Nghiên cứu nhân giống in vitro cây dây ký ninh (tinospora crispa (l ) miers)

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP. HCM
TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO

BÁO CÁO NGHIỆM THU
NHIỆM VỤ KHOA HỌC - CÔNG NGHỆ

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY
DÂY KÝ NINH (Tinospora crispa (L.) Miers)

Ths. Huỳnh Thị Kim

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 01/2021


BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP. HCM
TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO

BÁO CÁO NGHIỆM THU
NHIỆM VỤ KHOA HỌC - CÔNG NGHỆ

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY
DÂY KÝ NINH (Tinospora crispa (L.) Miers)
CHỦ NHIỆM NHIỆM VỤ

Ths Huỳnh Thị Kim
CƠ QUAN QUẢN LÝ

CƠ QUAN CHỦ TRÌ

Thành phớ Hờ Chí Minh, tháng 01/2021

TÓM TẮT
Cây Dây ký ninh (Tinospora crispa (L.) Miers) là loài cây dược liệu phân bố ở
Châu Á bao gồm: Ấn Độ, Mianma, Thái Lan, Indonesia, Philippin, Singapo,
Campuchia, Lào, Việt Nam và vùng phía nam Trung Quốc. Cây có rất nhiều hợp chất
thứ cấp, trong đó có 65 hợp chất đã được phân lập và xác định. Các nghiên cứu gần
đây trên dịch chiết từ thân cây Dây ký ninh cho thấy cấy có khả năng chống tiểu
đường (type 2), chống tăng đường huyết, chống oxy hóa, bảo vệ gan, điều hòa
hormone (Rohit Sharma và ctv, 2015), ức chế dòng tế bào IR-HepG2 kháng insulin
của người (Modh và ctv, 2017). Trong nghiên cứu nhân giống in vitro cây Dây ký
ninh, nguồn vật liệu sử dụng để khử trùng là mẫu đốt thân mang mắt ngủ. Mẫu được
khử trùng bằng Javel 20% trong 10 phút cho tỷ lệ mẫu sạch đạt 88,33%, tỷ lệ tạo
chồi/mẫu sạch đạt 86,67%. Môi trường tối ưu cho nhân chồi là mơi trường WPM có
bổ sung 0,5 mg/l BA với tỷ lệ mẫu tạo chồi đạt 97,78% và có 4,62 chồi/mẫu. Chồi
Dây ký ninh in vitro tăng trưởng tốt trên môi trường WPM với chiều cao chồi đạt 2,06
cm, mẫu có màu xanh nhạt, phát triển đốt thân mới, lá mở, hình tim. Mơi trường thích
hợp cho sự tạo rễ ở cây Dây ký ninh là mơi trường WPM có bổ sung 1,5 mg/l IBA cho
tỷ lệ mẫu tạo rễ đạt 100% với 4,53 rễ/mẫu, rễ dài 3,80 cm, có sự phân nhánh nhiều và
kéo dài nhanh chóng.

BM20-QT.QLKH

Trang i


MỤC LỤC
Trang
TĨM TẮT.........................................................................................................................i
MỤC LỤC ...................................................................................................................... ii

DANH SÁCH BẢNG.....................................................................................................iv
DANH SÁCH HÌNH .......................................................................................................v
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................................vi
THÔNG TIN ĐỀ TÀI .....................................................................................................1
MỞ ĐẦU .........................................................................................................................3
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..............................................................................4
1.1. Tổng quan cây Dây Ký Ninh ....................................................................................4
1.1.1. Đặc điểm và phân bố: ............................................................................................4
1.1.2. Tác dụng dược lý: ..................................................................................................5
1.1.3. Thành phần hóa học: .............................................................................................6
1.1.4. Các cơng trình nghiên cứu trên lồi Tinospora: ..................................................11
1.2. Các phương pháp trong nuôi cấy in vitro ...............................................................12
1.2.1. Phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân ....................................................................12
1.2.2. Phương pháp nhân chồi bên ................................................................................13
1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro cây Dây Ký Ninh ..............................14
1.3.1. Chất điều hòa sinh trưởng auxin..........................................................................14
1.3.2. Chất điều hòa sinh trưởng cytokinin ...................................................................14
1.3.3. Ảnh hưởng của hiện tượng hóa nâu đến sự ni cấy in vitro..............................15
Chương 2: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .......................................................................17
2.1.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu ...................................................................17

2.2.

Vật liệu và thiết bị ............................................................................................17

2.3.

Nội dung nghiên cứu ........................................................................................18

2.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của Javel và HgCl2 đến khả năng khử trùng
mẫu cây Dây ký ninh .....................................................................................................18
2.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA lên sự tái sinh chồi
từ đốt thân cây Dây ký ninh in vitro ..............................................................................18
2.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Kinetin và NAA lên sự tái sinh
BM20-QT.QLKH

Trang ii


chồi từ đốt thân cây Dây ký ninh in vitro ......................................................................19
2.3.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ IBA và NAA riêng lẻ lên sự ra
rễ từ chồi cây Dây ký ninh in vitro ................................................................................21
2.4.

Phương pháp xử lý số liệu ...............................................................................22

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.....................................................................23
3.1.

Ảnh hưởng của Javel và HgCl2 đến khả năng khử trùng mẫu đốt thân cây Dây

ký ninh ..........................................................................................................................23
3.2.

Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA lên sự tạo chồi từ chồi in vitro của cây

Dây ký ninh ...................................................................................................................26
3.3.

Ảnh hưởng của nồng độ Kinetin và NAA lên sự tạo chồi từ đốt thân cây Dây

ký ninh in vitro ..............................................................................................................31
3.4.

Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sự tăng trưởng chồi ở cây Dây ký

ninh in vitro ...................................................................................................................33
3.5.

Ảnh hưởng của nồng độ IBA và NAA riêng lẻ lên sự ra rễ từ chồi cây Dây ký

ninh in vitro ...................................................................................................................37
3.6. Sản phẩm của nhiệm vụ nghiên cứu .......................................................................41
3.6.1. Quy trình nhân giống in vitro cây Dây ký ninh ...................................................41
3.6.2. Cây Dây ký ninh in vitro .....................................................................................42
Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................43
4.1.

Kết luận ............................................................................................................43

4.2.

Kiến nghị ..........................................................................................................43

TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................44
PHỤ LỤC ........................................................................................................................1

BM20-QT.QLKH

Trang iii


DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1.1 Công dụng của cây Tinosparo crispa ..............................................................5
Bảng 1.2 Các hợp chất hóa học được phân lập từ các bộ phận của cây T. crispa ..........6
Bảng 2.1 Khảo sát ảnh hưởng của Javel và HgCl2 đến khả năng khử trùng mẫu đốt
thân cây Dây ký ninh .....................................................................................................18
Bảng 2.2 Khảo sát nồng độ BA và NAA lên sự tái sinh chồi từ đốt thân cây Dây ký
ninh in vitro ...................................................................................................................19
Bảng 2.3 Khảo sát nồng độ Kinetin và NAA lên sự tái sinh chồi từ đốt thân cây Dây
ký ninh in vitro ..............................................................................................................20
Bảng 2.4 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tăng trưởng cây Dây ký
ninh in vitro ...................................................................................................................21
Bảng 2.5 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA và IBA lên sự ra rễ từ cây Dây ký
ninh in vitro ...................................................................................................................22
Bảng 3.1 Ảnh hưởng của Javel và HgCl2 đến khử trùng mẫu cây Dây ký ninh ...........24
Bảng 3.2 Nồng độ BA và NAA ảnh hưởng lên sự tạo chồi cây Dây ký ninh in vitro sau
60 ngày nuôi cấy ............................................................................................................28
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của Kinetin và NAA đến sự tạo chồi cây Dây ký ninh in vitro
sau 60 ngày nuôi cấy .....................................................................................................31
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tăng trưởng của chồi cây Dây ký
ninh in vitro sau 60 ngày nuôi cấy.................................................................................35
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của IBA và NAA riêng lẽ đến sự tạo rễ in vitro .........................39

BM20-QT.QLKH

Trang iv

DANH SÁCH HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

1

Hình thái cây Dây ký ninh

4

2

Cây giống Dây ký ninh sử dụng để đưa vào nuôi cấy in vitro

16

Ảnh hưởng của chế độ khử trùng lên sự tạo chồi từ mẫu đốt thân cây

24

3.1

ký ninh
3.2

Mẫu đối chứng chồi cây Dây ký ninh in vitro

29

3.3

Hình thái chồi cây Dây ký ninh in vitro trên mơi trường có BA và

29

NAA sau 60 ngày ni cấy
3.4

Hình thái chồi cây Dây ký ninh in vitro trên mơi trường có Kinetin và

32

NAA sau 60 ngày nuôi cấy
3.5

Sự tăng trưởng chồi cây Dây ký ninh in vitro trên các mơi trường khống

35

3.6

Mẫu rễ cây Dây ký ninh in vitro trên môi trường không có IBA và NAA

39

3.7

Hình thái rễ cây Dây ký ninh in vitro trên mơi trường có IBA

39

3.8

Hình thái rễ cây Dây ký ninh in vitro trên mơi trường có NAA

39

3.9

Sản phẩm cây Dây ký ninh in vitro

41

BM20-QT.QLKH

Trang v


DANH SÁCH CHỮ VIẾ T TẮT

Viết tắt

Thuật ngữ đầy đủ

ANOVA

Analysis of variance

BA

Benzyladenine

CĐHSTTV

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

ctv

Cộng tác viên

CV

Coefficient of variation

Duncan

Duncan’s multiple range test

ĐC

Đối chứng

IAA

Indole-3-acetic acid

IBA

Indole-3-butyric acid

MS

Môi trường Murashige và Skoog (1962)

NAA

α – naphthalene acetic acid

SH

Môi trường Schenk và Hilderbrant (1972)

WPM

Môi trường Woody plant medium (LJoyd và
McCown,1981)

BM20-QT.QLKH

Trang vi


THÔNG TIN ĐỀ TÀI
1. Tên đề tài/dự án: Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Dây Ký Ninh (Tinospora
crispa (L.) Miers).

2. Chủ nhiệm đề tài/dự án:
 Họ và tên: Huỳnh Thị Kim
 Năm sinh: 1986
 Học vị: Thạc sĩ
2014

Giới tính: Nữ
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

 Chức danh khoa học:

Năm đạt học vị:

Năm được phong chức danh:

 Chức vụ:
 Tên cơ quan đang công tác: Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Nông nghiệp
Công nghệ cao
 Địa chỉ cơ quan: Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, TPHCM
 Điện thoại cơ quan: (028) 8862726

Fax: (028) 37990500

 Địa chỉ nhà riêng:
 Điện thoại nhà riêng:

DTDĐ: 0967355357

 E-mail:
3. Cơ quan chủ trì:

- Tên cơ quan chủ trì nội dung nghiên cứu và cơ quan chủ quản: Trung tâm Nghiên
cứu và Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao – Ban Quản lý Khu Nơng nghiệp Cơng
nghệ cao Tp. Hồ Chí Minh.
- Điện thoại: 028 38862726
- Fax: 028 37990500
- Email:
- Website: www.chta.com.vn
- Địa chỉ: Ấp 1, Xã Phạm Văn Cội, Huyện Củ Chi, Tp. Hồ Chí Minh
- Số tài khoản: 952721032617

tại Kho bạc Nhà nước Củ Chi

4. Thời gian thực hiện: Từ tháng 01/2020 đến tháng 12/2020
5. Kinh phí được duyệt: 156.523.383 đồng (Bằng chữ: Một trăm năm mươi sáu triệu
năm trăm hai mươi ba ngàn ba trăm tám mươi ba đồng).
6. Mục tiêu:
a. Mục tiêu tổng quát
BM20-QT.QLKH

trang 1


Nhân giống in vitro cây Dây ký ninh nhằm có khả năng tạo một lượng cây
giống lớn để ứng dụng trong sản xuất dược liệu.
b. Mục tiêu cụ thể:
- Xác định nồng độ BA và NAA thích hợp lên sự tái sinh chồi từ chồi in vitro
của cây Dây ký ninh in vitro.
- Xác định nồng độ Kinetin và NAA thích hợp lên sự tái sinh chồi từ chồi in
vitro của cây Dây ký ninh in vitro.
- Xác định môi trường ni cấy thích hợp lên sự tăng trưởng chồi cây Dây ký

ninh in vitro.
- Xác định nồng độ NAA và IBA thích hợp lên sự ra rễ từ cây Dây ký ninh in
vitro.
7. Nội dung đề tài
Nội dung 1: Cảm ứng tạo chồi in vitro trực tiếp từ đốt thân cây Dây ký ninh in vitro
Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của Javel và HgCl2 đến khả năng khử trùng mẫu
cây Dây ký ninh.
Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA lên sự tái sinh chồi từ
chồi in vitro cây Dây ký ninh in vitro.
Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Kinetin và NAA lên sự tái sinh chồi từ
chồi in vitro của cây Dây ký ninh in vitro.
Nội dung 2: Tăng trưởng cây Dây ký ninh
Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sự tăng trưởng chồi
Dây ký ninh in vitro.
Nội dung 3: Tạo rễ cây Dây ký ninh
Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ IBA và NAA riêng lẻ lên sự ra rễ từ
chồi cây Dây ký ninh in vitro.
8. Sản phẩm của đề tài /dự án:
Quy trình nhân giống in vitro cây Dây ký ninh: Đầy đủ các thông số kỹ thuật
như môi trường nuôi cấy, nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật ở từng giai đoạn
tạo chồi, tăng sinh, tăng trưởng chồi và ra rễ.
Cây in vitro: 500 cây, cây phát triển tốt, khơng có biến dị về hình thái. Cây cao
4 – 5 cm, có từ 2 – 3 rễ.

BM20-QT.QLKH

trang 2


MỞ ĐẦU

Bệnh tiểu đường (hay còn gọi là đái tháo đường) là bệnh do rối loạn nội tiết tố
và là một trong những yếu tố chính ảnh hưởng đến bệnh tim mạch, là một căn bệnh
nghiêm trọng và tốn kém đang ngày càng trở nên phổ biến, đặc biệt là ở các nước đang
phát triển và các nước nghèo. Bệnh tiểu đường có 2 loại là loại 1 và loại 2, bệnh tiểu
đường loại 2 chiếm khoảng 90% trong tất cả các trường hợp tiểu đường trên toàn thế
giới (www.who.int/mediacentre). Dự kiến khoảng 300 triệu dân trên toàn cầu mắc
bệnh tiểu đường vào năm 2025. Một số loại thuốc chống tiểu đường đã có mặt trên thị
trường chứng tỏ là có lợi cho những bệnh nhân này, nhưng với xu hướng sử dụng
thuốc hạ đường huyết gần đây, khả năng kháng thuốc và biến chứng phát sinh. Hơn
nữa, thuốc cần tăng liều ở bệnh nhân do độ nhạy của nó và hiệu quả trong việc sử dụng
lâu dài của một loại thuốc. Vì vậy mọi người hiện đang chuyển sang hướng dùng thảo
dược ít có tác dụng phụ hơn và chi phí điều trị thấp hơn.
Tinospora crispa có rất nhiều hợp chất thứ cấp, trong đó có 65 hợp chất đã
được phân lập và xác định. Các nghiên cứu gần đây trên dịch chiết từ thân cây
Tinospora crispa (Dây ký ninh) cho thấy khả năng chống tiểu đường (type 2), chống
tăng đường huyết, chống oxy hóa, chống tăng huyết áp, bảo vệ gan, điều hòa hormone
(Rohit Sharma và ctv, 2015). Modh và ctv (2017) nghiên cứu làm sáng tỏ sự ức chế
dòng tế bào IR-HepG2 kháng insulin của người khi điều trị với dịch chiết T. crispa.
Khi cho dịch chiết T. crispa vào thì sự hấp thu glucose của IR-HepG2 giảm, kích thích
các receptor insulin hoạt động p-Akt và GLUT4. Cuối cùng sự tăng trưởng của dòng tế
bào IR-HepG2 bị ức chế thông qua apoptosis sau khi cải thiện sự cảm ứng của tế bào
với insulin và hấp thu glucose.
Dây ký ninh đã được trồng ở một số nơi tại Thái Lan, Srilanca và Ấn Độ (Đỗ
Huy Bích và ctv, 2006), ở Việt nam Dây ký ninh mọc hoang và khai thác một cách tự
phát chưa có quy hoạch trồng ở quy mô lớn để ứng dụng trong điều trị bệnh, chính vì
vậy nhiệm vụ nghiên cứu “Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Dây ký ninh
(Tinospora crispa (L.) Miers) được thực hiện.

BM20-QT.QLKH

trang 3


Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan cây Dây Ký Ninh
Họ: Tiết dê (Menispermaceae)
Tên khoa học: Tinospora crispa (L.) Miers.
Tên thơng thường: Dây ký ninh, dây cóc.
1.1.1. Đặc điểm và phân bố:
Dây ký ninh là một loại dây leo, thân rất xù xì, màu nâu nhạt, dài tới 6 – 7 cm
hay hơn, mọc rất khỏe. Lá mọc so le, hình tim, mép ngun, trơng hơi dày, dài 8 – 12
cm, rộng 5 – 6 cm, cuống gầy ngắn hơn phiến lá. Hoa tập hợp thành 1 – 2 chùm ở kẽ
lá. Quả chín có màu đỏ, dài chừng 12 mm.
Dây ký ninh phân bố rộng rãi ở vùng nhiệt đới Châu Á bào gồm: Ấn Độ,
Mianma, Thái Lan, Indonesia, Philippin, Singapo, Campuchia, Lào, Việt Nam và vùng
phía nam Trung Quốc.
Ở Việt Nam, dây ký ninh có rải rác ở nhiều địa phương thuộc vùng trung du,
miền núi và đồng bằng độ cao phân bố tới gần 800 m. Cây thuộc loại dây leo gỗ, rụng
lá mùa đông, ưa ẩm và có thể hơi chịu bóng. Cây đã được trồng ở một số nơi tại Thái
Lan, Srilanca và Ấn Độ (Đỗ Huy Bích và ctv, 2006).

Hình 2 Hình thái cây Dây ký ninh
A. Cây Dây ký ninh; B. Lá Dây ký ninh; C. Thân Dây ký ninh; D. Hoa Dây ký ninh
(Waqas Ahmad, 2016)

BM20-QT.QLKH

trang 4

1.1.2. Tác dụng dược lý:
Ở Thái Lan thân T. crispa được sử dụng như thuốc hạ sốt, kháng viêm, trị tiểu
đường, giảm khát, tăng cường cơn đói, giảm nhiệt độ cơ thể và duy trì cho sức khỏe tốt
(Kongsaktrakoon và ctv, 1984; Dweck và Cavin, 2006).
Indonesia T. crispa dùng để chữa bệnh tiểu đường, tăng huyết áp và đau lưng
(Dweck và Cavin, 2006).
Trung Quốc sử dụng T. crispa trong điều trị vết bầm tím, nhiễm trùng máu, sốt,
gãy xương, ghẻ và các rối loạn liên quan đến lở loét do nhiệt (Li và ctv, 2006).
T. crispa ở Malaysia còn dùng trong trị liệu bệnh tiểu đường, tăng huyết áp,
kích thích sự thèm ăn và bảo vệ khỏi bị côn trùng cắn (Gimlette và Burkill, 1930).
Ngoài ra, chiếc xuất lá T. crispa được dùng điều trị đầy hơi, khó tiêu, tiêu chảy, thấp
khớp và viêm khớp ở Philippin.
Ở Việt nam, Dây ký ninh được dùng chữa sốt rét, cảm cúm, phát ban, ho, làm
thuốc bổ giúp tiêu hóa, tiêu mụn nhọt, lở loét, đắp vết thương (Đỗ Huy Bích và ctv, 2006).
Bảng 1.1 Công dụng của Tinosparo crispa

Quốc Gia

Bộ phận
sử dụng

Cách dùng

Công dụng

Tham khảo

Điều trị tiểu đường, sốt,
tiêu chảy, thấp khớp và rắn
Thân

Truyền dịch cắn.

Lá

Thuốc

Rễ

Lá nghiền

sắc Điều trị vết thương ngứa
và

viêm.

Kongsaktrakoon
và ctv, 1984.

Để giảm khát và tăng sự
thèm ăn.

Thái lan
Hạt

Truyền lạnh

Nhiễm độc do thuốc hoặc Srithi và ctv,
rượu.

2009.

Hạ sốt, khai vị, thuốc bổ
đắng, dạ dày, các vấn đề về
Thân

Nhai

mắt và tai, xung huyết
niêm mạc, ký sinh trùng

Gimlette

và

Burkill, 1930

đường ruột.

BM20-QT.QLKH

trang 5


Điều trị sốt, sốt rét, đau dạ
Indonesia

Thân

Truyền dịch

dày, tiêu chảy. Điều trị Roosita và ctv,
bệnh

tiểu

đường,

tăng 2008.

huyết áp, đau thắt lưng.
Điều trị tăng huyết áp và Ahmad và ctv,

Tồn cây

Đun sơi

Thân

Thuốc sắc

sốt rét.

Malaysia

2003.

Điều trị đái tháo đường

Mohamad

và

ctv, 2011.

Điều trị gãy xương, nhiễm
Trung Quốc

trùng máu, sốt, ghẻ, lở loét Li và ctv, 2006.
liên quan đến nhiệt.

Campuchia

Island

Dùng trong trường hợp sốt, Hout

Thân

gãy xương

Lá

Thuốc

Thân

(uống)

sắc

và

ctv,

2006.

Chống tiểu đường.

Longuefosse và
Nosin, 1996.

1.1.3. Thành phần hóa học:
T. crispa có rất nhiều hợp chất thứ cấp, trong đó có 65 hợp chất đã được phân
lập và xác định. Một số hợp chất như furanoditerpene, latone, steroid, flavonoid,
lignan và alkaloid (Bảng 2). Trong các hợp chất phân lập này, furanoditerpen loại
clerodane là hợp chất đặc trung của T. crispa.
Bảng 1.2 Các hợp chất hóa học được phân lập từ các bộ phận của cây T. crispa

Số
thứ

Nhóm hợp chất hóa học

tự

Bộ phận
của cây

Tham khảo

FLAVONE VÀ FLAVONE GLYCOSIDE
1

Apigenin

2

Diosmetin (Luteolin 4’-methyl ether)

3

Genkwain

4

Luteolin 4’-methyl ether 7-glucoside

5

Genkwain 7-glucoside

BM20-QT.QLKH

Thân

Thân

Lin, 2009

Umi Kalson và
Noor, 1995

trang 6


6

Luteolin 4’-methyl ether 3-glucoside

TRITERPENE
7

Cycloeucalenol

8

Cycloeucalenone

Kongkathip

Thân

và

ctv, 2002.

DITERPENE VÀ DITERPENE GLUCOSIDE
9

Tinocrispol A

10

Borapentol A

11

Borapentol B

Thân

Lam và ctv, 2012.
Fukuda và ctv,

Toàn cây

1985;

Chung,

2011
12

2-O-lactoryborapetoside B

13

6’-O-lactoryborapetoside B

14

Borapentoside A

15

Borapentoside B

16

Borapentoside C

17

Borapentoside D

18

Borapentoside E

19

Borapentoside F

20

Borapentoside G

Thân

Martin
1996;

Borapentoside H

22

Rumphioside A

23

Rumphioside B

24

Syringin

và

ctv,

Chung,

2011.

Choudhary
Thân

21

Lam và ctv, 2012

và

ctv, 2010b.
Lam và ctv, 2011.
Chung, 2011.
Cavin
1998;

và

ctv,

Chung,

2011.
25

Columbin

Lam và ctv, 2012

CISCLERODANE - TYPE FURANODITERPENOID
26

(3R,4R,5R,6S,8R,9S,10S,12S)-15,16-Epoxy3,4-epoxy-6-O-(β-D-glucopyranosyl)-cleroda3,13(16),14-trien-17,12-olid-18-oic acid methyl

BM20-QT.QLKH

Thân
lá

và Choudhary

và

ctv, 2010b.

trang 7


ester
27

(1R,4S,5R,8S,9R,10S,12S)-15,16-Epoxy-4-O(β-D-glucopyranosyl)-cleroda-2,13(16),14triene-17(12),18(1)-diolide.

28

(2R,5R,6R,8R,9S,10S,12S)-15,16-Epoxy-2hydroxy-6-O-(β-D-glucopyranosyl)-cleroda3,13(16),14-trien-17,12-olid-18-oic acid methyl
ester

29

(5R,6R,8S,9R,10R,12S)-15,16-Epoxy-2hydroxy-6-O-(β-D-glucopyranosyl)-cleroda3,13(16),14-trien-17,12-olid-18-oic acid methyl
ester

30

(2R,5R,6R,8S,9S,10S,12S)-15,16-Epoxy-2hydroxy-6-O-(β-D-glucopyranosyl)-cleroda3,13(16),14-trien-17,12-olid-18-oic acid methyl

ester

31

Rumphio E

32

(5R,6R,8S,9R,10S,12S)-15,16-Epoxy-2hydroxy-6-O-(β-D-glucopyranosyl)-cleroda3,13(16),14-trien-17,12-olid-18-oic acid methyl
ester

33

(5R,6S,9S,10S,12S)-15,16-Epoxy-2-hydroxy-6O-(β-D-glucopyranosyl)-cleroda-3,7,13(16),14trien-17,12-olid-18-oic acid methyl ester

34

(2R,5R,6S,9S,10S,12S)-15,16-Epoxy-2hydroxy-6-O-(β-D-glucopyranosyl)-cleroda3,7,13(16),14-trien-17,12-olid-18-oic

acid

methyl ester
ALKALOID
35

N-formylasimilobine 2-O-β-D-glucopyranoside

BM20-QT.QLKH

Thân

Choudhary

và

trang 8


ctv, 2010a.
36

N-formylasimilobine2-O-β-D-glucopyranosyl-

Thân

(1→2)-β-D-glucopyranoside

Fukuda và ctv,
1983; Choudhary
và ctv, 2010a.

37

Magnoflorine

Thân

Fukuda và ctv,
1983; Choudhary
và ctv, 2010a.;

Yusoff

và

ctv,

2014
38

N-demethyl-N-formyldehydronomuciferine

Choudhary

và

ctv, 2010a.
39

N-formylanonaine

Thân

Pachaly và ctv,
1992; Choudhary
và ctv, 2010a.;
Yusoff

và

ctv,

2014.
40

N-acetylanonaine

Thân

Pachaly và ctv,
1992; Lin, 2009.

41

N-formylnomuciferine

Thân

Pachaly và ctv,
1992; Choudhary
và ctv, 2010a.;
Yusoff

và

ctv,

2014.
42

N-acetylnomuciferine

Thân

Pachaly và ctv,
1992;

Chung

2011.
43

Lysicamine

Thân

Suminoto
Chemical

Co.,

Ltd, 1982
44

Tyrmine

BM20-QT.QLKH

Thân

Praman và ctv,

trang 9


45

Higenamine

2012

46

N-cis-feruloyltyramine

Chung, 2011

47

N-trans-feruloyltyramine

Choudhary
ctv,

và

2010a.;

Yusoff

và

ctv,

2014.
48

Paprazine

Choudhary

và

ctv, 2010a.
49

N-trans-caffeoyltyramine

50

4,13-dihydroxy-2,8,9-

Lin, 2009

trimethoxydibenzo[a,g]quinolizinium

Yusoff

51

Columbamine

2014.

52

Dihydrodiscretamin

53

Palmatine

Suminoto

54

Jatrorrhizine

Chemical

và

ctv,

Co.,

Ltd, 1982.
55

Beberine

Bisset

và

Nwaiwu, 1983.
56

Salsolinol

Praman và ctv,

57

(-)-Litcubinine

2012

LIGNAN
58

Secoisolariciresinol

59

Syringaresinol

60

Adenosine

61

Urdine

62

Adenine

Thân

Thân

Chung, 2011

Praman và ctv,
2012

STEROL
63

β-sitosterol

64

Stigmasterol

65

Makisterone C

BM20-QT.QLKH

Lin, 2009

trang 10


1.1.4. Các cơng trình nghiên cứu trên lồi Tinospora:
Rohit Sharma và ctv (2015) đánh giá vai trò của Tinospora cordifolia (Willd)
trong điều trị bệnh tiểu đường. Nghiên cứu được thiết kế để đánh giá đặc tính chống
tiểu đường của T. cordifolia trên dịch chiết của nó được chứng minh bằng các thử
nghiệm lâm sàng.
Yuhui Xu và ctv (2017) nghiên cứu cho thấy hoạt chất Borapetoside E một
diterpenoid clerodane từ dịch chiết Tinospora crispa cải thiện đáng kể tình trạng tăng
đường huyết và tăng lipid máu ở ở chuột béo phì bị tiểu đường type 2.
Ira Arundina và ctv (2017) nghiên cứu tác dụng của dịch chiết từ thân Tinospa
cordifolia đối với sự tăng số lượng tế bào lympho trong quá trình chữa bệnh loét chấn
thương trên chuột bị tiểu đường. Kết quả cho thấy dịch chiết từ thân cây T. crispa với
liều 250 mg/kg trong 14 ngày có thể làm giảm mức đường huyết ở chuột bị tiểu
đường. Nó cũng làm tăng số lượng tế bào lympho trong ngày 3, 5 và 7 trong quá trình
chữa lành vết loét do chấn thương trên niêm mạc miệng.
Hamdan và ctv (1989) nghiên cứu tác dụng chống đái tháo đường của chuột từ
cây Tinospora crispa, sau 2 tuần cho chuột uống dịch chiết từ thân cây (4 g/l) cho thấy
cải thiện về khả năng dung nạp glucose. Hơn nữa, điều trị tiêm tĩnh mạch với chiết
xuất (50 mg/kg) gây ra sự gia tăng nồng độ insulin huyết tương.
Modh và ctv (2017) nghiên cứu làm sáng tỏ sự ức chế dòng tế bào IR-HepG2
kháng insulin của người khi điều trị với dịch chiết Tinospora crispa. Khi cho dịch
chiết T. crispa vào thì sự hâp thu glucose của IR-HepG2 giảm, kích thích các receptor
insulin hoạt động p-Akt và GLUT4. Cuối cùng sự tăng trưởng của dịng tế bào IRHepG2 bị ức chế thơng qua apoptosis sau khi cải thiện sự cảm ứng của tế bào với
insulin và hấp thu glucose.

Năm 2017 Jitendra và ctv tiến hành vi nhân giống cây Tinospora cordifolia (Wild.)
Miers từ đốt thân cây trưởng thành ngồi tự nhiên trên mơi trường MS bổ sung N6benzyladenin (4,44µM) kết hợp với N6-2-iso-pentenyl adenin (2,45µM), than hoạt tính,
polyvinyl pyrrolidone và acid ascorbic, sự cảm ứng chồi in vitro đạt cao nhất 7,9 chồi/mẫu.
Năm 2017 Sheema và ctv nghiên cứu cảm ứng mô sẹo và phát sinh cơ quan từ
cây Tinospora formanii, các đoạn thân 1 năm tuổi ngoài tự nhiên được sử dụng cảm
ứng mơ sẹo trên mơi trường MS có bổ sung BAP 1,0 mg/l kết hợp với NAA 0,2 mg/l,

BM20-QT.QLKH

trang 11


tỷ lệ mẫu phát sinh mô sẹo là 96% sau 60 ngày ni cấy, chồi phát sinh có chiều dài
2,5 – 3,0 cm sau 65 ngày nuôi cấy.
Năm 2018 Sruthy và ctv tiến hành sàn lọc và nhân giống in vitro cây
Tinospora cordifolia (Wild.) Miers, tác giả sử dụng đốt thân cây ngoài tự nhiên để cảm
ứng chồi in vitro trên mơi trường MS có bổ sung BA 2 mg/l đạt số chồi 3 chồi/mẫu.
Năm 2017, Mridula và ctv đã nghiên cứu phát sinh cơ quan in vitro cho cây
Tinospora cordifolia (Wild.) Miers từ lá và đốt thân non thông qua tạo mô sẹo. Tỷ lệ
mẫu tạo mô sẹo đạt 100% trên mơi trường MS có bổ sung 2 mg/l IAA, mơi trường MS
có bổ sung 2 mg/l BA, 1 mg/l Kinetin, 100 mg/l acid ascorbic và 0,5 mg/l IAA cho số
chồi tái sinh đạt hơn 11 chồi/mẫu, môi trường ½ MS có bổ sung 0,5 mg/l IBA và 0,5
mg/l NAA cho tỷ lệ 100% chồi tạo rễ và tỷ lệ sống sót trồng ngồi vườn ươm đạt 75%.
Năm 2009 Singh và ctv đã nghiên cứu nhân giống in vitro cho cây Tinospora
cordifolia (Wild.) Miers từ mẫu lá và đốt thân. Hầu hết các mẫu tạo mô sẹo trên môi
trường MS có bổ sung chất điều hịa sinh trưởng, mẫu được tái sinh chồi trên mơi
trường MS có bổ sung 1,5 mg/l Kinetin với chiều cao 2,4 cm, sau đó mẫu được cấy
chuyển sang mơi trường MS có bổ sung 1 mg/l BA và 2,5 mg/l NAA để tạo rễ chiều
dài rễ là 3,5 cm.
Cũng trong năm 2017, Sheema và ctv đã thực hiện nghiên cứu bảo tồn cây

Tinospora formanii trong điều kiện in vitro. Các đoạn đốt thân được khử trùng bằng
HgCl2 0,1% sau đó được cấy vào mơi trường MS có bổ sung 2 mg/l BA và 0,5 mg/l
IBA cho tỷ lệ mẫu tạo chồi đạt 95% và trung bình đạt 12,75 chồi/mẫu. Sau đó các chồi
được cấy vào mơi trường ½ MS để tạo rễ, các cây con được thuần hóa và trồng ngồi
vườn ươm cho tỷ lệ sống 100% .
1.2. Các phương pháp trong nuôi cấy in vitro
1.2.1. Phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân
Phương pháp nuôi cấy này sử dụng mẫu cấy là chồi ngọn hoặc chồi bên có
mang một đoạn thân ngắn. Chồi này sẽ được kích thích cho tăng trưởng, ra rễ để
tạo thành cây nguyên vẹn. Chồi được thu từ chồi ngọn và ở các nách lá, sau đó cấy
trên mơi trường dinh dưỡng thích hợp với các điều kiện tối ưu để tăng trưởng. Chồi
mới tăng trưởng sẽ mang nhiều lá và các chồi ở các nách lá tiếp tục được cấy
chuyền đến khi đạt đủ số lượng chồi cần thiết thì chúng được cảm ứng ra rễ để trở

BM20-QT.QLKH

trang 12


thành cây con hoàn chỉnh và được chuyển ra trồng trong đất (Nguyễn Đức Lượng và
Lê Thị Thủy Tiên, 2006).
Tuy nhiên khi áp dụng phương pháp này có một số điểm cần lưu ý: phương
pháp này không thể áp dụng với những cây có lá xếp theo dạng hoa hồng và khi
mẫu cấy có khả năng bị nhiễm cao; để giảm khả năng bị nhiễm nên chọn những
chồi còn khép kín; tốc độ nhân giống phụ thuộc vào số lượng chồi có sẵn, số lượng
chồi ít thì tốc độ nhân giống sẽ chậm, chồi tăng trưởng tạo ra càng nhiều lá thì số
lượng chồi bên càng nhiều dẫn đến sự tăng tốc độ nhân giống; đối với những cây
thân gỗ của vùng ôn đới, trạng thái hưu miên của mẫu cấy phụ thuộc vào vị trí thu
mẫu trên cây, tuổi của cây, thời điểm thu mẫu trên cây, các yếu tố vật lý cũng như
thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng quan trọng đến trạng thái hưu

miên của chồi; các chồi được trẻ hóa, đặc biệt với cây thân gỗ, tăng trưởng nhanh
hơn đối với chồi trưởng thành; sự tạo rễ trên các chồi trưởng thành khó thực hiện vì
cây cần phải trẻ hóa chồi để có thể cảm ứng được tạo rễ. Phương pháp này rất hiệu
quả trong việc nhân giống những cây có ưu tính ngọn mạnh không thể nhân giống
bằng chồi bất định (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006).
1.2.2. Phương pháp nhân chồi bên
Về nguyên tắc, phương pháp này giống như phương pháp nuôi cấy nốt đơn
thân. Điều khác nhau lớn nhất là phương pháp ni cấy nốt đơn thân có sự kéo dài
chồi, thân và thường không cần dùng đến cytokinin để phát triển. Trong phương
pháp nhân chồi bên, chồi ngọn được cô lập trên môi trường dinh dưỡng và các chồi
bên từ các nách lá phát triển dưới ảnh hưởng của cytokinin với nồng độ cao. Vai trò
của cytokinin lúc này là hạn chế ưu tính ngọn để các chồi bên có thể phát triển. Các
chồi bên này được tiếp tục chuyển sang mơi trường mới có bổ sung cytokinin thì
các chồi bên mới lại tiếp tục được tạo ra. Sau đó các chồi này được chuyển sang
mơi trường ra rễ và được đưa ra ngoài vườn ươm khi đã có rễ hồn chỉnh (Nguyễn
Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006).
Thực tế hai phương pháp này thường được áp dụng chung: đầu tiên chồi tăng
trưởng bình thường, sau đó bổ sung cytokinin vào môi trường nuôi cấy để cảm ứng
sự hình thành các chồi bên. Điều trở ngại khi dùng phương pháp này là có sự nhiễm
của vi sinh vật bên trong cây mẹ. Đặc biệt là ở những cây có dạng hoa hồng, việc

BM20-QT.QLKH

trang 13


vơ trùng mẫu cấy đơi khi khó thực hiện. Vì vậy người ta thường sử dụng chồi ngọn
với kích thước càng nhỏ càng tốt để nuôi cấy. Với những cây bị virus nên sử dụng
phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Hiện nay phương pháp nhân giống từ chồi
bên được áp dụng cho nhiều loài thực vật và phổ biến là ở một số loài cây ăn trái

(Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006).
1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro cây Dây Ký Ninh
1.3.1. Chất điều hòa sinh trưởng auxin
Auxin là một trong những chất kích thích sinh trưởng thực vật được sử dụng
thường xun trong ni cấy mơ. Auxin có vai trị kích thích sự tăng trưởng và kéo dài
tế bào. Các hormone của nhóm này có hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, lóng,
tính hướng sáng, tính ưu thế ngọn, kích thích ra rễ và phân hóa mạch dẫn. Tác động
của auxin thường liên quan tới độ dài của thân, đốt, chồi chính, rễ. Đối với ni cấy
mơ và tế bào thực vật thường sử dụng nhóm auxin: IBA, IAA, NAA và 2,4-D.
Trong số các auxin, IBA và NAA chủ yếu sử dụng cho môi trường ra rễ và phối
hợp với cytokinin sử dụng cho môi trường tạo chồi (Lê Văn Hồng, 2008). Trong sự
phát sinh hình thái (trên sự tạo chồi và tạo rễ): khi nồng độ cytokinin cao hơn auxin thì
sẽ có sự tạo chồi từ mẫu cấy. Ngược lại, khi nồng độ auxin cao hơn cytokinin hoặc khi
xử lí với auxin thì rễ được hình thành. Các loại auxin như NAA và 2,4-D khơng bị biến
tính trong mơi trường nuôi cấy nhưng một khi đã được mô thực vật hấp thụ vào thì tốc
độ phân tách xảy ra nhanh không chỉ do các tác nhân vật lý mà cịn do tác động của
enzyme. Ở nồng độ thích hợp, NAA cịn có vai trị kích thích sinh trưởng, phân chia tế
bào và kích thích tạo rễ (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006).
1.3.2. Chất điều hòa sinh trưởng cytokinin
Cytokinin là dẫn xuất của adenine, hormone liên quan chủ yếu đến sự phân chia
tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong ni cấy mơ tế bào thực vật,
ngăn cản sự lão hóa mơ, thúc đẩy sự hình thành chồi non nhưng ức chế sự tạo rễ. Các
cytokinin thường được sử dụng nhất là BAP, Kinetin, Zeatin, BA. Hầu hết các loại
cytokinin được sử dụng trong ni cấy chồi ở các lồi thực vật khác nhau. Ở một số
loài thực vật, khi phối hợp một vài loại cytokinin với nhau thì sẽ làm tăng hiệu quả
tăng sinh chồi như Corylus avellana (Anderson, 1984; Cucumismelo và ctv, 1988). Ở
nồng độ cao, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định,

BM20-QT.QLKH

trang 14


đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi ni cấy. Nồng độ cytokinin q cao sẽ kích
thích sự hình thành của nhiều chồi nhỏ nhưng những chồi này không thể kéo dài và
làm cho lá bị biến dạng hay làm cho chồi chứa nhiều nước.
Chất BAP và Kinetin là các loại cytokinin tổng hợp kích thích mạnh mẽ sự
phân chia tế bào, tăng kích thước của tế bào và sinh tổng hợp protein. Hoạt lực của
BAP cao hơn nhiều so với Kinetin và bền vững hơn so với Zeatin dưới tác động của nhiệt
độ cao. Chất BAP kích thích sự tăng sinh chồi bên của Castanea (Vieitez, 1980) cịn
Kinetin thì kích thích sự tạo chồi bên trong q trình ni cấy chồi Prunus và để tăng
sinh chồi cần phải sử dụng đến BAP (Martinelli, 1985). Sự kết hợp BAP và Kinetin sẽ
kích thích sự tạo chồi dạng hoa hồng ở Brassica campestris trong ni cấy chồi. Ngồi
ra trong nuôi cấy chồi Gynura sarmentosa, BAP, Kinetin và 2-Pi đều kích thích sự tạo
chồi khi sử dụng riêng lẻ nhưng mỗi chất đều gây ra sự bất thường ở vài chồi. Chồi
được tạo ra khỏe mạnh và tăng trưởng nhanh hơn khi phối hợp cả 3 chất cùng lúc.
1.3.3. Ảnh hưởng của hiện tượng hóa nâu đến sự ni cấy in vitro
Mẫu cấy của vài lồi thực vật có thể hóa nâu hoặc đen sau vài ngày kể từ khi
bắt đầu ni cấy. Khi bị hóa nâu thì sự tăng sinh của mẫu sẽ bị ức chế và nếu để lâu
ngày thì mẫu sẽ chết. Hiện tượng hóa nâu này xảy ra khi trong mẫu cấy có tích tụ một
lượng lớn tanin hoặc các hợp chất hydroxyphenol. Các mô non thường ít bị hóa nâu
hơn mơ trưởng thành hay mơ già. Hiện tượng hóa nâu có thể ngăn cản bằng cách: loại
bỏ các hợp chất phenol do mẫu cấy tiết ra môi trường nuôi cấy; bổ sung các chất khử
phenol vào môi trường nuôi cấy; ngăn chặn hoạt động của enzyme phenolase; giảm
lượng phenol có sẵn trong mẫu bằng cách lắc mẫu trong mơi trường lỏng có thành
phần tương tự như mơi trường đặc; giảm diện tích vết cắt trên mẫu (Nguyễn Đức
Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006).
Trong đó phương pháp được sử dụng nhiều nhất là dùng than hoạt tính để hấp thụ
bớt các hợp chất phenol được tiết ra và lượng thường dùng cho nuôi cấy mô là từ 0,5 – 5,0
g/l. Tuy nhiên, than hoạt tính cũng có thể hấp thu một phần chất điều hịa sinh trưởng thực

vật trong mơi trường ni cấy và vì vậy sẽ làm giảm tác dụng của chất điều hòa sinh
trưởng lên mẫu cấy. Một chất khác cũng được sử dụng là polyvinyl pyrolidone (PVP) có
khả năng hấp thụ phenol và làm giảm hiện tượng hóa nâu của mẫu và nồng độ của PVP
được sử dụng là 0,01 – 2,00%. Nhóm chất thứ 3 có thể được sử dụng là acid ascorbic, acid

BM20-QT.QLKH

trang 15


citric, L – cystein, hydrochloride, 1,4 – ditheithreitol, glutathione và mercaptoethanol.
Hỗn hợp giữa ascorbic với acid citric nồng độ 50 – 150 mg/l có tác dụng rất tốt để ngăn
cản sự hóa nâu này (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006).

BM20-QT.QLKH

trang 16