Các phương pháp sắc ký

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

TIỂU LUẬN
MÔN CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

GIẢNG VIÊN: TS. BÙI HỮU TÀI
HỌC VIÊN: ĐÀO THỊ MAI
LỚP: CHE2019B-1

Hà Nội - 2021


MỤC LỤC

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Lịch sử hình thành
Năm 1903, nhà bác học Nga Michael Tswett đã cho dung dịch các sắc tố thực
vật trong ete dầu hoả lên cột nhồi bột mịn canxi cacbonat, ông thấy các sắc tố bị
hấp phụ lên trên đầu cột. Khi cho ete dầu hoả lên cột, các sắc tố di chuyển trong
cột từ trên xuống dưới, mỗi sắc tố có một tốc độ riêng, tách thành những vùng hay
vòng màu xếp chồng lên nhau, hình thành một hệ mà Tvest gọi đó là sắc đồ. Ông
đặt tên cho phương pháp tách này là sắc ký (Chromatography). Trong tiếng Hy
Lạp,“chroma” có nghĩa là chất màu, graphein có nghĩa là viết. Tên gọi này ngày
nay vẫn được sử dụng mặc dù phương pháp này còn được dùng tách các chất
không màu.
Đến thập kỷ 1930-1940, phương pháp này được phát triển nhanh chóng với
nhiều kỹ thuật khác nhau như sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký trao đổi ion, sắc

ký ái lực,..
Năm 1954, Mould D.L phát triển sắc ký gel để tách các hợp chất mang điện
tích theo trọng lượng phân tử của chúng. Đến năm 1964, Moor gọi là “gel
permeation chromatography” hay gọi là sắc ký lọc gel.
Năm 1906, sắc ký khí được biết đến nhưng đến 1952, kỹ thuật này mới phát
triển mạnh mẽ, nhất là trong thập niên 1960.
Năm 1967, Horvath C. là tác giả tạo máy sắc ký lỏng cao áp.
1.2. Định nghĩa sắc ký
Sắc ký là một nhóm các phương pháp hoá lý dùng để tách các thành phần của
một hỗn hợp. Sự tách sắc ký được dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất
khác nhau vào hai pha ln tiếp xúc và khơng hồ lẫn vào nhau: một pha tĩnh và
một pha động (Trong thí nghiệm của Tvest: pha tĩnh là canxi cacbonat, pha động là
ete dầu hoả). Pha tĩnh trì hỗn sự di chuyển của các thành phần trong mẫu. Khi các
thành phần này di chuyển qua hệ thống sắc ký với tốc độ khác nhau, chúng sẽ được
3


tách khỏi nhau theo thời gian. Mỗi một thành phần đi qua hệ thống trong một
khoảng thời gian riêng biệt, gọi là thời gian lưu. Trong kỹ thuật sắc ký, hỗn hợp
được chuyên chở trong chất lỏng hoặc khí và các thành phần của nó được tách ra
do sự phân bố khác 3 nhau của các chất hòa tan khi chúng chảy qua pha tĩnh rắn
hoặc lỏng. Nhiều kỹ thuật khác nhau đã được dùng để phân tích hợp chất phức tạp
dựa trên ái tính khác nhau của các chất trong mơi trường động khí hoặc lỏng và đối
với mơi trường hấp phụ tĩnh mà chúng di chuyển qua như giấy, gelatin hay gel
magnesium silicate,...
Sắc ký là phương pháp để phân tách và tinh sạch các phân tử sinh học. Sắc ký
là phương pháp nhanh, dễ dàng và không ảnh hưởng đến protein, đây là phương
pháp được đề nghị trong nghiên cứu định lượng protein hay các phân tử.
1.3. Các giai đoạn của quá trình sắc ký
Quá trình sắc ký gồm 3 giai đoạn chính:

Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh (ví dụ: đưa dung dịch các sắc tố lên đầu cột canxi
cacbonat). Các chất được giữ trên pha tĩnh.
Cho pha động chạy qua pha tĩnh (dung môi để dầu hoả qua cột), pha động
sẽ kéo theo các chất di chuyển trên pha tĩnh với tốc độ khác nhau, tách khỏi nhau
và có vị trí khác nhau trên pha tĩnh tạo thành sắc ký đồ (chromatogram). Giai đoạn
này gọi là khai triển sắc ký.
+ Nếu tiếp tục cho pha động chạy qua thì các chất có thể lần lượt bị kéo ra
ngồi pha tĩnh (ví dụ: ra khỏi cột). Đó là q trình rửa giải và dung mơi dùng được
và dung môi rửa giải (eluent), dịch hứng được ờ cuối cột gọi là dịch rửa giải
(eluate).
+ Nếu các chất được tách trên pha tĩnh (sắc ký khai thêm ta có thể lấy từng
phần pha tĩnh có mang chất (phân đoạn bột trên cột) đem chiết lấy chất.
+ Nếu các chất được tách ra ngoài pha tĩnh (sắc ký rửa giải) ta có thể hứng thu
lấy các phân đoạn dịch rửa giải có các chất cần phân tích.

4


Phát hiện các chất: Các chất màu có thể phát hiện dễ dàng, các chất khơng
màu có thể phát hiện bằng đèn tử ngoại hay bằng các thuốc thử. Trong sắc ký rửa
giải có thể phát hiện các chất khi chúng đi ra khỏi cột bằng cách cho dung dịch rửa
giải đi qua một bộ phận phát hiện gọi là detector đặt sau cột.

Hình 1.1. Sơ đồ quá trình sắc ký

5


CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ BẢN MỎNG
2.1. Giới thiệu phương pháp sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography - TLC), dựa chủ yếu vào hiện
tượng hấp thu trong đó pha động là dung mơi hoặc hỗn hợp các dung môi, di
chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất trơ (thí dụ như: silicagel hay oxid
alumin). Pha tĩnh được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên nền phẳng như tấm
kiếng, tấm nhôm hay tấm plastic. Do chất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng
nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng.
Bình triển khai sắc ký: Một chậu, hũ, lọ bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng, có
nắp đậy.

Hình 2.1. Bình triển khai sắc ký
Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0,25 nm của một loại hợp chất hấp thu
(silicagel, alumin,..) được tráng thành lớp mỏng, đều, phủ lên tấm kiếng, tấm
nhôm, hay tấm plastic. Chất hấp thu trên nhờ giá đỡ sulphat canxi khan, tinh bột
hay một lọai polymer hữu cơ.
Mẫu cần phân tích: thường là hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực khác
nhau. Sử dụng khoảng 1ul dung dịch mẫu với nồng độ pha lõang 2-5%, nhờ một vi
quản để chấm thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phái trên cao hơn một chút
so với mặt thống của chất lỏng chứa trong bình.
6


Pha động: dung môi hay hỗn hợp 2 dung môi, di chuyển chầm chậm dọc theo
tấm lớp mỏng, và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Dung mơi di chuyển càng cao nhờ
tính mao quản. Mỗi thành phần chất sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau, đi phía
sau mực của dung môi. Vận tốc di chuyển này phụ thuộc vào các lực tương tác tĩnh
điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh và tùy thuộc vào độ hòa
tan của mẫu chất trong dung môi.
2.2. Các bước thực hiện sắc ký lớp mỏng
- Chuẩn bị ống vi quản: ống thủy tinh có đường kính trong ống nhỏ, khoảng
1-2mm, dài 10-20cm. Sử dụng ống vi quản để chấm nhiều lọai mẫu dung dịch khác

nhau, chỉ cần sau mỗi lần sử dụng, rửa sạch vi quản bằng dung môi hữu cơ như
aceton.
- Chuẩn bị tấm bản mỏng: tấm bản mỏng thương mại 20x20cm, dùng kéo cắt
bản với kiách thước cần thiết, tấm bản phải vừa bình giải ly. Dùng bút chì vạch nhẹ
nét xuất phát và mức tiền tuyến dung môi.
- Chuẩn bị dung dịch mẫu: Mẫu là chất lỏng, có thể chấm trực tiếp mẫu lên
bản mỏng, cịn mẫu là dung dịch q đặc, có thể pha lỗng mẫu. Với mẫu là chất
rắn phải hịa tan trong dung môi hữu cơ phù hợp, nồng độ 2-5%. Nhờ một vi quản
để chấm dung dịch mẫu lên bề mặt tấm sắc ký lớp mỏng một cách thận trọng,
nhanh và dứt khoát tránh làm hỏng bề mặt của lớp mỏng. Mỗi vết chấm trên bản
không chứa nhiều hơn 12ug (10ug là tối ưu) mẫu chất.
- Sấy nhẹ để dung môi bay đi khỏi vết chấm, rồi nhúng bản vào dung dịch giải
ly.
- Giải ly để dung môi giải ly di chuyển lên: Sau khi bình đã bão hịa dung
mơi, người ta đặt tấm mỏng vào bình khai triển để cho các vết chấm mẫu ở bờ cạnh
phía dưới đáy bình. Cạnh đáy của tấm lớp mỏng ngập trong dung môi giải ly
khỏang 0.5-1cm. Các vết mẫu không được ngập trong dung mơi giải ly, vì như thế
vệt mẫu sẽ khuếch tán vào trong dung môi.

7


- Hiện hình các vết sau khi giải ly: Các hợp chất có màu sẽ được nhìn thấy
bằng mắt thường, nhưng phần lớn các hợp chất hữu cơ khơng có màu, nên nếu
muốn nhìn thấy các vết, cần sử dụng phuơng pháp vật lý (Phát hiện bằ ng tia tử
ngoại UV: đèn chiếu tia UV 254nm ánh sáng này nhận ra các hợ p chất có thể hấp
thu tia UV, các hợp chất có màu tối sẫm trên nền sáng; đèn chiếu tia UV 366nm
ánh sàng này phát hiện những hợp chất có phát hùynh quang, các vết sẫm của chất
mẫu có màu sáng trên nền bản mỏng sẫm màu) hay dùng phương pháp hóa học
(Bằng cách dung thuốc thử hiện hình như hơi iod, 2,7-fluorescein phát hiện đa số

hợp

chất

hữu

cơ,

ninhydrin

phát

hiện

aminoacid

hay

amin,

2,4-

dinitrophenylhydrazin phát hiện aldehyde hay caton, clorur antimony phát hiện
steroid hay vitamin hay carotenoid,…).

Hình 2.2. Các bước của quá trình sắc ký lớp mỏng
2.3. Hệ số di chuyển
Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di
chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng
dịch chuyển của dung môi:

8


Trong đó:
a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử (cm);
b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi
của vết (cm).
Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l.

9


Các yếu tố ảnh hưởng đến Rf như:
Do độ khếch tán của dung mơi ở trong bình triển khai khơng đồng đều.
Do kỹ thuật cắt bản mỏng và kỹ thuật chấm chưa chuẩn cũng làm giá trị R f bị
thay đổi.
Chất lượng và hoạt tính chất hấp thụ.
Bề dày của lớp mỏng.
Chất lượng và độ tinh khiết của pha động.
2.4. Sắc ký lớp mỏng điều chế
Sắc ký lớp mỏng điều chế (Preparative thin layer chromatography – PTLC) là
một phương pháp sắc ký được sử dụng để tách một lượng nhỏ đơn chất (101000mg) từ một hỗn hợp đơn giản (chỉ gồm vài cấu tử). Trong PTLC, một dung
dịch mẫu thử được chấm trên một lớp chất hấp phụ (thường là silica gel, nhơm
oxit) có độ dày từ 0,5-2mm tráng trên nền phẳng (kính, kim loại, chất dẻo) đóng
vai trị là một pha tĩnh. Một dung môi triển khai (pha động) di chuyển dọc theo một
vận tốc khác nhautaoj thành một sắc ký đồ gồm nhiều vết có R f khác nhau. Sau khi
triển khai, ta có thể thu được những cấu tử đặc trưng bằng cách cạo vùng chất hấp
phụ chứa vết ra khỏi bản và phản hấp phụ chất ra khỏi giá hấp phụ bằng một dung
mơi thích hợp. Hợp chất thu được từ bản mỏng có thể được tinh chế tiếp bằng TLC

hay phương pháp sắc ký khác hoặc hợp chất này đã đạt đủ độ tinh khiết để tiến
hành định tính, xác định cấu trúc bằng phương pháp phân tích cơ bản...
Phương pháp tiến hành PTLC nhìn chung tương tự như TLC chỉ khác ở việc
sử dụng những bản mỏng dày hơn so với TLC: PTLC 0,5-2mm, có thể dày đến 10
mm tùy yêu cầu sử dụng; TLC 0,2-0,25mm.
Ưu nhược điểm của PTLC
Ưu điểm
Nhanh, rẻ, thiết bị đơn giản và dễ áp dụng hơn so với sắc ký cột cổ điển và
HPLC điều chế.
10


Dễ tìm được dung mơi thích hợp để tách hỗn hợp các chất.
Sử dụng một lượng nhỏ dung mơi.
Có thể triển khai nhiều lần để thu được kết quả phân tách tốt hơn, có độ tinh
khiết cao hơn.
Dễ dàng phản hấp phụ để lấy các chất cần điều chế ra khỏi bản mỏng.
Có thể triển khai đồng thời nhiều chất chuẩn trong cùng một điều kiện xác
định giúp tạo thuận lợi cho việc xác định hợp chất mong muốn.
Nhược điểm
Các hợp chất kém bền chấm trên bề mặt bản mỏng có thể bị phân hủy khi tiếp
xúc với khơng khí và ánh sáng.
Trong nhiều trường hợp có sự xuất hiện đồng thời của tạp chất trong khi phản
hấp phụ để thu hồi chất cần điều chế.
Phải chạy trên nhiều hệ dung môi để phân biệt trong trường hợp các chất có
Rf giống nhau trong một hệ dung mơi.

11

CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ CỘT
3.1. Giới thiệu phương pháp sắc ký cột
Sắc ký cột được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển. Pha tĩnh là những
hạt có kích thước tương đối lớn (50-150um), được nạp trong cột thủy tinh. Mẫu
chất cần phân tích được đặt trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một lớ p thủy tinh
che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung mơi giải ly được đặt phái
trên cao. Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần bên dưới cột được hứng vào những lọ
nhỏ đặ ngay ống dẫn ra của cột. Phương pháp này thường làm cho quá trình tách bị
chậm, hiệu quả thấp so với sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Tuy vậy, sắc ký cột cũng có
ưu điểm là pha tĩnh và các dụng cụ rẻ tiền, dễ kiếm, có thể triển khai với một lượng
mẫu tương đối lớn.
3.2. Các bước thực hiện sắc ký cột
Bước 1. Lựa chọn chất hấp thụ
Pha tĩnh là silicagel loại thường, hợp chất không phân cực được giải ly khỏi
cột trước, hợp chất phân cực được giải ly sau. Với 2 phân tử khơng phân cực, phân
tử n có trọng luợng phân tử lớn sẽ có tính phân cực mạnh hơn phân tử kia, nó bị
pha tĩnh giữ lại trong cột nên di chuyển ra khỏi cột chậm hơn so với các phân tử
nhỏ, và cũng có khi nó ở lại lâu hơn trong cột so với phân tử tuy có tính phân cực.
Bước 2. Lựa chọn dung mơi
Mẫu cần sắc ký đuợc hoà tan hoàn toàn trong dung môi phù hợp với nồng độ
10mg/ml, gọi là dung dịch mẫu (A). Chuẩn bị 4-6 tấm bản mỏng 2,5x10cm. Chấm
lên những tấm bản này mỗi tấm khoảng 2-5ul dd(A). Mỗi bản mỏng được triển
khai với một loại dung môi giải ly khác nhau, kế đó phát hiện bằng đèn UV hay
thuốc thử. Với đơn dung môi sẽ dễ dàng thấy được dung mơi nào phù hợp. Từ kết
quả đó, cố gắng tìm một hỗn hợp dung mơi, trong đó một dung môi phân cực và
một dung môi kém phân cực thí dụ như ete dầu hỏa: etyl acetate.

12

Hình 3.1. Hình ảnh cột sắc ký
Bước 3. Chuẩn bị cột
Một số cột có lớp lọc thủy tinh frit (hình 3.2, bên trái) để tránh thất thoát pha
tĩnh từ đáy cột; loại khác khơng có và cần phải có lớp đệm bông thủy tinh hoặc
bông vải ở dưới đáy cột. Đặt thêm lớp vải thủy tinh hay lớp bông vải nghe có vẻ lạ
nhưng với lỗ lọc thủy tinh frit khó làm sạch hơn và có thể gây nhiễm tạp, chẳng
hạn như silica rò rỉ qua lỗ lọc frit vào trong phân đoạn thu hồi. Để tránh hiện tượng
này có thể cho thêm một lớp cát ở giữa lỗ lọc frit và silica. Mật độ, kích thước lỗ
lọc frit cũng khơng giống nhau. Nghĩa là tốc độ dịng dung mơi ở các cột khác
nhau có thể khác nhau. Loại lớp lọc frit lớn sẽ làm rò rỉ nhiều silica hơn, nhưng
loại lỗ nhỏ hơn có thể cho tốc độ dịng thấp hơn – đôi khi là rất thấp – và có thể
dẫn đên tạo áp lực trong sắc ký cột nhanh.

13


Hình 3.2. Cột có lớp lọc frit (trái) và khơng có lớp lọc frit (phải)
Cột có lớp lọc frit
Chọn một cột có kích thước phù hợp, rửa thật sạch, tráng với nước cất và sấy
khô.
Kẹp cột thẳng đứng lên giá và đóng van ở phía dưới cột lại (trên hình 3.2).
Cho vào một lớp cát mỏng (khoảng 0,5cm, nếu muốn).
Cột khơng có lớp lọc frit
Miếng đệm bơng vải hoặc sợi thủy tinh cần đủ rộng để che được đáy của cột,
nhưng không được rộng quá và chặt quá sẽ làm cản trở dịng chảy của dung mơi
(hình 3.3). Một mảnh có kích thước bằng ngón tay út là đủ dùng.
Vị trí của miếng đệm bơng hay sợi thủy tinh phải đảm bảo nằm chắc chắn ở
phần hẹp nhất của cột bằng cách dùng đũa thủy tinh hoặc dụng cụ khác nén xuống.
Kẹp cột thẳng đứng lên giá và đóng van ở phía dưới cột lại (trên hình 3.2)
Thêm một lớp cát vào cột (khoảng 2cm, Hình 3.3). Điều này đảm bảo pha tĩnh

một lớp nền và ngăn sự tập trung và không liên tục do lớp vải bông khi các chất đi
ra ở cuối cột.

14


Hình 3.3. Hướng dẫn chọn kích cỡ của miếng đệm bông vải hay sợi thủy tinh và
lượng cát phù hợp cho cột khơng có lớp lọc frit
Bước 4. Nhồi cột
Có một số phương pháp nhồi cột như sau:
Cách 1: Nhồi cột khô kiểu 1
Dụng cụ cần thiết:
Cột đã được chuẩn bị như trên
Phễu phù hợp dùng cho chất rắn khô
Van để đóng cột
Dung mơi
Silica hoặc Alumina
Ưu điểm
+
Giảm thiểu q trình rửa cột
Cách làm:

Nhược điểm
Khó đạt được hiệu quả nhồi cao nhất

Cho dung môi vào cột, cho chạy qua cát và miếng đêm bơng vải để loại bọt
khí trong đó (Hình 3.4, bước B)
Đặt phễu khô trên đỉnh cột và đổ từ từ silica hoặc alumina (pha tĩnh) vào
trong dung môi này. Để dung môi chảy ra từ từ tránh bị tràn (hình 3.4, bước C)
Để pha tĩnh lắng xuống và nhẹ nhàng đóng van cột lại để silica/alumina được

nhồi chặt trong cột (Hình 3.4, bước D)
Tháo dung mơi đến mức chạm vào bề mặt pha rắn (hình 3.4, bước E)

15


Hình 3.4. Phương pháp nhồi cột khơ kiểu 1
Cách 2: Nhồi cột khô kiểu 2
Dụng cụ cần thiết:
Cột đã được chuẩn bị
Phễu phù hợp dùng cho chất rắn khô
Dây dẫn chân không
Dung môi
Silica hoặc Alumina
Ưu điểm
Nhồi cột chặt
Cách làm:

+

Nhược điểm
Cần rất nhiều dung môi

-

Thêm silica gel khô vào cột và nối chân không bằng cách nối ống chân không
vào đầu ra của cột (hình 3.5, bước B). Chân khơng sẽ giúp q trình nén silica gel
và giữ nó ổn định cho bước tiếp theo. Quá trình nhồi sẽ tốt hơn khi được vỗ nhẹ lên
thành cột (hình 3.5, bước C)
Khi tạo độ chân khơng rồi, rót từ từ dung mơi vào (Hình 3.5, bước D)

16


Để dung môi chảy qua cột tới khi chảy đến đáy cột. Tại điểm này, đóng van
và tắt chân khơng (Hình 3.5, bước E)
Để dung mơi qua cột với lượng khoảng 5 – 6 lần lượng dung môi đầy cột để
đảm bảo hồn thành q trình nhồi cột
Tháo dung mơi cho tới khi mức dung môi trong cột chạm vào bề mặt pha tĩnh
(hình 3.5, bước F)

Hình 3.5. Phương pháp nhồi cột khô kiểu 2
Cách 3: Nhồi cột kiểu ướt (huyền phù)
Dụng cụ cần thiết:
Cột đã được chuẩn bị
Phễu phù hợp dùng cho chất rắn ướt
2 cốc có mỏ hoặc bình tam giác
Que khuấy thủy tinh
Dung mơi
Silica hoặc Alumina
Pipet Pasteur
17


Ưu điểm
Nhanh và dễ dàng
Cách làm:

+

Nhược điểm
Cho hiệu quả rửa tốt nhất

-

Rót dung mơi vào khoảng 1/3 dung tích cột (Hình 3.6, bước B)
Dùng cốc có mỏ, đong lượng silica/alumina vừa đủ
Trong bình phản ứng hoặc cốc có mỏ, đong lượng dung môi gấp khoảng 1,5
lần lượng silica
Thêm silica vào dung mơi, từng ít một, vừa thêm vừa lắc nhẹ, sử dụng pipet
Pasteur hoặc đũa thủy tinh để khuấy lên.
Rót hoặc dùng pipet để thêm hỗn hợp silica và dung mơi vào cột. Để dung
mơi thốt ra khỏi cột tránh bị tràn (Hình 3.6, bước C)
Gõ nhẹ vào cột để bọt khí thốt ra và silica lắng xuống (Hình 3.6, bước D)
Tiếp tục đổ hỗn hợp vào cột đến khi tất cả lượng silica/alumina hết.
Rửa thành cột bằng cách rót dung môi lên thành trong của cột.
Mở van tháo dung môi đến khi mức dung môi trong cột chạm đến bề mặt của
pha tĩnh (Hình 3.6, bước E)

Hình 3.6. Nhồi cột kiểu ướt

18


19


Bước 5. Làm sạch cột
Sau khi có được sản phẩm tách ra, cơng việc cịn lại là đổ silica ra và làm sạch
cột cho lần tách tiếp theo. Để làm nhanh q rình, việc rửa giải loại bỏ dung mơi có

thể dùng máy nén khí và cho dịng khí đi qua cột khoảng 2 giờ. Q trình này sẽ làm
khơ silica, từ đó đổ ra khỏi cột dễ hơn nhiều.
Sau khi rửa giải tất cả các dung môi và giữ cột thẳng đứng, úp ngược vào trong
cốc có mỏ lớn, để khô qua đêm trong tủ hút.
3.3. Sự khác nhau về mặt vật lý, hóa học của chất hấp phụ Silica gel và Silica gel
pha đảo
Bề mặt các hạt silica gel – SiO 2 được xử lý (thủy phân) bằng cách đun nóng với
HCl 0,1M trong một hoặc hai ngày để tạo ra những nhóm SiOH như sau (thơng
thường chỉ có khoảng 8 µmol SiOH/m2 bề mặt):

Trong khi đó, pha đảo được tạo ra bởi phản ứng với các organochlorosilan để
tạo ra các pha tĩnh không phân cực, phân cực trung bình hoặc rất phân cực tùy theo
nhóm R gắn vào.

Do đặc tính chứa các nhóm SiOH trên bề mặt, silica gel có tính phân cực mạnh
nên nó giữ lại các chất phân cực cao, tương tác kém với chất kém phân cực. Do đó,
trong sắc ký pha thuận, dung môi được sử dụng theo thứ tự tăng dần độ phân cực, các
chất kém phân cực sẽ ra trước các chất phân cực.
Trái lại, do bề mặt được xử lý loại bỏ các nhóm –OH và thay bởi các gốc alkyl
nên pha đảo có tính phân cực rất kém. Trong sắc ký cột pha đảo, các chất kém phân
cực bị giữ lại lâu hơn trên pha tĩnh, trong khi các chất phân cực sẽ được rửa giải
20


trước. Dung môi được sử dụng thường điều chỉnh cho giảm độ phân cực. Không sử
dụng dung môi hữu cơ quá kém phân cực cho sắc ký pha đảo.

21

22


23


24