Nghiên cứu nhân giống in vitro cây đỉnh tùng (cephalotaxus mannii hook f ) (năm thứ 2)

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP. HCM
TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO

BÁO CÁO NGHIỆM THU
NHIỆM VỤ KHOA HỌC - CÔNG NGHỆ

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY ĐỈNH TÙNG
(Cephalotaxus mannii Hook.F.) (NĂM THỨ 2)

Ths. Huỳnh Thị Kim

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 01/2021


BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP. HCM
TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO

BÁO CÁO NGHIỆM THU
NHIỆM VỤ KHOA HỌC - CÔNG NGHỆ

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY ĐỈNH TÙNG
(Cephalotaxus mannii Hook.F.) (NĂM THỨ 2)
CHỦ NHIỆM NHIỆM VỤ

Ths Huỳnh Thị Kim
CƠ QUAN QUẢN LÝ

CƠ QUAN CHỦ TRÌ

Thành phớ Hờ Chí Minh, tháng 01/2021

TÓM TẮT
Đỉnh tùng (Cephalotaxus mannii Hook.f.) là một loại cây dược liệu q, thành phần
hóa học chính gồm các alkaloid, flavonoid và diterpenoid. Một số cephalotaxine
alkaloid như harringtonine, homoharringtonine, isoharringtonine thể hiện được hoạt
tính kháng một số dịng tế bào ung thư mạnh như ung thư phổi, ung thư máu, ung thư
gan,…và đã được sử dụng làm thuốc hỗ trợ trong điều trị bệnh bạch cầu mãn tính.
Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, cây Đỉnh tùng được xếp vào tình trạng sắp tuyệt
chủng. Trong nghiên cứu nhân giống in vitro cây Đỉnh tùng (Cephalotaxus
mannii Hook. f.), chúng tôi tiếp tục nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh. Kết quả cho thấy
mơi trường thích hợp cho sự tăng trưởng chồi Đỉnh tùng in vitro là mơi trường WPM
có bổ sung PVP 0,5 g/l, saccharose 30 g/l, agar 8 g/l, chồi mở lá to, lá có màu xanh
đậm, chồi cao 2,53 cm. Chồi Đỉnh tùng in vitro khơng có sự hình rễ khi ni cấy trên
mơi trường WPM, có bổ sung 0,5 g/l PVP, 0,5 g/l than hoạt tính và nồng độ IBA, IAA,
NAA 0,5 – 2,0 mg/l. Tỷ lệ sống của chồi Đỉnh tùng in vitro đạt 56,67% khi trồng trong
vườn ươm, với giá thể sử dụng mụn dừa 50% : tro trấu 50% và kết hợp xử lý với IBA
nồng độ 1000 ppm.
Từ khóa: Đỉnh tùng, Cephalotaxus, in vitro, nhân giống.

BM20-QT.QLKH

Trang i


MỤC LỤC
TÓM TẮT

i

MỤC LỤC

ii

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

iv

DANH SÁCH BẢNG

v

DANH SÁCH HÌNH

vi

THƠNG TIN ĐỀ TÀI

1

MỞ ĐẦU

3

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

5

1.1. Giới thiệu về chi Cephalotaxus

5

1.2. Giới thiệu về cây Đỉnh tùng Cephalotaxus mannii Hook.f.

6

1.2.1. Đặc điểm hình thái và sự phân bố

7

1.2.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học các loài trong chi Cephalotaxus

8

1.2.3. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về chi Cephalotaxus

10

1.2.4. Một số nghiên cứu nhân giống in vitro trên cây thân gỗ

13

1.3. Ảnh hưởng của môi trường và điều kiện nuôi cấy trong nhân giống in vitro

15

ở thực vật
1.3.1. Môi trường nuôi cấy

15

1.3.2. Các chất kích thích sinh trưởng

16

1.3.3. Điều kiện ni cấy

17

Chương 2: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

18

2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

18

2.1.1. Thời gian

18

2.1.2. Địa điểm nghiên cứu

18

2.2. Nội dung nghiên cứu

18

2.2.1. Nội dung 2 tăng trưởng cây Đỉnh tùng

18

2.2.2. Nội dung 3 tạo rễ cây Đỉnh tùng

19

2.2.3. Nội dung 4 khảo sát tỷ lệ sống cây Đỉnh tùng in vitro ngoài vườn ươm

20

2.4. Phương pháp xử lý số liệu

21

BM20-QT.QLKH

Trang ii


Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

22

3.1. Kết quả ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sự tăng trưởng chồi Đỉnh

22

tùng in vitro
3.2. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ IBA, IAA và NAA riêng lẻ lên sự ra rễ từ

25

chồi cây Đỉnh tùng in vitro.
3.3. Kết quả ảnh hưởng của giá thể trồng lên tỷ lệ sống cây Đỉnh tùng in vitro

26

trong vườn ươm
3.7. Sản phẩm đề tài

29

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

32

4.1. Kết luận

32

4.2. Kiến nghị

32

TÀI LIỆU THAM KHẢO

33

PHỤ LỤC

BM20-QT.QLKH

Trang iii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt

Thuật ngữ đầy đủ

ANOVA

Analysis of variance

B5

Mơi trường Gamborg và Miller (1986)

BA

Benzyladenine

CĐHSTTV

Chất điều hịa sinh trưởng thực vật

ctv

Cộng tác viên

Duncan

Duncan’s multiple range test

ĐC

Đối chứng

IAA

3-Indoleacetic acid

Kinetin

6-furfurylaminopurine

MS

Môi trường Murashige và Skoog (1962)

NAA

α – naphthalene acetic acid

PVP

Polyvinyl pyrrolidone

SH

Môi trường Schenk và Hilderbrant (1972)

SPSS

Phần mềm thống kê Statistical Package for the Social Sciences

WPM

Môi trường Lloyd và McCown (1980)

WV5

Westvaco WV5, Coke 1996

BM20-QT.QLKH

Trang iv


DANH SÁCH BẢNG
Bảng
2.1

2.2

3.1

3.2

3.3

Tên bảng
Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sự tăng trưởng
chồi Đỉnh tùng in vitro
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA, IAA và IBA lên sự ra rễ
từ chồi Đỉnh tùng in vitro
Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tăng trưởng cây
Đỉnh tùng in vitro
Ảnh hưởng của nồng độ NAA, IAA và IBA lên sự ra rễ từ cây
Đỉnh tùng in vitro
Ảnh hưởng của giá thể trồng lên tỷ lệ sống cây Đỉnh tùng in
vitro ngoài vườn ươm

BM20-QT.QLKH

Trang
18

19

22

25

27

Trang v

DANH SÁCH HÌNH

Hình
1.1
3.1

Tên hình
Cây, thân và cành lá cây Đỉnh tùng
Ảnh hưởng của mơi trường khống lên sự tăng trưởng chồi cây
Đỉnh tùng in vitro sau 60 ngày nuôi cấy

Trang
6
24

3.2

Cây Đỉnh tùng 2 tháng trồng trong vườn ươm

28

3.3

Cây Đỉnh tùng sau 3 tháng trồng trong vườn ươm

29

BM20-QT.QLKH

Trang vi

THÔNG TIN ĐỀ TÀI
1. Tên nhiệm vụ/dự án: Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Đỉnh Tùng
(Cephalotaxus mannii Hook.f.) (Năm thứ 2).
2. Chủ nhiệm nhiệm vụ/dự án:
Chủ nhiệm nhiệm vụ :
-

Họ và tên: Huỳnh Thị Kim

-

Năm sinh: 1986

-

Học vị: Thạc sĩ

-

Chức danh khoa học:

-

Chức vụ: Chuyên viên nghiên cứu

-

Tên cơ quan đang công tác: Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Nơng nghiệp

Giới tính: Nữ
Chun ngành: Cơng nghệ sinh học

Năm đạt học vị: 2014

Năm được phong chức danh:

Công nghệ cao
-

Địa chỉ cơ quan: Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, TPHCM

-

Điện thoại cơ quan: (028) 8862726

-

Địa chỉ nhà riêng: 28/10 Đông Hưng Thuận 16, phường Đông Hưng Thuận,

Fax: (028) 37990500

quận 12, Tp. Hồ Chí Minh.
-

Điện thoại nhà riêng:

DTDĐ: 0967 355 357

-

E-mail: kimhuynhpy@ gmail.com

3. Cơ quan chủ trì:
-

Tên cơ quan chủ trì nội dung nghiên cứu và cơ quan chủ quản: Trung tâm

Nghiên cứu và Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao – Ban Quản lý Khu Nông
nghiệp Công nghệ cao Tp. Hồ Chí Minh.
-

Điện thoại: 028 38862726

-

Fax: 028 37990500

-

Email:

-

Website: www.chta.com.vn

-

Địa chỉ: Ấp 1, Xã Phạm Văn Cội, Huyện Củ Chi, Tp. Hồ Chí Minh

-

Số tài khoản: 9527 2 1032617

tại Kho bạc Nhà nước Củ Chi

4. Thời gian thực hiện: Từ tháng 01/2020 đến tháng 12/2020
5. Kinh phí đã sử dụng: 144.591.383 đồng (Bằng chữ: Một tram bốn mươi bốn triệu
năm tram chín mươi mốt ngàn ba tram tám mươi ba đồng).

BM20-QT.QLKH

1


6. Mục tiêu:
a. Mục tiêu tổng quát
Tạo cây Đỉnh tùng in vitro hồn chỉnh và có khả năng sống thích nghi với điều kiện
Tp. Hồ Chí Minh.
b. Mục tiêu cụ thể
- Xác định được mơi trường ni cấy thích hợp lên sự tăng trưởng cây Đỉnh tùng
in vitro.
- Xác định được nồng IBA, IAA và NAA thích hợp lên sự ra rễ cây Đỉnh tùng in
vitro.
- Xác định tỷ lệ sống của cây Đỉnh tùng in vitro ngoài vườn ươm.
7. Nội dung đề tài
TT

Các nội dung, công việc

Kết quả

chủ yếu cần được thực hiện

cần đạt

Năm 2019: Nghiên cứu tạo chồi và nhân
nhanh chồi cây Đỉnh tùng

Chồi cây Đỉnh tùng in vitro

Năm 2020: Tạo cây in vitro hồn chỉnh
Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của môi
trường nuôi cấy lên sự tăng trưởng chồi Đỉnh
tùng in vitro.
Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng
độ IBA, IAA và NAA riêng lẻ lên sự ra rễ từ
chồi cây Đỉnh tùng in vitro.
Thí nghiệm 3: Khảo sát tỷ lệ sống cây Đỉnh
tùng giai đoạn vườn ươm

Xác định được mơi trường ni
cấy thích hợp lên sự tăng trưởng
cây Đỉnh tùng in vitro.
Xác định được nồng độ IBA,
IAA và NAA thích hợp lên sự ra rễ
cây Đỉnh tùng in vitro.
Xác định tỷ lệ sống của cây
Đỉnh tùng in vitro ngoài vườn ươm.

8. Sản phẩm của đề tài /dự án:
Quy trình nhân giống in vitro cây Đỉnh Tùng, với các thông số kỹ thuật như môi
trường, nồng độ chất điều hịa sinh trưởng thực vật thích hợp ở giai đoạn nhân nhanh.
100 cây Đỉnh Tùng ex vitro, cây có chiều cao 3 – 4 cm, 2 – 3 rễ, có ít nhất 3 cặp lá.

BM20-QT.QLKH

2


MỞ ĐẦU
Thực vật giữ vai trò quan trọng trong sự cân bằng sinh thái, cải tạo môi sinh
trong việc điều hịa khí hậu, đồng thời các lồi thực vật cịn là nguồn cung cấp số
lượng lớn các hợp chất thiên nhiên có tác dụng dược lý có thể ứng dụng trong nghiên
cứu phát triển các thế hệ thuốc mới trong điều trị bệnh như: các bệnh về đường tiêu
hóa, tim mạch, hệ hô hấp, bài tiết, máu, ung thư… Do đó, nghiên cứu sàng lọc các loại
thảo dược có cơng dụng chữa bệnh nhằm tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên mới có
hoạt tính sinh học cao hiện nay đang là một hướng đi tích cực.
Hiện nay ung thư được đánh giá là một căn bệnh nan y. Mặc dù với sự tiến bộ
của khoa học, tiến trình điều trị ung thư vẫn cịn gặp rất nhiều khó khăn và thách thức.
Các hợp chất thiên nhiên đóng vai trị quan trọng trong việc nghiên cứu phát triển
thuốc điều trị bệnh. Sự đa dạng về cấu trúc, hoạt tính gây độc tế bào cao và chọn lọc
của các hợp chất thiên nhiên nổi trội so với các phương pháp nghiên cứu sàng lọc
khác, đã chứng tỏ thiên nhiên là nguồn giàu tiềm năng có thể cung cấp các hoạt chất
đáp ứng việc nghiên cứu và phát triển thuốc mới trong lĩnh vực hóa dược.
Cây Đỉnh tùng là lồi cây lá kim, có chiều cao khoảng 20-30 m, có thành phần
hóa học chính là các alkaloid, flavonoid và diterpenoid. Một số cephalotaxine alkaloid
như harringtonine, homoharringtonine, isoharringtonine thể hiện được hoạt tính kháng
một số dòng tế bào ung thư mạnh như: phổi, máu, Sarcoma-180, HCT116, SK-BR-3

và HepG2. Đáng chú ý, năm 2012 homoharringtonine đã được FDA chấp nhận là
thuốc hỗ trợ trong điều trị bệnh bạch cầu mãn tính do tủy xương tạo ra. Ngồi ra
Norisoharringtonine từ vỏ cây Đỉnh tùng có khả năng ức chế mạnh khi thử nghiệm
trong phịng thí nghiệm lên các dịng tế bào ung thư biểu mơ (KB), ung thư gan (HepG2), ung thư phổi (LU) và ung thư vú. Ngồi khả năng điều trị bệnh cây có tiềm năng
sử dụng làm cây cảnh do có hình dáng đẹp, gỗ Đỉnh tùng có chất lượng cao chịu mối
mọt nên được sử dụng làm đồ gỗ cao cấp.
Trên thế giới loài Cephalotaxus mannii Hook. f. (Đỉnh tùng) được xếp vào tình
trạng sắp tuyệt chủng (VU A1d), cịn ở Việt Nam lồi xếp vào tình trạng sắp tuyệt
chủng (VU A2cd B1ab, B2ab, C1). Hiện nay Đỉnh tùng được bảo tồn với quần thể nhỏ
ở Vườn quốc gia Ba Vì (Hà Nội), Bạch Mã (Thừa Thiên Huế), Bidoup Núi Bà (Lâm
Đồng). Hoạt chất Norisoharringtonine trong cây Đỉnh tùng có tác dụng ức chế rất

BM20-QT.QLKH

3


mạnh với các dòng tế bào ung thư, tuy nhiên nó chỉ có hoạt tính mạnh khi tách chiết từ
cây trưởng thành từ 5 - 10 năm tuổi, trong khi, cây Đỉnh tùng đang đứng trước nguy cơ
tuyệt chủng. Nhằm bảo tồn và phát triển nguồn cây dược liệu quý này nên nhiệm vụ
nghiên cứu “Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Đỉnh Tùng (Cephalotaxus mannii
Hook.f.)” được thực hiện.

BM20-QT.QLKH

4


Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về chi Cephalotaxus

Chi Cephalotaxus gồm một nhóm các lồi thực vật quả nón, với 3 chi và khoảng
hơn 20 lồi.
Ba chi của Cephalotaxus là:
 Amentotaxus (Dẻ tùng hay sam bơng) gồm có 5 loài: Amentotaxus argotaenia,
amentotaxus assamica, amentotaxus formosana, amentotaxus poilanei, amentotaxus
yumnanensis.
 Torreya (Phỉ) có nguồn gốc từ phía đơng châu Á và Bắc Mỹ, gồm 7 loài:
Torreya californica, torreya clarnensis, torreya fargesii, torreya grandis, torreya
jackii, torreya nucifera, torreya taxifolia.
 Cephalotaxus (Đỉnh tùng hay phỉ ba mũi) chi này có tên tiếng Anh là Plum
Yew hoặc Cowtail Pine. Chi Cephalotaxus gồm những cây lá kim, phân bố ở phía
đơng châu Á, chi gồm khoảng 11 loài: Cephalotaxus oliveri, Cephalotaxus fortunei,
Cephalotaxus alpina, Cephalotaxus harringtonii, Cephalotaxus sinensis, Cephalotaxus
wilsoniana, Cephalotaxus hainanesis, Cephalotaxus mannii, Cephalotaxus koreana,
Cephalotaxus

griffithii

(Cephalotaxus

lanceolata),

Cephalotaxus

latifolia

(Cephalotaxus nana).
Chi Cephalotaxus bao gồm các loại cây bụi hay cây thân gỗ có nhiều cành. Lá
của chúng thường xanh, sắp xếp theo vòng xoắn, thường vặn xoắn lại tại gốc lá để xuất
hiện theo kiểu hai hàng lá. Lá có hình dáng từ thẳng tới mũi mác, có màu xanh lục

nhạt hoặc có các dải khí khổng trắng ở mặt dưới. Các lồi của họ này hoặc là đơn tính
cùng gốc hoặc là đơn tính cận khác gốc hoặc đơn tính khác gốc. Các nón đực dài
khoảng 4 -5 mm và phát tán phấn vào đầu xuân. Các nón cái bị thối hóa, với một
hoặc một số lá nỗn và một hạt trên một lá noãn. Khi hạt phát triển đầy đủ thì nỗn
cũng phát triển thành một dạng áo hạt nhiều thịt có màu lục, tía hay đỏ, mềm và có
chứa nhựa. Thơng thường hạt trưởng thành có độ dài 12 – 40 mm. Mỗi lá noãn nằm
rời rạc, vì thế nón cái phát triển thành một cọng ngắn với một hay vài hạt trông giống
như một loại quả mọng. Chúng có thể do chim hay một số lồi động vật khác ăn để sau
đó phát tán phần hạt cứng không bị phân hủy.

BM20-QT.QLKH

5


1.2. Giới thiệu về cây Đỉnh tùng Cephalotaxus mannii Hook.f.:
Phân loại thực vật:
Giới: Plantae
Lớp: Pinopsida
Bộ: Cupressales
Họ: Taxaceae
Chi: Cephalotaxus
Loài: Cephalotaxus mannii
Tên khoa học: Cephalotaxus mannii Hook.f.
Tên thơng thường: Đỉnh tùng.

Hình 1.1. Cây, thân và cành lá cây Đỉnh tùng
( />
BM20-QT.QLKH

6


1.2.1. Đặc điểm hình thái và sự phân bố:
1.2.1.1. Đặc điểm hình thái:
Cây Đỉnh tùng: cây gỗ to, thân thẳng, tán hẹp, cao 20 – 30 m, đường kính thân
50 – 110 cm. Vỏ màu nâu nhạt hoặc nâu đỏ, bị bong dần ra khi cây trưởng thành. Cành
cây hình elip hay hình chữ nhật. Cành mảnh, mọc gần như đối xứng và xòe ngang. Lá
mọc nghiêng 45o – 80o so với trục cành. Lá mọc xoắn ốc xếp thành 2 dãy, hình dài 2 –
4 cm, rộng 0,2 – 0,4 cm, thẳng hay hơi cong ở gần đầu, cụt hay hơi trịn ở gốc, mặt
dưới của lá có 2 dãy lỗ khí khổng màu trắng.
Nón đực hình đầu mang từ 8 - 10 hoa đính trên cuống ngắn có vảy, mọc ở nách
lá; mỗi hoa có lá hoa ở gốc mang 7 - 10 nhị, mỗi nhị có 3 túi phấn. Nón cái đơn độc
hay mọc chùm 3 - 5 cái ở nách lá; mỗi nón gồm 9 - 10 vảy, ở mặt bụng có 2 nỗn. Hạt
hình trứng, dài khoảng 2,7 cm, đường kính khoảng 1,8 cm, trịn và có mũi nhọn ở
đỉnh, vỏ hạt vàng hoặc xanh, khi chín mọng nước.
Mùa ra nón tháng 4 - 5, hạt chín vào tháng 9 - 10 năm sau. Tái sinh bằng hạt diễn
ra bình thường. Mọc rải rác ở phần dưới sườn núi đất hoặc đá vơi, ít khi lên gần
đỉnh, trong rừng rậm thường xanh cây lá rộng, ở độ cao khoảng 600 - 1200 m, nơi có ít
ánh sáng và ẩm.
1.2.1.2. Phân bố:
Đỉnh tùng Cephalotaxus mannii Hook.f. mọc rải rác trong tầng cây gỗ trong rừng
rậm nhiệt đới, thường ở trên núi cao, trên đất sét – đá, trên đá phiến, sét kết hay đá vôi,
ở độ cao 1500 – 2000 m, nơi có ít ánh sáng, trên tầng đất dày và ẩm. Trên thế giới loài
Đỉnh tùng này chủ yếu phân bố ở Đông Bắc Ấn Độ (Khasi, Jaintia và Naga), Thái Lan,
Lào, Myanmar, Việt Nam, Trung Quốc. Ở Trung Quốc loài này sống trong rừng hỗn
hợp hoặc ở các khe núi cao, chúng xuất hiện nhiều ở Quảng Đông, Quảng Tây, Hải
Nam (Jianfeng Ling, Limu Ling, Ngũ Chỉ Sơn), Vân Nam, Tây Tạng.
Ở Việt Nam Đỉnh tùng này được tìm thấy ở Sơn La (Yên Châu), Lào Cai,Hịa
Bình, Hà Giang (n Minh, Đồng Văn), Cao Bằng (Ngun Bình), Hà Tây (Ba Vì),

Thanh Hóa, Quảng Trị, Huế, Kon Tum (Đăk Glêi, Đăk Tô, SaThầy, Kon Plông), Gia
Lai, Lâm Đồng (Lang Bian, Di Linh). Đỉnh tùng Cephalotaxus mannii Hook.f. thường
mọc cùng với kim giao núi đất (Nageva wallichiana), thông đỏ nam (Taxus
wallichiana), thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius) và thông nàng (Dacrycarpus

BM20-QT.QLKH

7


imbricatus) trên các vùng đá silicat chủ yếu ở miền trung và nam Việt Nam. Cây cũng
mọc với thiết sam giả (Pseudotsuga sinensis), thơng Pà Cị (Pinus kwangtungensis),
kim giao núi đá (Nageia fleuryi), thông tre lá ngắn (Podocarpus pilgeri), pơ mu
(Fokienia hodginsii), thơng đỏ bắc (Taxus chinensis) và các lồi dẻ tùng (Amentotaxus
Spp.) trên núi đá vôi ở bắc Việt Nam.
1.2.1.3. Cơng dụng:
Cành lá Đỉnh tùng có tác dụng kháng nham, dùng trị u ác tính và bệnh bạch
huyết. Ngồi ra ĐỈnh tùng cịn có tiềm năng sử dụng làm cây cảnh do có lá dẹp, các
cây non chịu bóng và có hình dáng đẹp, cịn các cây trưởng thành có kiểu vỏ độc đáo.
Gỗ Đỉnh tùng có thế thẳng, có chất lượng cao, kết cấu rất mịn, đều, hơi cứng, dễ gia
cơng, chịu mối mọt, dễ đánh bóng, dùng làm đồ gỗ cao cấp, đồ mỹ nghệ, cán công cụ,
dụng cụ văn phòng phẩm… Hạt Đỉnh tùng ép dầu dùng chế sơn, nến, dầu hóa cứng,
hạt cũng dùng làm thuốc có tác dụng nhuận phế, cầm ho, tiêu ứ. Dân gian cũng dùng
vỏ và lá sắc uống chữa các bệnh về đường hơ hấp. Hạt cịn có tác dụng sát trùng, tiêu
tích dùng trị các bệnh giun đũa, giun móc và đầy bụng ăn khơng tiêu (Phạm Hồng Hộ
và ctv (1999), Võ Văn Chi và ctv (1996)).
Hiện nay, loài Đỉnh tùng được xếp vào dạng sắp tuyệt chủng (VUA1d) do diện
tích rừng bị suy giảm trên tồn vùng phân bố. Ở Việt Nam Đỉnh tùng được coi là loài
hiếm và Việt Nam xếp lồi này vào tình trạng sắp tuyệt chủng (VUA2cd, B1ab, B2ab,
C1) do tình trạng khai thác lấy gỗ, hoặc lấy vỏ làm thuốc đã làm cây chết. Do đó cần

có biện pháp bảo vệ và tái sinh lồi này, vì Đỉnh tùng có nhiều cơng dụng rất quan
trọng. Theo đánh giá của các nhà khoa học, cây Đỉnh tùng là lồi thực vật cổ cịn sống
sót, mang nguồn gen quý, hiếm và độc đáo.
1.2.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học các lồi trong chi Cephalotaxus:
Năm 1972, nhóm nghiên cứu của Powell cơng bố 5 alkaloid: cephalotaxine (1) và
các ester của nó là harringtonine (2), isoharringtonine (3), homoharringtonine (4) và
deoxyharringtonine (5) từ hạt của lồi Đỉnh tùng Cephalotaxus harringtonia K. Koch
var. harringtonia cv.Trong đó 1 là chất khơng có hoạt tính sinh học, nhưng các ester
của nó là 2, 3, 4 và 5 là những chất có hoạt tính sinh học mạnh, có khả năng chống lại
bệnh bạch cầu.

BM20-QT.QLKH

8


Các chất 2 và 4 đã được phát triển như là thuốc trong điều trị bệnh ung thư ở
Trung Quốc như bệnh bạch cầu cấp tính nonlymphoid và bệnh bạch cầu hạt mạn tính.
Hợp chất 3 cũng được xem là hợp chất có khả năng kháng ung thư. Khả năng gây
độc tế bào của 3 cũng được kiểm tra với tế bào bạch cầu ở người HL-60. Kết quả cho
thấy với giá trị IC50 = 10-7 mol/l, thì tỉ lệ apoptosis có thể đạt 43,8% khi điều trị tế
bào HL-60 trong 120 phút. Các chất 2, 4 và 5 cũng được thử hoạt tính kháng tế bào
ung thư bạch cầu ở chuột (P-388) và ở người (lymphoid L1210), chúng có hoạt tính
mạnh nhất khi sử dụng với liều lượng 1-2 mg/kg.
Homoharringtonine (4), có tên thương mại là Synribo, là chất rắn dạng bột màu
trắng, tan một phần trong nước, tan nhiều trong DMSO, chloroform, ethanol,
methanol. Chất 4 được FDA (Food & Drug Administration) chấp nhận trong điều trị
bệnh bạch cầu nguyên bào tủy mạn tính đối với bệnh nhân là người lớn. Chất này có
hoạt tính sinh học mạnh, kháng tế bào ung thư người: KB (IC50 = 4 nM), tế bào A549
(IC50 = 30 nM), hay tế bào chuột P-388(IC50 = 31, 16 nM). Ngoài ra chất 4 chống lại

các tế bào KB-VIN nhân kháng thuốc với giá trị IC50 = 0,51 mM. Homoharringtonine
có khả năng gây ức chế sự tổng hợp protein khi dùng liều lượng phù hợp bằng cách tác
động lên các ribosome của các tế bào ung thư và ngăn chặn sự tiến triển của các tế
bào. Các nghiên cứu lâm sàng đã chỉ ra rằng homoharringtonine có hiệu quả trong điều
trị bệnh bạch cầu dịng tủy cấp tính (AML), bệnh bạch cầu myeloid mạn tính (CML)
và hội chứng myelodysplastic.
Năm 1979, khi tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học lồi Đỉnh tùng
Cephalotaxus mannii trồng ở Ấn Độ, Richard G. Powell tách được từ dịch chiết
chloroform của thân và rễ của cây này 3 hợp chất: cephalomannine, bacatin III và
taxol. Trong hầu hết các loài thuộc chi Cephalotaxus đã được nghiên cứu thì chủ yếu
tìm thấy các alkaloid thuộc harrigtonine, nhưng cephalomannine là một alkaloid mới
không thuộc kiểu đó, nó là chất gây độc tế bào KB với giá trị LD50 = 3,8 x 10-3 µg/ml
và gây ức chế mạnh đối với tế bào bạch cầu PS ở chuột.
Cisowski W. và ctv (2005) tiến hành khảo sát các loại tinh dầu có trong lá của 3
lồi đỉnh tùng là: Cephalotaxus sinensis, Cephalotaxusharringtonia var. drupacea,
Cephalotaxus fortunei bằng phương pháp sắc ký ghép nối khối phổ (GC-MS). Kết quả
đã phát hiện trong lá của ba lồi này có chứa 47 hợp chất, trong đó hai hợp chất chiếm

BM20-QT.QLKH

9


tỉ lệ cao là: α-pinene (18,4% -35,1%); β-caryophyllene (khoảng 22%); delta-carene
(khoảng 11%). Ngoài ra một số hợp chất khác như β-elemene, α-humulene, α-selinene,
β- selinene, sabinene, camphene, α – cadinol,…chiếm tỉ lệ thấp hơn 10%.
Năm 2004, Wang L.W. và ctv công bố kết quả nghiên cứu về loài đỉnh tùng
Cephalotaxus wilsoniana. Các hợp chất C-3-epi-wilsonione (15), taiwanhomoflavone
C (21), và một đồng phân của desmethylcephalotaxinone (22) đã được phân lập. Cấu
trúc của các chất này được xác định bằng các phương pháp phổ. Trong đó chất 15 có

khả năng chống lại tế bào ung thư người: Hep G2, MCF-7, Hep 3B, HT-29 với giá trị
IC50 lần lượt là 52,0; 42,0; 52,0 và 24,4 μg/ml.
Năm 2002, nhóm nghiên cứu của Kuo Y.H. và ctv đã tách từ dịch chiết ethanol
của Cephalotaxus wilsoniana được các chất: taiwanhomoflavone-B (17); 7,4’,7”-tri-Omethylamentoflavone (18); 6-C-methylnaringenin (19) và apigenin-7-O-β-glucoside
(20). Taiwanhomoflavone-B là chất gây độc tế bào với giá trị ED50 có giá trị lần lượt
là 3,8 và 3,5 μg/ml, có khả năng chống lại ung thư biểu mơ KB và tế bào gan Hepa3B.
Năm 2017, Trần Văn Lộc và ctv đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học 8
thành phần alkaloidal từ vỏ cây Đỉnh tùng (Cephalotaxus mannii Hook. f.) thu hái ở
cao nguyên tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam, đó là: cephalotaxin (1), isoharringtonine (2),
norisoharringtonine (3), desoxyharringtonine (4),

nordesoxyharringtonine

(5),

cephalotaxin, β-N-oxit (6), 3-epi-schellhammericine (7) và một đồng phân của 3-epichellhammericine (8). Trong số đó, norisoharringtonine (3) là hợp chất mới lần đầu
tiên được phân lập.
1.2.3. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về Chi Cephalotaxus:
Năm 2017, Trần Văn Lộc và ctv đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học 8
thành phần alkaloidal từ vỏ cây Đỉnh tùng (Cephalotaxus mannii Hook. f.) thu hái ở
cao nguyên tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam, đó là: cephalotaxin (1), isoharringtonine (2),
norisoharringtonine (3), desoxyharringtonine (4),

nordesoxyharringtonine

(5),

cephalotaxin, β-N-oxit (6), 3-epi-schellhammericine (7) và một đồng phân của 3-epichellhammericine (8). Trong số đó, norisoharringtonine (3) là hợp chất mới lần đầu
tiên được phân lập. Cấu trúc của các thành phần này được xác định bằng các phương

BM20-QT.QLKH

10


pháp quang phổ như FTIR, ESI-MS, HR-ESI-MS và NMR (1D, 2D) và so sánh với
các dữ liệu đã công bố.
Năm 2015, Đinh Thị Phịng đã nghiên cứu tính đa dạng nguồn gen di truyền và
thành phần hóa học một số lá kim ở Tây Nguyên. Qua phân tích DNA đã chỉ ra một số
vùng gen có thể sử dụng nhận dạng cho 6 lồi lá kim ở Tây Ngun (Thơng đà Lạt,
Thông nhựa, Thông lá dẹt, Thông tre lá dài và Dẻ tùng nam) và nguyên nhân gây suy
giảm tính đa dạng di truyền nguồn gen của 7 loài lá kim có nguy cơ tuyệt chủng (Đỉnh
tùng (Cephalotaxus mannii Hook. f.), Bách xanh, Thông đà lạt, Thông lá dẹt, Kim giao
núi đất, Du sam núi núi đất và Hoàng đàn giả). Tác giả đã phân lập được 33 hợp chất
từ bốn lồi lá kim là Đỉnh tùng, Thơng lá dẹt, Kim giao núi đất và Du sam núi đất,
trong đó có 1 chất mới (Norisoharringtonin) từ cây Đỉnh tùng, chất này có khả năng ức
chế rất mạnh các dịng tế bào ung thư ở người KB, Hep-G2, Lu và MCF-1.
Enaksha và ctv (1991), nghiên cứu sự phát sinh cơ quan từ mô sẹo Cephalotaxus
harringtonia: thiết lập nuôi cấy chồi và rễ. Mô sẹo tăng trưởng nhanh từ đoạn thân
Cephalotaxus harringtonia trên mơi trường khống MS và B5 với sucrose 3%, kinetin
1 µM và 2,4-D 4,5 µM. Mơ sẹo khi được ni trên mơi trường có bổ sung kinetin 10
µM và 2,4-D 0,45µM chuyển sang màu xanh lá cây và có sự phát sinh cơ quan khi
nuôi cấy trên môi trường khơng bổ sung chất điều hịa tăng trưởng. Chồi được cắt và
đặt trên môi trường 1/2MS với sucrose 10% để chồi phát triển hơn nữa. Trong suốt
quá trình phát sinh cơ quan, tác giả quan sát có sự khác biệt về rễ. Rễ ni cấy nhanh
chống được hình thành khi ni dưới chế độ sáng 24 giờ 35 µM/m2/s. 2 g rễ được nuôi
cấy trên môi trường B5 với sucrose 2% có khả năng tạo ra trung bình 24 g rễ trong
vòng 11 ngày. Tăng gấp 20 lần trọng lượng tươi trong vịng 3 tuần khi ni 15 g rễ
trong bioreactor 3 lít.
Janick J. và ctv (1994), vi nhân giống Cephalotaxus harringtonia sự nhân chồi từ

chồi của C. harringtonia trên mơi trường có bổ sung kết hợp BA và PBA nồng độ 1
mg/l cho số chồi cao nhất 15,5 chồi/mẫu. Tuy nhiên các chồi này được tiếp tục tăng
trưởng trên mơi trường khống WPM và MS có bổ sung BA và 2iP nồng độ (0,1 – 10
mg/l) có bổ sung than hoạt tính nhưng chồi khơng duy trì được trong ni cấy. Do đó
tác giả sử dụng hạt C. harringtonia để cảm ứng tạo phơi, kết quả 27 phơi có màu xanh
và phồng lên từ 180 phôi và chỉ duy nhất có 1 phơi nảy mầm trên mơi trường MS có

BM20-QT.QLKH

11


bổ sung 10% nước dừa, 1 mg/l 2,4-D. 1 phôi nảy mầm này được cảm ứng tạo chồi sau
1 năm mới đạt đủ số chồi để bố trí thí nghiệm. Sự tái sinh chồi cao nhất 26,2 chồi sau
3 lần cấy chuyền trên mơi trường MS có bổ sung 2,4-D nồng độ 1 mg/l, 10% nước
dừa. Tuy nhiên sau đó chồi tăng trưởng tốt trên mơi trường chỉ có 10% nước dừa
không cần 2,4-D, chồi tái sinh trong khoảng 7 năm.
Yu và ctv (2005) nghiên cứu cảm ứng chồi ngủ Amentotaxus argotaenia trên các
môi trường khác nhau, kết quả cho thấy chồi ngủ tái sinh từ chồi trưởng thành trên mơi
trường MB (1/2MS + B5) có bổ sung kinetin 1,5 mg/l, NAA 0,5 mg/l, saccharose 20
g/l và agar 8 g/l.
Lü Mei và ctv (2010), cảm ứng tạo mô sẹo cây Cephalotaxus oliveri từ lá non và
đoạn thân. Kết quả cho thấy tỷ lệ cảm ứng tạo sẹo từ đoạn thân non cao hơn so với lá
non, môi trường tạo sẹo tốt nhất cho đoạn thân non gồm khoáng MS, NAA 1 mg/l, BA
0,15 mg/l, 2,4-D 1 mg/l tỷ lệ tạo sẹo là 100%.
Wang C.T. và ctv (2013) nghiên cứu sự nhân nhanh và hóa nâu trên mơ sẹo
Cephalotaxus mannii Hook.f. cho thấy tỷ lệ hóa nâu của mơ sẹo từ lá thấp hơn từ thân
khi nuôi cấy mô sẹo trên mơi trường có bổ sung 0,5 g/l PVP. Mơi trường tái sinh tốt
nhất cho mô sẹo Cephalotaxus mannii Hook.f. gồm mơi trường khống MS có bổ sung
NAA 4 mg/l, kinetin 0,1 mg/l, saccharose 30 g/l, carrageenan 6 g/l và PVP 0,5 g/l.

Năm 2014, Yong-Cheng Li nghiên cứu nâng cao hợp chất cephalotaxine qua
nuôi cấy huyền phù tế bào Cephalotaxus mannii với sự kết hợp của con đường trao đổi
chất và chất cảm ứng tương ứng với NaF 10 mg/l, methyl jasmonate (MJ) 100 µmol/l,
NaF và MJ được cho vào bình nuôi cấy tế bào C.mannii. Kết quả cho thấy NaF làm
tăng hoạt tính enzyme glucose 6-phosphate hydrogen (G6PDH), nhưng khơng có hiệu
quả trên hoạt tính enzyme phenylalanine ammonum-lyase (PAL) và sự hình thành
phenol. Ngược lại, MJ tác động tích cực lên hoạt tính PAL và dẫn đến sự hình thành
phenol, nhưng lại khơng có ý nghĩa lên hoạt tính G6PDH. Trong nghiên cứu này cho
thấy hiệu quả của NaF và MJ lên sự sinh tổng hợp cephalotaxine gồm harringtonine và
homoharringtonine. NaF và MJ thúc đẩy sự sinh tổng hợp mạnh mẽ harringtonine đạt
7,245 mg/l cao gấp 4,8 lần so với đối chứng 1,506 mg/l. Tuy nhiên homoharringtonine
(0,491 mg/l) hầu như khơng có khi bổ sung NaF và MJ vào mơi trường nuôi cấy.
Sawsan và ctv (2014), nghiên cứu hàm lượng phenol và hoạt tính chống oxy hóa

BM20-QT.QLKH

12


trong nuôi cấy in vitro cây Cephalotaxus harringtonia L. ở Ai Cập thơng qua phương
pháp phân tích HPLC để xác định lượng phenol tổng, flavonoid và hoạt tính chống
oxy hóa từ cây mẹ, chồi in vitro và nuôi cấy mô sẹo Cephalotaxus harringtonia L..
Đối với nuôi cấy chồi, tác giả sử dụng mơi trường ni cấy gồm khống Woody plant
medium (WPM) có bổ sung Benzyladimin (BA) 2 mg/l số chồi đạt được cao nhất 2,33
chồi/mẫu, với chiều cao chồi đạt 2,67 cm, hàm lượng phenol 67,916 mg/g trọng lượng
khô, flavonoid 24,410 mg/g trọng lượng khơ. Với mơ sẹo được hình thành khi ni
trên mơi trường WPM có bổ sung naphthalenen acetic acid 6 mg/l, BA 0,2 mg/l thu
được trọng lượng mơ sẹo cao nhất, trong khi đó mơ sẹo ni trên môi trường MS bổ
sung NAA 2 mg/l, BA 0,2 mg/l cho hàm lượng phenol cao nhất là 34,060 mg/g trọng
lượng khơ, flavonoid 4,368 mg/g trọng lượng khơ. Hoạt tính chống oxy hóa được phân

tích qua phương pháp 2,2’diphenylpicrylhydrazyl (DPPH), kết quả phân tích cho thấy
chồi in vitro có hoạt tính chống oxy hóa IC50= 0,220 thấp hơn so với mô sẹo IC50=
0,432. Galic, cafeic, chlorogenic acid, rutin, apigenin-7-glucoside, quercetin và
apigenin được xác định có trong cây mẹ và chồi in vitro, trong mơ sẹo có sự hiện diện
của galic, cafeic, chlorogenic acid, rutin và quercetin.
1.2.4 Một số nghiên cứu nhân giống in vitro trên cây thân gỗ
Trần Trung Hiếu và ctv (2017) đã nghiên cứu nhân giống in vitro cây Xáo tam
phân (Paramignya trimera (Oliv.) Guill.). Đề tài này được thực hiện nhằm thiết lập
một quy trình nhân giống in vitro để bảo tồn loài dược liệu này. Các cụm chồi bất định
(5-8 chồi/cụm) được tái sinh từ các đoạn thân mang chồi bên (của cây 1-3 năm tuổi)
sau 3 tháng nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy cây thân gỗ WPM (Woody plant
medium) có chứa STS (silver thiosulfate) 3 và BA 5-7 mg/l. STS được sử dụng để
ngăn chặn sự rụng lá. Các cụm chồi con tăng trưởng chậm và đạt chiều cao từ 1-3 cm
sau 4 tháng nuôi cấy. Các cụm chồi này không thành lập rễ sau 2 tháng nuôi cấy trên
môi trường tạo rễ chứa IBA và/hoặc NAA 1-5 mg/l. Có 51% cụm chồi (đã được xử lý
trên mơi trường tạo rễ) có khả năng thích nghi và tạo thân và lá mới sau 2 tháng nuôi
trồng trong vườn ươm.
Năm 2007, Bùi Thị Tường Thu và Trần Văn Minh đã nghiên cứu nuôi cấy chồi
đỉnh cây Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc). Chồi đỉnh và đốt thân cây Thông đỏ (1-2
năm tuổi) được sử dụng trong nuôi cấy in vitro. Chồi non phát sinh sau 45 ngày

BM20-QT.QLKH

13


nuôi cấy trên môi trường MS + 5mg/L BA + 1mg/L KIN. Chồi non được nuôi cấy
phát sinh rễ trên môi trường WPM + 1mg/L NAA + 50mg/L Rhizopon say 75 ngày
ni cấy. AgNO3 thích hợp cho ni cấy ức chế sự hoá nâu mẫu. Chồi đỉnh chiếm
ưu thế trong quá trình phát sinh và sinh trưởng của chồi bên.

Ứng dụng kỹ thuật nhân giống in vitro để bảo tồn và nhân nhanh cây dược
liệu điển hình nhất ở Việt Nam là nghiên cứu nhân giống bảo tồn cây Thuỷ tùng
(Glyptostrobus pensilis) của Nguyễn Thành Sum (2007). Thuỷ tùng được xem như
là hoá thạch sống của ngành hạt Trần, là loài cây thuốc nằm trong sách Đỏ Thế giới.
Số cá thể này cịn lại q ít, q trính tái sinh tự nhiên kém (0,02%), hạt lép không
ươm được, hoa không thụ phấn. Mẫu vật được sử dụng là chồi ngọn và mẫu thân,
trong môi trường WPM bổ sung 0,5 mg/L BA mẫu cho khả năng nhân chồi cao. Khi
cấy mẫu trên môi trường WPM bổ sung 0,5 mg/L IBA sau 8 tuần ni cấy suất hiện
callus trắng, hơi xốp có hình dạng của rễ.
Nguyễn Văn Kết và ctv (2014) đã nghiên cứu khảo sát khả năng nhân giống cây
Trà my hoa đỏ (Camellia piquetiana (Pierre) Sealy) in vitro. Hạt trà my hoa đỏ ở
những độ tuổi khác nhau thu thập tại huyện Đạ Hoai, tỉnh Lâm Đồng được khử trùng
bằng dung dịch calcium hypochlorite (Ca(OCl)2) 7% trong 20 phút, sau đó ni cấy
trên mơi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l BA, 30 g/l sucrose và 1 g/l than hoạt tính, sau
60 ngày ni cấy hạt 30 ngày tuổi có tỷ lệ nảy mầm cao nhất và thời gian nảy mầm là
sớm nhất. Các chồi Trà my hoa đỏ in vitro được ni cấy trên 5 loại mơi trường
khống khác nhau để xác định thành phần muối khống thích hợp, sau khi có mơi
trường khống thích hợp tiếp tục khảo sát sự bổ sung nồng độ các chất kích thích sinh
trưởng BA và TDZ để xác định nồng độ chất kích thích sinh trưởng thích hợp cho việc
tạo chồi. Kết quả cho thấy mơi trường WPM là mơi trường thích hợp nhất cho sự sinh
trưởng và phát triển của cây Trà my hoa đỏ. Mơi trường WPM có bổ sung 2 mg/l TDZ
là mơi trường thích hợp nhất cho q trình hình thành chồi (3,53 chồi mới). Các chồi
Trà my hoa đỏ in vitro có 3 – 4 đốt và 5 – 6 lá được nuôi cấy trên môi trường có sự
thay đổi khác nhau của nồng độ IBA (1; 3; 5 và 7 mg/l) và NAA ( 0,1; 0,3; 0,5 và 0,7
mg/l), kết quả sau 30 ngày nuôi cấy cho thấy mơi trường WPM có bổ sung 5 mg/l IBA
và 0,5 mg/l NAA là mơi trường thích hợp nhất cho sự tạo rễ (14 rễ/chồi).

BM20-QT.QLKH

14

1.3. Ảnh hưởng của môi trường và điều kiện nuôi cấy trong nhân giống in
vitro ở thực vật
Thuật ngữ nhân giống in vitro hay còn gọi là vi nhân giống được sử dụng đặc biệt
cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều
bộ phận khác nhau của thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện vơ trùng trong
các ống nghiệm hoặc trong các loại bình ni cấy (Nguyễn Hoàng Lộc, 2007).
Kỹ thuật nhân giống in vitro nhằm mục đích sau:
- Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý, hiếm nhằm tạo vật liệu cho công tác
tạo giống.
- Nhân nhanh với hiệu quả kinh tế cao các lồi hoa, cây cảnh, cây ăn quả khơng
trồng bằng hạt.
- Nhân nhanh các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại rau, cây
cảnh và cây trồng khác.
- Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quý của cây lấy gỗ, cây làm thuốc, cây ăn
quả, rau xanh
- Nhân nhanh trong điều kiện vô trùng, cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch
bệnh virus.
- Bảo quản các tập đồn giống vơ tính và các lồi cây giao phấn trong ngân hàng
gen
1.3.1. Môi trường nuôi cấy
Trong nuôi cấy in vitro, môi trường nuôi cấy và điều kiện bên ngoài được xem là
vấn để quyết định sự thành bại của q trình ni cấy. Mơi trường ni cấy được xem
là phần đệm để cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự tăng trưởng và phân hố
mơ trong suốt q trình ni cấy in vitro. Cho đến nay, đã có nhiều mơi trường dinh
dưỡng được tìm ra (MS-62, WPM, WV3, N6, B5, LS…) tuỳ thuộc vào đối tượng và
mục đích ni cấy. Vấn đề lựa chọn mơi trường thích hợp cho cây sinh trưởng và phát
triển tối ưu trong từng giai đoạn của nuôi cấy mô là rất quan trọng. Môi trường nuôi
cấy của hầu hết các lồi thực vật bao gồm các muối khống đa lượng, vi lượng, nguồn

carbon, các amino acid và các chất điều hồ sinh trưởng (cũng có thể bổ sung thêm
một số chất phụ gia khác như than hoạt tính, nước dừa …) tuỳ từng lồi, giống, nguồn
gốc mẫu, thậm chí từng cơ quan trên cùng cơ thể mà dinh dưỡng cần cho sự sinh
trưởng tối ưu của chúng khác nhau. Vì vậy, vấn đề cần lựa chọn mơi trường thích hợp
cho sinh trưởng, phát triển tối ưu cho từng giai đoạn của hệ mô trong nuôi cấy mô rất
quan trọng, số lượng và các loại hố chất phải cần độ chính xác cao và phù hợp cho
BM20-QT.QLKH

15


từng giai đoạn, đối tượng cụ thể.
+ Nguồn carbon: trong ni cấy mơ, các tế bào chưa có khả năng quang hợp để
tổng hợp nên chất hữu cơ do vậy người ta phải đưa vào môi trường một lượng hợp
chất carbon nhất định để cung cấp năng nượng cho tế bào và mô (Debengh, 1991).
Nguồn carbon ở đây là các loại đường khoảng 20-30 mg/L có tác dụng giúp mơ tế bào
thực vật tổng hợp các hợp chất hữu cơ, giúp tế bào tăng sinh khối, ngồi ra nó đóng
vai trị là chất thẩm thấu chính của mơi trường. Người ta thường sử dụng 2 loại đường
đó là saccharose và glucose.
+ Nguồn Nitơ: tỷ lệ nguồn nitơ tuỳ thuộc vào lồi cây và trạng thái phát triển
mơ. Thơng thường, nguồn nitơ được đưa vào môi trường ở hai dạng là NH4 - và NO3+
(nitrat). Trong đó, việc hấp thụ NO3+ của các tế bào thực vật tỏ ra có hiệu quả hơn so
với là NH4 - , nhưng đôi khi NO3+ gây ra hiện tượng “kiềm hóa” mơi trường vì vậy giải
pháp sử dụng phối hợp cả 2 nguồn nitrơ với tỷ lệ hợp lý được sử dụng rộng rãi nhất.
1.3.2. Các chất kích thích sinh trưởng
Các chất kích thích sinh trưởng là những chất có tác dụng điều hồ sinh trưởng
và phát triển của thực vật. Chúng đóng vai trị quan trọng trong q trình sinh trưởng
và phát triển của thực vật như: phân chia, biệt hoá tế bào… ngồi ra cịn có ảnh hưởng
đến q trình lão hố mơ và nhiều q trình khác. Các chất điều hịa sinh trưởng có thể
chia thành 5 nhóm: Auxin, Cytokinin, Giberillin, Ethylen, Abscisic acid. Chúng là yếu

tố quan trọng nhất trong môi trường quyết định đến sự thành công của kết quả ni
cấy.
+ Auxin: Nhóm này gồm có các chất chính là: IBA (3-Indol butyric acid), IAA
(Indol acetic acid), NAA (Nathyl acetic acid),… trong nuôi cấy mô thực vật. Auxin
thường được sử dụng để kích thích sự phân chia tế bào, biệt hố rễ, hình thành mơ sẹo,
kìm hãm sự phát triển chồi và tạo ra các rễ phụ.
+ Cytokinin: Được bổ sung vào mơi trường chủ yếu để kích thích sự phân chia tế
bào và quyết định sự phân hoá chồi bất định từ mô sẹo và cơ quan. Các hợp chất
thường sử dụng là: Kinetine (6- Furfuryl aminopurine - C10H9N05), BAP (6- Benzyl
amino purine), Zip (Izopentenyl adenin), Zeatin… Trong các chất này thì Kinetin và
BAP được sử dụng phổ biến nhất vì chúng có hoạt tính cao và giá thành rẻ. Tuỳ vào
từng hệ mơ và mục đích ni cấy mà Cytokinin được sử dụng ở các nồng độ khác

BM20-QT.QLKH

16