Quá trình đồng sắc tố anthocyanin bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L.) với flavonol (rutin và quercetin) Ảnh hưởng của tỉ lệ mol và nồng độ anthocyanin lên hoạt tính chống oxy hóa và màu sắc

11

'
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYÊN TÁT THÀNH

KHOA KỸ THUẬT THỤC PHẨM VÀ MƠI TRƯỜNG

NGUYEN TAT THANH

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

Q TRÌNH ĐỊNG SẤC TÓ ANTHOCYANIN BỤP GIẤM

(HIBISCUS SABDARIFFA L.) VỚI FLAVONOL (RUTIN VÀ
QUERCETIN): ẢNH HƯỞNG CỦA TỈ LỆ MOL VÀ NÔNG ĐÔ

ANTHOCYANIN LÊN HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA VÀ
MÀU SẮC

NGƯYỄN THỪY TRANG

Tp.HCM, tháng 10 năm 2021

41


TÓM TẤT

Hoa bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L.) là một loại thực vật có nguồn gốc ở Tây

Phi, được xem như một nguyên liệu có lợi cho sức khỏe do thành phần hóa học bao gồm

các vitamin (vitamin nhóm B, vitamin C), acid hữu cơ, anthocyanin, flavonol. Trong đó,

anthocyanin thường tập trung ở phần đài hoa là thành phần được chú ý nhất do khả năng

tạo màu sắc đỏ đặc trưng cho sản phẩm và hợp chất này có ảnh hưởng tốt đến sức khỏe
như chống oxy hóa, kháng viêm, kháng ung thư, giảm đường huyết. Tuy nhiên, màu sắc

của anthocyanin dề bị thối hóa do tính ồn định thấp trong q trình chế biến và bảo

quản. Để cải thiện tính ổn định và giữ cho màu sắc của anthocyanin được bền hơn, quá
trình đồng sắc tố với flavonol là phương pháp tối ưu nhất, trong đó, rutin và quercetin

được chọn làm hai chất copigment. Vì vậy, mục tiêu của nghiên cứu này là khảo sát hoạt
tính chống oxy hóa và khả năng ổn định màu sắc của quá trình đồng sắc tố giữa

anthocyanin từ hoa bụp giấm với quercetin và rutin.

Đề tài này khảo sát hoạt tính chống oxy hóa bằng hai phương pháp là DPPH và
FRAP cũng như hiệu ứng hiệp lực, đồng thời đánh giá khả năng ổn định màu sắc bằng
việc khảo sát ảnh hưởng hồn hợp anthocyanin với flavonol lên độ hấp thu ở các tỉ lệ mol

[ACN]: [copigment] và nồng độ anthocyanin khác nhau.
Kết quả cho thấy rang quercetin có xu hướng làm tăng hoạt tính DPPH khi đồng

sắc tố với anthocyanin cao hơn rutin khi tăng nồng độ anthocyanin và tăng tỉ lệ mol. Giá
trị khử gốc tự do đạt giá trị cực đại 1233.83 mg TE/L ở nồng độ ACN 0.10 mM tại tỉ lệ

[ACN]:[quercetin] là 1:50. Trong khi đó, khi rutin đồng sắc tố với dịch chất màu
anthocyanin lại có hoạt tính khừ sắt cao hơn hồn hợp quercetin với anthocyanin. Giá trị
khử sắt đạt cực đại 4468.65 mg TE/L khi nồng độ rutin được thêm vào dung dịch

anthocyanin theo tỉ lệ 1:50 với [ACN] = 0.10 mM. Điều này có thể thấy qua hiệu ứng
hiệp lực, mặc dù rutin đơn lẻ có hoạt tính thấp hơn quercetin nhưng khi bơ sung vào
dịch màu bụp giấm lại làm tăng hoạt tính tổng của hồn họp. Đồng thời, quercetin và

rutin không làm thay đổi màu sẳc của dịch bụp giấm nhưng cường độ màu sắc của dịch
chất màu tăng 72.60% khi tỉ lệ [ACN]:[quercetin] là 1:50 ở nồng độ anthocyanin 0.10

mM.

viii


MỤC LỤC

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN TÓT NGHIỆP.............................................................. iv
LỜI CAM ĐOAN........................................................................................................ vi
LỜI CẢM ƠN.............................................................................................................vii

TÓM TẮT.................................................................................................................. viii
ABSTRACT................................................................................................................. ix
MỤC LỤC......................................................................................................................X

DANH MỤC CHỮ VIÉT TẮT.............................................................................. xiii
DANH MỤC HÌNH.................................................................................................. xiv
DANH MỤC BẢNG.................................................................................................. XV
MỎ ĐẦU..................................................................................................................... xvi
Chương 1. TÔNG QUAN VÈ NGHIÊN cứu....................................................... 1

1.1. HOA BỤP GIÁM............................................................................................ 1

1.1.1. Giới thiệu chung................................................................................................ 1
1.1.2. Đặc điểm............................................................................................................. 2

1.1.3. Lợi ích của hoa bụp giấm............................................................................... 3
1.1.4. cấu trúc của anthocyanin............................................................................... 4

1.2. Tổng quan về đồng sắc tố.............................................................................. 5
1.2.1. Định nghĩa.......................................................................................................... 5
1.2.2. Phân loại..............................................................................................................6
1.2.3. Yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển màu sắc và độ ồn định của

anthocyanin................................................................................................................................ 7

Chương 2. PHƯONG PHÁP NGHIÊN cứu........................................................ 8

2.1. NGUYÊN LIỆU.............................................................................................. 8

X


2.2. DỤNG CỤ - THIẾT BỊ - HÓA CHÁT..................................................... 8
2.2.1. Dụng cụ............................................................................................................... 8

2.2.2. Thiết bị................................................................................................................. 8
2.2.3. Hóa chất............................................................................................................. 10

2.3. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIẺM NGHIÊN cứu........................................ 10
2.3.1. Thời gian nghiên cứu..................................................................................... 10
2.3.2. Địa điểm nghiên cứu...................................................................................... 10

2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu............................................................. 10
2.4.1. Quy trình thu nhận dịch chiết bụp giấm................................................... 10
2.4.2. Quy trình tinh sạch dịch bụp giấm.......................................................... 11
2.4.3. Quy trình tạo đồng sắc tố với flavonol................................................... 11

2.5. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH................................................................. 11
2.5.1. Hiệu ứng bathochromic và hyperchromic............................................. 11
2.5.2. Hiệu ứng hiệp lực về khả năng chống oxy hóa...................................... 12
2.5.3. Khả năng khử gốc tự do DPPH.................................................................. 12
2.5.4. Khả năng khử sắt FRAP............................................................................... 12

2.6. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SÓ LIỆU......................................................... 13
Chương 3. KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................. 14

3.1. ẢNH HƯỞNG CỦA [ACNJ: [FLAVONOL] LÊN HOẠT TÍNH KHỬ
GỐC TỤ DO DPPH.......................................................................................................14

3.2. ẢNH HƯỞNG CỦA JACNJ: [FLAVONOL] LÊN HOẠT TÍNH KHỬ

SẮT (FRAP)..................................................................................................................... 16
3.3. ẢNH HƯỞNG CỦA [ACN]: [FLAVONOL] LÊN KHẢ NÀNG HIỆP

Lực CHÓNG OXY HÓA............................................................................................ 18
3.4. ẢNH HƯỞNG CỦA [ACN]: [FLAVONOL] LÊN PHÔ HÁP THU.. 22

KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ................................................................................. 26

XI

TÀI LIỆU THAM KHẢO

27

xii


DANH MỤC CHỮ VIÉT TẮT

Chữ viết tắt

Thuật ngừ tiếng Anh

Thuật ngừ tiếng Việt

ACN

Anthocyanin

Anthocyanin

C3G

Cyanidin-3-O-glucoside

Cyanidin-3-O-glucoside

DPPH (2,2-diphenyl-l-picrylhydrazyl) free

Hoạt tính khử gốc tự do

radical scavenging assay

DPPH

EGCG

Epigallocatechin gallate

Epigallocatechin gallate

FRAP

Ferric reducting antioxidant power assay

Hoạt tính khử sắt FRAP

PEC

Polyelectrolyte complex

Phức hợp polyelectrolyte

SE

Synergistic effect

Hiệu ứng hiệp lực

TE

Trolox equivalent

Đương lượng Trolox

DPPH

xiii


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hoa bụp giấm {Hibiscus sabdariffa L.)....................................................................... 1
Hình 1.2 Đài hoa bụp giấm tươi..................................................................................................... 2
Hình 1.3 Cấu trúc của anthocyanin (D. R. Kammerer, 2016)................................................ 4
Hình 1.4 Sáu cấu trúc tự nhiên của anthocyanin và độ phong phú của chúng (Pervaiz et

al.,2017)................................................................................................................................................ 5
Hình 2.1 Nguyên liệu hoa bụp giấm khơ (Cơng ty Việt Hibiscus)....................................... 8
Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ nồng độ mol [ACN]:[flavonol] lên hoạt tính khử gốc tự
do DPPH của dịch chất màu bụp giấm tại [ACN] = 0.05 và 0.10 mM.............................. 14

Hình 3.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ nồng độ mol [ACN]:[flavonol] lên hoạt tính khử sat FRAP
của dịch chất màu bụp giấm tại [ACN] = 0.05 và 0.10 mM................................................. 16

Hình 3.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ nồng độ mol [ACN]:[quercetin] lên phổ hấp thu trong

vùng 400-700 nm của dịch chất màu bụp giấm với nồng độ anthocyanin (a) 0.05 mM
và (b) 0.10 1Ĩ1M..................................................................................................................................22

Hình 3.4 Ảnh hưởng của ti lệ nồng độ mol [ACN]:[rutin] lên phồ hấp thu trong vùng
400-700 nm của dịch chất màu bụp giấm với nồng độ anthocyanin (a) 0.05 mM và (b)

0.10 mM.............................................................................................................................................. 23

xiv


DANH MỤC BANG

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ nồng độ mol [ACN]:[flavonol] lên hiệu ứng hiệp lực về
hoạt tính khử gốc tự do DPPH của dịch chất màu bụp giấm tại [ACN] = 0.05 và 0.10

mM........................................................................................................................................................ 18
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ nồng độ mol [ACN]:[flavonol] lên hiệu ứng hiệp lực về

hoạt tính khử sắt FRAP của dịch chất màu bụp giấm tại [ACN] = 0.05 và 0.10 mM. 20
Bảng 3.3 Hiệu ứng bathochromic và hyperchromic của dịch chất màu bụp giấm khi

tương tác đồng sắc tố với quercetin và rutin ở những tỉ lệ mol khác nhau.......................24

XV


MỞ ĐẦU

1.

Đặt vấn đề
Ngành công nghiệp thực phẩm ngày nay có xu hướng sử dụng chất tạo màu tự

nhiên thay thế cho chất tạo màu tơng hợp vì chúng có nguồn gốc từ thực vật, an tồn và

khơng độc hại. Trong các họp chất từ thực vật, anthocyanin là chất có tiềm năng được
sử dụng làm chất tạo màu (Jabeur et al., 2017) bởi vì phổ màu rộng gồm đỏ, tím, xanh
có thể thay đổi theo nồng độ pH, chúng là những sắc tố hịa tan trong nước thuộc nhóm

polyphenol có nhiều trong trái cây và rau quả (He & Giusti, 2010; Zhao et al., 2017).
Anthocyanin là một chất có lợi ích sinh học liên quan đến sức khỏe như chống một số

bệnh (ung thư, bệnh tim mạch) cũng như các rối loạn mãn tính khác chủ yếu nhờ vào

khả năng chống oxy hóa của nó (Aboonabi & Singh, 2015). Tuy nhiên, anthocyanin lại
dề bị suy thoái bởi các điều kiện môi trường như nhiệt độ, ánh sáng, pH,... màu sắc của

anthocyanin cũng khơng được bền trong q trình chế biến và bảo quản (Cavalcanti et

al„ 2011).
Với mục đích cải thiện màu sắc của anthocyanin, phương pháp đồng sắc tố với các
chat flavonol được áp dụng là một trong những phương pháp hiệu quả. Đồng sắc tố được

thực hiện với hai chat flavonol là quercetin và rutin, tạo phức không liên kết cộng hóa

trị với phân tử anthocyanin. Malien-Aubert và cộng sự (2001) cho rằng các chất màu
giàu flavonols và có tỉ lệ copigment / sắc tố cao nhất cho thấy sự ôn định đáng kể và
màu sắc dường như không bị ảnh hưởng nhiều (Malien-Aubert et al., 2001).

2. Mục tiêu nghiên cứu
Ơn định sự khơng bền về màu sắc và hoạt tính chống oxy hóa của anthocyanin
giúp ngành cơng nghiệp thực phẩm có nguồn phâm màu tự nhiên chất lượng, đa dạng

thay cho phẩm màu nhân tạo.

3. Nội dung nghiên cứu
Đe tài này khảo sát hoạt tính chống oxy hóa DPPH và FRAP, đồng thời đánh giá
hiệu ứng hiệp lực lên khả năng chống oxy hóa cũng như màu sắc của dịch bụp giấm khi

đồng sắc tố với flavonol.

XVI


- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ anthocyanin và tỉ lệ mol lên hoạt tính khử gốc tự

do DPPH của hồn họp đồng sac to anthocyanin với quercetin và rutin.
- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ anthocyanin và tỉ lệ mol lên hoạt tính khử sắt
FRAP của hồn hợp đồng sac to anthocyanin với quercetin và rutin.

- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ anthocyanin và tỉ lệ mol lên phổ hấp thu của hồn
họp đồng sac to anthocyanin với quercetin và rutin.

- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ anthocyanin và tỉ lệ mol lên hiệu ứng hiệp lực

của hỗn họp đồng sac to anthocyanin với quercetin và rutin.
- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ anthocyanin và tỉ lệ mol lên hiệu ứng
hyperchromic và bathochromic của hồn hợp đồng sac to anthocyanin với quercetin
và rutin.

4. Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu trên nguyên liệu hoa bụp giấm và quá trình đồng sắc tố.

xvii


Chương 1. TÓNG QUAN VÈ NGHIÊN cứu

1.1. HOA BỤPGIÁM

1.1.1. Giới thiệu chung
Hibiscus sabdariffa L. (Hình 1.1), cịn được gọi là roselle, là một cây thuốc thân
thảo, thuộc họ Malvaceae. Mặc dù có nguồn gốc từ châu Á nhưng nó cũng được trồng

rộng rãi ở nhiều khu vực, bao gồm cả Trung Mỹ và châu Phi. Lồi này thường được

ni trồng để lấy sợi và đài hoa của nó, và bao gồm ba kiều gen khác nhau: xanh lá cây,
đở (là loại phổ biển được sử dụng nhiều nhất) và đỏ sầm (Jabeur et al., 2017). Chiết xuất
bụp giấm có hoạt tính kháng khuẩn và chổng oxy hóa cũng như làm giảm cảm giác đói
và có tác dụng lên chuyển hóa lipid 3 (chống cholesterol). Nó cũng có tác dụng lợi tiêu,

chống tiểu đường, hạ huyết áp, các hoạt động chống viêm và các tác dụng sinh học khác,
chẳng hạn như phòng ngừa ung thư và bảo vệ gan (He & Giusti, 2010).

Hình 1.1 Hoa bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L.).
Roselle được trồng để lấy thân, lá, đài hoa và hạt giống như tất cả các bộ phận đều
có ứng dụng cơng nghiệp, y học và các ứng dụng khác (Jabeur et al., 2017). Hạt rất giàu

protein và sau khi chiết xuất dầu, chúng được luộc và ăn trong súp và cũng được dùng
thay thế cà phê ở Châu Phi. Ở nhiều nước, lá cũng được tiêu thụ như một loại rau xanh

1

ăn lá (Grajeda-Iglesias et al., 2016). Các lá non và thân mềm của roselle được ăn sống

trong salad hoặc nấu riêng hoặc với thịt hoặc cá, ăn ở dạng xanh hoặc khơ (Neuwinger,
2000). Các đài hoa có giá trị thương mại thích hợp để sản xuất đồ uống, nước trái cây,

mứt và syrup trong ngành công nghiệp thực phâm. Hơn nữa, những đài hoa này là nguồn

cung cấp chất tạo màu thực phâm tự nhiên tốt vì hàm lượng sắc tố cao của chúng (He &
Giusti, 2010).

1.1.2. Đặc điểm
Hoa bụp giấm là một loại cây cỏ sống hàng năm hoặc cây bụi phụ thân gồ, cao đến

2-2.5 m. Lá sâu 3-5 thùy hình bàn tay và dài 8-15 cm, xếp xen kẽ trên thân hình trụ,
nhằn màu đỏ. Các hoa phụ hoặc đầu tận cùng và có đường kính 8-10 cm, màu trắng đến

vàng nhạt với một đốm đỏ sẫm ở gốc mồi cánh hoa, và có một đài hoa mập mạp ở gốc,

rộng 1-2 cm, nở ra 3- 3.5 cm, nhiều thịt và có màu đỏ tươi khi quả chín (Ross, 2003)

(Hình 1.2).

Hình 1.2 Đài hoa bụp giấm tươi
Cây ưa đất tơi xốp, màu mỡ và ẩm ướt. Nó chống lại sương giá đến -22 °C. Bụp
giấm thông thường hầu như khơng xuất hiện ở nơi có điều kiện hoang dã. Nó rất dễ

trồng ở hầu hết các loại đất thoát nước tốt cũng như chịu được đất kém. Từ khi gieo hạt
đến khi trưởng thành, bụp giấm mất khoảng sáu tháng. Cây được trồng vào đầu mùa

mưa vào giữa tháng 4 và thu hoạch để lấy hoa trái, khoảng 3 tuần cho đến khi bắt đầu
ra hoa (Ali et aL, 2005; Dhar et al., 2015).

2


1.1.3. Lọi ích của hoa bụp giấm
Hoa bụp giấm được sử dụng rộng rãi như một loại thuốc. Ổ Án Độ, Châu Phi và
Mexico, các dần xuất lá hoặc đài hoa thường được sử dụng như thuốc lợi tiểu, chống lờ

đờ, hạ sốt, hạ huyết áp và làm giảm độ nhớt của máu (Andersen & Markham, 2005). Ở
Bắc Phi, các chế phâm từ đài hoa dùng đế điều trị đau họng và ho (Neuwinger, 2000).

Các thành phần chính của hoa bụp giấm có liên quan đến tính dược học là acid hữu
cơ, anthocyanin,

polysaccharide và flavonoid

(Pieczykolan

&

Kurek,

2019).

Anthocyanin là nhóm chất dẫn xuất của flavonoid và các sắc tổ tự nhiên có trong hoa

của bụp giấm và màu của anthocyanin thay đôi theo pH. Thành phần chính các

anthocyanin có trong hoa bụp giấm và được sử dụng như chất tạo màu thực phâm là:

delphinidin-3-O-glucoside,

delphinidin-3-O-sambubioside,

cyanidin-3-glucoside,

delphinidin-3-glucoside (Frank, 2005). Ngoài ra, trong đài hoa bụp giấm cịn có ascorbic
acid, cyanidin-3-rutinose (Mahadevan & Kamboj, 2009).

Đài hoa bụp giấm là một nguồn các phân tử có hoạt tính sinh học đầy tiềm năng
với các hoạt tính chổng oxy hóa, hạ huyết áp, chống nhiễm trùng, chống viêm, chống

đái tháo đường và chổng ung thư. Nhiều khảo sát khoa học đã tiết lộ rằng đài hoa bụp

giấm rất giàu polyphenol và flavonoid giúp tăng giá trị hoạt tính sinh học vì các hợp
chất này có tương quan với đặc tính chống oxy hóa của chúng. Hàm lượng phenolic

trong cây chủ yếu là anthocyanin như delphinidin-3-glucoside, sambubioside và

cyanidine-3-sambubioside (Jabeur et al., 2017; Sinela et al., 2017) và các flavonoid khác
như gossypetine hibiscetin và glycoside tương ứng của chúng; acid protocatechuic,

eugenol và sterol như-sitoesterol và ergoesterol (Ali et al., 2005; Hirunpanich et al.,
2006; Mahadevan & Kamboj, 2009). Các phân tử anthocyanin dề bị thối hóa. Độ ổn
định của chúng phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, sự hiện diện của enzyme, ánh sáng và cấu

trúc, sự hiện diện của các flavonoid khác, acid phenolic và kim loại (Idham et al., 2012).
Các nhà nghiên cứu chủ yếu sừ dụng dung môi nước hoặc dung mơi hữu cơ để trích

xuất polyphenol và anthocyanin từ đài hoa bụp giấm. Các kỹ thuật chiết xuất khác nhau
và các giống khác nhau của bụp giấm được sử dụng trong các nghiên cứu khác nhau

Luvonga et al. (2010) đã báo cáo tổng hàm lượng phenolic là 6.06 mg/g trong chiết xuất

bụp giấm (Luvonga et al., 2010). Jabeur và cộng sự (2017) trong nghiên cứu gần đây đã

3


xác định được hàm lượng của delphinedin-3-O-sambubioside, delphinidin 3-0
glucoside và cyanidine-3-O-sambubioside trong bụp giấm lần lượt là 7.03 mg/g, 1.54

mg/g và 4.40 mg/g (Jabeur et al., 2017).

1.1.4. Cấu trúc cua anthocyanin
Anthocyanin

là

O-glycoside

của

anthocyanidin

(là

ion

3,4',5,7

tetrahydroxyflavylium) được liên kết với các nhóm hydroxyl (-OH) và/hoặc nhóm

methoxy (-OCHỉ) ở vị trí C3' (thường là glycosyl hóa và cần nhiệt để ổn định) và C5'

(glycosyl hóa) (Rein, 2005). Anthocyanin là sự kết hợp của anthocyanidin (mang màu)
với những glucoside có gốc đường (glucose, glactose). Các gốc đường có thể được gắn

vào vị trí 3,5,7; thường được gắn vào vị trí 3 và 5 cịn vị trí 7 rất ít. Phân tử anthocyanin

có gốc đường được gắn vào vị trí 3 gọi là monoglycoside, ở vị trí 3 và 5 gọi là

diglycoside. Do đó, các anthocyanin cũng được phân loại theo số lượng các phân tử
đường trong cấu trúc của chúng (ví dụ, monoside, biosides, triosides) (Da-Costa-Rocha

et al„ 2014).

Name

R1

R2

r3

Delphindin

OH

OH

H

Petunidin

OH

H

Malvidin

och3

och3
och3

Cyanidin

OII

II

II

Peonidin

OCII3

II

II

Pelargonidin

H

H

H

Hình 1.3 Cấu trúc của anthocyanin (D. R. Kammerer, 2016).

4

H


Hầu như tất cả trong số hàng nghìn anthocyanin đã biết đều có nguồn gốc từ một

trong sáu cấu trúc anthocyanidin cơ bản (cyanidin, delphinidin, malvidin, pelargonidin,
peonidin và petunidin), chúng chỉ khác nhau về số lượng nhóm hydroxyl ở vịng B,

thường được tìm thấy trong trái cây và rau quả (Castaneda-Ovando, Araceli, et al., 2009)

(Hình 1.3 và 1.4). Trong đó, anthocyanin có dạng gốc cyanidin chiếm khoảng 50%. Đối
với một so anthocyanin có nguồn gốc từ hoa có mức độ glycosyl hóa và sự có mặt hoặc

khơng có các nhóm acyl bổ sung gắn với đường. Dạng đường phô biến là D-glucose

nhưng anthocyanin cũng thường liên kết với L-rhamnose, D-xylose, D-galactose,

arabinose, and fructose cũng như rutinose (6-O-a-L-rhamnosyl-D-ghicose), sophorose

(2- O-P-D-xylosyl-D-glucose), gentiobiose (6-O-p-D-glucosyl-D-glucose), sambubiose
(2-O-P-D-xylosyl-D-glucose), xylosylrutinose và glycosylrutinose (Trouillas et aL,
2016).

Pelargonidin (12%)

Delphinidin (12%)

Hình 1.4 Sáu cấu trúc tự nhiên của anthocyanin và độ phong phú cua chúng (Pervaiz et
al.,2017).

1.2. Tổng quan về đồng sắc tố
1.2.1. Định nghĩa
Đồng sắc tố là một quá trình tự nhiên dựa trên sự tạo phức khơng hóa trị (siêu phân

tử). Thuật ngừ đồng sắc tố thường dành cho anthocyanin vì chúng là nhóm màu sắc tự

5


nhiên có phơ màu rộng và là một nhóm dẫn xuất các chất phenolic lớn trong giới thực
vật (Haslam, 1998). Trong sự phát triển tương lai của ngành công nghiệp thực phâm,

đồng sắc tố được sử dụng nhằm mục định kiêm soát, ổn định màu sắc của chất màu tự
nhiên bang cách bồ sung các chất sắc tố (copigment) (Trouillas et al., 2016).

1.2.2. Phân loại
1.2.2.1. Đồng sắc to nội phân tứ (Intramolecular copigmentation)

Các anthocyanin được acyl hóa với cấu trúc lõi anthocyanidin, dề bị đồng sắc tố

trong phân tử hoặc tự liên kết (đồng phân khơng hóa trị) tùy thuộc vào cấu trúc của từng
anthocyanin. Việc xếp chồng trong phân tử tạo thành cấu trúc kiểu bánh sandwich đòi
hởi sự liên kết chặt chẽ giữa nhóm mang màu anthocyanin và gốc copigment (Dangles

et al., 1993). Hiệu quả của cấu trúc này nhờ vào liên kết cộng hóa trị giữa các chất hoặc
sự xếp chồng của tương tác n - Tt của gốc acyl hoặc liên kết hydro. Quá trình đồng sắc
tố nội phân tử ít phù hợp đê làm thực nghiệm vì chúng cần một trạng thái cân bằng cấu

trúc.

1.2.2.2. Đồng sắc to liên phân tử (Intermolecular copigmentation)
Anthocyanin liên kết với các hợp chất không màu khác chủ yếu bằng liên kết Van

der Waals, tương tác kỵ nước, tương tác ion để tạo nên một cơ chế đặc biệt bảo vệ các
cation flavylium có màu khỏi q trình hydrate hóa (Kammerer, 2016). Các hợp chất

khơng màu cịn được gọi là copigment bao gồm flavonol, alkaloid, acid amin, phenolic,
kim loại. Tỉ lệ giữa chất màu và copigment cao rất thuận lợi cho việc tăng và thay đổi

biểu hiện màu sẳc của anthocyanin trong mơi trường nước có tính acid thấp (Cavalcanti
et al., 2011). Hiện tượng đồng sắc tố ảnh hưởng đến bước sóng hấp thụ cực đại (Àmax)
làm màu sắc bị thay đôi nhiều hơn (bathochromic effect) hoặc tăng cường độ màu
(hyperchromic effect) của dung dịch anthocyanin (Brouillard et al., 2010).

1.2.2.3. Tự liên kết (self-association)

Sự tự liên kết của các cation flavylium được tăng cường khi số lượng nhóm

hydroxyl và metoxyl ở vòng B tăng lên. Sự tự liên kết này cũng bảo vệ cation flavylium
như đồng sắc tố và hỗ trợ sự chuyển đổi thành các base quinonoid (Leydet et al., 2012).

Tuy nhiên, sự tự liên kết này bị cản trở bởi lực đẩy tĩnh điện. Điều đáng chú ý là sự tự

6


liên kết sè cạnh tranh với sự đồng sắc tố giữa các phân tử. Khi trường hợp đó xảy ra,

quá trình chiếm ưu thế sẽ được xác định bởi nồng độ tương đối của chất màu và
copigment (T Escribano-Bailon & Santos-Buelga, 2012).

1.2.3. Yeu tố ảnh hưởng đến sự phát triển màu sắc và độ ổn định của anthocyanin
Màu sắc của anthocyanin được xác định bởi dạng thay thế vòng B aglycone bằng
nonacyl hóa và monoacyl hóa. Sự gia tăng số lượng các nhóm hydroxyl (pelargonidin

-> cyaniding -ỳ delphinidin) gây ra sự thay đôi màu sac (bathochromic effect), dịch

màu sẽ chuyển sang màu xanh hơn trong khi đó, sự giảm methyl hóa (cyanidin
peonidin -> malvidin) dẫn đen sự thay đơi cường độ màu sắc (hyperchromic effect) của

anthocyanin, giảm dần sắc độ đỏ của dịch màu (Dietmar R Kammerer et al., 2007).
Stintzing và cộng sự (2002) đã nghiên cứu quá trình tăng hiệu ứng sac tố của
anthocyanin với họp chất tạo đồng sac to (acid cinnamic). Việc acyl hóa với acid

cinnamic gây ra sự thay đơi màu sắc của dung dịch, có thể quan sát thấy màu xanh; tuy

nhiên, loại gốc acyl hóa được gắn vào saccharide cũng có liên quan đến sự phát triển
màu sắc và quang pho (Stintzing et aL, 2002). Trong nghiên cứu của Giusti và cộng sự
(1999) về quá trình đồng sắc tố của dịch chiết methanol chứa glycoside pelargonidin kết
họp với anthocyanin ở pH 1.0 cho thấy rằng cường độ màu sắc tăng trong khi đó giá trị

màu sac (hue) lại thấp hơn so với dung dịch nước. Ảnh hưởng này phụ thuộc vào mức
độ acyl hóa và nồng độ anthocyanin (Giusti et al., 1999). Các báo cáo về cường độ màu
sắc của anthocyanin cho thấy rằng đặc điểm màu sắc và quang phổ của anthocyanin là

sự tương tác của cấu trúc họp chất, nồng độ, giá trị pH, nhiệt độ, ion kim loại, loại dung

môi và các chất sắc tố.

7


Chương 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.1. NGUYÊN LIỆU
Hoa bụp giấm khô được mua từ Công ty Việt Hibiscus (Tp. Hồ Chí Minh, Việt

Nam). Bụp giấm được trồng ở Biên Hịa (Đồng Nai). Sau khi thu hoạch, hoa bụp giấm

tươi được sấy đối lưu bằng khơng khí nóng ở nhiệt độ 60 °C. Sản phẩm khô được bảo
quản trong túi polyethylene ở nơi khơ ráo, thống mát, tránh ánh nắng trực tiếp.

Hình 2.1 Ngun liệu hoa bụp giấm khơ (Cơng ty Việt Hibiscus).

2.2. DỤNG CỤ - THIÉT BỊ - HÓA CHÁT
2.2.1. Dụng cụ

Cốc thuỷ tinh

Giá ống nghiệm

pH kế

Pipet

Erlen

Bình định mức

Nhiệt kế

Ĩng nghiệm

Bình định mức

Ĩng ly tâm

Cốc thuỷ tinh

Phễu

Micropipet

Đũa thuỷ tinh

2.2.2. Thiết bị

8


Hình 2.2 Cân kỹ thuật 2 số lẻ PA2102

Hình 2.3 Máy đo pH để bàn MI 150

(Ohaus Corporation, New Jersey, USA).

(Milwaukee Instruments, Romania).

Hình 2.4 Máy lắc vortex kỹ thuật số

Hình 2.5 Khúc xạ kế đo độ ngọt Master-

ZX4 (Velp Scientifica, Usmate, Italia)

53M (Atago, Nhật Bản).

Hình 2.6 Máy quang phổ UV/VIS-9000S

Hình 2.7 Be điều nhiệt WB-22 (DaiHan

(Metash, Thượng Hải, Trung Quốc).

Scientific, Hàn Quốc).

9

2.2.3. Hóa chất
2,2- diphenyl-l-picrylhydrazyl (DPPH): cân 0.024g DPPH (99%, Sigma-Aldrich)
và định mức lên 100 mL bang methanol và bảo quản lạnh ở 4 °C trong 24 h.

2,4, 6-Tris(2-pyridyl)-s-triazine (TPTZ) 0.01 M: cân 0.078g TPTZ (99%, Sigma-

Aldrich) và định mức lên 25 mL bằng HC1 0.04 M.

6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2- carboxylic acid (Trolox) (99%, SigmaAldrich), quercetin (95%, Sigma-Aldrich), rutin (Sigma-Aldrich)
Sắt (III) chloride hexahydrate (FeCl3.6H2O) 0.02 M: cân 0.541g FeCl3.6H2O (97%,

Xilong, Trung Quốc) hòa tan trong 100 mL nước cat.
Natri acetate (CH3COONa) 0.3 M: cân 3.1 g CH3COONa (> 99%, Xilong, Trung

Quốc) và định mức lên 100 mL bằng nước cất.

Dung dịch acid hydrochloric (HC1) 0.01%: rút 1.68 mL dung dịch HC1 đậm đặc
(37%, Xilong, Trung Quốc) và định mức lên 500 mL bằng nước cất.
Methanol (CH3OH) (99.7%, Xilong, Trung Quốc), acid acetic (99%, Xilong,
Trung Quốc), nước cất (Việt Nam) đều đạt chuẩn phân tích.

2.3. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIẺM NGHIÊN cứu
2.3.1. Thời gian nghiên cứu
Từ ngày 05/7/2021 đến ngày 5/10/2021.

2.3.2. Địa điếm nghiên cứu
Phòng thí nghiệm Hóa đại cương 2, Khoa Kỳ thuật Thực phẩm và Môi trường,
Trường Đại học Nguyền Tất Thành, 331 Quốc lộ 1A, Phường An Phú Đông, Quận 12,

Thành phố Hồ Chí Minh.

2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.4.1. Quy trình thu nhận dịch chiết bụp giấm
25 g mầu bụp giấm khô được xay nhuyễn bằng máy xay thương mại (model BJYCB2L60-A, Berjaya Steel Product Sdn Bhd, Kuala Lumpur, Malaysia) và được trích ly

tại nhiệt độ 55 °C trong 30 phút bằng 100 mL nước cất. Sau khi trích ly, dịch trích được

10


thu nhận bằng cách lọc qua giấy lọc Whatman No.2 để thu nhận dịch chiết bụp giấm
thơ.

2.4.2. Quy trình tinh sạch dịch bụp giấm
Dịch chiết bụp giấm thô được tinh sạch bằng cách sử dụng cột chiết pha rắn SPE

C18 (Sigurdson & Giusti, 2014). Mầu được nạp vào cột C18 sau khi lọc qua màng PVDF
0.45 pm. Sau đó, cột được rửa lần 1 với dung dịch HC1 0.01% để loại bỏ đường và acid
hữu cơ roi được rửa lần 2 với ethyl acetate để loại bỏ phenolic. Cuối cùng, dung dịch

chứa anthocyanin được thu nhận bằng cách sử dụng methanol được acid hóa bang HC1

0.01%. Cuối cùng, dịch anthocyanin được cô đặc bằng thiết bị cô quay chân không Hei-

VAP Value (Heidolph Instruments, Schwabach, Đức) ở nhiệt độ 40 °C trong 30 phút để
loại bỏ dung môi methanol và được phân tích để xác định hàm lượng anthocyanin.

2.4.3. Quy trình tạo đồng sắc tố với flavonol
Dịch anthocyanin bụp giấm được pha loãng về hai nồng độ khảo sát là 0.05 và

0.10 mM bằng đệm acetate 0.2 M (pH 3.0) và được phối trộn với dung dịch quercetin
và rutin theo tỉ lệ mol [ACN]:[flavonol] ở giá trị 1:1, 1:10, 1:20 và 1:50. Dịch

anthocyanin gốc (1:0) và dịch flavonol gốc (0:1) được sử dụng làm mẫu đối chứng. Sau

30 phút phản ứng trong điều kiện tối ở nhiệt độ thường, hồn hợp phản ứng được phân
tích để xác định hoạt tính khử gốc tự do DPPH, hoạt tính khử sat FRAP và phổ hấp thu

trong vùng 400-700 nm.

2.5. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
2.5.1. Hiệu ứng bathochromic và hyperchromic
Hiệu ứng đồng sắc tố bao gồm hiệu ứng bathochromic và hyperchromic được tính
tốn dựa trên dừ liệu và phố hấp thu của hồn hợp phản ứng (Kanha et al., 2019). Hiệu

ứng bathochromic (%) được tính tốn theo cơng thức: (Ầ - Ầo)/Ào x 100; với Ào và À là
bước sóng hấp thu cực đại của dịch chất màu khi khơng có và có bổ sung copigment.

Hiệu ứng hyperchromic (%) được tính tốn theo cơng thức: (A - Ao)/Ao X 100; với Ao
và A là độ hấp thu ở bước sóng cực đại của dịch chất màu khi khơng có và có bổ sung

copigment.

11


2.5.2. Hiệu ứng hiệp lực về khả năng chống oxy hóa
Hiệu ứng hiệp lực (SE, %) về khả năng chống oxy hóa được tính tốn dựa trên %
chênh lệch hoạt tính chống oxy hóa của hồn hợp đồng sắc tố giữa ACN và flavonol so
với tổng hoạt tính của ACN và flavonol khi ở dạng dung dịch đon lẻ và được tính theo

cơng thức: (AAc - AAo)/AAo X 100; với AAc và AAo là hoạt tính thực tế của hồn hợp

đồng sắc tố và hoạt tính tính tốn trên lý thuyết của các dung dịch đơn lẻ.

2.5.3. Khả năng khử gốc tự do DPPH
Hoạt tính khử gốc tự do DPPH được thực hiện theo phương pháp được mô tả bởi
Brand-Williams và cộng sự (1995) với một số sửa đổi (Brand-Williams et al., 1995). Để

chuẩn bị thuốc thử DPPH, 0.024 g DPPH được hòa tan trong 100 mL methanol và được
bảo quản lạnh ở 4 °C trong 24 h. Thuốc thử làm việc được chuẩn bị bằng cách trộn dung
dịch DPPH gốc với methanol để độ hấp thu của hồn hợp đạt 1.10 ± 0.02 ở bước sóng

515 nm bằng máy quang phổ UV-Vis. Để xác định hoạt tính khử gốc tự do DPPH, 2.85

mL thuốc thử DPPH đã hiệu chỉnh được cho vào 0.15 mL dịch mẫu pha loãng. Hồn hợp
phản ứng được ủ 30 phút trong bóng tối và được đo độ hấp thu ở bước sóng 515 nm

bằng máy quang phổ UV-Vis. Methanol được sử dụng làm mầu để đoi chứng. Giá trị %
ức chế gốc tự do DPPH được tính theo cơng thức: % ức chế = (1 - Abs mầu/Abs đối
chứng)xioo. Hoạt tính chống oxy hóa DPPH được tính tốn dựa vào đường chuẩn

Trolox-% ức chế và được biếu diễn bằng đơn vị mg đương lượng Trolox/L (mg TE/L).

2.5.4. Khả năng khử sắt FRAP
Khả năng khừ sat FRAP được thực hiện theo phương pháp được mô tả bởi Benzie
và Strain (1996) với một số sửa đổi (Benzie & Strain, 1996). Đe chuẩn bị thuốc thử,

dung dịch đệm acetate (0.3 M, pH 3.6), TPTZ (10 mM pha trong HC1 40 mM) và dung
dịch EeCh.óHíO (20 mM) được phổi trộn theo tỉ lệ 10:1:1 về thể tích. Để xác định hoạt

tính khử sat FRAP, 2.85 mL thuốc thừ FRAP được cho vào 0.15 mL dịch mầu pha loãng.

Hồn hợp phản ứng được ủ 30 phút trong bóng tối và được đo độ hấp thu ở bước sóng
593 nm bằng máy quang phổ UV-Vis. Nước cất được sử dụng làm mẫu để đối chứng.
Khả năng khử sat FRAP được tính tốn dựa vào đường chuẩn Trolox và được biểu diễn

bằng đơn vị mg đương lượng Trolox/L (mg TE/L).

12


2.6. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SÓ LIỆU
Dừ liệu thực nghiệm được phân tích bằng phần mềm SPSS 15 (SPSS Inc. Chicago,
U.S.A) sử dụng những kỳ thuật thống kê cơ bản. Phân tích phương sai một nhân to (one­

way ANOVA) được áp dụng để xác định sự khác nhau giữa các chế độ xử lý mẫu và
Tukey’s Multiple Range test được áp dụng để xác định sự khác biệt có ý nghĩa giữa các

giá trị trung bình ở mức ý nghĩa 5%. Tất cả thí nghiệm và những chỉ tiêu phân tích được
lặp lại 3 lần.

13


Chương 3. KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. ẢNH HƯỞNG CỦA [ACN]: [FLAVONOL] LÊN HOẠT TÍNH KHỬGĨC Tự

DO DPPH

Anthocyanin và các dần xuất của chúng từ hoa bụp giấm là những sắc tố tạo nên

màu đỏ, flavonol đã được chứng minh góp phần ổn định màu sắc lâu dài cho anthocyanin
qua tương tác đồng sắc tố (Eiro & Heinonen, 2002). Tương tác giừa anthocyanin và các
chat flavonol khơng màu (hay cịn gọi là copigment) được thực hiện bang liên kết không

cộng hóa trị, nhờ vào sự liên kết yếu này mà màu sắc của anthocyanin được cải thiện và
ổn định rất hiệu quả (Boulton, 2001). Mặt khác, anthocyanin có tính chống oxy hóa cao;
do đó, việc đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của hồn hợp đồng sắc tố được thực hiện.

8 0.05 mM no.lOmM
Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ nồng độ mol [ACN]:[flavonol| iên hoạt tính khử gốc tự do
DPPH của dịch chất màu bụp giấm tại [ACN] = 0.05 và 0.10 mM.

Hình 3.1 thể hiện sự ảnh hưởng của tỉ lệ nồng độ mol giữa ACN và copigment
(rutin, quercetin) và nồng độ ACN lên hoạt tính chống oxy hóa của anthocyanin từ hoa

bụp giấm được đánh giá qua phương pháp DPPH. Ket quả cho thấy rằng nồng độ mol
[ACN]: [copigment] ảnh hưởng đáng kể lên hoạt tính chống oxy hóa. Khi đồng sắc tố

anthocyanin với quercetin ở các tỉ lệ mol khác nhau, hoạt tính DPPH có xu hướng tăng

14


đều từ 1:1 đến 1:20, đến 1:50 thì tăng mạnh. Cụ thể, ở nồng độ mol 1:50 có giá trị
1233.83 mg TE/L gấp khoảng 2.1 lần so với hoạt tính DPPH ở nồng độ mol 1:1 có giá

trị 588.84 mg TE/L tại [ACN] = 0.1 mM. Tưong tự, đối với rutin khi đồng sắc tổ với

anthocyanin từ hoa bụp giấm, hoạt tính chống oxy hóa khơng đáng kể. Ở các tỉ lệ mol

khác nhau từ 1:10 đến 1:50 có xu hướng tăng đều.

Nồng độ anthocyanin cũng thể hiện sự ảnh hưởng lên hoạt tính chổng oxy hóa
DPPH. Hình 3.1 thể hiện nồng độ anthocyanin 0.10 mM khi đồng sắc tố với quercetin
có hoạt tính gấp đơi nồng độ anthocyanin 0.05 mM. Ngược lại, khi rutin đồng sắc tố với
anthocyanin ở nồng độ 0.10 mM lại khá tương đồng với anthocyanin có nồng độ 0.05

mM, tuy nhiên ở tỉ lệ nồng độ mol [ACN]:[rutin] 1:50 tại nồng độ 0.10 mM tăng mạnh,
có giá trị 929.41 mg TE/L gấp khoảng 1.5 lần so với cùng tỉ lệ nồng độ mol tại nồng độ

0.05 mM (613.18 mg TE/L) (p < 0.05). So sánh tại tỉ lệ nồng độ mol 1:50 của hai hợp
chat rutin và quercetin ở cả hai nồng độ ACN 0.05 mM và 0.10 mM có thể nhận thấy

rang quercetin có khả năng khử các gốc tự do cao hơn rutin.

Việc bô sung copigment vào dịch màu anthocyanin làm tăng khả năng chống oxy
hóa của dịch chất màu từ bụp giấm. Các nghiên cứu đồng sắc tố giữa các phân tử được
thực hiện ở nồng độ 1 X 10'4 M để giảm thiểu hiện tượng tự liên kết giữa các phân tử
(Teixeira et al., 2013). Với mục đích tương tự, nghiên cứu này thực hiện ở nồng độ

anthocyanin 1 X 104 và 5 X 10'5 M. Ớ vị trí C3-OH tại vịng B của cấu trúc anthocyanin,
các glycoside đóng vai trị là copigment sẽ tạo phức đồng sắc tố kém ben (Oszmiahski
et al., 2004), theo cơ chế này, rutin có cấu trúc cản không gian nên khi liên kết với

anthocyanin ở vị trí C3-OH tạo phức kém bền dần đến hoạt tính chống oxy hóa thấp.

Bên cạnh đó, quercetin là một alglycone và Heim và cộng sự (2002) báo cáo rằng các
aglycone thường chống oxy hóa mạnh hơn các glycoside tương ứng (Heim et al., 2002).

Ket quả này tương tự với kết quả trong nghiên cứu của lacopini và cộng sự (2008)

về ảnh hưởng của catechin, epicatechin có trong hạt nho và quercetin, rutin và resvatrol

trong vỏ nho lên hoạt tính chống oxy hóa. Từ kết quả thực nghiệm, tác giả đã kết luận
rang catechin và epicatehin có khả năng khử gốc tự do yếu hơn quercetin và tương tự,

rutin có khả năng chống oxy hóa thấp hơn quercetin (lacopini et al., 2008). Tác giả
Hernandez-Herrero và cộng sự (2015) nghiên cứu ảnh hưởng của rutin khi được đồng

15