Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn người thành tế bào dạng tạo xương

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI




Đỗ Minh Trung




NGHIÊN CỨU BIỆT HÓA TẾ BÀO GỐC
TRUNG MÔ MÀNG DÂY RỐN NGƯỜI
THÀNH TẾ BÀO DẠNG TẠO XƯƠNG




LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC









HÀ NỘI – 2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Đỗ Minh Trung



NGHIÊN CỨU BIỆT HÓA TẾ BÀO GỐC
TRUNG MÔ MÀNG DÂY RỐN NGƯỜI
THÀNH TẾ BÀO DẠNG TẠO XƯƠNG

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 62 42 02 01


LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. PGS.TS. Lê Văn Đông
2. GS.TS. Đặng Thị Thu



HÀ NỘI – 2013


LỜI CAM ĐOAN

Luận án này là sản phẩm khoa học thuộc đề tài “Nghiên cứu biệt hóa tế bào
gốc màng dây rốn thành tế bào xương” mã số: 106.99.174.09 do Học viện Quân y
chủ trì. Luận án cũng sử dụng một phần kết quả của đề tài “Nghiên cứu xây dựng
ngân hàng tế bào gốc dây rốn khu vực Miền Nam và ứng dụng vào điều trị bệnh ở
người” mã số ĐTĐL 2007-03 do Công ty cổ
phần hóa dược phẩm Mekophar chủ trì
và Học viện Quân y là đơn vị phối hợp thực hiện.
Là người tham gia trực tiếp thực hiện các nội dung thuộc đề tài được trình
bày trong luận án này, tôi xin cam đoan những số liệu và kết quả nghiên cứu trong
luận án là trung thực và chưa từng được các tác giả khác công bố trong các luận
văn, luận án nào và đã được chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng vào luận án này.



Hà Nội, ngày tháng năm 2013











Nghiên cứu sinh

Đỗ Minh Trung







LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới Thượng tá PGS.TS
Lê Văn Đông - Chủ nhiệm Bộ môn Độc học và Phóng xạ Quân sự, Trưởng phòng Protein-
Độc chất-Tế bào, Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y và GS.TS
Đặng Thị Thu, Nguyên Phó viện trưởng Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực
phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi trong
suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn tới PGS.TS Tô Kim Anh Viện trưởng, PGS.TS Nguyễn
Thị Xuân Sâm, Trưởng bộ môn Hóa sinh – Vi sinh - Sinh học phân tử, PGS.TS Khuất Hữu
Thanh, TS. Lê Quang Hòa cùng các thầy cô giáo, các cán bộ phòng Hóa sinh – Vi sinh -
Sinh học phân tử, Trung tâm nghiên cứu & phát triển công nghệ sinh học - Viện Công
nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm và Viện Đào tạo Sau đại học – Trường Đại học
Bách Khoa Hà Nội đã tận tình giúp đỡ, dạy bảo và động viên tôi trong quá trình học tập và
nghiên cứu.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Đại tá GS.TS Hoàng Văn Lương – Phó Giám đốc
Học viện Quân y cùng các cán bộ, nhân viên Phòng Protein-Độc chất -Tế bào, Trung tâm
Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y và Ngân hàng Tế bào gốc MekoStem

đã động viên, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình công tác và thực hiện
nghiên cứu.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, khích lệ và
tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi học tập và nghiên cứu.


Hà Nội, ngày tháng năm 2013
Nghiên cứu sinh



Đỗ Minh Trung





MỤC LỤC

Trang
DANH MỤC CÁC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT i
DANH MỤC BẢNG iii
DANH MỤC HÌNH iv
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI 4
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 5
1.1. Tế bào gốc và công nghệ tế bào gốc 5
1.1.1. Tình hình nghiên cứu tế bào gốc nước ngoài 5
1.1.2. Tình hình nghiên cứu tế bào gốc trong nước 6

1.1.3. Tế bào gốc 7
1.1.4. Phân loại tế bào gốc 10
1.1.5. Tế bào gốc trung mô 14
1.1.5.1. Khái niệm 14
1.1.5.2. Đặc điểm 14
1.1.5.3. Tiềm năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô 15
1.1.5.4. Các nguồn tế bào gốc trung mô 19
1.2. Ứng dụng của tế bào gốc 21
1.3. Các bệnh về xương khớp và tế bào gốc trong điều trị các bệnh về xương khớp 22
1.4. Dây rốn, tế bào gốc từ dây rốn 27
1.4.1. Mô học, giải phẫu và chức năng 27
1.4.2. Tế bào gốc trung mô từ màng bao dây rốn 27
1.4.3. Tế bào gốc từ màng dây rốn và tiềm năng ứng dụng 28
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32
2.1. Vật liệu nghiên cứu 32

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu: 32
2.1.2. Hóa chất và Máy móc thiết bị 32
2.2. Phương pháp nghiên cứu 34
2.2.1. Phân lập tế bào gốc trung mô từ màng dây rốn người 34
2.2.1.1. Thu thập và bảo quản dây rốn 34
2.2.1.2. Phân lập tế bào gốc trung mô từ màng dây rốn người 34
2.2.1.3. Nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung mô màng dây rốn 35
2.2.2. Kiểm định sản phẩm tế bào gốc 35
2.2.2.1. Định danh tế bào gốc bằng dấu ấn bề mặt 35
2.2.2.2. Kiểm tra tính gốc của tế bào gốc trung mô màng dây rốn 36
2.2.3. Biệt hóa in vitro tế bào gốc trung mô theo hướng thành tế bào tạo xương 36
2.2.3.1. Khảo sát môi trường cơ bản và nồng độ chất cảm ứng biệt hóa tế bào gốc trung mô
thành tế bào tạo xương 36
2.2.3.2. Kiểm tra sự tích lũy canxi của tế bào sau biệt hóa bằng nhuộm alizarin red 38

2.2.3.3. Khả năng tích tụ canxi của tế bào tạo xương biệt hóa từ tế bào gốc trung mô 38
2.2.3.4. Xác định hoạt tính của Alkaline phosphates (ALP) 38
2.2.4. Tách chiết RNA và tiến hành phản ứng RT-PCR (Reverse Trancriptase -
Polymerase Chain Reaction) 39
2.2.5. Phương pháp xác định số lượng tế bào nuôi cấy 43
2.2.6. Thu hoạch và bảo quản tế bào 44
2.2.7. Phục hồi tế bào sau bảo quản lạnh sâu 44
2.2.8. Cấy ghép tế bào tạo xương biệt hóa từ tế bào gốc trung mô màng dây rốn lên
chuột nhắt đã gây suy giảm miễn dịch bằng hóa chất 45
2.2.8.1. Tạo mô hình chuột nhắt suy giảm miễn dịch 45
2.2.8.2. Cấy ghép tế bào tạo xương biệt hóa từ tế bào gốc trung mô màng dây rốn trên
chuột 45
2.3.9. Nhuộm hematoxylin và eosin 46
2.2.10. Phương pháp xử lý số liệu 46
2.2.11. Đạo đức trong nghiên cứu 46
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44

3.1. Phân lập và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung mô từ màng dây rốn người 47
3.1.1. Thu thập mẫu dây rốn 47
3.1.2. Khảo sát thời gian nuôi cấy mô tách màng dây rốn và khả năng bám dính 47
3.1.2.1. Thời gian nuôi cấy mô 47
3.1.2.2. Kết quả nuôi cấy màng dây rốn phân lập tế bào 49
3.1.3. Khảo sát môi trường cơ bản phân lập và nuôi cấy tế bào gốc 52
3.1.4. Thời gian nuôi cấy mô phân lập tế bào gốc trung mô 54
3.1.5. Khảo sát số lần cấy chuyển mô 60
3.1.6. Khảo sát thời gian c
ấy chuyển, nuôi cấy tăng sinh tế bào 62
3.2. Kiểm định sản phẩm tế bào gốc 64
3.2.1. Định danh tế bào bằng dấu ấn bề mặt 64
3.2.2. Kiểm tra tính gốc của tế bào gốc trung mô màng dây rốn 67

3.3. Biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn thành tế bào dạng tạo xương 69
3.3.1. Khảo sát môi trường cơ bản để biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn thành tế
bào dạng tạo xương 69
3.3.2. Khảo sát n
ồng độ chất cảm ứng biệt hóa TBG trung mô màng dây rốn thành tế bào
dạng tạo xương 71
3.3.3. Thời gian biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn thành tế bào dạng tạo xương 75
3.3.4. Xác định hoạt tính Alkaline phosphatase (ALP) 78
3.3.4. Biệt hóa tế bào 80
3.4. Một số biến đổi phân tử của tế bào gốc trung mô màng dây rốn trong quá trình
biệt hóa thành tế bào dạng tạo xương 84
3.5. Kết quả bước đầu thử nghiệm cấy ghép tế bào tạo xương biệt hóa từ tế bào gốc trung mô
trên động vật 89
KẾT LUẬN 93
KIẾN NGHỊ 94
TÀI LIỆU THAM KHẢO 95
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 109
PHỤ LỤC 110


i
DANH MỤC CÁC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT


ALP Alkaline phosphatase: phosphatase kiềm
AsA Ascorbic acid
AsAP L-ascorbic acid 2 phosphat
AT Adipose Tissue: Mô mỡ
BM Bone Marrow: Tủy xương
bp Base pair: cặp base

BSA Bovine Serum Albumin
BU Busulfan
CD
Cluster of Differentiation
cDNA Complementary deoxyribonucleic acid
COL I Colagene type I
CY Cyclophosphamide
DMEM Dulbecco
’
s Modified Eagle Medium
DMEM-LG Dulbecco
’
s Modified Eagle Medium Low Glucose
DMSO Dimethyl Sulfoxide
D-PBS Dulbecco's Phosphate buffer saline
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
F12 Nutrient Mixture F12
FBS Fetal brovine serum: Huyết thanh bào thai bê
FITC Fluorescein isothiocyanate
HBV Hepatitis B Virus
HCV Hepatitis C Virus
HIV
Human Immunodeficiency Virus
HLA Human leukocyte antigen: Kháng nguyên bạch cầu người
IBMX 3-Isobutyl-1-methylxanthin
ICM Inner Cell Mass: Khối tế bào bên trong
IMDM
Iscove's Modified Dulbecco's Medium
MSC Mesenchymal Stem Cell: Tế bào gốc trung mô
OC Osteocalcin

ON
Osteopontin
PBS Phosphate buffer saline
pNPP P-Nitrophenyl phosphate


ii
RNA Ribonucleic acid
RT-PCR Reverse trancriptase Polymerase chain reaction
ß-GP ß-glycerolphosphate
TBG Tế bào gốc
TBTX Tế bào tạo xương
TGF-β Transforming growth factor beta
UC Umbilical Cord: Dây rốn
UCB Umbilical Cord Blood: Máu dây rốn





iii


DANH MỤC BẢNG



Bảng 1.1: Ứng dụng lâm sàng của tế bào gốc trung mô trong tái tạo xương 21
Bảng 2.1: Thành phần môi trường biệt hóa được khảo sát 37
Bảng 2.2: Nồng độ chất cảm ứng biệt hóa được khảo sát 37

Bảng 2.3: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 39
Bảng 2.4. Trình tự các cặp mồi sử dụng để nhận biết tế bào tạo xương bằng kỹ thuật RT-PCR 40
Bảng 3.1: Kết quả khảo sát thời gian nuôi cấy mô tách màng dây rốn 48
Bảng 3.2: Nuôi cấy mô phân lập tế bào 51
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát môi trường cơ bản để nuôi cấy phân lập tế bào 52
Bảng 3.4: Lượng canxi tích lũy trong tế bào cảm ứng biệt hóa bằng các chất cảm ứng khác
nhau ở những nồng độ khác nhau 72
Bảng 3.5: Kết quả OD khả năng tích tụ canxi của tế bào biệt hóa 77
Bảng 3.6: Hoạt tính Alkaline phosphatase 79
Bảng 3.7: Xác định khả năng tích tụ canxi trong 10 mẫu tế bào biệt hóa 82
Bảng 3.8: Hoạt tính Alkaline phosphatase của tế bào xương biệt hóa từ tế bào gốc trung mô
màng dây rốn 83
Bảng 3.8: Kết quả gây suy giảm miễn dịch chuột bằng Busulfan 20mg/kg và
Cyclophosphamide 50mg/kg 90

iv


DANH MỤC HÌNH


Hình 1.1: Đặc tính chưa có chức năng chuyên biệt, có thể tạo ra nhiều loại tế bào khác
nhau của tế bào gốc tạo máu 8
Hình 1.2: Các hình thức phân bào 8
Hình 1.3: Ứng dụng của công nghệ tế bào gốc 9
Hình 1.4: Phân loại tế bào gốc theo loại mô hay theo nguồn gốc 12
Hình 1.5: Sự thay đổi, biểu hiện các dấu ấn trong quá trình biệt hóa TBG trung mô thành tế
bào tạo xương và tế bào mỡ 17
Hình 1.6: Tiềm năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô từ các nguồn khác nhau 20
Hình 1.7: Ứng dụng của Tế bào gốc trung mô được thử nghiệm trên lâm sàng 22
Hình 1.8: Nguồn lấy tế bào gốc dây rốn 29
Hình 1.9: Hình ảnh phác thảo về nuôi cấy, tuyển chọn, cấy ghép tế bào gốc trung mô
(MSC
s
: ) từ tủy xương 30
Hình 3.1: Kết quả nhuộm HE xác định cấu trúc dây rốn 47
Hình 3.2: Tách màng dây rốn và cắt thành từng mảnh nhỏ 48
Hình 3.3. Nuôi cấy màng dây rốn phân lập tế bào 50
Hình 3.4: Kết quả khảo sát các môi trường phân lập tế bào 53
Hình 3.5: Kết quả thời gian nuôi cấy mô phân lập tế bào gốc trung mô 55
Hình 3.6: Kết quả hình ảnh phân lập tế bào gốc trung mô của 10/ 15 mẫu dây rốn 58
Hình 3.7: Kết quả khảo sát số lần cấy chuyển mô phân lập tế bào. 61
Hình 3.8: Kết quả nhuộm HE của các miếng mô nuôi cấy phân lập tế bào gốc trung mô qua
các lần cấy chuyển. 62
Hình 3.9: Nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung mô 63

Hình 3.10: Kết quả phân tích biểu hiện một số marker bề mặt của tế bào thu nhận được sau
khi cấy chuyền 3 lần 65
Hình 3.11: Kết quả biệt hóa tế bào gốc trung mô thành tế bào mỡ 68
Hình 3.12: Hình ảnh tế bào biệt hóa sau 21 ngày nuôi cấy được nhuộm bằng alizarin red 70


v
Hình 3.13: Giếng nuôi cấy và tế bào được biệt hóa ở các thời gian khác nhau được nhuộm
với alizarin red 76
Hình 3.14: Kết quả xác định canxi theo thời gian biệt hóa tế bào 77
Hình 3.15: Hoạt tính Alkaline phosphatase ở các thời điểm cảm ứng biệt hóa khác nhau 78
Hình 3.16: Hình ảnh tế bào biệt hóa sau 21 ngày nuôi cấy được nhuộm bằng alizarin red 80
Hình 3.17: Xác định khả năng tích tụ canxi trong 10 mẫu tế bào biệt hóa 81
Hình 3.18: Xác định hoạt tính Alkaline phosphatase trong 10 mẫu tế bào biệt hóa từ tế bào
gốc trung mô màng dây rốn 83
Hình 3.19: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RNA của tế bào gốc trung mô 85
Hình 3.20: Xác định dấu ấn ß-Actin, OC, ON của 10 mẫu tế bào tạo xương biệt hóa từ tế
bào gốc trung mô màng dây rốn 87
Hình 3.21: : Xác định dấu ấn ALP, COL của 10 mẫu tế bào tạo xương biệt hóa từ tế bào 88
Hình 3.22: Hình ảnh sau 1 tháng cấy ghép tế bào tạo xương trên chuột suy giảm miễn dịch 90
Hình 3.23: Nốt can xi sau khi làm tiêu bản nhuộm hematoxylin và eosin 91
Hình 3.24: Quy trình biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn thành tế bào tạo xương 92

1

ĐẶT VẤN ĐỀ


Tế bào gốc (TBG) là các tế bào chưa có chức năng chuyên biệt, có khả năng biệt
hoá thành nhiều loại tế bào khác nhau. Vì vậy, có thể sử dụng TBG để tạo ra tế bào mới
thay thế cho các tế bào bị tổn thương hoặc mất chức năng, đem lại triển vọng trong điều trị
một số bệnh nan y có liên quan đến thoái hóa hoặc thiếu hụt tế bào [8,11,14,15,19,
40,77,99].
Các bệnh về xương kh
ớp là một nhóm bệnh thường gặp và có xu hướng ngày càng
tăng, gây thiệt hại lớn về kinh tế do chi phí điều trị cũng như thiệt hại do giảm sức lao động
và nghỉ việc. Chỉ riêng tại Mỹ, thống kê năm 1999 cho thấy chi phí cho nhóm bệnh này
chiếm tới 2,5% GDP (khoảng 225 tỷ USD) nhưng năm 2004 đã lên tới 849 tỷ USD
chiếm tới 7,7% GDP. Ở Việt Nam cũng đã có nhiều nghiên cứu về

dịch tễ các bệnh
xương khớp đã được tiến hành: tỷ lệ loãng xương ở phụ nữ trên 50 tuổi tại Hà nội là 23%
và tại thành phố Hồ Chí Minh là 17%. Cùng với sự gia tăng về tuổi thọ, ngoài các bệnh
loãng xương và một số bệnh khác liên quan đến bệnh xương khớp, tổn thương sụn, thoái
hóa khớp và cột sống đang trở thành vấn đề quan trọng. Cùng với sự phát triển không
ngừng của khoa học kỹ thuật, công nghệ tế bào gốc đã mở ra một hướng mới trong điều trị
các bệnh về xương khớp và đã được ứng dụng ở nhiều quốc gia trên thế giới và một số
bệnh viện trong nước. Các kết quả điều trị cho thấy việc điều trị bằng tế bào gốc nói chung
và các tế bào gốc trung mô nói riêng có kết quả tốt trong tái tạo xương, sụn [30, 124, 138].
Ghép TBG từ tuỷ xương tự thân đã được dùng trên lâm sàng để điều trị thành công
các trường hợp gãy xương lâu liền và khớp giả [5,6,7,9,10,16]. Phương pháp điều trị
thường là tiêm trực tiếp các tế bào gốc từ tuỷ xương vào ổ gãy xương. Khi được tiêm vào ổ
gãy xương, các TBG trung mô của tủy xương biệt hoá in vivo thành các tế bào tạo xương
(TBTX) và tái tạo lại ổ gãy xương. Ngoài ra các TBG trung mô từ tuỷ xương có thể được
phân lập và biệt hoá ex vivo thành các tế bào tạo xương trước khi được ghép trở lại ổ
khuyết xương của bệnh nhân [11,13,14,16]. Tuy nhiên, qui trình thu thập TBG từ tủy
xương tương đối phức tạp và số lượng TBG thu được không nhiều, nhất là ở bệnh nhân
gãy xương lâu liền do nguyên nhân bệnh lý của xương và tủy xương.
Dây rốn trẻ sơ sinh là nguồn cung cấp TBG có nhiều ưu điểm cả về phương diện kỹ
thuật cũng như đạo đức. Dây rốn có nhiều loại TBG bao gồm TBG tạo máu, TBG biểu mô,
TBG trung mô, TBG nội mô chứa trong máu dây rốn, trong lớp gel Wharton hay trong lớp


2
màng bao dây rốn. TBG dây rốn được thu thập ngay khi sinh và có thể bảo quản đông lạnh
hay lưu giữ trong ngân hàng như một nguồn TBG dự trữ để sử dụng bất kỳ khi nào cho chủ
nhân sinh học của mẫu tế bào. TBG trung mô từ dây rốn tương tự như các TBG trung mô ở
tủy xương, do đó có thể sử dụng chúng như một nguồn TBG thay thế cho TBG ở tủy
xương [49,50,64].
Để ứng dụng điều trị vết thương xương sớm có kết quả, các TBG cần được biệt hóa

thành tế bào tạo xương trước khi được cấy ghép vào ổ gãy xương. Theo cách này, các TBG
trung mô được phân lập, sau đó được tăng sinh và biệt hóa in vitro thành các tế bào khi
quan sát dưới kính hiển vi có hình dạng giống tế bào tạo xương (gọi tắt là tế bào dạng tế bào tạo
xương hay tế bào dạng tạo xương) bằng cách bổ sung các yếu tố kích thích biệt hóa và tạo
xương vào môi trường nuôi cấy, bao gồm các cytokine, các vitamin và canxi. Đặc biệt, để
điều trị các khuyết hổng xương lớn như mất đoạn xương, các tế bào tạo xương còn được
nuôi trong các giá đỡ giá đỡ tế bào, tạo thành vật liệu thay thế xương (hay xương nhân
tạo). Từ đây, khi cấy ghép, các tế bào tạo xương trong đoạn xương nhân tạo sẽ kết hợp với
các tế bào khác từ tổ chức xương lân cận hình thành cấu trúc xương mới hàn gắn khuyết
hổng xương [12,13,14].
Xuất phát từ những cơ sở lý luận và thực tiễn nêu trên chúng tôi tiến hành nghiên
cứu đề tài: “Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn người thành tế bào
dạng tạo xương” với các mục tiêu sau:

1. Thu nhận và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung mô từ màng bao dây rốn người
làm vật liệu để biệt hóa tế bào.

2. Biệt hoá in vitro tế bào gốc trung mô màng dây rốn người theo hướng thành tế
bào dạng tạo xương nhằm ứng dụng điều trị tổn thương xương.

3


NỘI DUNG NGHIÊN CỨU:


1. Nghiên cứu áp dụng qui trình phân lập và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung
mô từ màng dây rốn trẻ sơ sinh.

2. Nghiên cứu minh chứng kiểm định tế bào phân lập được từ màng dây rốn người
theo qui trình áp dụng là tế bào gốc trung mô.

3. Nghiên cứu các điều kiện thích hợp biệt hóa của tế bào gốc trung mô từ màng
dây rốn người thành tế bào dạng tạo xương in vitro (môi trường cơ bản, chất
cảm ứng, thời gian ).

4. Nghiên cứu một số biến đổi của tế bào gốc trung mô màng dây rốn trong quá
trình biệt hóa thành tế bào dạng tế bào tạo xương.

5. Thử nghiệm cấy ghép tế bào dạng tạo xương thu được sau biệt hóa từ tế bào gốc
trung mô màng dây rốn người lên chuột nhắt đã gây suy giảm miễn dịch bằng
hóa chất.

4
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI


Từ nguồn tế bào gốc trung mô phân lập được từ dây rốn trẻ sơ sinh đã tiến hành biệt hóa
các tế bào gốc trung mô này thành tế bào dạng tạo xương rồi cấy ghép thử nghiệm tế bào được biệt
hóa trên mô hình chuột suy giảm miễn dịch bằng hóa chất.
Đây là công trình lần đầu được nghiên cứu một cách hệ thống về quy trình thu
nhận, nuôi cấy tăng sinh và biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn người thành tế bào
dạng tạo xương tại Việt Nam, mở ra một tiềm năng mới cho lĩnh vực y học tái sinh/tái tạo
sử dụng công nghệ tế bào gốc.




5
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN


1.1. Tế bào gốc và công nghệ tế bào gốc
1.1.1 Tình hình nghiên cứu tế bào gốc nước ngoài
Nghiên cứu đầu tiên về TBG được thực hiện bởi Ernest A. McCulloch và James E.
Till vào năm 1960. Theo các tác giả này thì TBG được chia thành hai nhóm: TBG phôi và

TBG ở các mô của người trưởng thành.
Năm 1981, Evans và Kaufman và Martin phân lập được TBG phôi từ phối tế bào
bên trong của phôi túi (blastocyst) chuột nhắt [71].
Năm 1998, James Thomson và cộng sự ở đại học Wisconsin-Madison (Mỹ) đã thu
nhận dòng TBG phôi người [71].
Năm 2001, Tìm ra một số phương pháp định hướng TBG biệt hóa in vitro tạo ra
các mô có thể dùng cho ghép mô.
Năm 2003, Tạo được noãn bào từ TBG phôi chuột. Điều này gợi ý rằng TBG phôi
có thể có tính toàn năng, bằng thực nghiệm có thể làm một tế bào “trẻ lại”.
Năm 2005, các nhà nghiên cứu ở Đại học Kingston (Anh) đã tuyên bố phát hiện
trong máu cuống rốn một liên loại TBG giống TBG phôi, chúng được thu nhận và gọi là
TBG giống TBG phôi phân lập từ máu cuống rốn (CBEs - Cord-blood-derived Embryonic-
like stem cells) [43]. Nhóm nghiên cứu này cũng đã thành công khi thử nghiệm biệt hóa
các TBG nói trên thành các tế bào có chức năng sinh lý trưởng thành.
Tháng 7/2005, Phan Toàn Thắng tại Đại học Quốc gia Singapore đã phân lập được
nguồn tế bào gốc mới từ dây rốn người. Các tế bào gốc này có khả năng ứng dụng cao
trong điều trị.
Tháng 8/2006, Kazutoshi Takahashi và Shinya Yamanaka đã tạo ra các TBG vạn
năng cảm ứng iPS (induced pluripotent stem cells: Tế bào gốc vạn tiềm năng cảm ứng).
Tháng 10/2007, Mario Capecchi, Martin Evans và Oliver Smithies đã nhận giải
thưởng Nobel y sinh học cho các thành tựu nghiên cứu về TBG phôi trên chuột tạo ra các
cá thể con biến đổi di truyền mong muốn.
Tháng 2/2008, nhóm nghiên cứu của nhà khoa học Baetge, của hãng Novocell (San
Diego, Mỹ) đã thành công trong việc biệt hóa tế bào gốc phôi người thành tế bào sản xuất
insulin, các tế bào này đã được thử nghiệm điều trị tiểu đường trên mô hình chuột và đã có
kết tốt.


6
1.1.2. Tình hình nghiên cứu tế bào gốc trong nước

Năm 1995, Bệnh viện Huyết Học-Truyền Máu Thành phố Hồ Chí Minh lần đầu sử
dụng tuỷ xương (thực chất là liệu pháp tế bào gốc tạo máu) để ghép điều trị cho 1 bệnh
nhân 27 tuổi bị bệnh bạch cầu mạn dòng tuỷ (CML) [25]. Tiếp đó, năm 1996 thực hiện
ghép tế bào gốc máu ngoại vi tự thân để điều trị bệnh lý ác tính về máu. Năm 2002 bệnh
viện này tiến hành ghép tế bào gốc tạo máu từ máu cuống rốn để điều trị bệnh bạch cầu cấp
dòng lympho (ALL) [25]. Sau đó Viện Huyết học truyền máu Trung ương cũng bắt đầu
tiến hành nghiên cứu ghép tuỷ xương để điều trị bệnh suy tuỷ, một số bệnh lý máu ác tính.
Từ năm 2004, Trung tâm Huyết học và Truy
ền máu - Bệnh viện TW Huế cũng đã triển
khai ghép tế bào gốc từ máu ngoại vi để điều trị bệnh Lơ-xe-mi cấp [17]. Tại Bệnh viện
Trung ương Quân đội 108, năm 2004 đã tiến hành các ca ghép tế bào máu từ máu tự thân
cho các bệnh nhân ung thư máu.
Năm 2007, Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 tiến hành
ghép tế bào gốc từ tủy xương điều tr
ị tổn thương xương khó lành hoặc khớp giả [13,14].
Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh tiến hành các nghiên cứu cơ bản về tế bào gốc, biệt hóa
tế bào gốc trung mô dây rốn [22, 23] Năm 2009, Ngân hàng tế bào gốc dây rốn đầu tiên
của Việt Nam được thành lập để lưu trữ các tế bào gốc từ mẫu mô dây rốn. Hiện tại ở Việt
Nam đang có một số ngân hàng tế bào gốc được thành lập. Đó là ngân hàng tế bào gốc
MekoStem của Công ty cổ phần Mekophar; ngân hàng TBG của Viện Huyết học - Truyền
máu thành phố Hồ Chí Minh.
Viện bỏng quốc gia, Học viện Quân y trong nhiều năm đã nghiên cứu trị liệu tế bào
trong điều trị vết thương, vết bỏng, các tấm da nuôi cấy đã được chế tạo và sử dụng trong
điều trị đạt kết quả tốt. Viện bỏng quốc gia hiện nay đã nuôi cấy thành công nguyên bào
sợi và tế bào sừng để điều trị vết thương, vết bỏng [1]. Năm 2012 cũng tại Học viện Quân
y đã phân lập thành công tế bào gốc từ màng ối người [2].
Bên cạnh các nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc tạo máu được triển khai ở các cơ sở
nêu trên, các nghiên cứu tế bào gốc phôi chuột nhắt và tế bào gốc phôi gà cũng đã được
tiến hành tại hai trường Đại học khoa học tự nhiên thuộc Đại học Quốc gia Hà nội và
Thành phố Hồ Chí Minh.

Ở nước ta, ước tính hàng năm riêng nhu cầu điều trị bệnh máu bằng ghép tế bào
gốc cũng đã khoảng 300 - 500 trường hợp. Nhu cầu điều trị các khuyết hổng mô và suy
chức năng tế bào/cơ quan rất lớn mà triển vọng có thể áp dụng trị liệu tế bào gốc càng là
con số lớn hơn. Tuy nhiên, lĩnh vực này vẫn còn biểu hiện nhiều hạn chế. Đó là nguồn tế


7
bào gốc còn hạn chế (mới chỉ dừng lại từ dây rốn, tủy xương) đặc biệt là các nghiên cứu áp
dụng tế bào gốc biệt hóa thành các dòng tế bào áp dụng điều trị còn chưa đạt hiệu quả cao.
Tại nước ta, vết thương khuyết hổng xương do chấn thương hoặc do các bệnh lý
khác nhau là vấn đề thường gặp trên lâm sàng. Hậu quả thường dẫn đến xương không liền,
khớp giả và các dị tật ảnh hưởng lớn đến vận động của bệnh nhân. Để điều trị các tình
trạng này đã có nhiều biện pháp điều trị khác nhau được tiến hành như ngoại khoa cố định
xương, ghép xương tự thân hoặc ghép xương khác gen đồng loài (xương tươi, xương đông
khô), ghép xương dị loài, ghép bột xương Tuy nhiên các biện pháp này không giải quyết
đượ
c triệt để và nhiều trường hợp vẫn để lại dị tật như chi ngắn chi dài. Gần đây Bệnh viện
Việt Đức Hà Nội và Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 đã tiến hành đề tài sử dụng ghép
tuỷ xương tự thân (trong đó có các TBG) vào vết thương xương khó liền để điều trị, trong
đó có các trường hợp khớp giả xương chày [13,14]. Song song với hướng ứng d
ụng lâm
sàng đối với các TBG tự thân, các nghiên cứu biệt hoá TBG từ tuỷ xương, từ máu dây rốn
thành tế bào xương cũng đã được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Tế bào gốc của Trường
Đại học KHTN, ĐH Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh. Các tác giả đã tạo ra được các tế bào tích
tụ can-xi được hiển thị bằng các phương pháp nhuộm và kiểm tra các dấu ấn đặc hiệu.
1.1.3. Tế bào gốc
Tế bào gốc (TBG) là các tế bào chưa có chức năng chuyên biệt, có tiềm năng phát
triển thành nhiều loại tế bào khác nhau (hình 1.1) và có khả năng tự thay mới (Self-
Renewal) [2,11,12,20,21,44,50,59]. Các tế bào này là các tế bào chưa biệt hóa
(Unspecialized Cell) hoặc đang ở những giai đoạn khác nhau nhưng chưa kết thúc quá

trình biệt hóa (tế bào vạn tiềm năng, tế bào đa tiềm năng, tế bào ít tiềm năng, tế bào đơn
tiềm năng), do vậy chúng có thể đi theo nhiều hướng khác nhau để tạo thành nhiều loại tế
bào khác nhau.


8


Hình 1.1: Đặc tính chưa có chức năng chuyên biệt, có thể tạo ra nhiều loại tế bào khác
nhau của TBG tạo máu (nguồn: Terese Winslow).

Tự thay mới là khả năng của các TBG tạo ra các tế bào giống hệt chúng về mức độ
biệt hóa. Thông thường các tế bào phân chia theo kiểu đối xứng (Symetric): từ 1 tế bào tạo
ra 2 tế bào giống hệt nhau; các TBG là các tế bào có khả năng phân chia không đối xứng
(Asymetric): từ 1 tế bào tạo ra 2 tế bào không giống nhau (hình 1.2), 1 tế bào giống hệt tế
bào ban đầu về mức độ biệt hóa, tế bào còn lại đã biệt hóa hơn sẽ tiếp tục phân chia như
vậy để tạo thành các tế bào, cơ quan chuyên biệt. Khả năng tự thay mới và đặc tính chưa
có chức năng chuyên biệt chính là cơ sở cho những tiềm năng ứng dụng to lớn của công
nghệ TBG.

Hình 1.2: Các hình thức phân bào

Nghiên cứu về TBG có thể cho ta thêm những hiểu biết về quá trình biệt hóa tế bào
và sự phát triển của cơ thể người. Bản chất của quá trình biệt hóa là việc tắt các gen trong


9
vốn gen chung. Hiểu rõ về quá trình này ta có thể chủ động tác động và kiểm soát để tạo ra
các tế bào như mong muốn hoặc điều trị các bệnh di truyền .
Trên cơ sở các TBG chưa hoàn tất quá trình biệt hóa và khả năng tăng sinh mạnh mẽ

của chúng, các nhà khoa học có thể chủ động tạo ra các tế bào giống hệt nhau và ở các giai
đoạn sinh lý, bệnh lý khác nhau rất gần với thực tế lâm sàng, điều này rất có ý nghĩa trong
việc nghiên cứu cơ chế tác dụng cũng như độc tính của các loại thuốc hay các chế phẩm
sinh học.
Có thể nói ứng dụng quan trọng và rộng lớn nhất của công nghệ TBG là trong điều
trị. Trên cơ sở các TBG có thể biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau, chúng ta có thể
chủ động nuôi cấy TBG trong ống nghiệm sau đó biệt hóa chúng thành các tế bào như tế
bào cơ, tế bào xương, tế bào thần kinh, tế bào sụn, tế bào tuyến tụy, tế bào cơ tim (hình
1.3) rồi ghép vào cơ thể người bệnh để điều trị một số bệnh như các bệnh lý tim mạch,
điều trị Parkinson, tiểu đường, trong lĩnh vực thẩm mỹ hay thúc đẩy quá trình liền
xương… [31,35].

Hình 1.3: Ứng dụng của công nghệ TBG [31]



10
1.1.4. Phân loại tế bào gốc
Hiện nay có nhiều cách phân loại TBG, tùy theo các tiêu chí khác nhau cũng như sự
tiếp cận công nghệ TBG ở các góc độ khác nhau.
Theo mức độ tiềm năng biệt hóa có: TBG toàn năng (các tế bào của phôi dâu), TBG
vạn tiềm năng (các tế bào tách từ khối tế bào bên trong của phôi nang), TBG đa tiềm năng
(các tế bào tách từ ba lá phôi…), TBG ít tiềm năng (TBG tạo máu…), tế bào đơn tiềm năng
(tế bào tiền thân hồng cầu…) [3,4].
Theo cách thức tạo ra các TBG có các TBG tự nhiên và các TBG nhân tạo (các
TBG tạo ra từ công nghệ chuyển nhân và các TBG tạo ra từ công nghệ gen).
- Tế bào gốc phôi (embryonic stem cell), chính xác là các tế bào gốc từ phôi, được
phân lập từ phôi (bất kỳ phần nào của phôi, không giới hạn chỉ vào các tế bào của khối tế
bào bên trong phôi nang), là các tế bào gốc toàn năng hoặc vạn tiềm năng. Để có được các
tế bào này thường phải hủy phôi. Đã có những thông báo sinh thiết phôi lấy ra một số tế

bào của phôi sau đó phôi vẫn phát triển bình thường. Tuy nhiên còn nhiều nghi ngại về tính
an toàn của kỹ thuật này đối với phôi được sinh thiết, đặc biệt là sinh thiết khối tế bào bên
trong của phôi nang để có được các tế bào gốc phôi “kinh điển”.
- Tế bào gốc thai (fetal stem cell) được phân lập từ các mô của thai sau nạo phá
thai, thường là đa tiềm năng hoặc vạn tiềm năng. Việc nghiên cứu và sử dụng các tế bào
này có ảnh hưởng khá nặng nề về đạo đức nghiên cứu, nên thường chỉ giới hạn vào mục
đích tìm hiểu quá trình phát triển phôi thai.
- Tế bào gốc nhũ nhi (infant stem cell) được phân lập từ trẻ sơ sinh hoặc các phần
phụ của thai như dây rốn, nhau thai, màng ối, dịch ối… Các tế bào này thường là đa tiềm
năng hoặc vạn tiềm năng. Tùy theo cách thu thập có thể ảnh hưởng hoặc không ảnh hưởng
đến đối tượng cho tế bào. Chọc dịch ối trước khi sinh hoặc chọc tĩnh mạch dây rốn trước
sinh để lấy tế bào gốc của em bé có trong dịch ối hoặc trong máu dây rốn có những nguy
cơ của các kỹ thuật này là nhiễm trùng, chảy máu, sẩy thai hoặc đẻ non… Tuy nhiên, lấy
máu dây rốn từ dây rốn hoặc bánh nhau sau khi đã “mẹ tròn con vuông” vừa được tế bào
có thành phần giống hệt máu tĩnh mạch của trẻ sơ sinh lại không ảnh hưởng gì đến em bé.
Tương tự như vậy, lấy các tế bào từ mô dây rốn và bánh nhau sau khi sinh cũng không ảnh
hưởng đến sức khỏe của em bé vì các thành phần này là sản phẩm bỏ đi sau khi sinh.
- Tế bào gốc trưởng thành (adult stem cell) được phân lập từ các mô của người từ
trẻ em đến người già. Các tế bào này rất đa dạng, từ đa tiềm năng hoặc đơn tiềm năng. Kỹ
thuật thu thập ít nhiều đều ảnh hưởng đến sức khỏe của người cho nhưng mức độ dao động


11
rất lớn. Ví dụ lấy răng sữa hoặc da qui đầu của trẻ sau khi rụng hoặc cắt bỏ để tách tế bào
gốc không ảnh hưởng gì đáng kể đến trẻ; lấy dịch tủy xương để có tế bào gốc tủy xương
của bệnh nhân hoặc người hiến tủy xương là kỹ thuật tương đối phức tạp có hưởng nhất
định đến người cho vì ngoài việc thao tác chọc hút còn phải sử dụng thêm một số thuốc tác
động lên tủy xương.
- Tế bào giống tế bào gốc phôi (embryonic-like stem cell) hay tế bào gốc vạn tiềm
năng cảm ứng (induced pluripotent stem cell: iPS): được tạo ra bằng cách cảm ứng các tế

bào đã biệt hoá của cơ thể trở lại trạng thái giống như tế bào gốc phôi hay còn gọi là tế bào
gốc nhân tạo. Đây là kỹ thu
ật chủ yếu thao tác trong phòng thí nghiệm, người cho tế bào để
cảm ứng (ví dụ tế bào da) bị ảnh hưởng rất ít, có thể là sinh thiết để lấy một miếng da nhỏ.
- Tế bào gốc ung thư (cancer stem cell) được phân lập từ các khối u. Các tế bào gốc
này được coi là nguồn gốc của khối u. Trong chiến lược trị liệu miễn dịch chống ung thư,
tế bào này đang được chú ý để làm vaccine chố
ng ung thư với hy vọng điều trị được “tận
gốc” ung thư. Các tế bào gốc ung thư từ khối u của chính bệnh nhân hoặc khối u cùng loại
của bệnh nhân khác được dùng làm vaccine kích thích hệ thống miễn dịch của bệnh nhân
chống lại các thành phần của khối u.

12



Hình 1.4: Phân loại TBG theo loại mô hay theo nguồn gốc (theo Lee E. H. và Hui J. H. P, 2006) [85]


13
Theo nguồn gốc hay theo loại mô có hai nhóm lớn đó là các TBG phôi (Embryonic Stem
Cell) và các TBG trưởng thành (Adult Stem Cell), trong mỗi nhóm lại được chia nhỏ hơn
thành nhiều loại TBG khác [33]. Đây là cách phân loại hay sử dụng và trong khuôn khổ
nghiên cứu.
TBG phôi là các tế bào được tách ra từ khối tế bào bên trong (Inner Cell Mass – ICM)
của nụ phôi. Phôi nang này có thể là các phôi thừa của quá trình thụ tinh trong ống nghiệm (In
Vitro Fertilization) hoặc được tạo ra từ công nghệ chuyển nhân (Nuclear Transfer). Trong
những điều kiện nhất định, các t
ế bào này có thể biệt hóa thành bất kì loại tế bào nào trong cơ
thể, về tiềm năng biệt hóa thì đây chính là các tế bào vạn tiềm năng [31]. Hơn nữa các tế bào

này còn rất non nên có khả năng tăng sinh rất mạnh mẽ, chúng có thể nhanh chóng tạo ra một
số lượng lớn các tế bào nếu được cung cấp đầy đủ các yếu tố cần thiết, do vậy các tế bào này
có tiềm năng rất lớ
n trong điều trị. Đây cũng là loại tế bào được quan tâm nhiều nhất không
chỉ vì tiềm năng ứng dụng to lớn của chúng mà còn vì vấn đề đạo đức xung quanh việc sử
dụng các tế bào này bởi lẽ để thu được các tế bào này cần phải phá hủy phôi đồng nghĩa với
việc “giết người” và điều này bị nhiều tổ chức và quốc gia lên án.
TBG trưởng thành là các TBG phân lập t
ừ trẻ sơ sinh và các thành phần có liên quan
như màng ối, dây rốn; hoặc từ cơ thể trưởng thành [33]. Theo loại mô các TBG trưởng thành
lại được phân thành TBG trung mô (Mesenchymal Stem Cell), TBG tạo máu (Hematopoietic
Stem Cell), TBG của biểu bì da (Epidermal Stem Cell), TBG của tủy xương (Bone marrow
Stem Cell)…
Các tế bào gốc có rất nhiều triển vọng ứng dụng trong nghiên cứu cơ bản, nghiên cứu
phát triển thuốc cũng như ứng dụng vào điều trị trên lâm sàng. Trong nghiên cứu phát triển
thuốc thì cần có nh
ững mô hình thử thuốc (cả tác dụng lẫn độc tính) càng giống với mô hình
bệnh lý và có độ lặp lại cao qua các lần thử thì càng chính xác. Thí dụ, muốn khảo sát tác dụng
của một thuốc mới có khả năng chữa bệnh Alzheimer thì công nghệ tế bào gốc giúp tạo ra
được hàng hoạt tế bào thần kinh giống hệt nhau để làm mô hình thử thuốc sát với bệnh
Alzheimer nhất.
Tiềm năng ứng dụng quan trọng nhấ
t của tế bào gốc là ứng dụng lâm sàng qua trị liệu
tế bào gốc (stem cell therapy). Từ tế bào gốc có thể tạo ra các loại tế bào mới, mô mới để bổ
sung hoặc thay thế cho các tế bào và mô cơ quan bị tổn thương hay mất chức năng. Cho tới
nay biện pháp hữu hiệu nhất để điều trị những trường hợp này là ghép mô, cơ quan - nhưng