Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC và phương pháp sắc ký ghép khối phổ GCMS

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
HPLC và phương pháp sắc ký ghép khối phổ
GC/MS
Tìm hiểu chung về sắc ký
1. Tìm hiểu về phương pháp sắc ký
a. Định nghĩa:
Sắc ký (chromatography) là một phương pháp tách quan trọng dựa
trên các quá trình hấp phụ trong điều kiện động học. Trong phương pháp
sắc ký, quá trình tách được thực hiện liên tục bằng cách cho các tướng
tiếp xúc với nhau nhiều lần ở trên cột, trên giấy hay trên bản mỏng.
1
Tướng được giữ nguyên được gọi là tướng tĩnh. Tướng di động tiếp xúc
với tướng tĩnh gọi là tướng động.
Trong quá trình tiếp xúc giữa tướng tĩnh và tướng động, các cấu tử cần
phân tích sẽ phân bố khác nhau giữa các tướng ấy phụ thuộc vào bản
chất của chất phân tích, bản chất của tướng tĩnh và tướng động, nhờ đó
mà ta có thể tách riêng các cấu tử riêng biệt.
b. Phân loại:
2
Sắc ký
Sắc ký lỏng
hiệu năng cao
(HPLC)
Sắc ký
phẳng
Sắc ký
khí -
Sắc ký
khí-lỏng
Sắc ký khí – Gas
chromatography ( GC)

Sắc ký lỏng – Liquid
chromatography
Có nhiều cách khác nhau để phân loại các phương pháp sắc ký:
 Dựa trên cơ chế tách:
- Sắc ký hấp phụ ( lỏng và khí).
- Sắc ký phân bố.
- Sắc ký trao đổi ion.
- Sắc ký kết tủa.
- Sắc ký oxy hóa khử.
- Sắc ký hấp phụ-tạo phức.
 Dựa trên hình thức tách:
- Sắc ký cột.
- Sắc ký mao quản.
- Sắc ký phẳng ( sắc ký giấy và sắc ký bản mỏng).
 Dựa trên trạng thái vật lý của hệ:
- Sắc ký khí (GC).
- Sắc ký lỏng (LC).
- Sắc ký lỏng-khí.
Trong rất nhiều trường hợp có thể xảy ra đồng thời nhiều quá
trình với cơ chế khác nhau tạo nên một loại sắc ký hỗn hợp, tuy nhiên
bao giờ cũng có một quá trình nào đó chiếm ưu thế hơn cả (Cơ sở lý
luận của sắc ký chưa được giải thích đầy đủ trong mọi chi tiết. Thực
tế người ta không bao giờ được biết hết thông số lớn nhất mà họ cần
nắm bắt được).
c. Ưu điểm:
Phương pháp tách sắc ký có ưu điểm là nhanh, hiệu quả cao và
khả năng tự động hóa lớn nên được sử dụng rộng rãi.
2. Tìm hiểu về sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS-Gas
Chromatography Mass Spectometry)
Sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS_Gas Chromatography Mass

Spectometry) là một trong những phương pháp sắc ký hiện đại nhất hiện
3
nay với độ nhạy và độ đặc hiệu cao và được sử dụng trong các nghiên
cứu và phân tích kết hợp.
Thiết bị GC/MS được cấu tạo thành 2 phần: phần sắc ký khí (GC)
và phần khối phổ (MS)
+ Phần sắc ký khí (GC): dùng để phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra
chất cần phân tích
+ Phần khối phổ (MS): mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số
khối.
Ngày nay, người ta ứng dụng kỹ thuật GC/MS rất nhiều và sử dụng rộng
rãi trong các ngành như y học, môi trường, nông sản, kiểm nghiệm thực
phẩm…, có thể phân tích các hỗn hợp hóa chất phức tạp như không khí,
nước… Nếu trong mẫu có một chất lạ xuất hiện, khối phổ có thể nhận
dạng cấu trúc hóa học độc nhất của nó (giống như việc lấy dấu vân tay).
Cấu trúc của chất này sau đó được so sánh với một thư viện cấu trúc các
chất đã biết. Nếu không tìm ra được chất tương ứng trong thư viện thì
nhà nghiên cứu, có thể dựa trên cấu trúc mới tìm được để phát triển các
ý tưởng về cấu trúc hóa học. Nói cách khác, nhà nghiên cứu thu được 1
dữ liệu mới và có thể đóng góp vào thư viện cấu trúc nói trên, sau khi
tiến hành thêm các biện pháp để xác định chính xác loại hợp chất mới
này.
Khi GC kết hợp với MS, nó sẽ trở thành 1 máy phân tích đa năng, các
nhà nghiên cứu hóa học có thể hòa tan hỗn hợp các hợp chất hữu cơ,
4
tách chiết và bơm vào máy để nhận dạng chúng, qua đó có thể đánh giá,
phân tích định tính và định lượng và có cách giải quyết đối với một số
hóa chất.
a. Sắc ký khí (GC- Gas chromatography)
Sắc ký khí được dùng để chia tách các hỗn hợp của hóa chất ra các

phần riêng lẻ, mỗi phần có một giá trị riêng biệt.
Pha động mang hỗn hợp mẫu đi qua pha tĩnh, pha tĩnh được sử dụng là
các hóa chất, hóa chất này có độ nhạy và hấp thụ thành phần hỗn hợp
trong mẫu.
Thành phần hỗn hợp trong pha động tương tác với pha tĩnh, mỗi hợp
chất trong hỗn hợp tương tác với một tỷ lệ khác nhau, hợp chất tương tác
nhanh sẽ thoát ra khỏi cột trước và hợp chất tương tác chậm sẽ ra khỏi
cột sau. Đó là đặc trưng cơ bản của pha động và pha tĩnh, hơn nữa quá
trình chia tách có thể xảy ra bởi sự thay đổi nhiệt độ của pha tĩnh hoặc là
áp suất của pha động.
Cột trong GC được làm bằng thủy tinh, inox hoặc thép không rỉ có kích
thước, kích cỡ rất đa dạng. Cột của GC dài có thể là 25m, 30m, 50m,
100m và có đường kính rất nhỏ, bên trong đường kính được tránh bằng
một lớp polimer đặc biệt nhưphenyl 5% + dimetylsiloxane polymer
95%), đường kính cột thường rất nhỏ giống như là một ống mao dẫn.
Thông thường cột được sử dụng là semivolatile, hợp chất hữu cơ không
5
phân cực như PAHs, các chất trong hỗn hợp được phân tích bằng cách
chạy dọc theo cột này.
Một chất chia tách, rửa giải phóng đi ra khỏi cột và đi vào đầu dò. Đầu
dò có khả năng tạo ra một tín hiệu bất kỳ lúc nào, khi phát hiện ra chất
cần phân tích. Tín hiệu này phát ra từ máy tính, thời gian từ khi bơm
mẫu đến khi rửa giải gọi là thời gian lưu (T
R
).
Trong khi các thiết bị chạy, máy sẽ đưa ra các biểu đồ từ các tín hiệu
như hình 1.
Hình 1: Sắc đồ của sắc ký khí
Đây gọi là sắc đồ, mỗi một peak trong sắc đồ sẽ miêu tả một tín hiệu tạo
nên khi chất giải hấp từ cột sắc ký và đi vào đầu dò detector, trục hoành

6
biểu diễn thời gian lưu và trục tung biểu diễn cường độ của tín hiệu,
trong hình 1 mỗi đỉnh (peak) biểu diễn một chất riêng lẻ, chất này được
tách từ hỗn hợp mẫu phân tích, peak có thời gian lưu (T
R
) 4,97 phút là
dodecane, 6.36 phút là biphenyl, 7.64 phút là chlolobiphenyl, 9.41 phút
là hexadecanoic acid methyl ester.
b. Khối phổ (MS- Mass Spectometry)
Khối phổ được dùng để xác định một chất hóa học dựa trên cấu trúc của
nó. Khi giải hấp các hợp chất riêng lẻ từ cột sắc ký, chúng đi vào đầu dò
có dòng điện ion hóa (mass spectrometry). Khi đó, chúng sẽ tấn công
vào các luồng, do chúng bị bỡ thành những mảnh vụn, những mảnh vụn
này có thể lớn hoặc nhỏ;
Những mảnh vụn thực tế là các vật mang điện hay còn gọi là iôn, điều
này là quan trọng bởi vì các hạt cần ở trạng thái tích điện thì mới đi qua
được bộ lọc. Các khối nhỏ chắc chắn, khối của mảnh vỡ được chia bởi
các vật mang gọi là tỉ lệ vật mang khối (M/Z);
Hầu hết các mảnh vụn có điện tích là +1, M/Z thường miêu tả các phân
tử nặng của mảnh vụn.Nhóm gồm có 4 nam châm điện gọi là tứ cực
(quadrapole), tiêu điểm của các mảnh vụn đi xuyên qua các khe hở và đi
vào đầu dò detector, tứ cự được thành lập bởi phần mền chương trình và
hướng các mảnh vụn đi vào các khe của khối phổ.
Phân tích kết quả
7
Máy tính sẽ ghi lại các biểu đồ của mỗi lần quét. Trục hoành biểu diễn tỉ
lệ M/Z còn trục tung biểu diễn cường độ tín hiệu của mỗi mảnh vụn
được quét bởi đầu dò detector. Đây là đồ thị của số khối. Làm thế nào để
phân tích các kết quả từ máy tính? Dưới đây là một hình khối phổ. Trục
X là khối lượng còn trục Y là số lượng. Mỗi hóa chất chỉ tạo ra một mô

hình duy nhất, nói cách khác mỗi chất có một “dấu vân tay” để nhận
dạng, dựa trên mô hình ion của nó.
Trên hình ta thấy phân tử ban đầu có khối lượng là 5. Trên sơ đồ khối
phổ hạt lớn nhất này được gọi là ion phân tử (molecular ion). Các hạt
nhỏ hơn có khối lượng 1,2,3 và 4 được gọi là các ion phân mảnh
(fragment ions). Trong trường hợp ví dụ trên ta thấy các phân tử của
chất này có xu hướng bị phá vỡ thành các tổ hợp 1-4 hơn là 2-3.
8
Các nhà nghiên cứu có thể so sánh khối phổ thu được trong thí nghiệm
của họ với một thư viện khối phổ của các chất đã được xác đinh trước.
Việc này có thể giúp họ định danh được chất đó (nếu phép so sánh tìm
được kết quả tương ứng) hoặc là cơ sở để đăng ký một chất mới (nếu
phép so sánh không tìm được kết quả tương ứng).
Trong hình 2, hình ảnh khối cao nhất là dodecane, phần nềm của
GC/MS nó giống như là một thư viện hình ảnh dùng để nhận ra các chất
chưa biết tồn tại trong hỗn hợp mẫu. Thư viện này có thể so sánh hình
ảnh khối từ thành phần của mẫu với hình ảnh khối trong thư viện của
máy.
9
Hình 2: Mass-spectrum
Khi GC kết hợp với MS, nó sẽ trở thành 1 máy phân tích đa năng, các
nhà nghiên cứu hóa học có thể hòa tan hỗn hợp các hợp chất hữu cơ,
tách chiết và bơm vào máy để nhận dạng chúng, hơn nữa các nhà nghiên
cứu cũng xác định nồng độ của mỗi thành phần hóa chất.
Hình 3 sẽ mô tả 3 chiều (dài, rộng, sâu) khi GC kết hợp với MS.
10
Khác với các máy phân tích dư lượng kháng sinh như sắc ký lỏng ghép
khối phổ (LC/MS/MS), thì sắc ký khí ghép khối phổ độ phận giải cao
(HRGC/HRMS), GC/MSN sắc ký ghép khối phổ có ứng dụng phân tích
các độc chất trong nước tương, nước mắm (3 MCPD );

Nghiên cứu chiết xuất và xác định thành phần các chất hóa học,
độc chất, kháng sinh, đánh giá độ tồn lưu của hóa chất diệt côn trùng
khác nhau trong các vật liệu hoặc hợp chất khác nhau.
11