XÁC ĐINH HÀM LƯỢNG NITO TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH
BÀI 1 : XÁC ĐINH HÀM LƯỢNG NITO TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP
KJELDAHL
I.

Nguyên tắc của phương pháp phân tích
a. Nguyên tắc
Phân hủy phần mẫu thử bằng H2SO4 đậm đặc với sự có mặt của chất
xúc tác để chuyển hóa các nitơ hữu cơ thành (NH4)2SO4. NaOH dư được
thêm vào dịch phân hủy đã nguội để giải phóng NH3. NH3 giải phóng
được chưng cất vào dung dịch Boric H3BO3 dư, Định phân lượng
Tetraborat amôn tạo thành bằng dung dịch H2SO4 0,1N chuẩn. Từ đó tính
được lượng nitơ có trong mẫu ngun liệu thí nghiệm từ lượng amoniac
tạo thành.
b. Giải thích nguyên tắc
- Giai đoạn 1: Đốt đạm
Khi đốt nóng phẩm vật đem phân tích với H2SO4 đậm đặc, các hợp
chất hữu cơ bị oxi hóa. Cacbon và hidro tạo thành CO2 và H2O còn
nito sau khi được giải phóng ra dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 tạo
thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch:
R – CH - COOH + H2SO4 = NH3 + CO2 + SO2 + H2O
|
NH2
NH3 + H2SO4

=

(NH4)2SO4

- Giai đoạn 2: Cất đạm
Đuổi ammoniac khỏi dung dịch bằng NaOH đồng thời cất và thu nó

bằng 1 lượng dư axit boric H3BO3:
(NH4)2SO4 + 2NaOH

=

Na2SO4 + 2H2O + 2NH3

Lúc này dung dịch trong bình hứng đang có màu tím (Do mơi trường
acid yếu của H3BO3 nên thuốc thử Taxiro có màu tím) thì khi hấp thụ
NH3 sẽ chuyển sang màu xanh lá (Do môi trường kiềm hơn vì đã xảy
ra phản ứng trung hịa nên thuốc thử Taxiro có màu xanh lá).
(Để kiểm tra xem NH3 đã được hấp thụ hồn tồn hay chưa thì ta
sử dụng giấy quỳ tím)


2NH4OH + 4H3BO3

= (NH4)2SO4 (xanh) + 7H2O

- Giai đoạn 3: Định lượng NH3 tạo thành bằng H2SO4 0,1N
Định phân lượng tetraborat amon tạo thành bằng dung dịch H2SO4
chuẩn, qua đó dễ dàng tính được lượng nito có trong mẫu vật
(NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5H2O = (NH4)2SO4 + 4H3BO3
(xanh)
(tím)
(tím hồng)
Thời điểm dừng định phân là thời điểm mà dung dịch trong bình hấp
thụ NH3 vừa chuyển từ màu xanh lá sang màu tím (Do mơi trường lúc
này lại có tính acid do H2SO4 phản ứng với Tetraborac amon tạo ra
acid Boric nên chất chỉ thị Taxiro có màu tím).

Cũng có thể hấp thụ NH3 bằng 1 lượng dư axit sunfuric hay clohidric
chuẩn. Sau đó đem định phân axit sunfuric dư khơng phản ứng với
NH3 để tạo thành amon sunfat bằng dung dịch NaOH chuẩn, rồi suy
ra lượng H2SO4 đã tham gia phản ứng với NH3:
2NH3 + H2SO4 = (NH4)2SO4
H2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + H2O

 Từ lượng H2SO4 tiêu tốn ta nhân với hệ số chuyển sẽ ra lượng Nitơ tổng
số trong mẫu.
 Một số chú ý khi làm thí nghiệm:
- Loại bỏ hết Nito không phải protein.
- Ở bước vô cơ hóa Protein thực hiện đốt nóng mẫu ở nhiệt độ 350 – 380oC.
Thời gian đốt nóng mẫu thường dài khoảng 3 – 4h phụ thuộc lượng mẫu vật,
vào nguồn nhiệt, vào chất xúc tác. Nếu dùng muối đồng sunfat với lượng lớn
(1-2g) thì thời gian đốt mẫu mất khoảng 3 – 3,5h. Nếu dùng H2O2 thì thời
gian đốt mất khoảng 40 -50 phút. Nếu dùng selen thì thời gian đốt mẫu
khoảng 30 -40 phút. Nếu dùng hỗn hợp K2SO4 : CuSO4 : Se (100 : 10 : 1) thì
sẽ mất 50 – 60 phút. Phải thực hiện quá trình vơ cơ hóa mẫu vật trong tủ đốt
để tránh khí SO2 bay ra gây nguy hiểm.


- Rửa sạch bộ cất đạm, phễu bằng nước cất trước khi làm thí nghiệm để tránh
lượng đạm cịn sót lại của các thí nghiệm trước.
- Phải cho hóa chất theo thứ tự: NaOH 40%  H2O  dịch vô cơ hóa mẫu và
phải đóng phễu bầu cất ngay sau khi cho vào để tránh thất thoát NH3
- Phải thực hiện với mẫu đối chứng để làm vơ hiệu hóa tác động của các yếu
tố môi trường đến kết quả của thí nghiệm.
II.

Số liệu thí nghiệm

a. Loại mẫu
Mẫu phẩm đem vơ cơ hóa có thể là những mẫu giàu protein.
b. Thể tích
*Mẫu thí nghiệm:
- Bình hấp thụ NH3: Cho vào bình tam giác
+ 20ml H3BO3 3%
+ 2-3 giọt chỉ thị Taxiro
- Cho vào bình cất:
+ 5ml NaOH 40%
+ 2ml H2O
+ 5ml dịch vơ cơ hóa mẫu
*Mẫu kiểm chứng:
- Bình hấp thụ NH3: Cho vào bình tam giác
+20ml H3BO3 3%
+2-3 giọt chỉ thị Taxiro
- Cho vào bình cất:
+ 5ml NaOH 40%
+ 7ml H2O (5ml thay cho dịch vơ cơ hóa)
c. Kết quả

Mẫu thí nghiệm

Mẫu kiểm chứng


Lượng H2SO4 0,1N tiêu
tốn(ml)

3,5 ml

0,1 ml

III.

Tính tốn kết quả
a. Thiết lập công thức
- Xác định hàm lượng protein
Thông thường trong thực phẩm có khoảng 16% Nito
 100g protein thì có 16g Nito
Hàm lượng protein = Lượng nito × 100/16 = Lượng nito x 6.25
- Vì 1 ml H2SO4 0.1N tiêu tốn cho định phân tương ứng với 1.4 mg Nitơ có
trong mẫu cất nên ta có cơng thức tính số miligam Nitơ có trong 5 ml mẫu
là:
N = 1.4 x (a – b) (mg)

(1)

trong đó:
N là lượng Nitơ tổng số trong 5ml mẫu thí nghiệm (ml)
a là số ml H2SO4 0.1N dùng cho mẫu thí nghiệm (ml)
b là số ml H2SO4 0.1N dùng cho mẫu đối chứng (ml)
1.4 là hệ số chuyển đổi lượng H2SO4 tiêu tốn khi định phân
sang lượng Nitơ tương ứng
- Cơng thức tính tổng hàm lượng Nitơ của dịch cất đạm (%):
%(w/v) = x 100%

(2)

trong đó:
%(w/v) là hàm lượng nitơ của dịch cất đạm tính bằng %

a là số ml H2SO4 0.1N dùng cho mẫu thí nghiệm (ml)
b là số ml H2SO4 0.1N dùng cho mẫu đối chứng (ml)
1.4 là hệ số chuyển đổi lượng H2SO4 tiêu tốn khi định phân
sang lượng Nitơ tương ứng
V là lượng dung dịch vơ cơ hóa đem đi cất (ml)
là hệ số chuyển đổi lượng Nitơ từ miligam sang gam
b. Tính tốn
Có:
VH2SO4(mẫu thí nghiệm) = 3.5 ml = a
VH2SO4(mẫu kiểm chứng) = 0,1 ml = b


- Từ kết quả chuẩn độ, thay số vào công thức (1) ta được:
N = 1.4 x (a – b) = 1.4 x (3.5 – 0.1) = 3.4 (mg)
- Áp dụng cơng thức (2) ta tính được hàm lượng Nitơ của dịch cất đạm (%):
%(w/v) = x 100% = x 100% = 0.0952%
IV-Nhận xét
- Kết quả thí nghiệm có sai số có thể do:
Sai số của quy trình có thể đến ở các bước: sử dụng pipet lấy mẫu chưa chính xác,
khi cho các dung dịch vào phễu đã phản ứng với nhau tạo NH3 bay ra khơng khí vì
chưa đóng phễu ngay làm thất thốt NH3, chưa hấp thụ hết NH3 vào bình ngưng
tụ, kĩ thuật chuẩn độ chưa chính xác. Để giảm thiểu sai số thì cần chú ý các bước
trên.
- Dùng CCT Tashiro do : Axit boric H3BO3 có pH = 5
+ Dải đổi màu của Tashiro pH : 4,4 – 6,2

+ Thành phần : methylen xanh 0.2% và methyl đỏ 0.2% trong ethanol hoặc
trong methanol
Chức năng của xanh methylen là làm thay đổi sự chuyển dịch màu đỏ vàng
cảu đỏ metyl thành một sự chuyển dịch xanh tím rõ ràng hơn

Có thể thay CTT tashiro bằng alirazin natri sunfonate là muối natri hòa tan
trong nước của axit Alizarin sulfonic với cơng thức hóa học là C ₁₄H ₇NaO
₇S hoặc CCT metyl đỏ 1% pha trong cồn


- Vai trò của các chất xúc tác trong quá trình vơ cơ hóa mẫu :
+ CuSO4 : K2SO4 = 1:10 :
Làm cho năng lượng hoạt hóa của nito giảm xuống, trong giai đoạn vơ
cơ hóa mẫu sự có mặt của xúc tác CuSO4 , K2SO4 thích hợp để chuyển tồn
bộ hỗn hợp chứa N2 có trong mẫu thành NH4+
Có tác dụng làm tăng nhiệt độ sôi của H2SO4 và do đó làm tăng cường
vận tốc của q trình phản ứng
- Ngoài việc giúp xác định hàm lượng Nitơ tổng số trong mẫu thực phẩm và
hàm lượng Nitơ Protein thì phương pháp Kjelhahl còn giúp xác định hàm
lượng Nitơ phi protein và hàm lượng Protein trong mẫu thực phẩm. Nếu biết
lượng Nitơ Protein ta lấy nó nhân với hệ số N tùy theo loại mẫu thực phẩm
(VD: với sữa thì nhân hệ số 6.38) sẽ được lượng Protein trong mẫu thực
phẩm. Và nếu lấy lượng Nitơ tổng số trừ đi lượng Nitơ protein ta được
lượng Nitơ phi Protein hoặc xác định hàm lượng Nitơ Protein một cách trực
tiếp bằng cách đem vơ cơ hóa nước lọc sau khi kết tủa protein.
- Phương pháp tiêu hóa Kjeldahl có một số nhược điểm. Phương pháp này chỉ
đo được lượng Nitơ trong các hợp chất hữu cơ (protein, axit amin, axit
nucleic) và NH4+ trong mẫu. Các dạng Nitơ khác, chẳng hạn như Nitrat và
Nitrit, không thể đo được thông qua phương pháp này.