Thẩm định quy trình phân tích áp dụng đánh giá hàm lượng flavonoid tổng trong trà khô thành phẩm và nước trà ở nhiều điều kiện pha chế khác nhau

11
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỀN TÁT THÀNH

KHOA KỸ THUẬT THỤC PHÁM VÀ MỒI TRƯỜNG

NGUYEN TAT THANH

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

ÁP DỤNG ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG
FLAVONOID TỔNG TRONG
TRÀ KHÔ THÀNH PHẨM VÀ NƯỚC TRÀ Ở
NHIÈƯ ĐIỀU KIỆN PHA CHÉ KHÁC NHAU

THẠCH THỊ NA UY

Tp.HCM, tháng 10 năm 2021

—ít


TÓM TẮT
Trà (Camellia sinensis L.) được biết đến là một thức uống phô biến trên thế giới. Trên

thị trường hiện nay có nhiều sản phẩm trà, tùy thuộc vào giong và quả trình chế biến. Chat
lượng và giả trị của trà được quyết định bởi thành phần nội chất, đặc biệt là những hợp chất
kháng oxy hóa. Q trình thực nghiêm được tiến hành thông qua các phương pháp xác định

hàm lượng flavonoid tông (total flavonoid contents hay TFCs) dựa trên nguyên lý của kỹ thuật

quang phô hấp thu phân tử (UV- Vis) được xem là một trong những phương pháp phân tích đơn

giản nhất nham đảnh giá sự khác biệt về hàm lượng của loại hợp chất này. Đối với trà,
quercetin đirợc sử dụng làm chất chuẩn để định lượng TFCs, tinh theo milligram quercetin

equivalence trên gram mầu khô (mg QE g l). Mặc dù có nhiều phương pháp được sử dụng để
xác định hàm lượng flavonoid tông nhưng tat cả đều dựa trên khả năng tạo phức chelate với
ion nhôm với sự bô sung của một so loại tác chat khác nhưNaNCẸ, CHỉCOOH, CHĩCOONa, ...

Quy trình với sự có mặt của NaNO? trong mơi trường kiềm dành cho rutin, luteolin và catechin,

có độ hấp thụ đảng kể ở bước sóng 510 nm. Đường chuẩn của phương pháp được xây dựng từ

50 đến 700 mg L ‘, cho độ tuyến tính tot với R2 = 0.998, độ lặp và độ tái lặp thóa mãn yêu cầu
của AOAC (2016). Hảm lượngflavonoid tổng trong các mầu trà giảm dần theo thứ tự trà xanh,

trà pu ’erh, trà trắng, trà đen và trà oolong. Khi pha trà, nhiệt độ và thời gian tăng cỏ xu hướng
làm tăng hàm lượng flavonoid tong chiết được và đạt giả trị cao nhất ở 90 °C trong 40 phút.

ỉii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN............................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN........................................................................................................................ ii

TÓM TẮT............................................................................................................................. iii
ABSTRACT......................................................................................................................... iv

MỤC LỤC..............................................................................................................................V

DANH MỤC CHỮ VIÉT TẨT....................................................................................... viii
DANH MỤC HÌNH.......................................................................................................... viii

DANH MỤC BẢNG............................................................................................................ ix
MỞ ĐẦU................................................................................................................................ 1
1.

ĐẬT VẤN ĐÈ............................................................................................................ 1

2.

MỤC TIÊU NGHIÊN cứu..................................................................................... 1
2.1.

Mục tiêu tong quát.............................................................................................. 1

2.2.

Mục tiêu cụ thê.....................................................................................................1

3.

NỘI DUNG NGHIÊN cứu.....................................................................................2

4.

PHẠM VI NGHIÊN cứu........................................................................................ 3
4.1.

Đối tuợng nghiên cứu......................................................................................... 3

4.2.

Thời gian nghiên cứu.......................................................................................... 4

CHƯƠNG 1. TÓNG QUAN VÈ NGHIÊN cúư.......................................................... 7

1.1.

Giới thiệu về trà................................................................................................. 7
1.1.1 Nguồn gốc của trà và nơi phân bố...............................................................7

1.1.2 .

Phân loại trà........................................................................................ 8

1.2.

Thành phần hóa học của trà.............................................................................. 9

1.3.

Các phuơng pháp phân tích hàm lượng flavonoid trong trà...................... 11
V


1.3.1. Phương pháp chiết các hợp chất polyphenol trong trà.......................... 11

1.3.2. Phương pháp xác định hàm lượng flavonoid tống trong trà............... 11

1.4.

Tổng quan về tình hình nghiên cứu liên quan đến đề tài.............................12

CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚƯ........................................................... 13

2.1.

2.2.

Hóa chất, dụng cụ và thiết bị........................................................................... 13
2.1.1.

Hóa chất............................................................................................... 13

2.1.2.

Chuẩn bịhóa chất................................................................................ 13

2.1.3.

Dụng cụ................................................................................................ 13

2.1.4.

Thiết bị................................................................................................. 14

Lấy mầu và bảo quản mẫu................................................................................14
2.2.1.

Lấy mẫu................................................................................................ 14

2.2.2.

Tiền xử lýmẫu và bảo quản mầu....................................................... 15

2.3.

Quy trình chiết mầu........................................................................................... 15

2.4.

Quy trình lên màu.............................................................................................. 15

2.5.

Thấm định phương pháp................................................................................... 16

2.6.

2.5.1.

Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng...................................... 17

2.5.2.

Đường chuẩn và khoảng tuyến tính.................................................. 18

2.5.3.

Độ lặp lại và độ tái lặp........................................................................18

Xác định hàm lượng flavonoid tổng trong các mẫu trà............................... 18
2.6.1.

Phân tích hàm lượng flavonoid tổngtrong các mầu trà................. 18

2.6.2.

Phân tích hàm lượng flavonoid tống trong nước trà ở các nhiệt độ

và thời gian pha trà................................................................................................... 18
CHƯƠNG 3. KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................. 20
3.1.

Thẩm định phương pháp phân tích hàm lượng flavonoid tống trong trà.. 20

3.2.

Hàm lượng flavonoid trong các mẫu trà ở Việt Nam.................................. 21

VI


3.3.

Ảnh hưởng nhiệt độ pha trà.............................................................................23

3.4.

Ảnh hưởng cùa thời gian đến hàm lượng flavonoid tong........................... 24

CHƯƠNG 4. ĐỀ XUÁT CÁC GIẢIPHÁP....................................................................26

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................................................... 27
1.

Kết luận..............................................................................................................27

2.

Kiến nghị........................................................................................................... 27

TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................................. 28
PHỤ LỤC.............................................................................................................................31

vii


DANH MỤC CHỮ VIÉT TẮT
Từ viết tắt

AOAC

EC
ECG
EGC
EGCG
GAE

HPLC
ISO

LAL
LWL
MP
MS
PL
PTFE
ỌC
rpm
RSD
SP
TFC
UAL
UPLC

UV-Vis
UWL

Nghĩa tiếng Anh
Association of Official Analytical
Chemists
Epicatechin
Epicatechin gallate
Epigallocatechin
Epigallocatechin gallate
Gallic Acid Equivalent
High Performance Liquid

Chromatography
International Organization for
Standardization
Lower Action Limit
Lower Warning Limit
Mobile phase
Mass Spectrometer
Polytetrafluoroethylene
Quality Control
round per minute
Relative Standard Deviation
Stationary phase
Total Flavonoid Contents
Upper Action Limit
Ultrahigh Performance Liquid
Chromatography
UltraViolet-Visible
Upper Warning Limit

Nghĩa tiếng Việt
Hiệp hội các nhà hóa học phân tích
chính thức

Đương lượng gallic acid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao
To chức Tiêu chuẩn quốc te

Giới hạn hành động dưới
Giới hạn cânh báo dưới

Pha động
Máy đo khối pho
Phụ lục
Kiểm sốt chất lượng
vịng trên phút
Độ lệch chuẩn tương đối
Pha tĩnh
Hàm lượng flavonoid tổng
Giới hạn hành động trên

Sac ký lỏng siêu hiệu năng

Tữ ngoại-Khà kiến
Giới hạn cảnh báo trên

viii


DANH MỤC HINH
Hình 1.1 Cây trà cổ thụ ở Suối Giàng, Yên Bái (Việt Nam)............................................. 7
Hình 1.2 Sáu loại trà chính..................................................................................................... 9
Hình 1.3 Các hợp chất sản phẩm Phenylalanine................................................................10

Hình 2.1 Quy trình chiết/trích ly phân tích TFCs trong mầu trà...................................... 15
Hình 2.2 Quy trình lên màu các họp chat flavonoid tổng................................................. 16
Hình 2.3 Thiết bị ƯV-Vis 1800 Shimadzu tại Phịng thí nghiệm Hóa Phân tích, Khoa

Kỹ thuật thực phẩm và mơi trường.......................................................................... 17

Hình 3.1 Đường chuan quercetin.........................................................................................20

Hình 3.2 Biểu đồ kiếm sốt chất lượng............................................................................... 21
Hình 3.3 Hàm lượng flavonoids trong các mầu trà...........................................................22
Hình 3.4 Ánh hưởng nhiệt độ pha trà đến hàm lượng flavonoid tổng............................ 23
Hình 3.5 Ảnh hưởng thời gian pha trà đến tỉ lệ chiết flavonoids................................... 24

viii


DANH MỤC BANG
Bảng 1.1 Thành phần chính cùa lá trà................................................................................... 9

Bảng 2.1 Thông tin các mầu trà được thực hiện trong đề tài.......................................... 14
Bảng 2.2 Các điều kiện pha trà........................................................................................... 19
Bảng 3.1 Ket quả thẩm định phương pháp........................................................................20
Bảng PL. 1 Độ chệch của các điểm chuẩn
Bảng PL. 2 Ket quả đánh giá độ tái lặp cùa mầu trà
Bảng PL. 3 Kết quả hàm lượng flavonoid tổng trong các mầu trà
Bảng PL. 4 Ket quả khảo sát nhiệt độ đầu của nước pha trà đến phần trăm flavonoid
tong chiết được trong mầu trà trắng

Bảng PL. 5 Ket quả khảo sát nhiệt độ đầu cùa nước pha trà đến phần trăm flavonoid
tong chiết được trong mầu trà đen

Bảng PL. 6 Ket quả khảo sát nhiệt độ đầu của nước pha trà đến phần trăm flavonoid
tổng chiết được trong mầu trà pu’erh

Bảng PL. 7 Ket quả khảo sát nhiệt độ đầu của nước pha trà đến phần trăm flavonoid
tổng chiết được trong mầu trà xanh

Bảng PL. 8 Ket quả khảo sát thời gian pha trà đến phần trăm flavonoid tống chiết được

trong mầu trà xanh

Bảng PL. 9 Ket quả khảo sát thời gian pha trà đến phần trăm flavonoid tổng chiết được
trong mầu trà Pu’erh

Bảng PL. 10 Ket quả khảo sát thời gian pha trà đến phần trăm flavonoid tổng chiết
được trong mầu hồng trà đen

Bảng PL. 11 Ket quả khảo sát thời gian pha trà đến phần trăm flavonoid tống chiết
được trong mầu trà trắng

ix


MỞ ĐÀU
1. ĐẶT VẤN ĐÈ
Flavonoid là một loại sản phẩm tự nhiên quan trọng đặc biệt, chúng thuộc về một

loại chất chuyến hóa thứ cấp thực vật có cấu trúc polyphenol, đuợc tìm thấy rộng rãi
trong trái cây, rau và một số đồ uống. Flavonoid cũng đuợc tìm thấy nhiều trong thực

phẩm và đồ uống có nguồn gốc thực vật, chắng hạn nhu trái cây, rau, trà, ca cao và rượu
vang. Flavonoid có một số phân nhóm, bao gồm chaicones, flavon, flavonols và
isoflavone. Flavonoid có liên quan đến nhiều tác dụng tăng cường sức khỏe và là một

thành phần không thể thiếu trong nhiều ứng dụng dinh dường, dược phẩm và mỳ phẩm.

Điều này là do các đặc tính chống oxy hóa, chống viêm, chống đột biến và chống ung
thư cùng với khả năng điều chỉnh các chức năng chính của enzym tế bào. Chúng cũng
được biết đến là chất ức chế mạnh đối với một so enzym, chăng hạn như xanthine

oxidase (XO), cyclo-oxygenase (COX),lipoxygenase và phosphoinositide3-kinase(4-6).
Trà là một loại thức uống có the dễ dàng tìm thấy trên thị trường với nhiều dòng trà khác
nhau, với giá thành họp lý vì vậy, chúng phổ biến khắp mọi noi từ nông thôn cho đến

thành thị từ trong nước cho đến ngoài nước, do nhu cầu sử dụng trà khá cao trong thời

gian vừa qua, do đó việc khảo sát hàm lượng flavonoid tổng trong trà và điều kiện pha
tra cũng giúp ta xác định được hàm lượng flavonoid trong các loại trà là khác nhau.

2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỬU
2.1.

Mục tiêu tổng quát

Nghiên cứu về hàm lượng Flavonoids tổng cùa trà và điều kiện pha khác nhau
trong các loại trà ở Việt Nam nhằm xác định sự thay đối của hàm lượng flavonoid trong

trà qua các điều kiện khác nhau.
2.2.

Mục tiêu cụ thể

Đe đạt được mục tiêu tống quát đã nêu trên, chúng tôi đặt ra các mục tiêu cụ the

như sau:
■

Tham định phưong pháp phân tích hàm lượng flavonoid tong (TFCs) trong trà
khô thành phẩm trên thiết bị UV-Vis Shimadzu 1800 tại Phịng Thí nghiệm Hóa

Phân tích, Khoa Kỹ thuật Thực phấm và Mơi trường;

Khóa luận tơt nghiệp đại học-SV: Thạch Thị Na Uy-1611540902

Trang 1


■

Đánh giá hàm lượng flavonoid tổng (TFCs) trong một số loại trà khô thành phẩm
được tron và sản xuất ở khu vực miền Nam và miền núi phía Bắc tại Việt Nam
dựa trên phương pháp đã được tham định;

■

Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian pha trà đến hàm lượng flavonoid
tong so (TFCs) trong nước trà (tea liquor).

3. NỘI DUNG NGHIÊN cúu

STT
1

2

Nội dung công việc
Nội dung 1. Tìm kiếm, tơng hợp tài
liệu và xây dựng đê cương nghiên
cứu

Nội dung 2. Thu thập mẫu, bảo
quản mầu tại Phòng thí nghiệm và
tiền xử lý mẫu
Nội dung 2.1. Thu thập mẫu và bảo
quản mầu tại Phịng thí nghiệm
Nội dung 2.2. Thực hiện quy trình
tiền xử lý mẫu

Kết quả cần đạt
Báo cáo tông họp tài liệu và đề cương
nghiên cứu
Các mẫu trà được thu thập gồm: trà
xanh, trà pu’erh, trà trắng, trà đen
(miên núi phía Băc) và trà xanh, trà
oolong (miên Nam)
Báo cáo về điều kiện bảo quản mẫu
thích họp tại Phịng thí nghiệm
Báo cáo về quy trình tiền xử lý mẫu
và các mẫu trà đã qua bước tiền xử lý

3

4

5

Nội dung 3. Thâm định phương
pháp phân tích flavonoid tơng trên
thiết bị UV-Vis Shimadzu 1800,
bao gồm:

■ Ước lượng giới hạn phát
hiện và giới hạn định lượng
■ Xây dựng đường chuẩn
■ Đánh giá độ lặp, độ tái lặp
Các tiêu chi cho thấm định được
đánh giá theo Phụ lục F của AOAC
và số liệu tham chiếu của ISO
14502-1:2005
Nội dung 4. Đánh giá hàm lượng
flavonoid tông trong các mầu trà
khác nhau:
■ Khu vực miền núi phía Bắc:
trà xanh, trà pu’erh, trà
trắng, trà đen
■ Khu vực miền Nam: trà
xanh, trà oolong
Nội dung 5. Đánh giá ảnh hưởng
của nhiệt độ pha trà đên hàm lượng

Báo cáo kết quả thấm định phương
pháp phân tích flavonoid tơng trên
thiêt bị ƯV-Vis Shimadzu 1800 gồm:
giá trị giới hạn phát hiện, giới hạn
định lượng ước lương, đường chuẩn,
đánh giá vê độ lặp và độ tái lặp (thơng
qua biêu đơ kiêm sốt chât lượng)

Kết quả hàm lượng flavonoid tống
trong các mầu trà được trình bày dưới
dạng bảng số liệu và đồ thị kèm theo

nhận xét, đánh giá của người làm.

Kết quả đánh giá ảnh hưởng của nhiệt
độ pha trà đên hàm lượng flavonoid

Khóa luận tơt nghiệp đại học-SV: Thạch Thị Na Uy-1611540902

Trang 2


CHƯƠNG 1.

1.1.

TÓNG QUAN VỀ NGHIÊN cúư

Giới thiệu về trà

1.1.1 Nguồn gốc của trà và nơi phân bo

Cây trà có tên khoa học là Camellia sinesis (L.), thuộc họ Theaceae (Khan &
Mukhtar, 2013). Cây trà bao gồm hai giống chính là cây Trung Quốc lá nhỏ (Camellia
sinesis) và cây Assam lá lớn (C. Sinesỉs assamica) (Einõther, 2016). Hoa trà thuộc họ
Theaceae (Họ thực vật có hoa) có nguồn gốc từ Đơng Nam Á nhung hiện đang được

trồng ở hơn 30 quốc gia trên thế giới, là một loại cây rừng mọc trong điều kiện ẩm ướt,

râm mát của vùng khí hậu cận nhiệt đới gió mùa Đơng Nam Á và chủ yếu được trồng

tại các nước châu Á và châu Phi như Trung Quốc, Sri Lanka, Án Độ, Kenya, Zimbabwe

(Chang, 2015; Zhang et al., 2018). ớ Việt Nam, trà được trồng chù yếu ở Tây Bắc, Việt
Bắc - Hoàng Liên Sơn, trung du Bắc Bộ, Bắc Trung Bộ, Tây Nguyên, duyên hải miền
Trung và cánh cung Đơng Bắc, trà có 6 loại được tiêu thụ chính được phân loại dựa trên
các kĩ thuật oxy hoá và lên men khác nhau gồm bạch trà (white tea), lục trà (green tea),

trà đen (black tea), trà vàng (yellow tea), trà oolong (oolong tea) và trà phổ nhĩ (pu’erh
tea) (Chang, 2015). Các hợp chat polyphenol, amino acid, tannic acid hay các chat chong

oxy hoá được tìm thấy nhiều trong trà. Vì vậy, uống trà sẽ mang lại nhiều lới ích sức

khỏe và phịng ngừa rất nhiều loại bệnh như chứng Alzheimer, huyết áp cao, béo phì và
làm giảm nguy cơ ung thư (Hung et al., 2010). Ngồi ra, trong lá trà cịn chứa các ngun
tố thiết yếu như kali, mangan, selen, boron, kẽm, strontium, đồng giúp bổ dung các

nguyên tố vi lượng thiết yếu trong cơ thể con người (Zhang et al., 2018).

Hình 1.1 Cây trà cổ thụ ở Suối Giàng, Yên Bái (Việt Nam)

Khóa luận tôt nghiệp đại học-SV: Thạch Thị Na Uy-1611540902

Trang 7


1.1.2 . Phân loại trà
Tất cả các loại trà đều có nguồn gốc từ lá của cây trà Camellia sinensis, nhưng
các phương pháp chế biến khác nhau sẽ tạo ra các loại trà khác nhau,loại trước đây có

nguồn gốc từ Trung Quốc và thường được sử dụng đe làm trà trắng và xanh. Loại thứ
hai có nguồn gốc từ vùng Assam của Án Độ, cũng như các vùng ở Đông Nam Á, và

thường được sử dụng để làm các loại trà đen, bao gồm cả trà pu’erh ở tỉnh Vân Nam,
Trung Ọuốc (Einõther, 2016).

Trà trắng được làm từ búp chưa mở và lá non, được hấp hoặc nung để khử hoạt
tính polyphenol oxidase, sau đó sấy khơ. Do đó, do q trình oxy hóa tối thiếu, trà trắng

vẫn giữ được nồng độ cao cùa catechin có trong lá trà tươi (Einõther, 2016).
Trà xanh được làm từ những lá trà trưởng thành hơn trà trắng, lá trà có thể bị héo

trước khi hấp hoặc nung, sau đó được cán và sấy khơ. Giống như trà trắng, trà xanh có

hàm lượng catechin cao, nhưng tổng hàm lượng và thành phần của catechin có thể khác
nhau tùy thuộc vào giống cây trồng và nguồn thương mại. Lưu ý, trà xanh và trà trắng

đôi khi có thế chứa lượng catechin tương tự nhau nhưng vần thế hiện khả năng chống

oxy hóa khác nhau; điều này là do sự hiện diện của các chất chống oxy hóa khơng
catechin khác trong trà (Einỏther, 2016).

Lá trà được mệnh danh là trà oolong được "làm nát" để cho phép giải phóng một
so polyphenol oxidase có trong lá. Trà oolong được phép oxy hóa ở mức độ cao hơn so

với trà trắng hoặc trà xanh, nhưng trong thời gian ngắn hơn so với trà đen, trước khi
chúng được sấy khơ. Do đó, mức catechin, theaflavin và thearubigin trong trà oolong

thường nằm giữa mức của trà xanh và trà trắng chưa lên men và trà đen đã bị oxy hóa

hồn toàn (Einõther, 2016).
Lá trà dùng làm trà đen được cuộn hoặc bẻ hồn tồn đe tối đa hóa sự tương tác

giữa catechin và polyphenol oxidase. Bởi vì chúng oxy hóa hồn tồn trước khi sấy khơ,
hầu hết các loại trà đen có hàm lượng flavan-3-ols đơn chất tương đối thấp, như (-) -

epigallocatechin gallate (EGCG), và giàu theaflavins (2% - 6% chất rắn chiết xuất) và
thearubigin (> 20% chat rắn chiết được). Một so theaflavins đã cho thấy các hoạt động
chống oxy hóa lớn hơn EGCG (Einõther, 2016).

Khóa luận tơt nghiệp đại học-SV: Thạch Thị Na Uy-1611540902

Trang 8


Hầu hết trà pu’erh được sản xuất ở tỉnh Vân Nam, Trung Quốc từ những lá lớn

hơn của giống hoa trà Camellia sinensis. Q trình sản xuất có thể bao gồm cả q trình
oxy hóa bang enzym và q trình lên men do nấm. Trong trường hợp "trà pu’erh thô

(lâu năm)", cách chuẩn bị ban đầu giống với cách pha trà xanh. Lá được làm nóng, sấy
khơ, và sau đó làm ẩm trước khi được áp chảo và nén; sau đó, việc chuẩn bị được lưu
trừ cẩn thận trong một mơi trường được kiểm sốt và để lâu trong nhiều thập kỷ. Q

trình lão hóa nhanh hơn, kết hợp q trình oxy hóa và lên men bởi nấm Aspergillus niger
trong vài tháng, cũng có thể được sử dụng đe sản xuất "trà pu’erh chín" (Einõther, 2016).

Hình 1.2 Sáu loại trà chính

1.2.

Thành phần hóa học của trà

Thành phần chính của lá trà là nước (75 - 82%), là chất quan trọng khơng thể

thiếu được để duy trì sự sống của cây. Bên cạnh thành phần chính là nước thì thành phần

và hàm lượng các chất hòa tan trong trà là một trong những mối quan tâm hàng đầu đối

với các nhà nghiên cứu về trà. Trong đó nhóm chat flavonoid được xem như thành phần
chính, chiếm khoảng 25 - 35% chất khơ trong trà. Ngồi các hợp chat polyphenol, trà
cịn có nhiều hợp chất khác, bao gồm alkaloid, amino acid, protein, glucid, chat bay hơi

và kim loại dạng vết. Hơn nữa trong trà cịn có một số chất có hàm lượng vết như calcium,
manganese, chrome, flour... Một so hợp chat bay hơi bao gom: alcohol, các hợp chất có

nhóm carbonyl, ester, và các hợp chất vòng (Cabrera et al., 2006; Senanayake, 2013).
Bảng 1.1 Thành phàn chính của lá trà

Thành phân
Polyphenol

% khơi lượng khơ
36~

Khóa luận tơt nghiệp đại học-SV: Thạch Thị Na Uy-1611540902

Trang 9


Methylxanthine
Aminoacids
Acid hữu cơ

Carotennoid
Carbonhydrate
Protein
Lipid
Chlorophyll
Tro

3.5
4
1.5
<0.1
25
15
2
0.5
5

Polyphenol mang lại nhiều lợi ích sức khoẻ như: chống oxy hoá, kháng viêm và

chống ung thư, giúp động mạch co giãn đe duy trì lưu lượng máu và giữ cho động mạch
không bị xơ vữa. Các hợp chat polyphenol được coi là chất chuyển hóa thứ cấp được

tổng hợp bởi cây trồng trong quá trình phát triển bình thường và chống lại các điều kiện

như nhiễm trùng, tổn thương, tia cực tím... Những hợp chất này phổ bin v cú ngun
gc t phenylalanine v tyrosine.

IôH.

|â|.

Suberin*. c Ulins

Hỡnh 1.3 Các hợp chất sản phẩm Phenylalanine (Naczk & Shahidi, 2004)
Trà cũng là một nguồn tốt của một nhóm flavonoid khác được gọi là flavonols và
nó chịu về màu sắc trong trà, các flavonols được tìm thấy trong trà bao gom kaempferol,

quercetin và myricetin. Hàm lượng flavonol trong trà ít bị ảnh hưởng bởi q trình chế

biến và flavonols có số lượng tương đương trong các loại trà bị oxy hóa và khơng bị oxy

hóa. Khơng giống như flavan-3-ols, flavonols thường có trong trà dưới dạng glycoside,
tức là liên kết với một phân tử đường, mặc dù khả dụng sinh học kém, flavonoid được
cho là đóng góp đáng ke vào những lợi ích sức khỏe liên quan đến việc uống trà hàng

Khóa luận tơt nghiệp đại học-SV: Thạch Thị Na Uy-1611540902

Trang 10


ngày. Flavonoid là những hợp chất phenol phân bố rộng rãi nhất trong thực phẩm thực

vật và cũng là những hợp chất được nghiên cứu nhiều nhất. Theo mức độ hydroxyl hóa

và sự hiện diện của liên kết đơi C2-C3 trong vịng pyrone dị vịng, flavonoid có the được
chia thành 13 nhóm, quan trọng nhất được đại diện bởi flavonols, flavanol, flavone,

isoflavone, anthocyanidins hoặc anthocyanins, và flavanones. Trong các lớp này có
nhiều biến the về cấu trúc theo mức độ hydro hóa và hydroxyl hóa của hệ ba vịng cùa

các hợp chất này. Flavonoid cũng xuất hiện dưới dạng các dẫn xuất sulfat hóa và metyl

hóa, liên hợp với monosaccharide và disaccharide, và tạo phức với oligosaccharide, lipid,

amin, acid cacboxylic và acid hừu cơ, khoảng 8000 hợp chất đang được biết đến (Alan
Crozier, 2016).

1.3.

Các phưong pháp phân tích hàm lượng flavonoid trong trà
1.3.1. Phương pháp chiết các hợp chat polyphenol trong trà

Nhiều kỳ thuật được sử dụng đe chiết flavonoid bao gồm chiết bằng nước nóng,
chiết bằng dung mơi hay là nhờ sự hồ trợ của nhiệt độ, trong đó nước được xem là dung

mơi chiết có khả năng hịa tan cao. Theo tiêu chuẩn ISO 14502-1:2005 (ISO 14502-1,
2005), hồn hợp dung môi bao gồm methanol với nước theo tỷ lệ 70:30 đã dược sử dụng,
trong đó 70% là methanol được sử dụng làm dung mơi chính, cịn 30% là nước vì nước
có khả năng hịa tan tốt sẽ đi sâu vào cấu trúc của mẫu đe hòa tan các hợp chat flavonoid

tot hơn so với methanol.
1.3.2. Phương pháp xác định hàm lượngflavonoid tông trong trà

Hàm lượng flavonoid được xác định theo phương pháp aluminum chloride
colorimetric (AICI3). Các thuốc thử được sử dụng bao gồm NaNƠ2 5%, AICI3 10%,
NaOH 1 M được pha lỗng bằng nước cất. Sau đó tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng

510 nm bằng thiết bị phân tích quang phổ phân tử (cịn gọi là phương pháp phân tích

trắc quang hoặc ƯV-Vis) (Semiz et al., 2018).
Phương pháp trắc quang là phương pháp phân tích định lượng dựa vào hiệu ứng
hấp thụ xảy ra khi phân tử vật chất tương tác với bức xạ điện từ. Vùng bức xạ được sử

dụng trong phương pháp này là vùng tử ngoại gần hay khả kiến ứng với bước sóng
khoảng từ 200 đến 800 nm. Hiện tượng hấp thụ bức xạ điện từ tuân theo định luật

Khóa luận tôt nghiệp đại học-SV: Thạch Thị Na Uy-1611540902

Trang 11


Lambert - Beer, úng dụng phương pháp phổ đo quang, người ta có thể xác định nhiều

hợp chất trong phạm vi nồng độ khá rộng nhờ các cải tiến quan trọng trong thủ tục phân
tích. Đây là phương pháp phân tích được phát triển mạnh vì nó đơn giản, đáng tin cậy

và được sử dụng nhiều trong kiểm tra sản xuất hoá học, luyện kim và trong nghiên cứu
hoá sinh, môi trường và nhiều lĩnh vực khác (Scientific, 2018).

1.4.

Tổng quan về tình hình nghiên cứu liên quan đến đề tài
Hiện nay việc nghiên cứu về trà đang thu hút nhiều sự quan tâm cùa các nhà

nghiên cứu và tầm quan trọng trên tồn thế giới khơng phải vì sự phố biến của nó mà là
do sự hiện diện của hàng trăm hợp chất điều trị quan trọng và chất chống oxy hóa chù

yếu là flavonoid và polyflavonoid có khả năng sinh học và tác dụng trực tiếp hơn so với
các cây thuốc khác (Chaturvedula et. al. 2011). Các hợp chat polyphenol và flavonoid
có trong lá trà có tác dụng chống oxy hóa mạnh hoạt động và phổ rộng của các hoạt

động sinh học quan trọng khác. Tổng lượng flavonoid dao động trong khoảng 23.17 mg

g"* đến 48.81 mg gHàm lượng flavonoid tối đa được tìm thấy trong dịch truyền trà
đen Parichaya Golden (48.81 mg g '), flavonoid như là nguồn phong phú của các hợp
chất hoạt tính sinh học và nó biện minh cho việc sử dụng chúng vì lợi ích sức khỏe con

người, trong quá trình che biến trà đen và trà xanh đều đã được nghiên cứu rộng rãi do
tầm quan trọng của chúng đối với chất lượng trà (Balentine et.al. 1997). Tuy nhiên, có

rất ít dữ liệu tài liệu về các loại trà riêng lẻ thường được tiêu thụ ở nhiều nơi khác nhau

trên thế giới. Trong một nghiên cứu gần đây về thành phần flavonoid của các loại trà
thường được tiêu thụ ở Vương quốc Anh đã báo cáo mức tong so flavonoid trong các

loại trà sử dụng sắc ký lỏng hiệu suất cao pha đảo ngược (Khokar et.al.2002).

Khóa luận tơt nghiệp đại học-SV: Thạch Thị Na Uy-1611540902

Trang 12


PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN củư

CHƯƠNG 2.
2.1.

Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
2.1.1. Hóa chất

•

2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxychromen-4-one

Quercetin
C15H10O7),

(95%,

Sigma-Alddrich, Germany.

•

Sodium nitrite (97%, NaNCh), Sigma-Aldrich, Germany.

•

Aluminum chloride hexahydrate (99%, AICI3.6H2O), Sigma-Aldrich, Germany.

•

Sodium hydroxide (98%, NaOH), Sigma-Alddrich, Germany.
2.1.2. Chn bị hóa chat

•

Chuan goc Quercetin (1000 mg L_|): cân chính xác 0.0100 (± 0.0001) g quercetin
cho vào bình định mức 10 mL, hòa tan và định mức đến vạch bang methanol,

dung dịch sau khi pha được chứa trong ống đựng chuẩn bằng thủy tinh, bảo quản
ở -18 °C trong điều kiện tránh ánh sáng và sử dụng trong 1 tháng.
•

Dung dịch sodium nitrite 5% (w/v): cân chính xác 5.00 g NaNƠ2 cho vào bình
định mức 100 mL và định mức đến vạch bằng nước cất, dung dịch sau khi pha

được chứa trong chai thủy tinh kín, bảo quản ở nhiệt độ phịng và được sử dụng

trong 1 tuần.

•

Dung dịch aluminum chloride hexahydrate 10% (w/v): sử dụng AICI3.6H2O,
cân chính xác 18.00 g AICI3.6H2O cho vào bình định mức 100 mL và định mức
cho đến vạch bằng nước cất, dung dịch sau khi pha được chứa trong chai thủy
tinh kín, bảo quản ở nhiệt độ phòng và sử dụng trong 1 tuần.

•

Dung dịch sodium hydroxide 1 M: cân 40.00 g NaOH cho vào bình định mức
1 L và định mức cho đến vạch bằng nước cất, dung dịch sau pha được chứa trong

chai thủy tinh kín và được bảo quản ở nhiệt độ phòng và pha mới trước khi sử
dụng.

2.1.3. Dụng cụ

•

Bình định mức 25 mL, 50 mL, 100 mL, 1 L (ISOLAB, Germany).

•

Pipette 5 mL,10 mL (ISOLAB, Germany).
Khóa luận tơt nghiệp đại học-SV: Thạch Thị Na Uy-1611540902

Trang 13


•

Micropipette 10 - 100 pL, 100 - 1000 pL, 1000 - 5000 pL (ISOLAB, Germany).

•

Ống ly tâm nhựa 15 mL, 50 mL (ISOLAB, Germany).

•

Beaker 50 mL, 100 mL (ISOLAB, Germany).

•

Pasteur pipette thủy tinh (Hirschmann, Germany).

•

Ống đong 500 mL, 1 L (ISOLAB, Germany).

•

Chai trung tính GL 45 100 mL (Germany).
2.1.4. Thiết bi

•

Máy đo quang (Shimadzu UV-VIS 1800, Janpan).

•

Be điều nhiệt (Biobase, China).

•

Máy ly tâm (LC-04R CENTRIFUGE).

•

TÙ say (Memmert, Germany).

Lay mẫu và bảo quản mẫu

2.2.

2.2.1. Layman

Nghiên cứu đuợc tiến hành trên 18 mầu trà gồm 5 loại trà là trà xanh, trà trắng,
trà oolong, trà pu’erh và trà đen (Bảng 2.1). Các mầu được chúng tôi thu thập từ khu

vực miền núi phía Bắc (12 mầu, 4 loại trà) và khu vực phía Nam (6 mẫu, 2 loại trà). Tất

cả mầu sau khi thu thập được chuyển về phịng thí nghiệm xay và bảo quản trong điều
kiện tránh ánh sáng trực tiếp và nhiệt độ, độ ấm thích hợp.

Bảng 2.1 Thơng tin các mẫu trà được thực hiện trong đề tài

Loại trà

Số lượng

Mã mẫu

Khu vực lẩy mẫu

Trà xanh

3

Green-1, Green-2, Green-3

Trà trắng

3

White-1, White-2, White-3

Trà Pu’erh

3

Pu’erh-1, Pu’erh-2, Pu’erh-3

Trà đen

3

Black-1, Black-2, Black-3

Trà xanh
Trà oolong

3
3

Green-4, Green-5, Green-6
Khu vực phía Nam
Oolong-1, Oolong-2, Oolong-3

Khu vực miền núi phía Bắc

Khóa luận tơt nghiệp đại học-SV: Thạch Thị Na Uy-1611540902

Trang 14


2.2.2. Tiền xử lý mẫu và bảo quản mẫu

Mầu trà trước khi phân tích các chỉ tiêu sè trải qua các công đoạn tiền xử lý mầu

như: xay nhuyễn bằng máy xay thành hồn hợp đồng nhất, mầu sau xay sè chuyển vào
túi zipper và bảo quản lạnh ở 25 °C, tránh ánh nắng theo TCVN 9738:2013.
2.3.

Quy trình chiết mẫu

Mầu trà sau khi trải qua quá trình tiền xử lấy mầu sè được chiết đe xác định hàm
lượng flavonoid tống. Quy trình thực hiện được tham khảo theo ISO 14502-1:2005 (ISO
14502-1, 2005) with some modifications được thê hiện ở Hình 2.1.

Hình 2.1 Quy trình chỉết/trích ly phân tích TFCs trong mẫu trà
2.4.

Quy trình lên màu

Mầu trà sau khi được chiết cũng như được pha loãng xong sè được đem đi lên
màu theo quy trình như Hình 2.2.

Khóa luận tơt nghiệp đại học-SV: Thạch Thị Na Uy-1611540902

Trang 15


Hình 2.2 Quy trình lên màu các hợp chất flavonoid tổng
Hàm lượng flavonoid tống chứa trong mầu được tính theo cơng thức:

CcaL X PF X V
mx 1000
Trong đó:
o

CĐ/c: Nồng độ tính được từ đường chuẩn (mg QE L1)

o

DF: Hệ số pha lỗng.

o

mcân: khối lượng mẫu phân tích (g).

o

Vchiết:

thể tích dịch chiết (mL).

Khi thực hiện thêm 2 mL NaOH IM (4) cần định mức nhanh lên 10 mL bằng
nước cất (5) và đo quang ngay.

2.5.

Thẩm định phưcmg pháp
Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành thẩm định phương pháp với các giá trị

giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), khoảng tuyến tính, độ lặp lại

(RSDr) và độ tái lặp (RSDr).
Phương pháp xác định hàm lượng flavonoid tổng trong trà được thẩm định trên
thiết bị UV-Vis 1800 Shimadzu tại Phịng thí nghiệm Hóa phân tích, Khoa Kỳ thuật

Khóa luận tôt nghiệp đại học-SV: Thạch Thị Na Uy-1611540902

Trang 16

Thực phẩm và Môi trường, của Trường Đại học Nguyền Tất Thành (cơ sở An Phú Đông,

Quận 12, Thành phố Hồ Chí Minh). Máy quang phổ tử ngoại 1800 Shimadzu dùng đe
định tính và định lượng các chất cần phân tích trong các nền mầu thực phẩm, dược phấm

và mơi trường, phịng thí nghiệm sinh hóa.

Hình 2.3 Thiết bị UV-Vis 1800 Shimadzu tại Phịng thí nghiệm Hóa Phân tích, Khoa
Kỹ thuật Thực phẩm và Môi trường

2.5.1. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp được tiến hành trên
mầu blank. Giá trị LOD và LOỌ được tính tốn dựa trên giá trị độ lệch chuẩn (SD sau

10 lần thực hiện lặp lại theo công thức:
LOD = 3xSD

Đánh giá kết quả LOD đã tính được thơng qua giá trị R và R được tính theo
cơng thức:

SD
Trong đó:
Xtb

là giá trị trung bình tì lệ của 10 mầu song song

SD là độ lệch chuẩn của 10 mầu song song

Khóa luận tơt nghiệp đại học-SV: Thạch Thị Na Uy-1611540902

Trang 17


Neu giá trị R tính được nằm trong khoảng 4 - 10 thì giá trị LOD chấp nhận

được. Sau đó giá trị LOQ được tính gián tiếp từ LOD theo cơng thức:
LOQ = 3.3xLOD.

2.5.2. Đường chuấn và khoảng tuyến tính
Chúng tôi tiến hành xây dựng một đường chuấn với 11 điểm có nồng độ từ 50

đến 1000 mg L-1, mồi điếm chuẩn được thực hiện lặp lại 3 lần. Khoảng tuyến tính

thỏa mãn đe xây dựng đường chuẩn khi có hệ số tuyến tính R2 > 0.995 và độ chệch các
diêm chuân không lớn hơn 15%.

2.5.3. Độ lặp lại và độ tải lặp

Độ lặp lại được tiến hành trên mầu Green-3 với 6 lần thực hiện lặp lại và tính

tốn giá trị RSDr. Đối với độ tái lặp, thực hiện lặp lại 6 lần mầu Green-3 trong 3 ngày
khác nhau, sử dụng ANOVA một yếu to đe tính tốn giá trị RSDr. So sánh các giá trị
RSD thu được với quy định được trình bài trong phụ lục F AOAC.

Biếu đồ kiểm soát chất lượng (control chart) được xây dựng trong 21 ngày nhằm
kiếm soát độ ổn định của thiết bị qua từng ngày làm việc.

2.6.

Xác định hàm lượng flavonoid tổng trong các mẫu trà

2.6.1. Phân tích hàm lượng flavonoid tông trong các mẫu trà

Các mầu nghiên cứu sau khi thu thập sẽ được xử lý theo quy trình xử lý mầu
được quy định ở TCVN 9738:2013. Sau đó mẫu trà được tiến hành xử lý theo quy trình

chiết mẫu được thực hiện ở Hình 2.1. Ket thúc quy trình chiết,dung dịch được tiến hành

pha lỗng đến hệ số thích hợp và thực hiện quy trình lên màu (Hình 2.2). Mồi mầu sẽ
được thực hiện lặp lại 3 lần, tính toán các giá trị độ lệch chuẩn và độ lệch chuẩn tương

đoi, so sánh với quy định cùa phụ lục F AOAC đối với mức nồng độ tương ứng.

2.6.2. Phán tích hàm lượng flavonoid tơng trong nước trà ở các nhiệt độ và

thời gian pha trà

Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng bởi nhiệt độ và thời gian truyền trà được mô
phỏng theo quy trinh truyền trà với dung môi sử dụng là nước. Thời gian và nhiệt độ

khảo sát được thực hiện ở (Bảng 2.2). Khi khảo sát nhiệt độ thì chúng tơi tiến hành cố
Khóa luận tơt nghiệp đại học-SV: Thạch Thị Na Uy-1611540902

Trang 18


định thời gian chiết là 60 phút nhằm nhận thấy rõ sự chênh lệch giữa các mốc nhiệt độ.

Ngược lại, khi khảo sát thời gian phản ứng chúng tôi cố định nhiệt độ pha tra là 90 °C.
Ket thúc quy trinh pha trà, dung dịch được pha loãng đến hệ số thích hợp và tiến

hành lên màu với quy trình được tiến hành (ở Hình 2.2). Mồi thí nghiệm được chúng
tơi tiến hành lặp lại 3 lần, tính tốn kết quả bao gồm hàm lượng flavonoid (mg QE g1)
và phần trăm chiết (được tính trên hàm lượng tổng của mầu tương ứng) theo công thức
sau:
axioo

ỵ-~ĨT (%)
Trong công thức trên “a” là hàm lượng flavonoid tông ở các mốc khảo sát, “b” là

hàm lượng flavonoid tổng ở các mầu trà tương ứng.
Bảng 2.2 Các điều kiện pha trà

Các mốc khảo sát

Nhiệt độ (°C)
10; 20; 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90

Thòi gian (phút)
3; 5; 10; 15; 20; 30; 40; 50; 60

Trong thí nghiệm này chúng tơi sử dụng các mầu trà ở khu vực miền núi phía

Bắc nhằm đảm bảo sự đồng đều về chất lượng trà cũng như sự đa dạng về loại trà. Tất

cả các điều kiện khảo sát được chúng tơi kiếm sốt một cách chặt chẽ. Đối với khảo sát
nhiệt độ, mồi mốc nhiệt độ được giữ trong be ủ nhiệt và kiêm sốt thơng qua nhiệt kế.

Khảo sát thời gian pha trà được kiếm sốt thơng qua đồng hồ bấm giờ cho mồi mầu chiết
nhằm đảm bảo sự chính xác về thời gian cho từng mầu.

Khóa luận tôt nghiệp đại học-SV: Thạch Thị Na Uy-1611540902

Trang 19


CHƯƠNG 3.

3.1.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Thẩm định phương pháp phân tích hàm lượng flavonoid tổng trong trà
Sau khi thực hiện xác định các giá trị phát hiện (LOD),giới hạn định lượng (LOQ),

khoảng tuyến tính, độ lặp lại (RSDr), độ tái lặp (RSDr) chúng tôi thu được kết quả sau

(Bảng 3.1).

Bảng 3.1 Két quả thẩm định phuoiig pháp

LOD
(mg QE g->)

Thông số
Kết quả

LOQ

(mg QE g-')

4.1

1.4

Khoảng tuyến
tính (mg L-1)

RSDr
(%)
1.14

50-700

RSDr
(%)
1.15

Các giá trị RSDr và RSDr lần lượt là 1.14 % và 1.15 %, theo quy định cùa AO AC
đối với mức nồng độ từ 10 đến 100 % thì giá trị RSDr nhỏ hơn 1.3 % và giá trị RSDr

nhỏ hơn 2 %. Ket quả thu được sau khi thấm định hoàn toàn phù hợp với quy định của

AOAC ở mức nồng độ tương ứng.

Đường chuẩn xác định hàm lượng flavonoid tổng với khoảng tuyến tính từ 50
đến 700 mg L-1 được thể hiện ở Hình 3.1.

0

100

200

300

400

500

600

700

Nồng độ QE (mg L-1)

Hình 3.1 Đường chuẩn quercetin
•

Phương trinh đường chuẩn: y = 0.0013x + 0.0872

•

Hệ số tuyến tính: R2 = 0.998

Khóa luận tơt nghiệp đại học-SV: Thạch Thị Na Uy-1611540902

Trang 20

Đường chuẩn với hệ số tuyến tính lớn hơn 0.995,độ chênh lệch các điểm chuẩn
tính tốn được dao động trong khoảng 3.1- 10.5% hoàn toàn phù hợp với quy định của

AOAC.
Độ ốn định của phương pháp được kiểm sốt thơng qua biểu đồ kiếm soát chất
lượng (control chart) được thực hiện trong 21 ngày liên tiếp. Đồng thời, mầu được chọn
đế xây dựng biểu đo kiểm soát chất được sẽ được sử dụng như mầu kiêm soát (QC) được

thực hiện cùng các loạt mẫu xác định hàm lượng flavonoid tổng của trà.

Ngày

Hình 3.2 Biểu đồ kiểm sốt chất lượng

Mầu kiêm soát trong 21 ngày khác nhau cùng nằm trong vùng an tồn (LWLUWL) và phân bố đều về hai phía của trục trung bình (Cmean). Vì vậy, phương pháp đã
được độ ơn định và có thế sử dụng phương pháp cho việc xác định hàm lượng flavonoid
tổng trong các mẫu trà.

3.2.

Hàm lượng flavonoid trong các mẫu trà ở Việt Nam

Hàm lượng flavonoid của các mẫu trà được chọn nghiên cứu được thực hiện bằng
đồ thị (Hình 3.3).

Khóa luận tơt nghiệp đại học-SV: Thạch Thị Na Uy-1611540902

Trang 21