tế bào MSC bắt đầu trải ra trên bề
mặt bình Roux, khi đó tế bào
MSC đã có hình dạng đặc trưng, thường là hình thoi. Sau 120 giờ nuôi cấy, tế bào
MSC tiếp tục trải rộng ra và phân chia gia tăng số lượng trên bề mặt bình Roux.
Sau 240 giờ, tế bào MSC hợp dòng, bám đều và trải rộng trên bề mặt bình Roux.
Khi mật độ tế bào MSC đạt 70% - 80% diện tích bình Roux, tiến hành cấy chuyền nhằm
cung cấp không gian sống và chất dinh dưỡng cho tế bào MSC.
2. Cấy chuyền tăng sinh tế bào MSC
Khi vừa được cấy chuyền, tế bào MSC chưa có hình dạng đặc trưng và trôi lơ lửng
trong môi trường giống như khi vừa được thu nhận từ tuỷ xương.
(a)
(b))
(c)
(d)
Phần IV: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT
335
Sau 24 giờ, tế bào MSC bắt đầu bám dính và trải rộng. Sau 48 giờ, tế bào MSC trải
rộng, có dạng hình thoi đặc trưng và bắt đầu tăng sinh. Tuy nhiên, khả năng tăng sinh
của tế bào MSC lúc này vẫn còn rất chậm.
Sau 152 giờ, tế bào MSC hợp dòng và trải đều trên bề mặt bình Roux.
Biệt hoá tế bào MSC
Hình 2. Kết quả biệt hoá tế bào MSC. (a) Các tế bào tạo mỡ: sau 7-14 ngày trong môi trường biệt
hoá tạo mỡ, các tế bào bắt đầu tích tụ các giọt mỡ ( ); (b) Các giọt mỡ bắt m àu đen khi nhuộm với

thuốc nhuộm Sudan Black; (c) Các tế bào tạo xương: sau 7-14 ngày trong môi trường biệt hoá tạo
xương, các tế bào bắt đầu tròn lại và tích tụ calci trong chất nền. Sự tích tụ calci được xác định
bằng cách nhuộm với Alizarin Red; (d) Tế bào giống tế bào thần kinh: các tế bào MSC sau khi nuôi
trong môi trường biệt hoá thần kinh, MSC thay đổi hình dạng thành tế bào giống tế bào thần kinh
với exon dài ( ), thân tế bào thần kinh ( ).
Biệt hoá hành tế bào mỡ
Sau 48 giờ, các tế bào bắt đầu tích tụ các giọt mỡ trong tế bào chất. Các giọt mỡ
nhỏ góp lại dần thành các giọt lớn. Chúng chuyển từ dạng dài, trải rộng chuyển sang
dạng tròn. Các giọt mỡ có thể quan sát dễ dàng dưới kính hiển vi đảo ngược có độ
phóng đại X20.
Biệt hoá hành tế bào xương
Sau khi nuôi trong môi trường biệt hóa, các tế bào từ dạng dài chuyển sang dạng
tròn và hình hạt đậu. Về mặt hình thái học, có thể đánh giá sơ bộ là các tế bào này đã
biệt hóa thành công. Dạng thuôn dài, trải rộng là hình dạng của tế bào gốc trung mô và
dạng tròn hay hình hạt đậu là hình dạng của tế bào tạo xương (osteoblast).
Khi nhuộm với Alizarin red, các tế bào tròn hay hình hạt đậu sẽ nhuộm màu đỏ
cam. Điều này chứng tỏ các tế bào có nguồn gốc từ tế bào MSC này đã có sự lắng tụ
muối calci trong chất nền ngoại bào. Như vậy, các tế bào MSC đã biệt hóa thành các tế
bào tạo xương.
(a)
(b)
(c)
(d)
X20
X20
X20
X40
Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
336
Biệt hoá thành tế bào giống tế bào thần kinh

Sau 10-14 ngày biệt hoá, một số tế bào bắt đầu thay đổi hình dạng với sợi trục kéo
dài và một đầu phình to giống thân tế bào thần kinh cũng như các nhánh nhỏ xuất phát
từ thân giống như các sợi nhánh.
KẾT LUẬN
Thu nhận và nuôi cấy thành công tế bào gốc trung mô từ tủy xương chuột Mus
Muscular var. Albino.
Tế bào gốc trung mô từ tủy xương chuột Mus Muscular var. Albino có khả năng
biệt hóa thành tế bào tạo mỡ, xương và tế bào thần kinh khi nuôi cấy trong môi trường
có bổ sung một số nhân tố cảm ứng biệt hoá thích hợp.
TÀI LIỆU THAM KHÀO
1. Daniel R. Marshak, Richard L. Gardner & David Gottlieb (2001). Stem cell
Biology. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
2. Freshney R. I. (2000). Culture of animal cells - A Manual of basic Technique, 4th Ed.
Newyork: Willey Liss.
3. Moustapha Kassen và Cs (2004). Mesenchymal Stem Cells: Cell Biology and Potenntial
Use in Therapy. Basic & Clinical Pharmacology & Texicology, 95, 209-214.
4. Robert I.(2004). Mesenchymal stem cell. Vox Sanguinis. 38-41.
SUMMARY
Collecting and differentiating mesenchymal stem cells
from mouse bone marrow
Truong Dinh, Truong Hai Nhung, Pham Van Phuc, Phan Kim Ngoc
University of Sciences HCMCity
Bone marrow is a rich source of mesenchymal stem cells (MSCs). MSCs have been
collected and cultured with DMEM/F12 medium plus 10% FBS (fetal bovine serum).
At about 10th day, MSCs strongly expand and cover with 70 -80% Roux’s surface. At
that time, MSCs are subcultured by trypsin/EDTA 0,25% to provide nutrients and
surface for development. MSCs are pluripotential stem cells. They can differentiate to
many different cell types, such as: osteoblasts, adipocytes, neuron -like cells MSCs
could be differentiated to osteoblasts in DMEM/F12, 10% FBS medium plus
dexamethasone, glycerol phosphate, ascorbate, EGF (epidermal growth factor); to

adipocytes in DMEM/F12, 10% FBS plus isobutyl-methylxanthine, dexamethasone,
insulin, indomethacin; to neuron-like cells in DMEM/F12, 10% FBS plus mouse brain
crude extract.