TIỂU LUẬN:Chuẩn đoán virus Viêm não Nhật Bản bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào ppt

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT


- 1 -
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC







GVHD: PGS.TS. NGUYỄN NGỌC HẢI
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Hoa Thùy (MSSV: 06126151)






Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2009
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT


- 2 -
ĐẶT VẤN ĐỀ

Chúng ta thấy ở nước ta, mùa hè là mùa dễ phát sinh nhiều loại bệnh như
dịch tả, thương hàn, sốt xuất huyết,… và đặc biệt một bệnh rất nguy hiểm là bệnh
viêm não Nhật bản, hay gặp ở trẻ dưới 15 tuổi và nhóm có nguy cơ cao nhất là trẻ
từ 2 – 6 tuổi (chiếm 75% tổng số trẻ mắc bệnh).
Theo thông báo của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, mỗi năm có khoảng
3000 trẻ em mắc bệnh viêm não, trong đó có 30 – 40% bị bệnh viêm não Nhật
bản. Bệnh viêm não Nhật Bản do muỗi truyền virus và phát triển mạnh vào mùa
nắng nóng nên thường gọi là bệnh viêm não mùa hè hay bệnh viêm não B. Hiện
nay bệnh viêm não Nhật Bản chưa có thuốc đặc trị nên thường có tỷ lệ tử vong cao
(10-20%) hay là để lại những di chứng nặng nề như động kinh, giảm học lực, đần
độn, liệt, thất ngôn. Những di ch
ứng này thường chiếm 50% người mắc bệnh,
thường gây tàn phế, mất khả năng lao động để lại gánh nặng cho gia đình, xã hội.
Ở chuyên đề này, tôi xin trình bày kỹ hơn về virus và bệnh viêm não Nhật
Bản, đặc biệt là phương pháp chuẩn đoán virus này bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào.








TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT


- 3 -
TỔNG QUAN
I-Bệnh viêm não Nhật Bản

1. Khái niệm:
Viêm não Nhật Bản (VNNB) là một bệnh truyền nhiễm trùng cấp
tính gây ra bởi một loại siêu vi trùng thuộc nhóm Arbovirus có ái tính với tế bào
thần kinh, có tên là Japanese Encephalitis Virus (JE Virus). Virus lây truyền qua
người nhờ trung gian là muỗi Culex tritaeniorhynchus và Culex vishnui. Bệnh có
thể xảy ra rải rác hay thành dịch. Bệnh không truyền từ người này sang người
khác.Bệnh có thể dẫn đến tình trạng tổn thương não vĩnh viễn, tỷ lệ tử vong rất
cao. Bệnh viêm não đã mô tả từ năm 1871 nh
ững mãi đến nam 1935 mới phát
hiện và phân lập được từ bệnh nhân ở Tokyo nên được gọi là bệnh viêm não Nhật
Bản.
Tùy theo mức độ và vị trí tổn thương tại hệ thần kinh trung ương
(HTKTW), lâm sàng sẽ có biểu hiện triệu chứng của nơi bị xâm phạm như : viêm
não, viêm màng não, viêm sừng trước tủy sống hoặc bệnh cảnh phối hợp: viêm
não màng não, viêm não màng não tủy sống.
2. Dịch tễ học
Khái quát lịch sử:

VNNB là bệnh dẫn đầu trong số các bệnh viêm não do virus ở Châu
Á. Nó được lưu hành rộng rãi ở các nước trong vùng Đông Á, Nam Á, và Đông
Nam Á trong đó có Việt Nam. Bệnh cũng đã xuất hiện ở phía Tây Thái Bình
Dương. Hằng năm vào khoảng 50000 trường hợp mới mắc trên thế giới với con
số tử vong ước chừng 10000(1988).
Bệnh đã được biết tới vào 1871 nhưng mãi đến năm 1924 mới biết
rõ về lâm sàng qua trận dịch lớn với 6000 trường hợp, và tỷ lệ tử vong vào
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT

- 4 -
khoảng 60% (ở Nhật Bản), bệnh được gọi là “ viêm não mùa hè”. Năm 1935
người ta phân lập được virus từ não của một bệnh nhân tử vong tại Tokyo, và
cung cấp được chủng Nakayama nguyên mẫu. Virus này được gọi là virus VNNB
B có liên quan đến viêm não mùa hè tại Nhật Bản.
Năm 1952, virus VNNB đầu tiên được phân lập từ một lính viễn
chinh Pháp tại miền Bắc Việt Nam, tiếp theo đó năm 1953 có 98 trường hợp
VNNB trong quân đội viễn chinh Pháp.
Trong thập kỉ 1960 có nhiều trận dịch viêm não siêu vi được gọi là
hội chứng viêm não cấp tính gọi tắt là hội chứng não cấp (HCNC), xảy ra tại hầu
hết các địa phương ở miền Bắc, nhất là ở miền trung du và vùng đồng bằng châu
thổ sông Hồng, có nơi tỷ lệ mắc bệnh hằng năm lên tới 6-10/100000 dân với tỷ lệ
tử vong từ 5,7% - 28,5% và siêu vi VNNB là tác nhân gây ra 50% - 70% HCNC.
Tại miền Nam viêm não siêu vi xảy ra rải rác quanh năm, số mắc
cao nhất vào năm 1980 với tỷ lệ 4,95/100000 dân và tỷ lệ tử vong 27,46% thường
tập trung nhiều ở đồng bằng sông Cửu Long, nơi có thói quen nuôi heo gần nhà.
Chưa tiến hành nghiên cứu có hệ thống tại đây, nhưng qua kết quả báo cáo sơ bộ
của bệnh viện lớn tại TP.HCM, từ 64% - 69% hội chứng não cấp nhập viện có tác
nhân gây b
ệnh là virus VNNB, với tỷ lệ tử vong vào khoảng 16%.
Về mặt dịch tễ học bệnh VNNB có đặc điểm
:
a. Nguồn lây
Các loài chim hoang dã như cò, diệc, cò quặm, liếu điếu… và các
loài chim khác sống gần các vùng đầm lầy là những vật chủ quan trọng mang
mầm bệnh virus VNNB.
Các nhà khoa học đã xác định và phân lập được virus VNNB từ nội
tạng của chim hoang dã. Mặc dù mang virus trong máu kéo dài nhưng các loài
chim này không biểu hiện bệnh, và nó là nguồn lây nhiễm cho các loài muỗi
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT


- 5 -
trong thiên nhiên. Các loài chim di cư có thể lây truyền mầm bệnh virus từ vùng
này qua vùng khác.

Qua điều tra giám sát về huyết thanh, hầu hết gia súc như trâu bò,
dê, cừu, chó, đều có thể nhiễm virus VNNB, nhưng chỉ có heo, ngựa có biểu hiện
bệnh như: viêm não ở ngựa, virus có thể qua nhau, nhiễm bào thai ở heo nái gây
chết thai, hoặc xảy thai.
Tuy nhiên chỉ có heo là nguồn nhiễm virus huyết quan trọng truyền
cho muỗi vì những lý do sau:
- Heo đẻ được nhiều lứa, tạo ra số lượng một quần thể heo cảm nhiễm virus
mới
- Luân chuyển thường xuyên mỗi 6-8 tháng
- Chỉ số heo nhiễm virus trong tự nhiên cao hơn tất cả gia súc khác
- Nhiễm virus máu ở heo thường cao nên dễ truyền virus qua muỗi
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT


- 6 -
b. Trung gian truyền bệnh
Đối với virus VNNB thì
muỗi là con vật trung gian truyền bệnh
quan trọng. Hiện nay người ta đã phát
hiện có 30 loài muỗi khác nhau thuộc 5
họ Culex, Anopheles, Aedes, Mansoni
và Amergeres là trung gian truyền bệnh

VNNB do virus, trong đó có 2 loại
C.tritae, C.vishui là vật chủ trung gian có khả năng truyền bệnh cao nhất.
Nhiều nghiên cứu đã khẳng định muỗi Culex Tritaeniorhynchus là
vật chủ trung gian chính lan truyền virus VNNB tại Việt Nam. C.Tritae có nhiều
ở vùng nông thôn nơi mương máng, đồng ruộng ngập nước. Về đêm muỗi cái ưa
hút máu động vật có xương sống như gia súc, chim, và cả người, sau đó bay phát
tán đi xa.
Muỗi hút máu
động vật là heo, chim, trong
thời kỳ nhiễm virus huyết,
virus nhân lên trong muỗi với
hiệu quả cao, sau đó có khả
năng truyền bệnh suốt đời và
có thể truyền virus sang thế hệ
sau qua trứng. Muỗi truyền mầm bệnh virus từ chim sang lợn và người khi đốt,
muỗi cũng có thể truyền mầm bệnh virus từ lợn sang người.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT


- 7 -
c. Chu trình lây truyền virus VNNB
Virus VNNB được bảo tồn trong thiên nhiên do truyền sinh học từ
động vật có xương sống này sang động vật có xương sống khác qua trung gian
côn trùng hút máu là muỗi. Tuy chim là động vật chủ cơ bản của quá trình trong
việc duy trì virus VNNB trong tự nhiên nhưng chưa có nghiên cứu rõ về vai trò
quan trọng của chim trong việc truyền virus VNNB qua muỗi đến người.
Heo là vật chủ quan trọng nhất có khả năng làm lan rộng virus
VNNB, và chu trình tồn tại quanh năm. Người sống gần chu trình sinh thái tự

nhiên này có thể mắc bệnh khi bị muỗi đốt. Người được coi là vật chủ cuối cùng
đối với virus VNNB và có vai trò rất quan trọng trong dịch tễ học bệnh này.
Virus VNNB trong máu người tồn tại trong thời gian ngắn với nồng
độ thấp, nên không thể lây bệnh từ người này sang người khác qua muỗi đốt.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT


- 8 -
d. Phân bố bệnh
Phân bố theo mùa:
¾ Virus VNNB lan truyền theo mùa trên hầu hết các vùng của Châu Á.
¾ Khí hậu với những yếu tố nhiệt độ và mưa có ảnh hưởng đến tình
hình bệnh. Ở vùng ôn hòa, virus Japansese encephalitis lan truyền vào mùa hè và
đầu mùa thu(vào khoảng từ tháng 5-9). Ở vùng cận nhiệt và nhiệt đới, sự lan
truyền virus theo mùa có liên quan đến sự thừa thải trung gian truyền bệnh là
muỗi và vật chủ lan truyền có xương sống.Vào mùa mưa ruộng lúa đầy n
ước tạo
điều kiện tốt cho muỗi sinh sản và phát triển mạnh trong thiên nhiên, trùng hợp
với thời điểm bệnh xảy ra nhiều.
¾ Vào mùa hè thời tiết nóng, ở nhiệt độ từ 27
0
C - 30
0
C virus thường
phát triển tốt trong cơ thể muỗi. Nếu dưới 20
0
C thì sự phát triển của virus dừng
lại.
¾ Mô hình dịch tễ học lại khác nhau giữa các vùng miền, cụ thể là ở 2

miền Nam Bắc Việt Nam. Tại miền Bắc bệnh giảm nhiều vào những tháng lạnh,
tăng vào những tháng hè và đỉnh cao vào tháng 5-6-7. Tại miền Nam, thời tiết
nóng bệnh rải rác quanh năm.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT


- 9 -


Phân bố theo tuổi và giới tính :
¾ Tất cả mọi lứa tuổi chưa có miễn dịch đều có thể mắc bệnh. Ở những
vùng có bệnh VNNB lưu hành, trẻ em sớm tiếp xúc với tác nhân gây bệnh nên tỷ
lệ mắc bệnh ở trẻ cao thường từ 2-10 tuổi, phần đông ở thể không triệu chứng lâm
sàng, số lượng trẻ có kháng thể đặc hiệu tăng theo tuổ
i nên tỷ lệ mắc bệnh giảm ở
trẻ lớn và người lớn. Những người nếu chưa có miễn dịch đặc hiệu đều có thể
mắc khi đến vùng có VNNB lưu hành. Bệnh không liên quan tới giới tính tuy
nhiên trong thực tế số bệnh nam thường nhiều hơn nữ.
Tuy chu trình sinh thái của virus VNNB trong thiên nhiên
không thay đổi, nhưng tình hình dịch tễ có biến đổi trước tác động của con người,
như thay đổi lề lối canh tác và chăn nuôi, đô thị hóa, điều kiện kinh tế xã hội
được nâng cao, sử dụng thuốc diệt trừ côn trùng trong canh nông, và cuối cùng là
vaccine chủng ngừa VNNB đã được sử dụng.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT


- 10 -
3. Cách sinh bệnh

Khi bị muỗi đốt, virus từ nước bọt của muỗi qua da. Giai đoạn đầu
virus nhân lên tại chỗ và ở hạch lympho vùng, đây là nguồn dẫn đến virus huyết
đầu tiên. Từ máu virus đi đến các tổ chức và nội tạng khác như tổ chức lympho,
mô liên kết, cơ vân, cơ tim, tuyến nội và ngoại tiết. Virus tiếp tục nhân lên tại tổ
chức ngoài thần kinh đưa đến virus huyết lần n
ữa kéo dài 3-5 ngày, thường với
nồng độ thấp ở người. Nếu kháng thể trung hòa tăng kịp thì xảy ra hiện tượng
virus huyết ngưng. Chưa biết rõ cơ chế xâm nhập hệ thần kinh trung ương của
virus. Tuy nhiên, não bộ bị nhiễm lan tỏa chứng tỏ virus xâm nhập qua đường
mạch máu. Mặt khác khi hàng rào mạch máu não bị tổn thương trong giai đoạn
tiềm ẩn dễ tạo cơ hội cho virus xâm nh
ập thần kinh, như mắc bệnh VNNB trong
trường hợp có sẵn bệnh cysticercosis não, hoặc sau chấn thương sọ não.
Những biến đổi bệnh lý trong quá trình phát triển của virus trong hệ
thần kinh trung ương như sau :
¾ Virus nhân lên trong tế bào thần kinh với nồng độ trong não gấp
triệu lần so với ở vị trí khác ngoài thần kinh. Trong giai đoạn cấp tính, nói chung
màng não bình thường hoặc thoáng mờ, não bị xung huyết , phù nề, xuất hiện
điểm xuất huyết hoặc chảy máu tại chất xám, hoại tử ở đồi thị, nhân xám nề
n sọ,
não giữa, tiểu não, nhân xám thân não, chất xám của võ não, không thấy tổn
thương của chất trắng. Sừng trước tủy sống bị tổn thương giống như trong sốt bại
liệt.
¾ Về mặt vi thể, hiện tượng tế bào thần kinh đệm thực bào thần kinh
chết tạo ra những nốt điển hình do quá sản tế bào thần kinh đệm, khi bệnh kéo dài
tế bào viêm bao quanh huyết qu
ản tạo thành những hình ảnh vỏ ngoại quản, cuối
cùng xuất hiện những ổ hoại tử khan hiếm tế bào do những tế bào thần kinh bị
thoái hóa, tiêu hủy tạo ra, đôi khi có chất vôi ứ đọng bên trong.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT


- 11 -
4. Đặc trưng bệnh
VNNB có một thời kì ủ bệnh từ 5-15 ngày. Bệnh nhân có triệu
chứng giống như cảm cúm. Sốt và lạnh run, sổ mũi là những dấu hiệu ban đầu
của bệnh này. Sau đó là một số triệu chứng như nhức đầu, khó chịu, nôn
mửa ,có thể rối loạn tâm lý. Trẻ em thường kém ăn. Trong trường hợp nặng có
thể suy nhược, liệt nhẹ, co giật, sốt cao 39-41
o
C, có thể dẫn đến hôn mê và tử
vong. Ở trẻ có tình trạng rối loạn ý thức, nôn mửa, cứng gáy, sảng, ảo giác, co
giật, động kinh và lâm vào tình trạng rối loạn nhịp thở, hôn mê.
Nếu có dấu hiệu nghi ngờ nhiễm bệnh, bệnh nhân cần được đến
bệnh viện càng sớm càng tốt để tiến hành các xét nghiệm chẩn đoán bệnh ( như
xét nghiệm máu, dịch não tủy, huyết thanh học, điện não đồ
5. Điều trị
Cho đến nay chưa có một phương pháp điều trị đặc hiệu nào cho
bệnh này. Chủ yếu là điều trị triệu chứng, nâng đỡ bệnh nhân trong các đơn vị hồi
sức cấp cứu (chống sốt, chống co giật, chống phù não, trợ tim mạch, hô hấp,
chống rối loạn thần kinh thực vật, chăm sóc tích cực, dinh dưỡng tốt ).
Trong giai đoạn phục hồi, người bệnh cũng cần được huấn luyện
phục hồi các di chứng.
II. Virus viêm não Nhật Bản và phương pháp chuẩn đoán virus
đó bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào
1.Virus viêm não Nhật Bản
a) Giới thiệu chung
Virus viêm não Nhật Bản thuộc họ Flaviridae. Nó có quan hệ gần

gũi với West Nile virus và ST.Louis encephalitis virus.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT


- 12 -
Virus viêm não Nhật Bản hình cầu, nhân chứa RNA mạch đơn, kích
thước 45-50nm, bao quanh bởi cấu trúc hình khối gọi là capsid, phần vỏ giàu chất
lipid.
Virus viêm não Nhật
Bản dễ mất hoạt lực ở nhiệt độ
56
o
C trong nửa giờ hoặc trong
formalin 0,2%, ether,
natrideoxycholate và cũng bị bất
hoạt nhanh bởi tia tử ngoại.
Virus này có thể được
nuôi cấy trên tế bào thận heo, thận
chuột Hamster, trên não chuột
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT


- 13 -
bạch sơ sinh, chuột bạch trưởng thành hay trên tế bào của tổ chức côn trùng như
muỗi.
Virus viêm não Nhật Bản có 3 loại protein kháng nguyên: protein
màng M, protein lõi C, protein vỏ E trong đó kháng nguyên vỏ E đóng vai trò
quan trọng nhất trong bước đầu tiên của phản ứng với tế bào kí chủ và tạo ra kích

thích miễn dịch bảo vệ cơ thể.
b) Bộ gen virus VNNB
Bộ máy di truyền của virus viêm não Nhật Bản là 1 RNA mạch đơn
2. Chuẩn đoán virus VNNB bằng kỹ thuật Shell vial culture (SVC)
Shell vial culture (SVC) là sự biến đổi của công nghệ nuôi cấy tế
bào thông thường cho phát hiện nhanh virus trong ống nghiệm. Kỹ thuật này gồm
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT


- 14 -
có sự tiêm nhiễm mẫu lâm sàng vào tế bào một lớp phát triển trên một lá kính đậy
(lamen) trong ống nuôi cấy SVC, sau đó đem đi ly tâm ở tốc độ chậm rồi ủ.
Hệ thống này làm việc trên nguyên lý ly tâm tốc độ chậm làm tăng
tính nhiễm virus vào những tế bào nhạy cảm. Người ta nghĩ rằng chấn thương
nhỏ trên bề mặt tế bào đưa đến kết quả của việc ly tâm tốc độ chậm làm gia tăng
lực cho virus vào trong tế bào, việc này làm giảm tổng thời gian mà virus xâm
nhiễm vào tế bào.
Trước tiên SVC được mô tả cho cytomegalovirus ở chuột. Sau đó,
nguyên lý này được dùng trong lĩnh vực dược phẩm vi sinh cho phân lập
Chlamydia trachomatis từ vùng sinh dục của người. Phát hiện nhanh
cytomagelovirus trong mẫu nước tiểu ở người đã nhiễm sử dụng sự biểu hiện của
tế bào nguyên bào sợi lưỡng bội của người (MRC-5), nó có ích trong chuẩn đoán
virus. Sự nhanh của kỹ thuật này mà không giảm tính nhạy đã làm SVC trở nên
phổ
biến trong trường hợp bệnh lâm sàng do virus.
SVC được dùng để chuẩn đoán nhanh nhiều loại virus khác nhau
như cytomegalovirus, Herpes Zoster, Mumps (quai bị), Measles (bệnh sởi) và
virus hợp bào hệ hô hấp. Trong tất cả các nghiên cứu, kỹ thuật SVC biểu hiện gia
tăng tốc độ phân lập virus mà không làm giảm độ nhạy. Kỹ thuật SVC làm giảm

thời gian so với kỹ thuật nuôi cấy tế bào thông thường. Kỹ thuật SVC tốn khoảng
36 giờ trong khi kỹ thuật nuôi cấy thông thường cần
đến 3-7 ngày cho chuẩn đoán
một mẫu quan trọng.
Trong 50 mẫu lấy từ 50 bệnh nhân, SVC có thể chuẩn đoán tất cả 24
trường hợp dương tính chuẩn đoán bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang
trực tiếp. Ngoài ra, SVC còn chuẩn đoán được thêm 5 trường hợp mà phương
phâp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp không chuẩn đoán được.
Nguyên liệu và phương pháp
¾ Mẫu:
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT


- 15 -
Dịch não-tủy được lấy từ việc tiêm chích vào thắt lưng 50 bệnh nhân, bao
gồm 46 bệnh nhân khoa nhi từ 18 tháng tuổi đến 12 tuổi và 4 người trưởng thành
từ 13 đến 40 tuổi. Tất cả các bệnh nhân này đến từ Pondicherry và quận lân cận
của Tamil Nadu State.
¾ Dòng tế bào:
Tế bào thận lợn (PS-Porcine Kidney) lấy từ trung tâm quốc tế về khoa học
tế bào được sử dụng trong nghiên cứu. Tế bào phát triển trong bình nuôi cấy mô
plastic và bình Roux ở 37
o
C.
¾ Dung môi:
Eagle’s modified MEM, NEAA, phenol red không có l-glutamine,
NaHCO
3
và kháng sinh được sử dụng. L-glutamine (3%), NaHCO

3
, vitamine,
glucose (10%), huyết thanh bào thai bò (10%) và hỗn hợp kháng sinh (Penicillin
100U/ml, Gentamicin 4 mg/ml, Streptomycin 100µg/ml, Ciprofloxacin 2mg/ml và
Amphoterincin-B5 mg/ml) được thêm vào sau khi Eagle’s modified MEM được
hấp.
¾ Shell vials
Shell vials hình trụ phần đáy được dát mỏng và tiệt trùng (4.5 cm x 1.5
cm), với lamen đường kính 13mm lấy từ Flow Laboratories, Scotland.
Mouse Ascitic Fluid (MAF) và Rabbit IgG FITC kết hợp được dùng cho việc
nhuộm đốm CSF và tế bào một lớp trong shell vial.
¾ Controls (Sự thử lại):
Virus VNNB gây nhiễm vào tế bào não chuột lấy từ Viện sức khỏe tâm
thần và khoa học thần kinh quốc tế
(Nation Institute of Mental Health and
Neurosciences), Bangalore, nó được gây nhiễm vào não chuột sơ sinh. Rồi sau đó
giống được làm thích ứng với dòng tế bào thận lợn trong phòng thí nghiệm. Tế
bào thận lợn nhiễm virus VNNB được nhuộm màu bằng kỹ thuật huỳnh quang
miễn dịch trực tiếp phù hợp với sự thử lại dương tính với thí nghiệm huỳnh quang
miễn dịch trực tiếp trong những mẫu bệnh lâm sàng.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT


- 16 -
Shell vial culture positive
¾ Sự tiêu chuẩn hóa Shell vial culture
Sau khi nhiễm virus VNNB vào tế bào thận lợn, giống được sử dụng trong
sự tiêu chuẩn hóa SVC. Tế bào thận lợn một lớp được phát triển trên lamen của
shell vial. Sau khi ly tâm 1000 rpm trong 45 phút, shell vials được ủ tại những thời

điểm khác nhau 12h, 24h, 36h và 48h tại nhiệt độ phòng. Tế bào một lớp được cố
định lại với acetone lạnh và nhuộm màu bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang
trự
c tiếp. Người ta thấy rằng kết quả sớm nhất là sau 36h ủ.
¾ Phương thức của thử nghiệm Shell vial
1ml tế bào thận (4 x 10
5

tế bào/ml) trong dung môi phát
triển được thêm vào mỗi shell
vial và ủ ở 37
o
C cho tới khi tế
bào một lớp hợp dòng được tạo
thành. Dung môi phát triển của
virus được lấy ra. 300 µl mẫu
xét nghiệm được tiêm nhiễm
vào shell vial và nhuộm màu
bằng kỹ thuật miễm dịch huỳnh
quang trực tiếp. Shell vial được
đem đi ly tâm 1000 rpm trong 45 phút tại nhiệt độ phòng sau đó thêm 1 ml dung
môi bảo quản vào shell vial rồi đem ủ ở 37
o
C trong vòng 36h. Dung môi bảo quản
được lấy ra cẩn thận khỏi shell vial và loại bỏ. Tế bào một lớp được rửa với PBS
(pH 7.2) 3 – 4 lần sấy khô và cố định bằng acetone trong 30 phút. Lamen được
nhuộm bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang trục tiếp. Vết trải trên bàn kính
sẽ được quan sát dưới kính hiển vi quang học, nếu có sẽ cho huỳnh quang tế bào
chất màu xanh (apple green fluorescence).

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT


- 17 -
Kết luận
Hiện tại các nhà khoa học trên khắp thế giới vẫn đang nghiên cứu về chủng
virus viêm não Nhật Bản hy vọng tìm ra thuốc đặc trị khi bị nhiễm cho dù đã có
vaccine phỏng bệnh.
Đối với phương pháp chuẩn đoán virus Viêm não Nhật Bản bằng kỹ thuật
nuôi cấy mô tế bào thì thường dùng phương pháp Shell vial culture. Đây là
phương pháp chuyên dùng để chuẩn đoán các virus thuộc nhóm Flavivirus như
Japanese Encephalitis Virus (JEV), West Nile Virus, Dengue-2 viral encephalitis
virus,….
Đây là một phương pháp chuẩ
n đoán nhanh và nhạy. Nó có những ưu điểm
vượt trội hơn so với chuẩn đoán bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực
tiếp và phương pháp nuôi cấy tế bào thông thường (như đã trình bày ở trên).
Tuy nhiên, ở Việt Nam phương pháp chuẩn đoán Shell vial culture này
chưa thật sự phổ biến bằng những kỹ thuật khác như kỹ thuật ELISA, kỹ thuật
gen, kỹ thuật miễ
n dịch huỳnh quang trực tiếp,…. Hy vọng trong tương lai sắp tới,
phương pháp này sẽ được ứng dụng rộng rãi ở nước ta để chuẩn đoán nhanh và
chính xác virus viêm não Nhật Bản phục vụ cho công tác điều trị bệnh này.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT


- 18 -

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Anh: (tài liệu cho phần Shell vial culture)
1.Umenai T, Kruzysko R, Bektimirov TA, Assaad FA: Japanese
encephalitis-Current world status.
2. Cinque P, Bossolasco S, Lundkvist A: Molecular analysis of
cerebrospinal fluid in viral diseases of the central nervous system.
3.Forbes BA, Sahm DF, Weissfeld AS: Indirect Immunofluorescence.
4. Engler HD, Preuss J: Laboratory diagnosis of respiratory virus
infections in 24 hours by utilising shell vial cultures.
5.Kedarnath N, Prasad SR, Dandavathe CN, Koshy AA, George S, Ghosh
SN: Isolation of Japanese encephalitis and West Nile viruses from peripheral
blood of encephalitis patients.
Tài liệu tiếng Việt: (tài liệu cho phần giới thiệu virus và bệnh VNNB)
Trần Văn Hưng: Giáo trình Vi sinh vật Y học. NXB Y học.
Web: (tài liệu, hình ảnh cho giới thiệu virus và bệnh VNNB)




/>5&ct=result&prev=/search%3Fq%3DArbovirus%26hl%3Dvi%26sa%3DG
e/

/>

/>
/>
/>

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT


- 19 -



MỤC LỤC
Đặt vấn đề…………………………………………………………… 3
Tổng quan
I/ Bệnh Viêm não Nhật Bản 4
1.Khái niệm 4
2.Dịch tễ học 4
a/Nguồn lây 5
b/Trung gian truyền bệnh 7
c/Chu trình lây truyền virus viêm não Nhật Bản 8
d/Phân bố bệnh 9
3.Cách sinh bệnh 11
4.Đặc trưng bệnh 12
5.Điều trị 12
II/ Virus viêm não Nhật Bản-Gen và phương pháp chuẩn đoán 12
1. Virus Viêm não Nhật Bản 12
a/ Giới thiệu chung 12
b/Bộ gen virus viêm não Nhật Bản 14
2.Phương pháp chuẩn đoán Shell vial culture (SVC) 14