Đánh giá hoạt tính sinh học LH và FSH của hormone eCG tái tổ hợp trên dòng tế bào HEK293 và mLTC 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC QUY NHƠN

VÕ THỊ THU HIỀN

ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC LH VÀ FSH CỦA
HORMONE eCG TÁI TỔ HỢP TRÊN DÒNG
TẾ BÀO HEK293 và mLTC-1

Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM
Mã số: 8420114

Ngƣời hƣớng dẫn: PGS.TS. Nguyễn Thị Mộng Điệp


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là
trung thực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào.
Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã
được cảm ơn và các thơng tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn
gốc và được phép cơng bố.
Bình Định, tháng 08 năm 2022
Học viên

Võ Thị Thu Hiền


LỜI CẢM ƠN
Trước hết tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc và kính trọng tới Ban giám
hiệu Trường Đại học Quy Nhơn, Quý Thầy Cô trong trường đã tạo điều kiện
cũng như truyền thụ những kiến thức quý báu để tơi có thể hồn thành khóa

học.
Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến PGS.TS. Nguyễn Thị
Mộng Điệp, người cô đầy tâm huyết đã luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất để tơi
có thể hồn thành luận văn này. Cơ ln tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi trong
cả q trình nghiên cứu khoa học, là nguồn động lực lớn giúp tơi vượt qua
được những khó khăn trong q trình hồn thành luận văn.
Tơi xin chân thành cảm ơn Quỹ Đổi mới sáng tạo Vingroup (VINIF) đã
tài trợ kinh phí cho chúng tơi thực hiện đề tài nghiên cứu này.
Xin cảm ơn các thầy tại Học viện Quân y Hà Nội đã hết lòng giúp đỡ,
tạo điều kiện cho tơi trong q trình thực hiện luận văn này.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, người thân cùng
tập thể lớp Sinh học thực nghiệm K23 đã luôn động viên và giúp đỡ tơi trong
q trình học tập và thực hiện đề tài nghiên cứu này.
Do thời gian và sự hiểu biết của bản thân có hạn nên luận văn khó tránh
khỏi sai sót. Tơi mong nhận được lời góp ý, chỉ bảo của thầy cơ để có thể
hồn thiện hơn luận văn này.
Bình Định, tháng 08 năm 2022
Học viên

Võ Thị Thu Hiền


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ
DANH MỤC HÌNH ẢNH
MỞ Đ U........................................................................................................................ 1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................................ 1

2. Mục đ ch và nhiệm vụ nghi n cứu ........................................................................... 2
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................................ 3
4.

ngh a khoa học và thực ti n của đề tài ................................................................. 3

4.1.

ngh a khoa học .................................................................................................... 3

4.2.

ngh a thực ti n ..................................................................................................... 3

5. Những đóng góp mới của đề tài ............................................................................... 3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU................................ 4
1.1. Tổng quan về hormone gonadotropin................................................................... 4
1.2. Tổng quan về eCG .................................................................................................. 8
1.2.1. Nguồn gốc và cấu trúc của eCG......................................................................... 8
1.2.2. Hoạt động sinh học của eCG ............................................................................10
1.2.3. Chức năng của eCG...........................................................................................11
1.3. Những nghiên cứu về eCG tái tổ hợp ................................................................. 13
1.4. Tổng quan về tế bào HEK293 và mLTC-1 ........................................................ 19
1.4.1. Tổng quan về tế bào HEK293 ..........................................................................19
1.4.2. Tổng quan về tế bào mLTC-1 ..........................................................................21
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ..............................................................................................................................25
2.1. Đối tượng nghiên cứu: Hoạt tính sinh học LH và FSH của hormone eCG tái
tổ hợp chuỗi đơn........................................................................................................... 25

2.2. Hóa chất và thiết bị ............................................................................................... 25
2.3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................ 26
2.3.1. Xác định hoạt tính sinh học LH của eCG tái tổ hợp in vitro .........................26
2.3.1.1. Xác định nồng độ cAMP tạo ra trong tế bào mLTC-1 đáp ứng với
kích hoạt của eCG tái tổ hợp chuỗi đơn............................................................26
2.3.1.2. Xác định nồng độ Progesterone sản sinh ra trong tế bào mLTC-1 đáp
ứng với kích hoạt của eCG tái tổ hợp chuỗi đơn. ............................................26
2.3.1.3. Xác định nồng độ ATP sản sinh ra trong tế bào mLTC-1 đáp ứng với
kích hoạt của eCG tái tổ hợp chuỗi đơn............................................................26
2.3.1.4. Xác định tỷ lệ sống của tế bào sau khi kích kích bằng eCG tái tổ hợp
chuỗi đơn..............................................................................................................26
2.3.2. Xác định hoạt tính sinh học FSH của eCG tái tổ hợp in vitro .......................26
2.3.2.1. Xác định nồng độ cAMP tạo ra trong tế bào HEK293 đáp ứng với
kích hoạt của eCG tái tổ hợp chuỗi đơn............................................................26
2.3.2.2. Xác định nồng độ Progesterone sản sinh ra trong tế bào HEK293 đáp
ứng với kích hoạt của eCG tái tổ hợp chuỗi đơn. ............................................26
2.3.2.3. Xác định nồng độ ATP sản sinh ra trong tế bào HEK293 đáp ứng với
kích hoạt của eCG tái tổ hợp chuỗi đơn............................................................26
2.3.2.4. Xác định tỷ lệ sống của tế bào sau khi kích kích bằng eCG tái tổ hợp
chuỗi đơn..............................................................................................................26
2.4. Phương pháp nghi n cứu ..................................................................................... 26
2.4.1. Nuôi cấy tế bào ..................................................................................................26
2.4.2. Phương pháp t nh tỷ lệ sống của tế bào trong hộp nuôi cấy ..........................28
2.4.3. Phương pháp xác định nồng độ cAMP ...........................................................29
2.4.4. Phương pháp xác định nồng độ của progesterone sản xuất trong tế bào .....29
2.4.5. Xác định mức năng lượng ATP trong tế bào ..................................................30
2.4.6. Phương pháp t nh tỷ lệ sống tế bào trong đ a nuôi cấy ..................................31
2.4.7. Phương pháp xử lý các số liệu..........................................................................32
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................33

3.1. Xác định hoạt tính sinh học LH và FSH của eCG tái tổ hợp chuỗi đơn in vitro
thông qua nồng độ cAMP tạo ra trong tế bào mLTC-1, HEK293 đáp ứng với kích
thích của eCG. .............................................................................................................. 33
3.2. Xác định nồng độ Progesterone sản sinh ra trong tế bào mLTC-1 và HEK293
đáp ứng với kích hoạt của eCG tái tổ hợp chuỗi đơn. .............................................. 39
3.3. Xác định nồng độ ATP sản sinh ra trong tế bào mLTC-1 và HEK293 đáp ứng
với kích hoạt của eCG tái tổ hợp chuỗi đơn. ............................................................. 43
3.4. Xác định tỷ lệ sống của tế bào mLTC-1 và HEK293 sau khi kích kích bằng
eCG tái tổ hợp chuỗi đơn. ........................................................................................... 46
KẾT LUẬN .................................................................................................................49
1. KẾT LUẬN .............................................................................................................. 49
2. KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 50
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ..............................................................51
PHỤ LỤC
QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN THẠC SĨ (BẢN SAO)


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Từ đầy đủ

STT

Từ viết tắt

1

eCG

2

PMSG

3

CTP

Carboxyl-terminal peptide

4

LH

Luteinizing hormone

5

FSH

Follicle-stimulating hormone

6

hCG

Human chorionic gonadotropin

7

rec-eCG

Recombinant equine chorionic gonadotropin

8

GnRHR

Gonadotropin releasing hormone receptor

9

rLH/CGR

Equine Chorionic Gonadotropin
Pregnant Mare's Serum Gonadotropin

Rat

luteinizing

hormone/chorionic

receptor
10

FSHR

Follicle-stimulating hormone receptor

11

rFSHR

Rat follicle-stimulating hormone receptor

gonadotropin


DANH MỤC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ
Bảng 3.1. Tỷ lệ phần trăm (%) tế bào mLTC-1 sống theo nồng độ eCG ....... 46


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1. 1. Cấu trúc của các gonadotropin FSH, LH, hCG ............................... 7
Hình 1. 2. Cấu trúc của gonadotropin ở động vật có vú cho thấy các vị trí gắn
carbohydrate .................................................................................................... 10
Hình 1. 3. Tế bào HEK293 nhuộm huỳnh quang ........................................... 21
Hình 1. 4. Ni cấy kết dính tế bào HEK293 ................................................. 21
Hình 1. 5. Tế bào Leydig mLTC-1 nhuộm Eosine ......................................... 23
Hình 1. 6. Tế bào Leydig mLTC-1 ni kết dính ........................................... 24
Hình 2. 1. Hộp nhựa ni cấy tế bào động vật................................................ 27
Hình 2.2. Tế bào mLTC-1 ni cấy trong đ a 96 giếng.................................. 28
Hình 2.3. Cơ chế phản ứng phát quang của Luciferin trong Cell-Titer-Glo 2.0
dưới xúc tác của enzyme luciferase và ion Mg2+ ............................................ 31
Hình 3.1. Biểu hiện tín hiệu của cAMP dưới tác động kích thích của eCG tái
tổ hợp sau 1 giờ ủ tế bào mLTC-1 và HEK293 ở các nồng độ khác nhau. .... 36
Hình 3.2. Biểu hiện tín hiệu của cAMP (được chuyển đổi sang giá trị AUC)
dưới tác động kích thích của eCG sau 1 giờ ủ tế bào mLTC-1 ở các nồng độ
khác nhau......................................................................................................... 37

Hình 3.3. Sơ đồ mơ tả q trình sản xuất cAMP trong tế bào ........................ 39
Hình 3.4. Đồ thị chuẩn Gamme progesterone................................................. 41
Hình 3.5. Sản xuất progesterone dưới kích thích của eCG tái tổ hơp trong
mLTC-1 ........................................................................................................... 42
Hình 3.6. Đồ thị chuẩn ATP............................................................................ 44
Hình 3.7. Ảnh hưởng của eCG tái tổ hợp đến nồng độ ATP trong tế bào
mLTC-1 và HEK293 ....................................................................................... 45
Hình 3.8. Tế bào mLTC-1 sau khi ủ 1 giờ với eCG tái tổ hợp và được kiểm tra
khả năng sống bằng CellTiter-Blue ................................................................ 47
Hình 3.9. Tế bào HEK293 sau khi ủ 1 giờ với eCG tái tổ hợp và được kiểm
tra khả năng sống bằng CellTiter-Blue ........................................................... 47


1

MỞ Đ U
1. Lý do chọn đề tài
Gonadotropin màng đệm ngựa (eCG), còn được gọi là gonadotropin
huyết thanh ngựa cái (PMSG), là một hormone glycoprotein được tiết ra bởi
các tế bào biểu mơ có nguồn gốc từ bào thai tạo thành nội mạc tử cung [1],
[23]. Về cấu trúc, eCG có hai tiểu đơn vị là alpha và beta. Các tiểu đơn vị
alpha là chung cho tất cả các hormone glycoprotein. Các tiểu đơn vị beta là
đặc trưng theo loài. Các tiểu đơn vị beta có tính đặc hiệu với hormone và chịu
trách nhiệm về tính đặc hiệu liên kết với thụ thể, mặc dù CG liên kết với cùng
một thụ thể Luteinizing hormone / choriogonadotropin như LH. eCG là một
thành viên duy nhất của họ hormone glycoprotein có thể hiện cả hoạt động
giống hormone hoàng thể (LH) và hormone kích thích nang trứng (FSH) ở
các lồi khơng ngựa. Tuy nhiên, eCG chỉ biểu hiện hoạt động giống LH ở các
lồi ngựa [21], [54].
Cơng dụng của eCG bao gồm kích thích dậy thì, tăng cường khả năng

sinh sản và rụng trứng [41]. Hormone này được sử dụng rộng rãi, cùng với
gonadotropin màng đệm của người để kích thích sự phát triển của nang trứng
và rụng trứng ở lợn nái chưa trưởng thành [18], [28]. eCG cũng được sử dụng
để gây rụng trứng ở bò, bò sữa, dê, cừu và lợn cũng như q trình thụ thai ở
cùng lồi, cho các chương trình chuyển phơi. eCG cũng thường được sử dụng
để gây động dục đồng bộ ở các trang trại chăn nuôi lợn, cho phép quản lý lợn
hiệu quả hơn và giảm các vấn đề về an toàn sinh học li n quan đến việc di
chuyển động vật vào và ra khỏi chuồng.
Để chiết xuất và tinh chế eCG, ngựa cái mang thai được đặt tại nơi sản
xuất, một lượng nhỏ máu được rút ra và kiểm tra bằng xét nghiệm hấp thụ
mi n dịch liên kết với enzyme (ELISA) để tìm hàm lượng eCG khi ngựa cái
tiếp cận ngày thứ 40 của thai kỳ, và một khi được xác nhận là dương t nh,


2
lượng máu lớn được thu thập hàng tuần hoặc thường xuy n hơn giữa các ngày
tuổi thai 40 và 120 [1], [23]. Tuy nhiên, hiện nay vì lý do chi phí, các cơng ty
dược phẩm thú y chưa ra mắt gonadotropin tái tổ hợp nên trên thị trường hiện
nay không có sẵn eCGs tái tổ hợp. Hormone eCG tự nhiên, hay còn gọi là
PMSG, được sử dụng phần lớn trong chăn nuôi gia súc (gia súc, lợn, cừu, dê)
gần đây đã bị tranh cãi nhiều vì nó địi hỏi phải lấy máu liên tục và vi phạm
quy định về sức khỏe động vật ở nhiều nước. Do đó, sự ra đời của eCG tái tổ
hợp để thay thế cho nguồn eCG tự nhiên là rất cần thiết hiện nay đối với
ngành chăn nuôi, thú y.
Hiện nay eCG tái tổ hợp trên thị trường hầu như khơng có, những
nghiên cứu về eCG tái tổ hợp mới chỉ dừng ở giai đoạn in-vitro. Nhóm nghiên
cứu của chúng ta gần đây đã tiến hành nghiên cứu eCG tái tổ hợp dạng chuỗi
đơn bằng cách gắn vào tiểu đơn vị alpha và beta một liên kết Linker và thay
đổi vị trí chuỗi O-glycosyl hóa tại C-terminus của tiểu đơn vị beta bằng chuỗi
hai N-glycosyl hố. Chúng tơi đã thành cơng trong việc chuyển gen plasmid

Linker và hai N-glycosyl hoá vào tế bào HEK293 và thu được eCG tái tổ hợp
được sản xuất ra trong môi trường nuôi cấy tế bào HEK293 sau 4 ngày. Tuy
nhiên, chất lượng của eCG cần phải được đánh giá thơng qua việc thử các
hoạt tính sinh học của nó trong các dòng tế bào khác nhau. Do vậy trong
nghiên cứu này, chúng tơi sẽ đánh giá hoạt tính sinh học LH và FSH của eCG
tái tổ hợp chuỗi đơn tr n dòng tế bào HEK293 và mLTC-1. Đây là hai dịng tế
bào với đặc điểm đặc trưng là có chứa thụ thể LH trên mLTC-1và FSH trên
HEK293, do vậy chúng tơi đã lựa chọn hai dịng tế bào này để thử hoạt tính
sinh học của eCG tái tổ hợp chuỗi đơn.
2. Mục tiêu và nội dung nghi n ứu
- Mục ti u của đề tài là đánh giá hoạt t nh LH và FSH của hormone eCG
tái tổ hợp tr n dòng tế bào HEK293 và mLTC-1.


3
- Nội dung nghi n cứu:
 Xác định hoạt t nh sinh học LH của eCGs tái tổ hợp in vitro
thông qua nồng độ cAMP, ATP và progesterone sau khi k ch hoạt dòng tế bào
mLTC-1.
 Xác định hoạt t nh sinh học FSH của eCGs tái tổ hợp in vitro
thông qua nồng độ cAMP, ATP và progesterone sau khi k ch hoạt dòng tế bào
HEK293.
3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghi n cứu: Hoạt t nh sinh học LH và FSH của hormone
eCG tái tổ hợp chuỗi đơn.
- Phạm vi nghi n cứu: dòng tế bào HEK293 (Human Embryonic
Kidney293) và mLTC-1 (Mouse Leydig tumor cells -1).
4.

ngh

ho họ v thự tiễn ủ đề t i

4
Kết quả nghi n cứu sẽ đóng góp bằng chứng về việc có n n hay khơng
nên sử dụng eCG tái tổ hợp chuỗi đơn để k ch th ch noãn ch n và rụng trong
thụ tinh nhân tạo ở động vật.
42

t ực tiễn
Kết quả nghi n cứu của đề tài sẽ đóng góp giá trị lớn trong việc sản

xuất hormone k ch th ch trứng ch n và rụng ở động vật với thời gian bán hủy
lâu dài trong cơ thể. Đề tài sẽ có giá trị lớn trong ngành dược phẩm thú y.
5. Những đóng góp mới củ đề tài
T nh mới hấp dẫn trong nghi n cứu này là chúng tôi sẽ kiểm tra được
cả hai hoạt t nh sinh học LH và FSH tr n cùng một loại hormone eCG tái tổ
hợp chuỗi đơn.


4

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU
1.1. Tổng quan về hormone gonadotropin
Gonadotropin là các hormone điều chỉnh chức năng buồng trứng và
tinh hoàn, cần thiết cho sự tăng trưởng, phát triển và sinh sản bình thường ở
động vật có vú và con người [58]. Các gonadotropin đóng vai trị thiết yếu
trong sinh sản bao gồm: hormone hoàng thể (LH), hormone kích thích nang
trứng (FSH) và hormone gonadotropin màng đệm (CG) [56]. LH và FSH giải
phóng từ thùy trước tuyến yên, trong khi CG sản xuất bởi các hợp bào nuôi từ

nhau thai. Các hormone glycoprotein là các dị phân tử phức tạp bao gồm một
tiểu đơn vị α liên kết khơng cộng hóa trị với một tiểu đơn vị β, có cấu trúc đặc
trưng trong chuỗi peptide của nó đối với từng thành viên và mang lại t nh đặc
hiệu liên kết ở cấp độ thụ thể [56]. Cả hai tiểu đơn vị đều được gắn các chuỗi
oligosaccharide, mà số lượng của chúng thay đổi tùy thuộc vào hormone
glycoprotein cụ thể, và có li n quan đến nhiều chức năng, thời gian bán hủy
trong huyết tương và hoạt tính sinh học của hormone tại tế bào đ ch [56].
Quá trình tổng hợp và bài tiết gonadotropin được điều chỉnh bởi hoạt
động phối hợp của một số yếu tố nội tiết, tuyến nội tiết và tự nội tiết có cấu
trúc hóa học đa dạng, tác nhân chính là hormone giải phóng gonadotropin
(Gonadotropin-Releasing Hormone, GnRH) [56]. Gonadotropin tương tác với
các thụ thể tương ứng của chúng (thụ thể FSH và thụ thể LH/CG) trong buồng
trứng và tinh hoàn [56]. Trong buồng trứng, FSH điều chỉnh sự phát triển và
trưởng thành của các nang buồng trứng cũng như sản xuất estrogen bởi các tế
bào hạt, trong khi trong tinh hồn FSH kích thích các tế bào Sertoli giải phóng
protein liên kết androgen (Androgen-binding protein, ABP), điều này giúp
điều chỉnh quá trình sinh tinh trùng do sự giải phóng hormone ức chế [56]. Tế
bào đ ch của LH là tế bào theca của nang buồng trứng và hồng thể, nơi nó
thúc đẩy q trình tổng hợp hormone steroid sinh dục và quá trình phóng


5
nỗn [56]. Trong tinh hồn, LH kích thích sự sản sinh steroid của tế bào
Leydig, chủ yếu là sản xuất testosterone, để thúc đẩy sự trưởng thành và chức
năng tình dục, cũng như quá trình sinh tinh [56]. Các đột biến trong kiểu gen
tiểu đơn vị β của LH và FSH dẫn đến thiếu hụt gonadotropin và có biểu hiện
lâm sàng như sự thiếu trưởng thành ở tuổi dậy thì và vô sinh ở nam, nữ khi
xuất hiện đột biến ở LHβ [56]. Trong khi đột biến ở FSHβ có thể dẫn đến
bệnh azoospermia ở nam hoặc dậy thì khơng hồn tồn và vơ sinh ở nữ
[56]. Hiện nay, một số chế phẩm tái tổ hợp của gonadotropin hiện có sẵn cho

các mục đ ch điều trị này. Các gonadotropin của tuyến n chịu sự kiểm sốt
của hormone giải phóng gonadotropin GnRH, một decapeptide được sản xuất
ở vùng dưới đồi và được giải phóng để đáp ứng với mức lưu hành của
estrogen và progesterone [56].
Hormone kích thích nang trứng (FSH) là một hormone được điều tiết
bởi tuyến yên ảnh hưởng đến sự tăng trưởng, phát triển giới tính và sinh sản,
bao gồm kinh nguyệt, phát triển nang trứng và rụng trứng [58]. FSH là một
chất hetertodimer glycoprotein gồm hai đơn vị α và β. Tiểu đơn vị α của FSH
gồm 96 axit amin [47]. FSH có tiểu đơn vị β gồm 111 axit amin, tạo ra hoạt
động sinh học cụ thể của nó và chịu trách nhiệm tương tác với thụ thể
hormone kích thích nang trứng. Cả hai tiểu đơn vị đều cần thiết cho hoạt động
sinh học. Phần oligosaccharide của hormone này được liên kết cộng hóa trị
với asparagin,

và

bao

gồm

N-acetylgalactosamine, mannose, N-

acetylglucosamine, galactose và axit sialic [25]. FSH, ít nhất là một phần,
được điều chỉnh bởi GnRH được tạo ra ở vùng dưới đồi để phản ứng với
nhiều tín hiệu bao gồm cả mức lưu hành của hormone sinh dục [17]. FSH
tương tác với các thụ thể trên nang trứng và là yếu tố chính quyết định mức
độ trưởng thành của các nang trứng [20]. Nồng độ FSH tăng đột biến xảy ra
vào giữa chu kỳ kinh nguyệt dẫn đến rụng trứng. Ở nam giới, FSH thúc đẩy

6
quá trình sinh tinh và đáp ứng androgen trong tinh hồn. Vì vậy, FSH cần
thiết cho sự thành thục và sinh sản về giới tính ở cả nam và nữ.
Hormone tạo hoàng thể (LH) là một hormone tuyến yên cần thiết cho
sự phát triển và sinh sản giới tính ở cả nam và nữ. LH là một glycoprotein dị
phân tử, mỗi đơn vị monomer là một phân tử glycoprotein gồm một tiểu đơn
vị α và một tiểu đơn vị là β [25]. Các tiểu đơn vị α của LH chứa 92 axit
amin ở người nhưng 96 axit amin ở hầu hết các lồi động vật có xương sống
khác [25]. LH có một tiểu đơn vị β gồm 120 axit amin tạo ra hoạt động sinh
học cụ thể của nó và chịu trách nhiệm về t nh đặc hiệu của sự tương tác
với thụ thể LH [25]. Thành phần khác nhau của các oligosaccharide ảnh
hưởng đến hoạt tính sinh học và tốc độ phân hủy của nó trong huyết tương
[25]. Thời gian bán hủy sinh học của LH là 20 phút, ngắn hơn của FSH (3 - 4
giờ) và hCG (24 giờ) [19]. LH được điều chỉnh bởi GnRH từ vùng dưới đồi
nhạy cảm với mức lưu hành của hormone sinh dục. LH tương tác với các thụ
thể trên nang trứng và thúc đẩy sự trưởng thành của chúng. Vào giữa chu kỳ
kinh nguyệt, sự gia tăng LH k ch hoạt q trình rụng trứng và sản xuất
progesterone bởi hồng thể, cần thiết cho sự trưởng thành của nội mạc tử
cung để làm tổ của trứng đã thụ tinh. Ở nam giới, LH kích thích tinh hồn sản
xuất testosterone.
Gonadotropin màng đệm ở người (hCG) là một hormone glycoprotein,
được tiết ra bởi các tế bào hợp bào ni của nỗn đã thụ tinh, đi vào hệ tuần
hoàn của người mẹ tại thời điểm nội mạc tử cung làm tổ. hCG là dạng dị phân
tử với một tiểu đơn vị α giống với tiểu đơn vị của hormone tạo hồng thể
(LH), hormone kích thích nang trứng (FSH), hormone kích thích tuyến
giáp (TSH) và tiểu đơn vị β là đặc trưng và duy nhất cho hCG. Tiểu đơn vị
α gồm 92 axit amin [9]. Tiểu đơn vị β chứa 145 axit amin [9]. Gonadotropin
màng đệm ở người có một vai trị quan trọng trong quá trình sinh sản của con

7
người. Một số nghiên cứu đã chứng minh vai trò quan trọng của nó trong việc
thúc đẩy sản xuất progesterone bởi các tế bào hồng thể, thúc đẩy q trình
hình thành mạch trong hệ mạch tử cung, gây ra sự phát triển của tử cung song
song với sự phát triển của thai nhi, gây ra sự tăng trưởng và biệt hóa của dây
rốn; báo hiệu cho nội mạc tử cung về quá trình làm tổ sắp tới, hoạt động trên
cơ quan thụ cảm trong não của mẹ gây ra chứng buồn nôn và dường như thúc
đẩy sự phát triển của các cơ quan của thai nhi trong thời kỳ mang thai
[12]. Do tính chất tương tự như LH, hCG cũng có thể được sử dụng trên lâm
sàng để gây rụng trứng trong buồng trứng cũng như sản xuất testosterone
trong tinh hoàn. Ngoài ra, hCG đã được sử dụng trong các quy trình hỗ trợ
sinh sản bằng cách bắt chước Luteinizing Hormone (LH) nội sinh phát triển
trong giai đoạn cuối của nang trứng để tạo ra sự trưởng thành và rụng trứng
của nang trứng và tế bào trứng cuối cùng.

Hình 1.1. Cấu trúc của các gonadotropin FSH, LH, hCG


8
1.2. Tổng quan về eCG
1.2.1. Nguồn gốc và cấu trúc của eCG
Gonadotropin màng đệm ngựa (Equine Chorionic Gonadotropin, eCG)
được phát hiện cách đây hơn 80 năm, là một hormone được sản xuất trong
màng đệm sinh dục của ngựa cái mang thai, thường được gọi là huyết thanh
ngựa chửa (Pregnant Mare's Serum Gonadotropin, PMSG) [41]. Trong những
nghiên cứu đầu tiên, huyết thanh từ những con ngựa mang thai được tiêm vào
động vật thí nghiệm đã k ch th ch sự tăng trưởng buồng trứng. Một thời gian
sau đó, chất đóng vai trò k ch th ch buồng trứng này đã được xác định có mặt
trong tử cung ngựa, dẫn đến gợi ý rằng nó có nguồn gốc từ bào thai [31]. Các
nghiên cứu vào đầu những năm 1970 đã xác nhận rằng, nguồn gốc của

hormone này là từ các tế bào chorionic bào thai xâm nhập biểu mô tử cung để
tạo thành các lớp nội mạc tử cung. Phát hiện này đã dẫn đến việc đổi tên
hormone PMSG thành Equine chorionic gonadotropin (eCG) [31].
eCG là một dạng biến thể của hormone tạo hồng thể ngựa (LH), được
glycosyl hóa một cách khác biệt bởi các tế bào ngun bào ni ngựa [41].
Nó có đặc t nh đặc biệt là kích thích hoạt động của cả hormone kích thích
nang trứng FSH và hormone tạo hồng thể LH ở các lồi khơng phải ngựa
[41]. Cơ sở sinh học cho hoạt động kép này được cho là kết quả của sự phát
triển mạnh các thụ thể FSH của động vật có vú, truyền khả năng đáp ứng với
hormone giống LH ở ngựa [41]. eCG tiết ra từ nội mạc tử cung của ngựa cái
từ ngày thứ 40 đến ngày 130 thai kỳ, có bản chất là một kích thích tố
glycoprotein, gồm có hai tiểu đơn vị là α và β. Các tiểu đơn vị α là chung cho
tất cả các hormone glycoprotein (LH, FSH, TSH). Các tiểu đơn vị β là đặc
trưng theo loài [41]. Tiểu đơn vị eCGα chứa hai vị trí glycosyl hóa liên kết N
ở gốc axit amin 56 và 82, trong khi tiểu đơn vị eCGβ chỉ chứa một vị trí
glycosyl hóa liên kết N ở gốc axit amin 13 [37], [55]. Ngoài ra, tiểu đơn vị


9
eCG β chứa khoảng 12 vị trí glycosyl hóa liên kết O trong vùng peptit đầu tận
cùng cacboxyl (carboxy-terminal peptide, CTP) [7]. Trong số tất cả các
hormone glycoprotein đã biết, eCG có hàm lượng carbohydrate cao nhất (hơn
40%) [2]. Do đó, eCG có các chức năng sinh học và cấu hình carbohydrate
độc đáo.
Phân t ch protein đã chứng minh rằng eCG được tổng hợp và tiết ra
tương tự như gonadotropin tuyến y n (FSH, LH), nó được chuyển hóa sau khi
được glycosyl hóa [40]. Giải trình tự axit amin cho thấy cấu trúc chính của
eCGꞵ giống hệt với LHꞵ. Cả hai hiển thị một phần mở rộng đầu cuối
carboxyl gồm 30 axit amin, và đi này được glycosyl hóa mạnh (Hình 1.1).
Các nghiên cứu sau đó đã chứng minh rằng chúng là hai sản phẩm của một

gen đơn [52]. Sự glycosyl hóa đã phân biệt chúng, vì chuỗi LH được bổ sung
với oligosaccharides sialyl hóa và sulfat, trong khi các dạng sialyl hóa chiếm
ưu thế trong phân tử eCGꞵ glycosyl hoá mạnh hơn [31]. Sự khác biệt này,
đặc biệt là sự gắn kết của axit sialic, dẫn tới một trong những tính chất quan
trọng nhất là thời gian bán rã sinh học kéo dài của eCG, dài hơn sáu lần so với
LH [30].
Màng đệm bắt đầu phát triển trong giai đoạn phôi sớm trong tuần thứ 7
của thai kỳ và bắt đầu xâm nhập nội mạc tử cung để tạo thành các ống nội
mạc tử cung. Vào thời gian này, eCG có thể được phát hiện trong huyết thanh
của ngựa. Trong một mơ hình chung, đỉnh eCG tồn tại ở ngày thứ 70-80 của
thai kỳ [41].


10

Hình 1.2. Cấu trúc của gonadotropin ở động vật có vú cho thấy các vị trí gắn
carbohydrate [41]

1.2.2. Hoạt động sinh h c của eCG
eCG có hoạt tính sinh học như hormone LH ở ngựa (eLH), mặc dù ít
mạnh hơn eLH [50]. Vai trò đáng chú ý của eCG đã được khai thác trong
nhiều bối cảnh thử nghiệm và thương mại, là khả năng thể hiện hoạt động
hormone kích thích nang trứng (FSH) ở các loài khác ngựa. Cơ sở sinh học
cho hiện tượng này vẫn chưa được hiểu đầy đủ, giải thích chủ yếu dựa trên
hoạt động kép của yếu tố quyết định cấu trúc của eCG hoặc của các thụ thể
LH và FSH ở các lồi khơng phải là ngựa.
Một trong những đặc điểm của eCG là độ dài bán rã của nó. Khi tiêm
vào chuột, eCG hiển thị thời gian bán rã vượt quá 5 giờ; trong khi ở cừu, giá
trị này là 21 giờ. Ở gia súc, thời gian bán rã được ước tính là 45,6 giờ [41].
Cơ sở cho sự kéo dài này là do sự glycosyl hóa mạnh, bao gồm khoảng 45%

trọng lượng phân tử của nó [32]. Cả hai chuỗi được glycosyl hóa tại các liên
kết asparagine (N-glycosyl hố) và serine-threonine (O-glycosyl hóa) và phần
mở rộng C-terminal của chuỗi β được glycosyl hóa mạnh, trong đó các chuỗi
carbohydrate chứa axit sialic, tạo ra thời gian bán rã dài [30]. Loại bỏ axit


11
sialic khỏi eCG làm giảm thời gian bán rã, và khi loại bỏ 80% thì giảm thời
gian bán rã xuống dưới 60 phút [30]. Tuy nhiên, mơ hình glycosyl hóa eCG
khơng chỉ quyết định sự tồn tại của nó trong huyết thanh mà cịn hoạt động
sinh học của nó trong mơ đ ch [30], [42]. Vì cấu trúc có khả năng li n kết với
các thụ thể, đặc biệt trong thụ thể của FSH, là cơ sở cho hoạt động kép (vai
trò như LH và FSH) của eCG. Hiệu ứng này được tăng cường bởi thời gian
bán rã kéo dài của nó.
Các thụ thể LH của ngựa cho thấy t nh tương đồng cao với các thụ thể
LH ở động vật có vú khác, cũng như khả năng li n kết LH từ các loài khác
[49]. Trong khi eCG tương tác độc quyền với thụ thể LH ở ngựa, nó chỉ hiển
thị một phần nhỏ hoạt động như LH [50]. Tuy nhiên, eCG liên kết với eLH
trong thời gian mang thai sớm, có thể cung cấp hỗ trợ nội tiết tố để duy trì thai
kỳ. Vào khoảng ngày thứ 40 của thai kỳ, các cấu trúc hoàng thể xuất hiện
trong buồng trứng, trùng hợp với sự bắt đầu bài tiết eCG từ các ống nội mạc
tử cung. Đây có thể là kết quả của sự rụng trứng bổ sung, vì sự khởi đầu của
chúng đã được chứng minh là đi kèm với sự xuất hiện của noãn bào trong
buồng trứng và có sự gia tăng đồng thời progesterone trong máu. Mối quan hệ
thời gian giữa hai sự kiện này cho thấy eCG có thể gây ra sự rụng trứng bổ
sung và hỗ trợ nội tiết tố đủ để tiếp tục mang thai [41]. Khi sự sản xuất eCG
giảm đáng kể kéo theo sự gia tăng đồng thời tần suất hư thai trong thời gian
mang thai sớm [6].
1.2.3. Chứ

ă

ủa eCG

Ở các lồi khơng phải ngựa, eCG gây ra sự giải phóng cả hormone tạo
hồng thể (LH) và hormone kích thích nang trứng (FSH) [14]. Do đó, việc sử
dụng eCG trong chăn ni phổ biến ở các nước có khí hậu ơn đới, nơi mà chu
kỳ động dục tự nhiên của vật nuôi thường chỉ hỗ trợ cho việc mang thai theo
mùa. Công dụng của eCG bao gồm đảo ngược cơn mê, kích thích dậy thì,


12
tăng cường khả năng sinh sản và rụng trứng [41]. Hormone này được sử dụng
rộng rãi, cùng với gonadotropin màng đệm của người để kích thích sự phát
triển của nang trứng và rụng trứng ở lợn nái hậu bị chưa trưởng thành
[18]. Nó cũng được sử dụng để gây rụng trứng ở bò gây mê và bò sữa, dê, cừu
và lợn cũng như thụ thai ở cùng một loài, cho các chương trình chuyển phơi
[13], [15]. eCG cũng thường được sử dụng để động dục đồng bộ ở các trang
trại lợn để cho phép quản lý lợn và nhân viên hiệu quả hơn và giảm các vấn
đề về an toàn sinh học li n quan đến việc di chuyển một phần động vật vào và
ra khỏi chuồng [10]. eCG được sử dụng rộng rãi trong các quy trình thụ tinh
nhân tạo ở bị sữa, trong đó nó được cho là có tác dụng có lợi đối với phơi
đang phát triển [15].
eCG thường được sử dụng phối hợp với progesterone để gây rụng trứng
trong chăn nuôi trước khi thụ tinh nhân tạo. eCG có xu hướng được sử dụng
rộng rãi vì nó có thời gian bán rã dài. Ngồi ra, nó còn k ch th ch sự trưởng
thành của ống sinh tinh và sự sinh tinh ở con đực [41].
Trong quá trình chuyển phơi, eCG được sử dụng để k ch th ch buồng
trứng ở động vật cho phôi. Thời gian bán rã dài của nó tạo ra lợi thế của sự
si u nạp bằng phương pháp ti m đơn, vì nó có khuynh hướng k ch th ch

buồng trứng, dẫn đến tạo nhiều nang và năng suất của phôi khả thi rất cao [4].
Tuy nhi n, ở một số trường hợp, chất lượng phôi giảm cũng đã được quy cho
hoạt động LH của eCG, vì nó có thể gây ra sự tái phát sớm của giảm phân
trong tế bào trứng [39]. Một chiến lược được sử dụng để giải quyết những vấn
đề này là quản lý antiserum eCG tại một thời điểm sau khi điều trị bằng eCG
[22]. Điều trị với antiserum sau 60 giờ sau khi ti m eCG tăng gấp đôi cả số
lượng trứng rụng và số lượng phôi chuyển giao [22]. Các biến thể gần đây về
chủ đề si u k ch th ch đã bao gồm thay thế FSH tuyến y n với liều thấp eCG


13
(200 IU) vào hai ngày cuối cùng của giao thức si u k ch th ch [33]. Cách tiếp
cận này đã chứng tỏ có lợi trong việc tăng số lượng phôi chuyển giao.
Việc sử dụng eCG trong các giao thức đồng bộ hóa đã cho phép cố
định thời gian thụ tinh ở bò [48], cừu [29] và gây động dục đồng pha ở bị cái
nhận phơi [52]. Đối với thụ tinh vào thời gian cố định, việc điều trị dựa tr n
liều thấp eCG (300 IU) sau khi ti m prostaglandin (PGF2a) hoặc progesterone
để đồng bộ hóa đã được áp dụng cho bò Zebu (Bos indicus) với kết quả khác
nhau [5]. Sử dụng eCG tỏ ra thuận lợi trong việc tăng tỷ lệ mang thai trong
thời gian chuyển phôi cố định, độc lập với giao thức được sử dụng để gây
động dục đồng pha [16].
Như đã mô tả ở tr n, eCG hiển thị cả hoạt động của FSH và LH, và
được biết rằng cả hai k ch th ch tố này là cần thiết cho sự trưởng thành và
rụng trứng của nang trứng ở động vật có vú. Một số nghi n cứu đã chỉ ra
rằng, điều trị này làm tăng tần suất rụng trứng và dẫn đến progesterone tuần
hoàn tăng cao. Nhưng ở một số nghi n cứu khác, tăng progesterone không
tương quan với tăng tỷ lệ mang thai [44]. Tuy nhi n, trong một số giao thức,
sự tăng tổng hợp progesterone do eCG gây ra đã dẫn đến thành công trong
thai kỳ được cải thiện [3]. Hiện nay, cơ chế duy nhất được biết đến để cải
thiện khả năng sinh sản với điều trị liều thấp eCG là sự tăng cường chức năng

của hoàng thể.
1.3. Những nghiên cứu về eCG tái tổ hợp
Một nghi n cứu về eCG tái tổ hợp (rec-eCG) cho thấy rằng axit amin
(aa) 102-104 của tiểu đơn vị β rất quan trọng đối với sự li n kết của eCG với
thụ thể FSHR [11]. Ngoài ra, các gốc aa 104-109 của tiểu đơn vị β rất quan
trọng cho việc tiết ra eCGβ/α được gấp lại hồn tồn và hoạt động giống FSH
của nó nhưng không giống với hoạt động LH [21]. Trước đây báo cáo rằng
rec-eCG được tạo ra từ tế bào CHO-K1 thể hiện cả hoạt động giống LH và


14
FSH trong tế bào Leydig của chuột [21], tế bào granulosa ở chuột và các tế
bào biểu hiện thụ thể lutropin/CG ở chuột (rLH/CGR) và FSHR của chuột
[24], [45]. Gần đây đã chứng minh rằng việc sử dụng các protein rec-eCG làm
giảm đáng kể số lượng tế bào trứng không chức năng và tần suất xuất hiện các
tế bào trứng khơng chức năng trong nhóm được xử lý eCG tự nhiên và receCG lần lượt là khoảng 20% và 2% [35]. Ngồi ra, phân tích microarray cho
thấy sự biểu hiện khác biệt của các gen li n quan đến rụng trứng trong buồng
trứng chuột giữa các nhóm được xử lý eCG tự nhi n và eCG tái tổ hợp [36].
Trước đây các nhà nghi n cứu đã kiểm tra các vai trị khác nhau của
rec-eCG và các mơ hình glycosyl hóa của nó trong q trình cấy ni sơ cấp
tế bào Leydig của chuột và tế bào granulosa [21], [34], [51]. Hoạt t nh giống
LH của eCGαΔ56-/-β được điều hòa hồn tồn trong q trình sản xuất
testosterone trong ni cấy tế bào Leydig của chuột. Tuy nhi n, hoạt t nh
giống FSH của eCGαΔ56-/-β tương tự như eCG kiểu hoang dã, điều này chỉ
ra rằng đột biến eCGαΔ56-/- β k ch th ch sản xuất estradiol trong q trình
ni cấy sơ cấp của tế bào hạt chuột. Do đó, các vai trị sinh học của vị tr
glycosyl hóa tại Asn56 của tiểu đơn vị eCGα dường như khác nhau về cả hoạt
động giống LH và FSH trong các mẫu cấy sơ cấp tế bào Leydig của chuột và
bào tế granulosa. Tuy nhi n, ảnh hưởng của đột biến vị tr glycosyl hóa l n
các hoạt động giống LH và FSH của sự k ch th ch qua trung gian eCG của

đáp ứng cAMP chưa được kiểm tra trong các tế bào biểu hiện rLH/CGR và
rFSHR. Nghi n cứu này nhằm xác định vai trị của các vị tr glycosyl hóa
trong các hoạt động giống LH và FSH của eCG bằng cách sử dụng các đột
biến rec-eCG. Các dạng eCG chuỗi đơn và các đột biến vị tr glycosyl hóa của
nó được xây dựng và hoạt t nh sinh học của các protein này được kiểm tra
trong ống nghiệm bằng cách sử dụng các tế bào biểu hiện rLH/CGR và
rFSHR. Những phát hiện của nghi n cứu này cho thấy vai trị của các vị tr
glycosyl hóa trong các hoạt động giống LH và FSH của eCG.


15
Gonadotropin màng đệm ngựa (eCG), bao gồm tiểu đơn vị α và tiểu
đơn vị β glycosyl hóa cao, là một thành viên duy nhất của họ hormone
glycoprotein vì nó tạo ra cả hormone kích thích nang trứng (FSH) và hormone
tạo hồng thể (LH) nhưng phản ứng ở các lồi khơng đồng đều. Để kiểm tra
chức năng sinh học của các vị tr glycosyl hóa trong eCG, các đột biến vị trí
glycosyl hóa sau đây đã được xây dựng: eCGβ/αΔ56, thay thế Asn56 của tiểu
đơn vị α với Gln; eCGβ-D/α, xóa vị trí glycosyl hóa liên kết O tại vùng peptit
đầu tận cùng cacboxyl (CTP) của tiểu đơn vị β; eCGβ-D/αΔ56, đột biến kép
[27]. Các đột biến eCG (rec-eCG) tái tổ hợp được biểu hiện trong các tế bào
treo buồng trứng chuột hamster Trung Quốc (CHO-S) [27]. Các hoạt động
giống FSH và giống LH của các đột biến được kiểm tra bằng cách sử dụng
các tế bào CHO-K1 biểu hiện thụ thể lutropin/CG ở chuột (rLH / CGR) và thụ
thể FSH ở chuột (rFSHR). Cả rec-eCGβ/α và rec-eCGβ/αΔ56 đều được tiết
một cách hiệu quả vào môi trường nuôi cấy tế bào CHO-S ở ngày thứ nhất
sau chuyển nhi m [27]. Tuy nhiên, việc bài tiết eCGβ-D/α và eCGβ-D/αΔ56,
thiếu khoảng 12 vị trí glycosyl hóa liên kết O, hơi bị chậm lại. Mức độ biểu
hiện của tất cả các thể đột biến là tương tự nhau (200-250 mIU/mL) từ ngày
thứ 3 đến ngày thứ 7 sau khi chuyển gen [27]. Trọng lượng phân tử của receCGβ/α, rec-eCGβ/αΔ56 và rec-eCGβ-D/α lần lượt nằm trong khoảng 40-45,
37-42 và 34-36 kDa. Điều trị bằng peptide-N-glycanase F làm giảm rõ rệt

trọng lượng phân tử xuống khoảng 5-10kDa [27]. Rec-eCGβ-/-αΔ56 thể hiện
hoạt tính giống LH được điều chỉnh giảm rõ rệt [27]. Hoạt động truyền tín
hiệu của cả hai thể đột biến kép đều bị suy giảm hồn tồn. Điều này chỉ ra
rằng vị trí glycosyl hóa tại Asn56 của tiểu đơn vị α đóng vai trị quan trọng
trong hoạt động giống LH của eCG. Tương tự như vậy, hoạt động giống FSH
của các thể đột biến bị điều chỉnh giảm rõ rệt. eCGβ-D/α thể hiện các hoạt
động giống LH và FSH được điều hòa giảm rõ rệt [27]. Rec-eCGβ/α thể hiện
hoạt tính sinh học mạnh mẽ trong các tế bào biểu hiện rLH/CGR và rFSHR


16
[27]. Các phát hiện của nghiên cứu này gợi ý rằng các hoạt động giống LH và
FSH của eCG được điều chỉnh bởi vị trí glycosyl hóa liên kết N tại Asn56 của
tiểu đơn vị eCGα hoặc bởi các vị trí glycosyl hóa liên kết O của eCGβ.
Các phát hiện của nghi n cứu này cho thấy rec-eCGβ/α thể hiện hoạt
t nh sinh học mạnh mẽ trong các tế bào CHO-K1 biểu hiện rLH/CGR và
rFSHR. rec-eCGβ/α-wt được tiết một cách hiệu quả vào môi trường nuôi cấy
tế bào CHO-S ở ngày thứ nhất sau khi chuyển nạp [27]. CTP (aa 114-149)
của tiểu đơn vị eCG β chứa khoảng 12 vị tr O-glycosyl hóa là rất quan trọng
đối với việc tiết sớm eCG trong các tế bào CHO-S được truyền với hệ thống
vector biểu hiện của động vật có vú. Vị tr glycosyl hóa tại Asn 56của tiểu đơn
vị α đóng một vai trò quan trọng trong cả hoạt động giống LH và FSH của
eCG [27]. Đặc biệt, hoạt động giống LH của thể đột biến thiếu tiểu đơn vị
eCG β không bị ảnh hưởng nhưng hoạt động bị ức chế hoàn toàn ở thể đột
biến kép. Hoạt t nh giống FSH của rec-eCGβ/αΔ56 giảm rõ rệt, trong khi hoạt
t nh của rec-eCGβ-D/-α không bị ảnh hưởng [27]. Phản ứng cAMP của receCGβ-D/α tương tự như của eCGβ/α-wt. Các oligosaccharid ở Asn 56 của tiểu
đơn vị α và các oligosaccharide li n kết với O của tiểu đơn vị β thể hiện các
vai trò khác nhau trong việc truyền t n hiệu và bài tiết rec-eCG [27]. Một đột
biến rec-eCGβ/α chỉ biểu hiện hoạt động giống FSH để rụng trứng mà không
giống LH đã được xây dựng [27].

Gonadotropin màng đệm ở ngựa (eCG) được mã hóa bởi một gen duy
nhất và có các phần peptit giống hệt nhau [53]. Tuy nhiên, chúng khác nhau
về cấu trúc của các oligosaccharid đ nh kèm, phụ thuộc vào địa điểm sản xuất
của chúng. eCG tái tổ hợp (rec-eCG) sở hữu hoạt tính LH và FSH kép
[53]. eCG đột biến trong đó Asn-56 của tiểu đơn vị alpha được thay đổi thành
Gln để loại bỏ oligosaccharide liên kết N cho thấy mất hoạt tính LH hồn
tồn, trong khi hoạt tính FSH của nó mạnh hơn hoạt tính của loại hoang dã