Nghiên cứu thẩm định quy trình phân tích các chỉ tiêu hóa học trong vacxin cúm AH1N109

1

LỜI CẢM ƠN

Từ lòng biết ơn sâu sắc của mình, em xin dành trang đầu tiên của khóa luận
để bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến:
Ban giám hiệu trường Đại học Nha Trang, Phòng Đào tạo, Ban giám đốc
Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường cùng toàn thể quý thầy cô đã giảng dạy tận
tình và giúp đỡ em trong quá trình học tập tại trường.
Tiến sỹ Lê Văn Bé – Viện trưởng Viện Vacxin và Sinh phẩm Y tế Nha
Trang, người thầy đã luôn quan tâm hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho em
trong quá trình thực tập tại Viện.
Tiến sỹ Nguyễn Thị Lan Phương – trưởng phòng Kiểm Định, ThS. Vũ Thị
Thu Hương, CN. Tô Thị Hồng Vân, Nguyễn Thị Hồng Nhiên đã trực tiếp hướng
dẫn, chỉ bảo nhiệt tình, chu đáo và luôn tạo điều kiện thuận lợi nhất giúp em hoàn
thành luận văn này.
Qua đây em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS. Lê Phương Chung đã
nhiệt tình giúp đỡ, góp ý và động viên em trong thời gian thực tập và hoàn thành
luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc Viện Vacxin Nha Trang đã tạo
điều kiện thuận lợi cho em thực tập tại Viện.
Xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, tất cả bạn bè, anh chị và các em đã
quan tâm, giúp đỡ, chia sẻ, động viên em trong suốt thời gian qua.

Nha Trang, tháng 7 năm 2011
Sinh viên

Nguyễn Thị Tình.

2

MỤC LỤC


ĐẶT VẤN ĐỀ 8
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10
1.1.Tình hình bệnh cúm A/H1N1 và nghiên cứu sản xuất vacxin cúm A/H1N1. 10
1.2.Sản xuất vacxin cúm trên trứng gà có phôi 11
1.2.1.Quy trình sản xuất và kiểm định vacxin cúm trên trứng gà có phôi. 11
1.2.2.Tiêu chuẩn chất lượng của vacxin cúm A/H1N1. 13
1.3.Những yêu cầu và căn cứ pháp lý về thực hành tốt phòng thí nghiệm và thẩm
định quy trình phân tích. 13
1.4.Thẩm định quy trình phân tích. 15
1.4.1.Phạm vi thẩm định, tái thẩm định 15
1.4.2.Các yêu cầu thực hiện để thẩm định quy trình phân tích. 16
1.5.Các chỉ tiêu hóa học trong vacxin và phương pháp định lượng. 21
1.5.1.Protein và phương pháp định lượng protein. 21
1.5.2.Formaldehyde và các phương pháp định lượng formaldehyde. 22
1.5.3.Sucrose và các phương pháp bán định lượng sucrose. 24
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
2.1.Thời gian và địa điểm nghiên cứu. 26
2.2.Nguyên vật liệu 26
2.3.Phương pháp 27
2.3.1.Xác định hàm lượng protein tổng số bằng phương pháp Lowry. 27
2.3.2.Xác định hàm lượng formaldehyde tự do bằng phương pháp đo quang
với thuốc thử acetylaceton. 30
2.3.3.Bán định lượng sucrose bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng. 32
2.3.4.Thiết kế thực nghiệm và tiêu chuẩn đánh giá các thông số cần thẩm định

của phương pháp phân tích. 35
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 38
3.1.Kết quả thẩm định phương pháp xác định Lowry cải tiến. 38
3

3.1.1.Độ đúng 38
3.1.2.Độ chính xác. 38
3.1.3.Khoảng tuyến tính. 41
3.1.4.Độ đặc hiệu: 44
3.2.Kết quả thẩm định phương pháp xác định hàm lượng formaldehyde. 45
3.2.1.Độ đúng: 45
3.2.2.Độ chính xác. 45
3.2.3.Khoảng tuyến tính. 48
3.2.4.Dải đo. 51
3.2.5.Độ đặc hiệu 51
3.3.Kết quả thẩm định phương pháp sắc ký lớp mỏng. 52
3.4.Kết quả kiểm định hóa học vacxin cúm A/H1N1. 55
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57
4.1.KẾT LUẬN. 57
4.2.KIẾN NGHỊ. 57

4

KÍ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT

BĐM : Bình định mức
BSA : Bovine Serum Albumin
CTC : Copper Tartrate Carbonate
CV : Hệ số biến thiên
DAB : Digital Audio Broadcasting
DOC : Sodium deoxycholate
ĐC : Đường chuẩn
ELISA : Enzyme – linked immune sorbent assay
(Thử nghiệm miễn dịch gắn men)
EPA : Environmental Protection Agency
(Cơ quan bảo vệ Môi sinh Hoa Kỳ).
EU : European Union (Liên minh châu Âu)
HA : Haemagglutinin (Kháng nguyên HA)
FP : Function Programming
IARC : International Agency for Research on Cancer
(Cơ quan Quốc tế Nghiên cứu Ung thư)
IU : International Unit (Đơn vị quốc tế)

IVAC : Institute of Vaccines and medical biological
(Viện Vacxin và Sinh phẩm y tế)
LAL : Limulus Amoebocyte Lysate (Thử nghiệm tìm nội độc tố)
NIBSC : National Institute for Biological Standards and Control
(Viện Quốc gia về tiêu chuẩn và Kiểm dịch Sinh học)
GLP : Good Laboratory Practice (Thực hành tốt phòng thí nghiệm)
GMP : Good Manufacturing Practices (Quy phạm thực hành sản xuất tốt)
GTLT : Giá trị lý thuyết
OD : Optical density (Mật độ quang)
PBS : Photphat Buffer Saline (Dung dịch đệm của muối photphat)
5

Ph Eur : The European Pharmacopoeia
SD : Standard Deviation (Độ lệch chuẩn)
SDS : Sodium Dodecyl Sulphate
SRID : Single Radial Immunodifution
(Phản ứng khuếch tán miễn dịch vòng đơn)
TCA : Trichloroacetic Acid
TCYTTG : Tổ chức Y tế Thế giới
TH : Tiến hành
TLC : Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng)
TSB : Tryptic Soy Broth
WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)

6

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Tiêu chuẩn chất lượng của vacxin cúm A/H1N1/09 9. 13
Bảng 1.2: Các chỉ tiêu thẩm định các phương pháp phân tích [3] 20
Bảng 2.1: Bảng tóm tắt thẩm định thử nghiệm kiểm tra hàm lượng X 36
Bảng 2.2: Tổ hợp các điều kiện thử nghiệm để kiểm tra độ chính xác trung
gian. 37
Bảng 3.1: Kết quả sau 5 lần thử nghiệm của phương pháp Lowry cải tiến. 38

Bảng 3.2: Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp xác định hàm lượng
protein bằng phương pháp Lowry cải tiến. 39
Bảng 3.3: Tổ hợp các điều kiện thử nghiệm phương pháp Lowry cải tiến. 39
Bảng 3.4: Kết quả xác định độ chính xác trung gian của phương pháp Lowry
cải tiến. 40
Bảng 3.5: Phương trình đường chuẩn protein (750nm) 41
Bảng 3.6: Bảng kết quả kiểm tra độ đặc hiệu 44
Bảng 3.7: Kết quả xác định độ chính xác và độ đúng của phương pháp xác
định hàm lượng formol tự do bằng thuốc thử acetylaceton. 45
Bảng 3.8: Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp xác định hàm lượng
formol tự do bằng thuốc thử acetylaceton. 46
Bảng 3.9: Tổ hợp các điều kiện thử nghiệm phương pháp đo quang bằng thuốc
thử acetylaceton. 46
Bảng 3.10: Kết quả xác định độ chính xác trung gian của phương pháp xác
định hàm lượng formol tự do bằng thuốc thử acetylaceton. 47
Bảng 3.11: Phương trình đường chuẩn formol (420nm) 48
Bảng 3.12: Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu. 51
Bảng 3.13: Kết quả kiểm định hóa học vacxin cúm A/H1N1 55





7

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Quy trình sản xuất và kiểm định vacxin cúm. 12
Hình 3.1. Đồ thị đường chuẩn protein 1 41
Hình 3.2. Đồ thị đường chuẩn protein 2 42

Hình 3.3. Đồ thị đường chuẩn protein 3 42
Hình 3.4. Đồ thị đường chuẩn protein 4 43
Hình 3.5. Đồ thị đường chuẩn protein 5 43
Hình 3.6. Đồ thị đường chuẩn formol 1 48
Hình 3.7. Đồ thị đường chuẩn formol 2 49
Hình 3.8. Đồ thị đường chuẩn formol 3 49
Hình 3.9. Đồ thị đường chuẩn formol 4 50
Hình 3.10. Đồ thị đường chuẩn formol 5 50
Hình 3.11. Bản mỏng mỏng bán định lượng sucrose 1 52
Hình 3.12. Bản mỏng bán định lượng sucrose 2 53
Hình 3.13. Bản mỏng bán định lượng sucrose 3 54

8

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đại dịch cúm 2009 còn gọi là Dịch cúm A/H1N1 (2009), "cúm lợn" (hay
"cúm heo") là dịch cúm do một loại virus thuộc chủng H1N1 lần đầu tiên được các
cơ quan y tế phát hiện vào tháng 3 năm 2009. Cho đến nay, virus cúm gây ra đại
dịch H1N1 2009 đã lan tràn tại hầu hết quốc gia trên toàn thế giới. Trước tình hình
đó, Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG) đã phát triển mở rộng chương trình cúm toàn
cầu nhằm tìm ra các biện pháp kiểm soát và phòng ngừa nguy cơ bùng phát lan
rộng, trong đó việc phát triển một vacxin có hiệu quả được xem là nền tảng quan
trọng để bảo vệ cộng đồng. Ngày 06/08/2009, Tổ chức Sức khỏe Thế giới (WHO)
đã ra thông báo về quá trình sản xuất vacxin cúm đại dịch H1N1 2009.
Tổ chức Y tế Thế giới đã khuyến cáo các nước nên tự nghiên cứu sản xuất
vacxin cúm A/H1N1 để có thể chủ động trong công tác phòng chống dịch, bảo vệ
sức khỏe cộng đồng [9]. Cùng với việc tạo ra các chủng sản xuất vacxin cúm
A/H1N1 thích hợp bằng kỹ thuật di truyền ngược, các trung tâm nghiên cứu bệnh
cúm quốc tế cũng đưa ra những hướng sản xuất vacxin cúm khác nhau (sản xuất
trên trứng gà có phôi, tế bào động vật…). Trên cơ sở đó, tùy thuộc vào điều kiện
của từng quốc gia mà lựa chọn con đường sản xuất cho phù hợp nhưng phải đảm
bảo tính an toàn và hiệu quả cao.
Tại Việt Nam, Viện Vacxin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang đã nghiên sản
xuất vacxin cúm A/H1N1 cho người bằng phương pháp nuôi cấy trên trứng gà có
phôi. Và cho đến nay Viện đã sản xuất 20 lô vacxin thành công. Trước khi đưa vào
sử dụng, vacxin cúm phải đạt được các tiêu chuẩn an toàn, miễn dịch cần thiết theo
quy định của Bộ Y tế Việt Nam và TCYTTG. Một trong số các tiêu chuẩn đó là
hàm lượng protein tổng số, formaldehyde và sucrose (đây là các tạp chất trong
vacxin thành phẩm có thể gây dị ứng, ung thư…). Với điều kiện trang thiết bị hiện
có, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu thẩm định quy trình phân tích

các chỉ tiêu hóa học trong vacxin cúm A/H1N1/09”, bao gồm:
 Xác định hàm lượng protein tổng số bằng phương pháp Lowry cải tiến.
9

 Xác định hàm lượng formaldehyde tự do bằng phương pháp đo quang với
thuốc thử acetylaceton.
 Bán định lượng sucrose bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC).
Mục tiêu của đề tài:
- Chứng minh được các quy trình phân tích đã nêu trên phù hợp với mục đích
ứng dụng để kiểm tra các chỉ tiêu hóa học tương ứng trong vacxin.
- Thông qua kết quả thẩm định các quy trình phân tích với đầy đủ dữ liệu thực
nghiệm.
- Góp phần hoàn thành mục tiêu lấy chứng chỉ GMP cho sản xuất và kiểm
định vacxin cúm trong năm 2011.

10

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tình hình bệnh cúm A/H1N1 và nghiên cứu sản xuất vacxin cúm
A/H1N1.
Dịch cúm A/H1N1 mới bùng phát lần đầu tiên tại Mehico vào cuối tháng
3/2009, đến tháng 4 lan nhanh sang Mỹ và các quốc gia lân cận. Theo dòng người
di chuyển, dịch cúm lan nhanh ra toàn thế giới. Tính đến ngày 7/3/2010, dịch cúm
A/H1N1 mới lan ra 213 nước và vùng lãnh thổ ở tất cả các châu lục, với 339.620
người mắc và 16713 người chết, hai nước có số người chết nhiều nhất là Mehico:
108 người và Mỹ: 44 người [11]. Như vậy sau 41 năm (đại dịch năm 1957 giết chết
2 triệu người), thế giới lại có một đại dịch cúm mới A/H1N1. Trước tình hình đó
TCYTTG (ngày 11/6/2009) đã nâng mức báo động dịch lên mức cao nhất 6/6 [11].
Vacxin phòng đại dịch cúm có công hiệu bảo vệ mạnh khi được tiêm trước
hoặc gần thời điểm dịch bùng phát. Vì vậy, cần chế tạo và sản xuất vacxin đặc hiệu
dành cho virus cúm A/H1N1/09 càng sớm càng tốt cũng như có những chiến dịch
tiêm phòng đúng lúc đúng chỗ khi đại dịch cúm xảy ra. Để đối phó hiệu quả với đại
dịch, WHO thúc đẩy việc sản xuất vacxin cúm ở các nước đang phát triển bằng
hàng loạt giải pháp: Chuyển giao công nghệ, cấp kinh phí trợ cấp xây dựng cơ sở
sản xuất và đào tạo cán bộ, tổ chức các hội nghị bàn về việc thúc đẩy năng lực sản
xuất vacxin trên toàn thế giới [10]. Ngày 17/6/2009, Viện Vacxin và Sinh phẩm Y
tế (IVAC) đăng ký đề tài độc lập cấp nhà nước Nghiên cứu ứng dụng quy trình nuôi
cấy trên trứng gà có phôi để sản xuất vacxin cúm A/H1N1 mới. Trong năm 2010
Viện Vacxin và Sinh phẩm Y tế đã triển khai và hoàn thiện dây chuyền sản xuất
vacxin cúm tại trại Chăn nuôi Suối Dầu và sản xuất thử để ổn định quy trình 12 lô
vacxin cúm ở các quy mô khác nhau, trong đó có 5 lô hoàn thiện đến giai đoạn bán

thành phẩm [4].


11

1.2. Sản xuất vacxin cúm trên trứng gà có phôi.
1.2.1. Quy trình sản xuất và kiểm định vacxin cúm trên trứng gà có phôi.
Trứng gà sạch có phôi 10 đến 11 ngày tuổi được cấy chủng virus cúm. Sau
khi vào trong trứng, virus cúm sẽ nhân lên với số lượng lớn. Đến khi đủ số lượng,
tiến hành thu gặt dịch niệu nang. Dịch niệu nang được tinh chế sau đó hoàn nguyên
trong PBS và bất hoạt bằng formaldehyde, ly giải, lọc vô trùng để được nước cốt
pha bán thành phẩm. Sau đó, sản phẩm được đóng lọ tạo thành vacxin thành phẩm
[10].
Song song với quy trình sản xuất, quy trình kiểm định cũng diễn ra theo sơ
đồ 10:

12

Quy trình sản xuất Quy trình kiểm định


Gây nhiễm

tr

Thu gặt


Tinh sạch cô đặc



Ly tâm phân đoạn sucrose



Bất hoạt, lọc vô trùng

Hình 1.1: Quy trình sản xuất và kiểm định vacxin cúm.

13

1.2.2. Tiêu chuẩn chất lượng của vacxin cúm A/H1N1.
Mỗi lô vacxin cúm A/H1N1 trong quá trình sản xuất cũng như khi ra thành
phẩm, trước khi đưa vào sử dụng đều phải trải qua quá trình kiểm định chất lượng
rất chặt chẽ 14. Các tiêu chí kiểm tra đều dựa trên các tiêu chuẩn hiện hành của Bộ
Y tế Việt Nam và các quy định của TCYTTG cho vacxin cúm dùng cho người. Đối
với vacxin cúm sản xuất trên trứng gà có phôi, tiêu chuẩn chất lượng (vacxin cúm
A/H1N1/09) được TCYTTG khuyến cáo như bảng sau 11:
Bảng 1.1: Tiêu chuẩn chất lượng của vacxin cúm A/H1N1/09 11.
TT

Chỉ tiêu Phương pháp Tiêu chuẩn chấp thuận
1 Cảm quan Quan sát bằng mắt
Dung dịch trong suốt, không màu,
không lắng cặn.
2 pH Đo điện thế - điện cực 6,5 – 7,5
3 Vô trùng
Cấy trực tiếp trên môi
trường TSB và
Thioglycolate
Không có sự phát triển của vi
khuẩn và nấm trên cả hai loại môi
trường nuôi cấy.
4 Hiệu lực bất hoạt

Thử trên trứng gà có
phôi
Phôi sống ≥ 80%, HA âm tính
5 Nhận dạng SRID
Dương tính với kháng huyết thanh
đặc hiệu.
6 Hàm lượng HA SRID
≥ 30

g/ml
7 Protein tổng số Lowry
≤ 200

g/ml
8
Hàm lượng
endotoxin
LAL ≤ 200EU/ml
9
Hàm lượng
ovalbumin
ELISA – Serazyme kit
≤ 2g/ml
10
Hàm lượng
formaldehyde tồn
dư.
Đo quang với thuốc thử
acetyl acetone
≤ 0,02%

11
Hàm lượng
sucrose
Sắc ký lớp mỏng
≤ 0,4mg/100

g HA, tương đương
≤ 0,125mg/ml

1.3. Những yêu cầu và căn cứ pháp lý về thực hành tốt phòng thí nghiệm và
thẩm định quy trình phân tích.
Theo quy định của Bộ trưởng Bộ Y tế số 5405/2002/ QĐ – BYT ngày
31/12/2002 về việc ban hành “Hướng dẫn thực hành tốt sản xuất vacxin và sinh
14

phẩm y tế Việt Nam”, thì nhà sản xuất vacxin và sinh phẩm chỉ được cấp giấy phép
đăng ký khi hoạt động sản xuất của họ được cơ quan có thẩm quyền quốc gia Việt
Nam thanh tra thường xuyên. Hướng dẫn thực hành sản xuất tốt (GMP) được coi
như một tiêu chuẩn để chứng minh tình trạng. GMP tạo nên một trong những yếu tố
của hệ thống chứng chỉ của TCYTTG về chất lượng của sản phẩm thuốc ở thị
thương mại quốc tế thông qua việc đánh giá đơn xin sản xuất và là lý do để thanh
tra cơ sở sản xuất [3].
Thực hành sản xuất tốt là một phần của bảo đảm chất lượng nhằm đảm bảo
một cách chắc chắn rằng sản phẩm được sản xuất một cách ổn định và kiểm định
theo tiêu chuẩn chất lượng phù hợp với mục đích sử dụng ghi trong giấy phép kinh
doanh. Các điều luật GMP đưa ra nhằm giảm bớt những rủi ro luôn gắn liền với
sinh phẩm vì thực tế không thể phát hiện được nếu chỉ kiểm tra sản phẩm cuối cùng.
Ví dụ nhiễm trùng chéo, nhầm lẫn do dán nhãn sai trên vật chứa…[3].
Trong quá trình sản xuất vacxin sinh phẩm kiểm định đóng vai trò hết sức
quan trọng bởi vì những thiếu hụt có thể không phát hiện được bằng kiểm tra thành

phẩm. Vì những lý do này việc sản xuất vacxin và sinh phẩm phải thực hiện theo
nguyên tắc của GMP và tôn trọng một cách triệt để [3].
Công việc thẩm định là một phần quan trọng của GMP và phải được tiến
hành theo thường quy quy định. Phải báo cáo tổng kết các kết quả thu được, đưa ra
các kết luận và lưu trữ tất cả hồ sơ. Các quy định và thủ tục được thiết lập trên cơ sở
nghiên cứu thẩm định, tái thẩm định định kỳ nhằm đảm bảo rằng các quy trình và
thủ tục này vẫn đáp ứng được yêu cầu [3].
Theo quyết định của Bộ trưởng Bộ Y tế số 1570/2000/QĐ – BYT ngày
22/05/2000 về việc triển khai áp dụng nguyên tắc “Thực hành tốt phòng kiểm
nghiệm thuốc” ở tất cả các đơn vị kiểm nghiệm thuốc. Thực hành tốt phòng thí
nghiệm (GLP) là tất cả các hoạt động có hệ thống được hoạch định sẵn và áp dụng
theo hệ thống chất lượng, thể hiện những yếu tố thích hợp nhằm đảm bảo độ tin cậy
cần thiết đáp ứng được các yêu cầu chất lượng [15]. Việc thực hành tốt các nguyên
tắc kiểm nghiệm thuốc nhằm nâng cao tính hiệu quả của hệ thống các phòng kiểm
15

nghiệm thuốc trên cả hai mặt quản lý nghiệp vụ và quản lý kỹ thuật, kể cả khu quản
lý nhà nước và doanh nghiệp, nhằm đảm bảo tính khách quan, trung thực và chính
xác trong việc đánh giá chất lượng thuốc [3].
1.4. Thẩm định quy trình phân tích.
Trong công tác tiêu chuẩn, việc xây dựng các quy trình phân tích (Analytical
Procederes) hay còn gọi là quy trình thử nghiệm (Test Procedures) nhằm giúp cho
việc thực hiện kiểm tra chất lượng của tiêu chuẩn đó. Quy trình phân tích là quy
trình thử nghiệm, mô tả chi tiết các bước cần thiết để thực hiện một thử nghiệm.
Quy trình phân tích được chia thành 3 loại: Thử định tính, thử tinh khiết và thử định
lượng [7].
Thẩm định quy trình phân tích là một quá trình tiến hành thiết lập bằng thực
nghiệm các thông số đặc trưng của phương pháp để chứng minh rằng phương pháp
đáp ứng yêu cầu phân tích dự kiến. Nói cách khác, việc thẩm định một quy trình
phân tích yêu cầu chúng ta phải chứng minh một cách khoa học rằng khi tiến hành

thử nghiệm các sai số mắc phải là rất nhỏ và chấp nhận được.
Xây dựng quy trình phân tích bằng quy trình thực nghiệm nhằm mục đích:
+ Giúp cho việc thực hiện kiểm tra chất lượng của tiêu chuẩn cũng như thực hiện
các chỉ tiêu đề ra cho tiêu chuẩn đó.
+ Công việc bắt buộc, định kỳ, đảm bảo rằng quy trình đề xuất đáp ứng yêu cầu dự
kiến.
+ Sau khi được thẩm định có thể được đưa vào Dược điển hoặc tiêu chuẩn cơ sở để
xin đăng ký lưu hành [7].
1.4.1. Phạm vi thẩm định, tái thẩm định.
Nếu quy trình phân tích của một sản phẩm thử nghiệm đã có trong Dược
điển Việt Nam hiện hành hay có trong Dược điển Châu Âu (Ph Eur.), (USP), (JP),
(FP), (DAB), hoặc các phương pháp phân tích chính tắc của hiệp hội hóa học phân
tích thế giới thì không phải thẩm định lại, nếu không phải tái thẩm định lại.
Phạm vi thẩm định bao gồm: Quy trình phân tích mới hoàn toàn và thay đổi
quy trình phân tích đã được thẩm định.
16

Tái thẩm định bao gồm: Phương pháp phân tích chuyển đổi và xét duyệt tại
Cơ quan Kiểm nghiệm quốc gia xin đăng ký lại để lưu hành mặt hàng (thẩm định
định kỳ) [5].
1.4.2. Các yêu cầu thực hiện để thẩm định quy trình phân tích.
Trong công tác xây dựng tiêu chuẩn, phải xây dựng các quy trình phân tích
hay còn gọi là quy trình thử nghiệm để giúp việc kiểm tra chất lượng của tiêu chuẩn
cũng như các chỉ tiêu đề ra cho tiêu chuẩn đó. Mỗi quy trình hay phương pháp đưa
ra đều phải trải qua rất nhiều nghiên cứu để phát triển và hoàn thiện nó. Để biết
được quy trình đề xuất có đáp ứng được yêu cầu dự kiến và đạt tiêu chuẩn của một
quy trình phân tích hay không thì nó phải được thẩm định, đánh giá [6]. Cơ sở để
đánh giá một quy trình phân tích dựa vào các tiêu chuẩn sau:
 Tính đặc hiệu (Specificity).
Tính đặc hiệu là khả năng đánh giá chắc chắn một chất phân tích khi có mặt

các thành phần khác có thể có trong mẫu thử. Việc xác định tính đặc hiệu cần thiết
được tiến hành trong khi thẩm định các phép thử định tính, xác định tạp chất và
định lượng. Thông thường các thành phần gồm các tạp chất, sản phẩm phân hủy,
chất nền…Quy trình dùng để xác định tính đặc hiệu phụ thuộc vào mục tiêu đã định
của phương pháp phân tích. Một phương pháp phân tích kém đặc hiệu có thể được
bổ trợ bằng một hoặc nhiều phương pháp phân tích khác [5].
 Độ chính xác (Precision).
Độ chính xác của một phương pháp phân tích diễn tả sự thống nhất (mức độ
phân tán) kết quả giữa một loạt phép đo từ nhiều lần lấy mẫu trên cùng một mẫu thử
đồng nhất dưới những điều kiện mô tả. Độ chính xác có thể chia thành ba cấp: Độ
lặp lại, độ chính xác trung gian và độ tái lặp. Độ chính xác nên được thử trên một
mẫu thử thực, đồng nhất. Tuy nhiên, nếu không có mẫu đồng nhất thì có thể dùng
mẫu tự tạo hoặc một dung dịch mẫu thử. Độ chính xác thường được biểu thị dưới
dạng độ dao động, độ lệch chuẩn hoặc hệ số dao động của một loạt phép đo [5].


17

+ Độ lặp lại (Repeatability).
Độ lặp lại diễn tả độ chính xác của một phương pháp phân tích trong cùng
điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn. Độ lặp lại còn được gọi là độ
chính xác trong cùng điều kiện định lượng. Độ lặp lại có thể được đánh giá trên kết
quả của: Tối thiểu 9 lần định lượng trong khoảng nồng độ đã được xác định của quy
trình (ví dụ 3 nồng độ, mỗi nồng độ được tiến hành 3 lần) hoặc tối thiểu 6 lần định
lượng ở nồng độ thử 100% [5].
+ Độ chính xác trung gian (Intermediate Precision).
Độ chính xác trung gian diễn tả mức dao động của kết quả trong cùng một
phòng thí nghiệm được thực hiện ở các ngày khác nhau, kiểm định viên khác nhau
và thiết bị khác nhau. Việc xác định độ chính xác trung gian phụ thuộc vào tình
hình cụ thể đối với từng phương pháp phân tích được áp dụng. Cơ sở đăng ký cần

chỉ ra ảnh hưởng của các biến cố ngẫu nhiên đến độ chính xác của phương pháp
phân tích. Những thay đổi điển hình cần xem xét bao gồm: Ngày phân tích, kiểm
nghiệm viên, thiết bị…[5].
+ Độ tái lặp (Reproducibility).
Độ tái lặp diễn tả độ chính xác giữa các phòng thí nghiệm (các nghiên cứu
phối hợp giữa các phòng thí nghiệm thường được áp dụng để tiêu chuẩn hóa
phương pháp). Độ tái lặp được xác định bằng cách so sánh kết quả giữa các phòng
thí nghiệm. Độ tái lặp được tiến hành đánh giá trong trường hợp tiêu chuẩn hóa
phương pháp phân tích, ví dụ như đối với các quy trình trong Dược điển. Những số
liệu này không nằm trong hồ sơ đăng ký thuốc [5].
+ Dữ liệu cần có.
Độ chính xác của mỗi quy trình cần phải đưa ra các dữ liệu sau: Độ lệch
chuẩn (standard deviation), độ lệch chuẩn tương đối (relative standart deviation hay
hệ số biến thiên – coefficient of variation) [5].
 Độ đúng (Accuracy).
Độ đúng của một phương pháp phân tích diễn tả sự thống nhất giữa giá trị
tìm thấy với giá trị thực hoặc giá trị đối chiếu được chấp nhận. Đôi khi khái niệm
18

này còn được gọi là độ xác thực (trueness). Độ đúng cần được thiết lập trong
khoảng phân tích xác định của phương pháp phân tích. Phương pháp được thiết kế
nhằm xác định độ hồi phục (recovery) của các giá trị đo được bằng phương pháp so
với giá trị thực của mẫu [5].
 Tính tuyến tính (Linearity).
Tính tuyến tính của một phương pháp phân tích diễn tả kết quả phân tích thu
được tỷ lệ với nồng độ (trong khoảng nhất định) của chất phân tích trong mẫu thử.
Tính tuyến tính được xác định bằng cách sử dụng các số liệu của các thí nghiệm đo
độ chính xác trong cùng một lần thực hiện và trong nhiểu lần thực hiện. Mẫu được
pha loãng theo các nồng độ khác nhau và được thực hiện song song bởi 2 người
khác nhau trong 3 ngày liên tiếp. Đường hồi quy (regression line) và hệ số tương

quan (correlatiso coeffient) được tính toán để đánh giá khả năng tuyến tính giữa các
nồng độ của mẫu và kết quả đo được [5].
 Khoảng xác định (Range).
Khoảng xác định của một phương pháp phân tích là khoảng cách giữa nồng
độ trên và dưới của chất phân tích trong mẫu thử (bao gồm cả các nồng độ này),
trong khoảng nồng độ này, phương pháp phân tích đã được chứng minh đáp ứng độ
chính xác, độ đúng và tính tuyến tính. Khoảng xác định thường được lấy từ những
nghiên cứu tính tuyến tính và phụ thuộc vào việc ứng dụng dự định của quy trình.
Khoảng xác định được thiết lập bởi việc khẳng định phương pháp phân tích đã xây
dựng có tính tuyến tính, độ đúng và độ chính xác chấp nhận được khi áp dụng để
định lượng mẫu thử chứa chất phân tích với hàm lượng nằm trong khoảng hoặc ở
hai cực (cực đại và cực tiểu) của khoảng xác định của phương pháp phân tích [5].
 Giới hạn phát hiện (Detection Limit).
Giới hạn phát hiện của một phương pháp phân tích là lượng nhỏ nhất của
chất phân tích trong mẫu thử có thể phát hiện được nhưng không nhất thiết để có
thể định lượng được. Phương pháp xác định giới hạn phát hiện tùy thuộc vào
phương pháp phân tích là phương pháp phân tích dụng cụ hay không dụng cụ. Các
phương pháp phát hiện gồm có: Dựa vào quan sát, dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với
19

nhiễu, dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng và độ dốc, dựa vào độ lệch chuẩn của
mẫu trắng, dựa vào đường chuẩn…
Các dữ liệu cần có: Cần đưa ra giới hạn phát hiện và cách xác định giới hạn
phát hiện. Nếu giới hạn phát hiện được xác định dựa vào quan sát hoặc dựa vào tỷ
lệ đáp ứng trên nhiễu thì cần đưa ra các sắc ký đồ có liên quan. Trong trường hợp
ước tính giá trị giới hạn phát hiện bằng tính toán hoặc bằng ngoại suy thì sau đó
những ước tính này cần được đánh giá bằng cách phân tích độc lập một số lượng
mẫu thích hợp có nồng độ đã biết gần với giới hạn phát hiện hoặc bằng với giới hạn
phát hiện [5].
 Giới hạn định lượng (Quantitation Limit).

Giới hạn định lượng của một phương pháp phân tích là lượng nhỏ nhất của
chất phân tích trong mẫu thử để có thể định lượng được với độ đúng và độ chính
xác thích hợp. Giới hạn định lượng là một thông số của phép định lượng các chất có
nồng độ thấp trong mẫu thử, đặc biệt thường được dùng để xác định tạp chất và/
hoặc sản phẩm phân hủy. Phương pháp xác định giới hạn định lượng tùy thuộc vào
phương pháp phân tích là phương pháp phân tích dụng cụ hay không dụng cụ. Các
phương pháp xác định giới hạn định lượng gồm: Dựa vào quan sát, dựa vào tỷ lệ
đáp ứng so với nhiễu, dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng và độ dốc, dựa vào độ
lệch chuẩn của mẫu trắng, dựa vào đường chuẩn…định lượng. Giới hạn này sau đó
cần được đánh giá bằng cách phân tích một số lượng mẫu thử thích hợp có nồng độ
đã biết gần với giới hạn định lượng hoặc bằng giới hạn định lượng [5].
 Độ thô (Robustness).
Độ thô của phương pháp phân tích nhằm đánh giá khả năng duy trì của
phương pháp phân tích không bị ảnh hưởng bởi những biến đổi nhỏ nhưng có tính
chủ định trong các thông số của phương pháp và chỉ ra mức tin cậy của quy trình
trong điều kiện sử dụng bình thường. Việc đánh giá độ thô cần được xem xét trong
giai đoạn phát triển phương pháp và tùy thuộc vào loại phương pháp phân tích đang
nghiên cứu. Kết quả đánh giá độ thô là kết quả đánh giá dãy các thông số phản ánh
20

tính thích hợp của hệ thống phải được thiết lập để đảm bảo duy trì được tính hiệu
lực của phương pháp phân tích bất kỳ khi nào sử dụng [5].
Sau đây là bảng liệt kê các chỉ tiêu được xem là quan trọng nhất cho việc
thẩm định các loại phương pháp phân tích khác nhau:
Bảng 1.2: Các chỉ tiêu thẩm định các phương pháp phân tích [3]
Loại quy trình phân tích


Các chỉ tiêu
Định tính

Xác định tạp
chất
Định lượng:
-Độ hòa tan.
-Hàm lượng/
hoạt lực.
Định
lượng
Thử
giới
hạn
Độ đúng - + - +
Độ chính xác:
- Độ lặp lại - + - +
- Độ chính xác trung gian - + (1) - + (1)
Tính đặc hiệu (2) + + + +
Giới hạn phát hiện (LOD) - - (3) + -
Giới hạn định lượng (LOQ) - + - -
Tính tuyến tính - + - +
Khoảng xác định - + - +
Dấu – nhằm chỉ các chỉ tiêu này thông thường không cần phải đánh giá.
Dấu + nhằm chỉ các chỉ tiêu này cần phải đánh giá.
(1)trong trường hợp đã tiến hành kiểm tra độ tái lặp thì độ chính xác trung gian
không cần phải xem xét.
(2)một phương pháp phân tích kém đặc hiệu có thể bổ trợ bằng một hay nhiều
phương pháp phân tích hỗ trợ khác.
(3)có thể cần trong một số trường hợp [5].

21

1.5. Các chỉ tiêu hóa học trong vacxin và phương pháp định lượng.
1.5.1. Protein và phương pháp định lượng protein.
a. Protein.
Protein là hợp chất hữu cơ có ý nghĩa quan trọng trong bậc nhất trong cơ thể
sống và được tạo thành chủ yếu từ các amino acid vốn được nối với nhau bằng liên
kết peptide. Thông thường trong cấu trúc của protein gồm bốn nguyên tố chính là C
(≈50%), H (≈ 7%), O (≈23%), N (≈16%). Ngoài ra trong protein còn gặp một số
nguyên tố khác như S, P, Fe, Zn, Cu… Phân tử protein có cấu trúc, hình dạng và
kích thước rất đa dạng, khối lượng phân tử của các loại protein thay đổi trong
những giới hạn rất rộng, thông thường từ hàng trăm cho đến hàng triệu 16.
Protein là một chất sinh miễn dịch mạnh vì nó có đủ các yếu tố của chất sinh
miễn dịch. Đó là:
+ Tính lạ: Chất được gọi là chất sinh miễn dịch trước hết phải là chất lạ đối
với cơ thể vì bình thường cơ thể không đáp ứng bảo vệ với một chất của bản thân.
Ví dụ ovalbumin của lòng trắng trứng là một protein lạ đối với cơ thể. Khi protein
này được đưa vào cơ thể động vật (gây miễn dịch) nó sẽ kích thích cơ thể động vật
sản xuất ra kháng thể 12.
+ Trọng lượng phân tử đủ lớn: Kháng nguyên thường có trọng lượng phân tử
trên 10.000 dalton (đơn vị đo trọng lượng tương đương trọng lượng nguyên tử
hydro). Protein có trọng lượng phân tử lên đến hàng triệu dalton nên protein đủ điều
kiện trở thành kháng nguyên mạnh 12.
+ Cấu trúc phức tạp: Bất kỳ một chất sinh miễn dịch nào cũng có cấu trúc
phân tử tương đối phức tạp. Các chất có cấu trúc càng phức tạp thì tính sinh miễn
dịch càng cao, protein cũng thỏa mãn tính chất này. Cấu trúc của nó phức tạp do nó
được cấu tạo từ các acid amin sắp xếp theo các tổ hợp khác nhau 12.
Với các đặc điểm trên, protein là một kháng nguyên mạnh hay nó có tính
sinh miễn dịch mạnh. Mặt khác protein cũng là thành phần gây dị ứng đối với cơ

thể nên để đảm an toàn đối với người và động vật, bắt buộc phải kiểm tra thành
phần này trong vacxin thành phẩm.
22

b. Các phương pháp định lượng protein tổng số trong vacxin.
Protein có trong vacxin được xác định theo nhiều phương pháp khác nhau,
tùy theo từng loại vacxin.
 Phương pháp biuret: Dựa vào sự tương tác của ion Cu
2+

với protein trong dung
dịch alkalin, sản phẩm thu được có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 545nm [8].
 Phương pháp Bradford: Dựa trên sự kết hợp giữa thuốc nhuộm Coomasie với
protein trong môi trường acid [8].
 Phương pháp đồng/bicinchoninic acid: Dựa vào sự khử ion Cu
2+
thành Cu
+
do
protein, dùng acid bicinchoninic (BCA) để xác định Cu
+
[8].
 Phương pháp Micro Kjeldahl: Protein được vô cơ hóa bằng axit sulfuric đậm
đặc chuyển thành dạng ion amoni NH
4
+
rồi chuẩn độ định lượng hoặc đo quang
với thuốc thử Nessler (Phương pháp Nessler hay semi – Kjeldahl) [8].
 Phương pháp Lowry cải tiến: Protein có trong mẫu vacxin thử bị tủa với acid
tricloracetic. Xác định lượng tủa để tính ra lượng protein có trong vacxin bằng

phản ứng với đồng tactrate và thuốc thử Folin trong môi trường kiềm tạo phức
màu xanh da trời [8].
1.5.2. Formaldehyde và các phương pháp định lượng formaldehyde.
a. Formaldehyde.
Formaldehyde là một hợp chất hữu cơ với công thức CH
2
O. Đây là aldehyde
đơn giản, còn được gọi là formalin hoặc formol [8]. Formaldehyde là một chất khí
không màu với mùi cay nồng đặc trưng. Dung dịch formaldehyde có thể sử dụng
như một chất khử trùng, nó giết chết hầu hết các vi khuẩn và nấm (bao gồm cả bào
tử của chúng). Formaldehyde được áp dụng giải pháp tại chỗ trong y học để làm
khô da, chẳng hạn như điều trị mụn cóc. Nhiều người nuôi cá cảnh sử dụng
formaldehyde như một loại thuốc điều trị các loài ký sinh trùng trên cá.
Ở một số nơi, formaldehyde vẫn được sử dụng bất hợp pháp như là một chất
bảo quản trong thực phẩm khiến nhiều người ăn phải đồ ăn chứa formaldehyde. Ở
người, nếu uống phải formaldehyde sẽ gây nôn mửa, đau bụng, chóng mặt, và trong
trường hợp nặng có thể gây tử vong. Ở nồng độ trên 0,1 ppm trong không khí
23

formaldehyde có thể gây sưng mắt và niêm mạc màng, dẫn đến chảy nước mắt.
Formaldehyde hít ở nồng độ này có thể gây ra nhức đầu, cảm giác nóng trong cổ
họng, và khó thở, cũng như kích hoạt hoặc tăng nặng triệu chứng hen suyễn. Trong
EU, tối đa cho phép nồng độ formaldehyde trong các sản phẩm đã hoàn thành là
0,2%, và bất kỳ sản phẩm nào vượt quá 0,05% phải có cảnh báo rằng sản phẩm có
chứa formaldehyde. Năm 1987, EPA Hoa Kỳ phân loại nó như là một chất gây ung
thư của con người có thể xảy ra và sau khi nghiên cứu hơn nữa Cơ quan Quốc tế
Nghiên cứu Ung thư (IARC), năm 1995, cũng được phân loại nó có thể là một chất
gây ung thư đối với con người. Ngoài ra còn có các nghiên cứu có hỗ trợ lý thuyết
cho rằng phơi nhiễm formaldehyde liên quan đến vấn đề sinh sản ở phụ nữ…[17].
Formaldehyde được sử dụng để vô hiệu hóa các độc tố của virus trong

vacxin (vacxin sử dụng một loại độc tố virus không hoạt động để tạo ra miễn dịch).
Nó cũng được dùng để tiêu diệt virus và vi khuẩn không mong muốn có thể bị
nhiễm trong quá trình sản xuất vacxin [18]. Vì vậy việc kiểm tra hàm lượng
formaldehyde của các lô vacxin cúm là một yêu cầu bắt buộc. Theo TCYTTG thì
hàm lượng formaldehyde ≤ 0,02%.
b. Các phương pháp định lượng formaldehyde trong vacxin
 Xác định hàm lượng formaldehyde tự do bằng phương pháp đo quang với
thuốc thử fuchsin.
Đây là phương pháp định lượng formaldehyde bằng cách so màu của chinol
ở bước sóng 400nm. Phản ứng tạo chất màu chinol dưới tác dụng của thuốc thử
fuchsin và aldehyd hòa tan trong nước [8].
Phương pháp này phức tạp và khó thực hiện, kết quả không chính xác ở các
nồng độ rất thấp.
 Xác định hàm lượng formaldehyde tự do bằng phương pháp đo quang với
thuốc thử acetylaceton.
Đây là phương pháp định định lượng formaldehyde bằng cách so màu của
3,5 – diacetyl – 1,4 – dihydrolutidin ở bước sóng 410nm. Phức hợp tạo thành có
24

màu vàng chanh do phản ứng của formaldehyde tự do trong mẫu thử với
acetylaceton và amoni trong môi trường acid nhẹ [8].
Phương pháp này dễ thực hiện, tốn ít thời gian và cho kết quả chính xác hơn.
1.5.3. Sucrose và các phương pháp bán định lượng sucrose.
a. Sucrose.
Sucrose có trọng lượng phân tử là 342,3 đvC. Sucrose ở dạng bột kết tinh
màu trắng hay tinh thể trắng hoặc không màu, khô, bóng. Rất dễ tan trong nước,
khó tan trong ethanol 96%, thực tế không tan trong ethanol tuyệt đối. Sucrose có
công thức hóa học là  - D – fructofuranosyl  - D – glucopy – ranosid [8]. Sucrose
được sử dụng ở nồng độ cao trong quá trình tinh chế vacxin cúm (tách phân đoạn
bằng siêu ly tâm theo nguyên lý gradien nồng độ) [19]. Căn cứ vào tiêu chuẩn của

vacxin cúm mùa cũng như các kết quả thu được từ các lô vacxin cúm thử nghiệm
thì hàm lượng sucrose theo tiêu chuẩn chất lượng cho vacxin cúm A/H1N1/09 phải
≤ 0,125 mg/ml.
b. Các phương pháp định lượng sucrose.
 Xác định hàm lượng sucrose bằng phương pháp Schoorl.
Đây là phương pháp định dựa vào sự khử của ion Cu
2+
thành Cu
+
do đường,
dùng iod để định lượng Cu
2+
. Từ đó suy ra được hàm lượng đường sucrose [8].
2CuSO
4
+ 2KI = 2K
2
SO
4
+ Cu
2
I
2
+ I
2

I
2
+ Na
2

S
2
O
3
= Na
2
S
4
O
6
+ 2NaI
Tuy nhiên phương pháp này chỉ xác định hàm lượng sucrose khi trong mẫu
chứa lượng đường lớn.
 Bán định lượng sucrose bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng.
Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography – TLC) là kỹ thuật tách
sucrose từ một hỗn hợp các chất. TLC được tiến hành trên bản có tráng một lớp
mỏng chất hấp phụ (pha tĩnh) trên đó chấm hỗn hợp các chất cần tách. Dung môi
(pha động) di chuyển lên phía trên bản mỏng theo cơ chế mao dẫn. Sucrose được
tách ra do đặc tính khác nhau của các thành phần mẫu. Trên sắc ký đồ, cường độ vệt
mẫu hình thành trên bản mỏng tương ứng với nồng độ sucrose [8].
25

Phương pháp này có tính ổn định và độ nhạy cao, phát hiện được hàm lượng
sucrose nhỏ. Tuy nhiên hóa chất sử dụng trong phương pháp này đa số là các dung
môi hữu cơ rất độc hại cho người thao tác.