Nghiên cứu xác định phương thức phối trộn bột và đánh giá ảnh hưởng của vi tảo Haematococcus pluvialis vào trong thức ăn nuôi cá lên sinh trưởng của cá Koi tại Tp. Hồ Chí Minh

ĐẠI HOC
NGUYỄN TÁT THÀNH
NGUYEN TAT THANH

THỤC HỌC - THỤC HÀNH - THỤC DANH - THỤC NGHIỆP

KHOA CỒNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH PHƯƠNG THỨC
PHỐI TRỘN BỘT VÀ ĐẲNH giá ảnh hưởng
CỦA VI TẢÒ HÀEMATOCOCCVSPLVV1ALISNẢữ
TRONG THỨC ĂN NI CÁ LÊN SINH TRƯỞNG
CỦA CÁ KOI TẠI TP. HỊ CHÍ MINH

Sinh viên thực hiện : Nguyễn Hồng Tâm
MSSV

: 1511535940

GVHD

: ThS. Ông Bỉnh Nguyên

TP. HCM, 2020


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN................................................................................................................ i

MỤC LỤC..................................................................................................................... ii
TÓM TẮT.................................................................................................................... iv

SUMMARY................................................................................................................... V
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH.................................................................................. vi
DANH MỤC BẢNG BIẾU........................................................................................ vii
DANH MỤC CHŨ’ VIẾT TẮT................................................................................. viii

ĐẶT VẤN ĐÈ............................................................................................................... ix
CHƯƠNG 1. TÓNG QUAN TÀI LIỆU...................................................................... 1

1.1 Vi tảo H. pluivalìs................................................................................................... 1
1.1.1 Sự phân bố của H. pỉuvialis.................................................................................. 1

1.1.2 Hình thái tế bào và vịng đời................................................................................ 1
1.1.3 Thành phần sinh hố học của vi tảo..................................................................... 3
1.2 Astaxanthin............................................................................................................. 5

1.2.1 Tổng quan về Astaxanthin.................................................................................... 5
1.2.2 Nguồn gốc Astaxanthin trong vi tảo.................................................................... 6

1.2.3 ủng dụng của Astaxanthin trong thủy sản........................................................... 7
1.3 Tong quan về Cá Koi.............................................................................................. 8
1.4 Tình hình nghiên cứu về ứng dụng vi tảo H. pluvỉalis trong ni trồng thủy sản ..10

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước...................................................................... 10

1.4.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước......................................................................11
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu.......................... 13

2.1 Nơi thực hiện....................................................................................................... 13
2.2 Nội dung nghiên cứu........................................................................................... 13

ii


2.3 Phương pháp nghiên cứu....................................................................................... 14

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................. 17
3.1 Ket quả phân tích giá trị dinh dưỡng trong bột vi tảo H.pluvialis đã bị li trích
astaxanthin.....................................................................................................................17
3.2 Ket quả nghiên cứu phối trộn bột vi tảo H. pluvialis đã li trích astaxanthin vào

trong thức ăn cho cá.......................................................................................................19

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ........................................................................................ 30

TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 32
PHỤ LỤC.................................................................................................................... 35

iii


TÓM TẤT
Đe tài: “Nghiên cứu xác định phương thức phối trộn bột và đánh giá ảnh

hưởng ciia vỉ tảo Heantatococcus pluvialis vào trong thức ăn nuôi cá lên sinh

trưởng của cá Koi tại TP Hồ Chí Minh” được thực hiện từ tháng 5/2020 đen tháng
9/2020 tại phịng thí nghiệm Cơng Nghệ Sinh Học - Viên Khoa học Kỳ thuật Công

nghệ cao Nguyễn Tất Thành - Trường Đại học Nguyễn Tất Thành. 298 Nguyễn Tất
Thành, phường 13, Quận 4, Tp Hồ Chí Minh, Với 3 mục tiêu: Xác định giá trị dinh

dưỡng trong bột vi tảo H. pluvialis đã bị li trích astaxanthin, xác định được phương

thức phối trộn bột vi tảo H. pluvialis vào thức ăn cho cá và xác định ảnh hưởng cùa
thức ăn bổ sung bột vi tảo lên sinh trưởng và màu sắc cá. Ket quả đạt được:

1. Thành phần dinh dưỡng của bã tảo H.pluvialis chứa: 35,5 % protein, 14,9 %
béo, 36,8 % glucide, 4,48 % xơ thô.

2. Phương pháp xử lý bã vi tảo bằng NaOH O,1M cho kết quả cao nhất (0,3110
pg/ml) so với các phương pháp còn lại (PPI: HC1 0,lM 0,4059 pg/ml, pp 3:

Hấp ở 121 °C trong dung môi nước 0,1791 pg/ml, pp 4: Hấp 121 °C trong

dung môi dầu 0,3578 pg/ml).
3. Thức ăn phối trộn trong nghiên cứu của chúng tôi đạt được độ bền trong nước
vào khoảng 5 giờ, trong q trình sấy và phối trộn ảnh hưởng khơng đáng kể
đen lượng astaxanthin cho vào ban đầu.
Ket quả thử nghiệm trên cá KOI cho thấy nhóm TNI, TN2, TN3 và thức ăn có

sằn trên thị trường đều có tác dụng tương tự nhau lên màu sắc của cá.

IV


SUMMARY
Subject: "Research to determine the method of mixing powder and evaluate the

effect of microalgae Heamatococcus pluvialis on fish feed on growth and aesthetic
value of koi fish in Ho Chi Minh City " was conducted from May 2020 to September

2020 at Biotechnology Laboratory - Nguyen Tat Thanh High-Tech Science and

Technology Laboratory - Nguyen Tat Thanh University. 298 Nguyen Tat Thanh, Ward
13, District 4, Ho Chi Minh City, With 3 goals: Determining the nutritional value in

astaxanthin microalgae powder H. pluvialis, and determining the method of mixing
microalgae powder H. pluvialis to fish feed and determined the effect of microalgae

fortified food on fish growth and color. Result:

1. The nutritional composition of H.pluvialis residue contains: 35.5 % protein,
14.9 % fat, 36.8 % glucide, 4.48 % crude fiber.
2. The method of treating microalgae with 0.1M NaOH gave the highest result
(0.3110 pg/ml) compared with the other methods (PPI: 0.1M HC1 0.4059 pg/ml, pp 3:

Autoclave at 121 °C in 0.1791 pg/ml aq in water solvent, pp 4: 121 °C in oil solvent

0.3578 pg/ml).

3. The blended feed in our study was stable in water at about 5 hours, during
drying and mixing had a negligible effect on the initial amount of astaxanthin.

The experimental results on KOI fish showed that groups TNI, TN2, TN3 and
food available on the market have similar effects on fish color.

V

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Hình chụp qua kính hiển vi quang học hình thái tế bào H. pluviaỉis............. 2
Hình 1.2 Vịng đời của H.pluvialis 10........................................................................... 3

Hình 1.3 Con đường sinh tổng họp astaxanthin trong vi tảo H.pluvialỉs25................. 7
Hình 1.4 Cá chép koi..................................................................................................... 9
Hình 1.5 Các loại cá Koi được ni tại Việt Nam........................................................ 10
Hình 2.1 Bảng so màu để đánh giá màu sắc ở cá 34...................................................... 16
Hình 3.1 Biểu đồ hàm lượng astaxanthin thu được ở các phưong pháp khác nhau... 23
Hình 3.2 Hàm lượng astaxanthin có trong thức ăn sau khi phối trộn......................... 25
Hình 3.3 Thức ăn ngâm trong nước............................................................................. 27
Hình 3.4 Cá chép KOI trước khi và sau khi nuôi 14 ngày.......................................... 30

vi


DANH MỤC BẢNG BIÉU
Bảng 1.1 Thành phần chính trong vi tảo H. pluvialis ở cả hai giai đoạn sinh trưởng
khác nhau 14

..............................................................................................................4

Bảng 1.2 Cấu trúc của astaxanthin và các đồng phân hình học..................................... 5
Bảng 3.1 Hàm lượng protein, glucide và chất béo có trong bã tảo............................... 17
Bảng 3.2 Sử dụng các phương pháp phá vỡ vách tế bào vi tảo đe giải phóng chất dinh

dường trong tế bào........................................................................................................ 19
Bảng 3.3 Thành phần dinh dưỡng cùa thức ăn thử nghiệm......................................... 24

Bảng 3.4 Thời gian rà cùa thức ăn thử nghiệm............................................................ 25
Bảng 3.5 Khối lượng, chiều dài và màu sắc của cá Koi.............................................. 27

vii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẤT
DWG:

Daily Weight gain (tốc độ tăng trưởng khối lượng bình quân/ngày)

Đ/C:

Đối Chứng

H. pluvialis:

Haematococcus pluviaỉis

ISO:

International Organization for Standardization

NT:

Nghiệm Thức

OD:

Optical Density

PP:

Phưong Pháp

PH:

Potential of Hydrogen

SGR:

Specific Growth Rate (Tốc độ tăng trưởng đặc biệt)

TACS:

Thức Àn Có sẵn INVE

TCVN:

Tiêu Chuân Việt Nam

viii


ĐẶT VÁN ĐÈ
1. Tính cấp thiết của đề tài

Cá chép Koi là một trong những chủng loại cá cảnh được nhiều người u thích,
có tên khoa học là Cyprinus carpio, đã được thuần hóa và lai tạo với mục đích làm

cảnh trong những hồ nhỏ, chúng được nuôi pho biến tại Nhật Bản. Trong văn hóa nhật
bản, cá chép Koi được xem là biểu tượng của sự may mắn, giá trị cùa cá Koi từ 200
triệu hay lên đen hàng tỷ đồng đều phụ thuộc vào hình dáng và màu sắc của cá. Tuy

nhiên, như hầu hết các loài cá cảnh khác, khi được nuôi dường ở điều kiện nhân tạo,

màu sắc của cá trở nên nhợt nhạt. Màu sắc của cá nó được quyết định bởi các
carotenoid (Sefc, 2014), cá khơng thể tự tổng hợp được carotenoid, do đó chúng lấy
chù yếu trong khẩu phần ăn. Vì vậy để cá duy trì được màu rực rỡ, chúng ta cần phải
bổ sung vào khấu phần ăn của chúng một lượng carotenoid thích họp. Trong ni

trồng thủy sản, loại carotenoid thường được sử dụng nhất là astaxanthin, vì ngồi việc

cung cấp sắc tố, tạo màu sắc đẹp cho tôm, cá..., astaxanthin cịn có chức năng tăng
cường bảo vệ cơ thể, chống lại sự oxi hóa, tăng cường hệ miễn dịch, sức đề kháng cùa
tơm, cá.

Trong các lồi vi tảo nước ngọt, H. pluvialis có khả năng tích lũy hàm lượng
astaxanthin đạt đến 2 - 7 % sinh khối khô. Astaxanthin từ tảo H. pluvialis đã được
chứng minh là an toàn và hiệu quả cho màu sắc thịt của cá, có tác dụng tăng cường

màu sắc thịt, tăng cường hệ thống chống ôxy hóa, tăng chất lượng trứng cá, giúp tăng

trưởng tốt hơn và tăng tỷ lệ sống sót của cá.
Tại Việt Nam, Mơ hình ni cấy vi tảo H. pluvialis trên hệ thống Twin-layer porous

substrate photobioreactor đă nghiên cứu thành công, hàm lượng astaxanthin thu được
đạt hơn 3 % sinh khối khô. Mặc khác trên thị trường thức ăn cho cá cảnh ờ Việt Nam,

tuy rất đa dạng và nhiều chủng loại nhưng hầu hết điều là sản phẩm nhập khẩu, với giá

thành đắc đỏ, chất lượng khơng được kiểm sốt chặc chẽ. Do đó, toi quyết định chọn

đềi tài “Nghiên cứu xác định phương thức phối trộn bột và đánh giá ảnh hưởng
của vi tảo Heamatococcus pluvialìs vào trong thức ăn nuôi cá lên sinh trưởng của

cá Koi tại TP Hồ Chí Minh”.

IX


2. Mục tiêu ciia đề tài
- Xác định giá trị dinh dưỡng trong bột vi tảo H. pluvialis đă bị li trích astaxanthin;
- Xác định được phưong thức phối trộn bột vi tảo H. pluvialỉs vào thức ăn cho cá;
- Xác định ảnh hưởng cùa thức ăn bổ sung bột vi tảo lên sinh trưởng và màu sắc cá.

X


Chương 1. Tổng quan tài liệu

CHƯƠNG 1. TÓNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Vi tảo H. pluivalis

1.1.1 Sự phân bố của H. pluvialis
Vi tảo lục đơn bào hai roi nước ngọt Haematococcus pluvialis thuộc ngành Tảo

lục

(Chlorophyta),

lóp

Chlorophyceae,

bộ

Chlamydotnonadaỉes,

họ

Heamatococcaceae, chi Haematococcus 1.

Haematococcus pluvialis phân bố rộng rãi trong nhiều mơi trường song trên tồn
thế giới, từ nhũng vũng nước ngọt tạm thời tự nhiên và nhân tạo như nước mưa hay hồ
bơi; ao cá nước ngọt ở Bihor, Romania 2, lưu vực nước ngọt trong tuyết tan chảy trên
đảo Blomstrandhalvoya, Na Uy 3, nước lợ trên những tảng đá trên bờ biển 4, đài phun
nước khơ Blagoevgrad, Bulgaria 5, tầng mái của tồ nhà Kiost ở Seoul, Hàn Quốc 6.

H.pluvỉalis có the tồn tại ở điều kiện nhiệt độ, ánh sáng hay nồng độ muối khắc
nghiệt mà hầu như các lồi vi tảo khác khơng sống được, đó là nhờ vào khả năng hình
thành bào nang (màng dầy bao bọc tế bào) và có khả năng nảy mầm trở lại khi điều

kiện thuận lợi, do đó chúng thành một lồi chiếm ưu thế 7.
1.1.2 Hình thái tế bào và vòng đời
Haematococcus pỉuviaỉis cỏ hai dạng hình thái tế bào chính: Te bào sinh dưỡng
(Hình 1.5A) và nang bào tử (Hình 1.1 B-D). Trong đó, tế bào sinh dưỡng là các tế bào

có màu lục, hình elip với đường kính khoảng 10-20 pm. Te bào được bao quanh bởi
thành tế bào và có the di chuyển nhờ hai roi. Dưới điều kiện thuận lợi, phần lớn tế bào

ở dạng sinh dường, các tế bào này có hàm lượng chlorophyll a, b và tiền carotenoid,
đặc biệt là p-carotene và lutein cao. Khi điều kiện sống không thuận lợi (stress) như
thiếu dinh dưỡng (thiếu nitơ, photpho ...), cường độ ánh sáng hay hàm lượng muối

cao,...tế bào sẽ chuyển sang dạng nang bào tử, có hình cầu, bắt đầu tích luỳ
astaxanthin (Hình 1.1C). Chúng mất đi roi và khơng còn khả năng di chuyến, thành tế

bào dầy lên, đường kính của tế bào tăng lên đột ngột lên 40-50 pm. Các tế bào dạng

nang bào tử trưởng thành (Hình 1.1D) chứa astaxanthin chiếm khoảng tối đa 5% sinh
khối khô 8.

1


Chương 1. Tổng quan tài liệu

Hình 1.1 Hình chụp qua kính hiến vi quang học hình thái tế bào H. pỉuvỉaỉis
(A) Giai đoạn tế bào sinh dưỡng; (B), (C), (D) Giai đoạn nang bào tử

Kích thước thước: 10 pm9

Vịng đời của H.pluvialis khá phức tạp, được chia làm bốn giai đoạn như sau:
Một, giai đoạn tế bào sinh dưỡng: Giai đoạn này, tế bào ở dạng sinh dưỡng có
hình cầu, elip hay hình quả lê, chuyển động bằng hai roi, tế bào có thể phân chia thành

từ hai đen ba mươi hai te bào bằng hình thức giảm phân '°. Các te bào này chứa hàm
lượng chlorophyll và protein cao nhưng hàm lượng carotenoid lại thấp (hình 1.1A).

Hai, giai đoạn tạo bào nang non (encyst): ở giai đoạn này, các tế bào sinh dưỡng

mất roi và tăng kích thước, chuyển sang dạng tế bào nang non có màu nâu, hình cầu.

Trong suốt giai đoạn nang bào, hàm lượng chlorophyll và protein giảm đi, trong khi

mức độ sinh tống hợp carotenoid và protein tăng lên 11 (hình 1.1B).
Ba, giai đoạn tế bào cyst hoàn chỉnh: ở giai đoạn này, tế bào cyst đã hồn chỉnh,
bất động, tích lũy hàm lượng carotenoid cao nhất. Trong suốt giai đoạn chín này, q
trình tống họp carotenoid, chlorophyll và protein chậm lại (hình 1.1C).

Bốn, giai đoạn nảy mầm: ơ giai đoạn này xảy ra sự tống hợp chlorophyll và
protein, xuất hiện sự phân giải carotenoid. Có 2 cách thức nảy mầm ở vi tảo
H.pluvialis đã được quan sát: (1) nảy mầm trực tiếp từ một nang bào tử hình cầu,

khơng di động thành một te bào sinh dường hình elip, có hai roi; (2) nảy mầm gián
tiếp thông qua pamella (cụm tế bào được bao bọc bởi một lớp màng). Khi đó màng

bao bọc pamella bị vỡ, từ một tế bào nang tạo ra 8 tế bào sinh dưỡng (hình 1.2D). Sinh

sản hữu tính hiếm thấy, nảy mầm là hình thức sinh sản chủ yếu 12.

2


Chương 1. Tổng quan tài liệu

Hình 1.2 Vịng đời của H.pluvialỉs 10

(A) giai đoạn tế bào sinh dưỡng;
(B) giai đoạn tạo bào nang non (encyst);
(C) giai đoạn tế bào cyst hồn chỉnh;

(D) giai đoạn nảy mầm
1.1.3 Thành phần sinh hố học của vi tảo
H.pỉuvialis ờ giai đoạn sinh dường có hàm lượng protein rất cao, dao động từ 29

- 45 % sinh khối khô, hàm lượng này giảm xuống 17-25 % khi tảo chuyển trạng thái

tế bào sang giai đoạn nang bào tử. Hàm lượng carbohydrate chiếm khoảng 15 - 17 %

sinh khối khô ở giai đoạn sinh dưỡng và tăng lên 36 - 40 % khi tảo ở giai đoạn nang
bào tử. Tương tự, hàm lượng lipid cũng có xu hướng tăng ở giai đoạn nang bào tử

(chiếm 32 - 37 % sinh khối khô), hàm lượng này cao gấp 1,5 lần so với hàm lượng
lipid ở giai đoạn sinh dưỡng. Hàm lượng lipid của tảo này tăng mạnh khi nuôi cấy

trong điều kiện thiếu hụt dinh dường13.

3


Chương 1. Tổng quan tài liệu
Bảng 1.1 Thành phần chính trong vi tảo H. pluvialis ở cả hai giai đoạn sinh trưởng

khác nhau 14

Thành phần trong tế bào

Pha xanh

Pha đỏ

Protein

29-45

17-25

Lipid tông

20-25

32-37

Lipid tự nhiên

59

51,9-53,5

Phospholipid

23,7

20,6-21,1

Glycolipid

11,5

25,7 -26,5

15-17

36-40

Carotenoid tổng

0,5

2-5

Neoxanthin

8,3

-

Violaxanthin

12,5

-

p - carotene

16,7

1,0

Lutein

56,3

0,5

Zeaxanthin

6,3

-

Astaxanthin (bao gom dạng este)

-

81,2

Adonixanthin

-

0,4

Adonirubin

-

0,6

Canthaxanthin

-

5,1

Echinenone

-

0,2

Chlorophyll

1,5-2

0

(% sinh khối khô)

Carbohydrate

4


Chương 1. Tổng quan tài liệu
1.2 Astaxanthin

1.2.1 Tổng quan về Astaxanthin
Astaxanthin là một keto-carotenoid (3,3-dihydroxy-p, p-carotene 4,4’dione), là
một sắc tố màu đơ thuộc nhóm xanthophyll carotenoid, cơng thức phân tử là

C40H52O4 15. Astaxanthin tồn tại ở các dạng đồng phân lập the, các đồng phân hình
học, dạng tự do và este hóa. Tất cả các dạng này đều được tìm thấy trong các nguồn

thu nhận astaxanthin từ tự nhiên.

Bảng 1.2 Cấu trúc cùa astaxanthin và các đồng phân hình học

Tính tan: astaxanthin15 là hợp chất ít phân cực nên rất ít tan trong nước, nó tan
trong các dung mơi hữu cơ như pyridine, ethanol, acetone, ete, dầu thực vật...

Sự hấp thụ ánh sáng và màu sac: astaxanthin hấp thụ rất mạnh bức xạ trong
vùng 476

480 nm nên được sử dụng đe xác định hàm lượng astaxanthin. Astaxanthin

có màu đỏ cam, tính hấp thụ ánh sáng cùa astaxanthin có thể bị thay đổi khi
astaxanthin liên kết với các cơ chất khác nhau. Dưới tác dụng của nhiệt, liên kết bị phá

hủy và astaxanthin được giải phóng dưới dạng tự do có màu đỏ cam.
Trong phân tử astaxanthin16 có chuồi polyen liên kết với các nhóm keto và

hydroxyl gắn với các vịng ở đầu mạch nên astaxanthin rất nhạy với ánh sáng, nhiệt độ
cao và các tác nhân oxy hóa, acid, base.

5


Chương 1. Tổng quan tài liệu

Màu đỏ của astaxanthin là do các nối đôi liên hợp ở trung tâm cùa hợp chất.

Các nối đôi liên hợp này hoạt động như một chất chống oxy hóa mạnh bằng cách cho
các electron và phản ứng với các gốc tự do để chuyển đổi chúng thành sản phẩm ổn

định hơn và chấm dứt phản ứng chuồi gốc tự do trong nhiều sinh vật sống.
Astaxanthin16 cho thấy hoạt tính sinh học mạnh hơn các chất chống oxy hố khác, vì

nó có thể liên kết với màng tế bào.

Các nghiên cứu gần đây cho thấy astaxanthin là chất có khả năng chống oxy
hóa mạnh 16 có lợi cho hệ miền dịch, hệ cơ tim, điều trị ung thư và trong điều trị lão
hóa da (Ambati và cs, 2014). Astaxanthin là chất chống oxy hố có hoạt tính cao hơn
so với vitamin E và vitamin c 17. So với các loại carotenoid khác, astaxanthin dễ dàng

được hấp thụ và tích luỳ. Astaxanthin thường được dùng với vai trị sắc tố bo sung
trong thức ăn chăn ni cá hồi và tôm nhưng đôi khi cũng dùng cho các gia cầm đe tạo

màu đẹp cho lòng đở trứng '8.
Astaxanthin được tìm thấy trong nhiều đối tượng như từ phế liệu giáp xác thủy
sản, nấm men Phaffia rhodozyma, một số loại vi khuẩn,... Một số vi khuẩn

(Paracoccus carotinifaciens) '9, nấm (Phaffia rhodozyma), tảo lục (Haematococcus

pluvialis) có khả năng tống họp tự nhiên astaxanthin. Trong đó, tảo lục H.pluvialis
được dùng phổ biến nhất trong sản xuất astaxanthin ở quy mô thương mại 20. H.

pluvialis có thể tích lũy astaxanthin đến 4,5 % sinh khối. Ngồi ra, quy trình sản xuất

cũng tốn ít năng lượng hơn và có hiệu suất cao hơn 21. Astaxanthin tồng hợp bởi H.
pluvialis có cấu hình 3S,3’S, loại này cũng ton tại trong cá hoi tự nhiên22,23

1.2.2 Nguồn gốc Astaxanthin trong vi tảo
Sự tích lũy Astaxanthin ở tảo H.phtvialis là một phản ứng của tế bào chống lại

các điều kiện bất lợi, giúp tế bào ton tại. Thành phần carotenoid cùa các tế bào sinh

dường bao gồm chủ yếu là lutein (75 - 80 %), p - carotene (10-20 %) và những sắc tố

khác (bao gồm chlorophyll a và b, violaxanthin, neoxanthin, lactucaxanthin và
zeaxanthin Trong giai đoạn bào nang, hàm lượng carotenoid tống số tăng mạnh, trong
đó sac to astaxanthin chiếm chủ yếu (80 - 99 % carotenoid tong so) 13.

ơ vi tảo H.pluvialis, có 2 con đường sinh tong họp astaxanthin: Con đường đầu
tiên là tổng họp astaxanthin từ các tiền chất echinenone, cantaxanthin; con đường thứ

6


Chương 1. Tổng quan tài liệu

hai bắt đầu từ quá trình hydroxyl hóa p-carotene tạo các sản phẩm trung gian pcryptoxanthin, zeaxanthin và adonixanthin trước khi tạo thành astaxanthin (hình 1.5).

Quá trình này nhờ vào hệ 2 enzyme p-carotene oxygenase (BKT) và p-carotene
hydroxylase (CHY) ở lục lạp dù sự tong hợp astaxanthin diễn ra ở te bào chất24. Sự

sinh tổng hợp này cũng dựa trên con đường tong hợp carotenoid chung đến (3-carotene,
sau đó nhờ hai enzyme trên chuyển hóa thành astaxanthin.
Gỡrnnylgoranyl pyrophosphale

Hình 1.3 Con đường sinh tổng họp astaxanthin trong vi tảo H.pluvialis ~~

1.2.3 ứng dụng của Astaxanthin trong thủy sản
Trong 20 năm qua, astaxanthin26 tổng hợp đã được sử dụng rộng rài đe làm tăng
sắc tố của cá (chiếm 95 % nhu cầu thị trường). Nó tạo màu hồng đặc trưng cho cá hồi,
cá tráp và tôm 26. Trên the giới, astaxanthin có giá khoảng 2500 USD/kg với doanh số

ước đạt 200 triệu ƯSD/năm. Trong NTTS, chi phí cho việc bổ sung astaxanthin vào
nguồn thức ăn chiếm 10 - 20% chi phí sản xuất thức ăn.

Astaxanthin được sản xuất từ tảo H. pỉuvialis có tiềm năng lớn trong ngành

công nghiệp NTTS do nhu cầu ngày càng tăng đối với các sản phẩm tự nhiên này. Cơ
quan Thanh tra thực phẩm Canada và Cục quản 1. thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ đã
chấp thuận việc sử dụng tảo này như một chất màu phụ gia trong thức ăn cá hồi.

Astaxanthin từ tảo H. pluvỉalis đã được chứng minh là chất an toàn và hiệu quả cho

màu sắc thịt của cá 27. Bổ sung sinh khối tảo H. pluvialis giàu astaxanthin vào thức ăn
đã dần đến lắng đọng đáng ke astaxanthin trong thịt và da, tăng cường màu sắc thịt,

7


Chương 1. Tổng quan tài liệu

tăng cường hệ thống chống ôxy hóa, tăng chất lượng trứng cá, giúp tăng trưởng tốt

hơn và tăng tỷ lệ sống sót của cá bột một số loài cá như cá hồi, cá tráp biến và cá hồi
Vân 28; các loài cá cảnh 29 và tôm '°. Một nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng chế độ ăn
bo sung tảo H. pluvialis đã cải thiện tốc độ tăng trưởng của cá Đù Vàng (yellow

croaker) tốt hơn chế độ ăn bổ sung astaxanthin tồng hợp 31.

Jagruthi và cộng sự 31 (2014) đã thông báo về ảnh hưởng của nồng độ
astaxanthin bổ sung (dao động từ 0, 25, 50, và 100 mg/kg thức ăn) vào trong thức ăn

cơ bản nhằm tăng khả năng miễn dịch và kháng bệnh ở cá Koi (Cyprinus carpio). Ket

quả cho thấy khi cá ăn với thức ăn có bố sung 50 và 100 mg astaxanthin/kg thức ăn, tỷ

lệ tử vong giảm xuống còn 10-20 %, các tế bào máu đỏ, các te bào máu trắng,
hemoglobin và giá trị hematocrit, hoạt tính lysozyme huyết thanh và hoạt tính diệt

khuẩn gia tăng đáng kể, giúp thúc đẩy sự tăng trưởng và điều chỉnh hệ thống miễn

dịch trong c. catpio chông lại Aeromonas hydrophila.
1.3 Tổng quan về Cá Koi

Giới (regnum)
Ngành (phylum)

Lớp (class)

Bộ (ordo)

Họ (familia)

Anũnalia
Chordata

Actinopterygii

Cypriniformes

Cyprinidae

Cyprinus

Chi (genus)

Loài (species)

c. carpio

Phân loài (subspecies)

c. c. haematopterus
Cyprinus carpio 1975 33

8


Chương 1. Tổng quan tài liệu

Hình 1.4 Cá chép koi
Nguồn gốc, xuất xứ của cá chép Koi Nhật Bản

Xuất hiện từ đầu đầu thế kỷ 20, năm 1914, đe tôn vinh hoàng tử Hirohito, Nhật

Bản đã cho triển lãm giống cá chép Koi đầu tiên tại Tokyo và đảo Niigata chính thức
được mang tên Niigata Koi. Từ đây, cá chép Nhật với 2 màu chú đạo "đỏ và trắng"
được tôn vinh và mua bán rộng rãi. Cá chép Koi là một trong những chủng loại cá

cảnh được nhiều người yêu thích, có tên khoa học là Cyprinus carpio, đã được thuần
hóa và lai tạo với mục đích làm cảnh trong những hồ nhỏ, chúng được nuôi phổ biến

tại Nhật Bản. Trong văn hóa nhật bản, cá chép Koi được xem là biếu tượng của sự
may mắn, giá trị của cá Koi từ 200 triệu hay lên đến hàng tỷ đồng đều phụ thuộc vào
hình dáng và màu sắc cùa cá.

9


Chương 1. Tổng quan tài liệu

Hình 1.5 Các loại cá Koi được ni tại Việt Nam
1.4 Tình hình nghiên cứu về ứng dụng vi tảo H. pluvìalìs trong ni trồng thủy

sản

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước
Trần Ngọc Châu (2000) đã nghiên cứu sử dụng dung môi acetone đe chiết xuất
astaxanthin từ vỏ tôm và thu được sản phẩm ở dạng bột màu astaxanthin thô.

10


Chương 1. Tổng quan tài liệu

Hoàng Mai Dũng (2000) đã nghiên cứu ảnh hưởng của thức ăn có chứa
carotenoid đến màu sắc và tốc độ sinh trưởng của cá chép phụng Nhật và cá tai tượng

Châu Phi.
Viện hóa học Hà Nội (2000) đã nghiên cứu nâng cao hiệu suất thu hồi
astaxanthin và xây dựng phương pháp thu nhận astaxanthin từ phế liệu tơm trong
phịng thí nghiệm.

Nguyễn Văn Trọng (2003) đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện bảo
quản đến sự giảm hàm lượng astaxanthin trong phế liệu tôm.
Lưu Thị Tâm, Lê Thị Thơm, Nguyền cấm Hà, Lê Hà Thu, Đặng Diềm Hồng

(2015). Bước đầu nghiên cứu ứng dụng sinh khối tảo H. pluvialis giàu astaxanthin làm
thức ăn bổ sung cho cá hồi ở Việt Nam.

Tại Việt Nam, chưa có nhiều các nghiên cứu về việc chiết xuất astaxanthin từ vi

tảo H.pluvialis cho mục đích thương mại, ngoại trừ một vài nghiên cứu của tác giả

Đặng Diễm Hồng và cộng sự, (2010); Đặng Diễm Hồng và cộng sự, (2012); Đinh Đức
Hoàng và cộng sự, (2011); Lê Thị Thơm và cộng sự, (2013) sử dụng dung môi để
chiết xuất và định lượng astaxanthin trong quá trình nghiên cứu về sự sinh trưởng của

vi tảo H.pluvialis.
1.4.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước

Astaxanthin được tống hợp nhân tạo chủ yếu dùng cho chăn nuôi. Một số vi
khuẩn (Paracoccus carotinifaciens), nấm (Phaffia rhodozyma), vi tảo lục (//. pluvialis')
có khả năng tơng hợp tự nhiên astaxanthin. Trong đó, tảo lục H. pỉuvialis được dùng

pho biến nhất trong sản xuất astaxanthin ở quy mô thương mại (Kang và cộng sự,

2006; Lorenz và Cysewski, 2000; Zhang và cộng sự, 2014). Ngồi ra, quy trình sản

xuất cũng tốn ít năng lượng hơn và có hiệu suất cao hơn (Baker và Saling, 2003).
Một số cơng trình nghiên cứu phương pháp chiết xuất astaxanthin từ vi tảo

H.pluvialis:
Năm 2012, Panicha đã khảo sát trích ly astaxanthin với tám loại dung môi dầu

(dầu dừa, dầu hạt nho, dầu olive, dầu gạo, dầu vừng, dầu cọ, dầu trà biến và dầu hạnh

11


Chương 1. Tổng quan tài liệu
nhân) theo quy trình tương tự của Chang (2007) đã cho kết quả dầu dừa là dung mơi
trích ly astaxanthin tốt nhất (Panicha và cộng sự, 2012).

Năm 2012, Jian-Liang Pan và cộng sự đã dùng phương pháp co2 siêu tới hạn để
chiết xuất astaxanthin từ H. pluvialis với hiệu suất chiết xuất là 71 ± 6 % (10,92 mg/g).

Đây là phương pháp thân thiện với môi trường, không cần phải dùng dung môi độc hại
(Jian-Liang Pan và cộng sự, 2012).
Sử dụng phương pháp co2 siêu tới hạn với dầu hướng dương làm đồng dung
môi, hiệu suất thu hoi astaxanthin lên tới từ 80 % đen 90 % (Machmudah và cộng sự,

2006; Nobre và cộng sự, 2006; Wang và cộng sự, 2012).
Năm 2013, Tang-Bin đã sử dụng siêu âm và hồn hợp đồng dung môi

ethanol: etylacetate, chiết xuất được hàm lượng astaxanthin cao nhất là 23,94 mg/g tại
nhiệt độ 40 °C (Tang-Bin Zou và cộng sự, 2013).

Năm 2014, Shengzhao Dong đà so sánh bốn phương pháp chiết xuất astaxanthin

từ H. pluvialis bằng các loại dung môi HC1 - acetone, dầu đậu nành, methanol -

acetone, hexane - isopropanol và đã tim ra được dung môi HC1 - acetone là dung môi
cho hiệu suất chiết xuất astaxanthin cao nhất đạt hiệu suất (33,3 ±1,1 %) (Shengzhao

Dong và cộng sự, 2014).

12


Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

CHƯƠNG 2. NÔI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1 Noi thực hiện

Đe tài được thực hiện từ 6 đến tháng 9 năm 2020 tại Khoa Công Nghệ Sinh Học
- Trường Đại Học Nguyền Tất Thành, số 298A-300A, phường 13, quận 4, TP Hồ Chí

Minh.
2.2 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Phân tích giá trị dinh dưỡng trong bột vi tảo H. pluvialis đã bị li

trích astaxanthin
Bột vi tảo thu được sau khi bị li trích astaxanthin sẽ được xác định các thành

phần dinh dưỡng chính:
Protein được xác định theo phương pháp Kjeldahl, nitơ tống số (%), xơ (%),
gluxit, polyxacharit, tro, ẩm xác định theo phương pháp phân tích AO AC 2000.

Tách chiết lipít từ sinh khối vi tảo được tiến hành theo phương pháp Bligh &
Dyer (1959).

Nội dung 2: Nghiên cứu phối trộn bột vi tảo H. pluvialỉs đã bị li trích astaxanthin

vào trong thức ăn cho cá

Dựa vào thành phần dinh dường và tỉ lệ astaxanthin còn lại trong bột vi tảo đã li
trích astaxanthin đe phối trộn vào trong thức ăn cho cá đạt các giá trị dinh dường phù
hợp. Trong đó, tiêu chí chính là hàm lượng astaxanthin trong thức ăn. Các hàm lượng
astaxanthin trong thức ăn sau khi pha trộn được nghiên cứu là: 50, 100 và 150 mg/kg
thức ăn. Các thí nghiệm gom:

Nghiên cứu phương pháp phá vỡ vách tế bào vi tảo đe giải phóng chất dinh
dưỡng trong tế bào: (1) hap autoclave, (2) nghiền cơ học, (3) hóa chat HC1, NaOH.

Nghiên cứu tỉ lệ dùng đe phối trộn tảo vào thức ăn: 10, 15, 20, 25, 30 mL
dầu/100 g bột tảo.
Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của thức ăn bổ sung bột vi tảo lên sinh

trưởng và màu sắc cá Koi Nhật
13


Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Cá Koi Nhật được ni và cho ăn bằng thức ăn có bổ sung bột vi tảo với thời

gian nuôi tối đa là 70 ngày. Các nghiệm thức tiến hành:
Đối chứng 1: Thức ăn không bổ sung bột vi tảo.

Đối chứng 2: Thức ăn bo sung astaxanthin có sằn trên thị trường.
Nghiệm thức 3: Thức ăn có bố sung bột vi tảo đe đạt hàm lượng astaxanthin 50
mg/kg thức ăn.

Nghiệm thức 4: Thức ăn có bo sung bột vi tảo đe đạt hàm lượng astaxanthin 100
mg/kg thức ăn.

Nghiệm thức 5: Thức ăn có bổ sung bột vi tảo để đạt hàm lượng astaxanthin 150
mg/kg thức ăn.

Các tiêu chí theo dõi, so sánh:
So màu: cảm quan và theo phương pháp so màu Theraphy.

Tỉ lệ chết, tăng trưởng: chiều dài và khối lượng, tính toán hiệu quả kinh tế khi áp

dụng thực tiễn.
2.3 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp xác định thành phần dinh dưỡng trong bột tảo

Thành phần dinh dưỡng của bột tảo (đã bị li trích astaxanthin) như hàm lượng
protein tong số được xác định theo phương pháp Kjeldahl, nitơ tong số (%),
polysaccharide, lipid, độ ấm xác định theo phương pháp phân tích AO AC 2000.

Phương pháp xác định tỉ lệ astaxanthin trong sinh khối khô vi tảo
Cân 0,001 g sinh khối khô trong eppendorf 2 mL, thêm 1 mL acetone 90 %,

nghiền kĩ bằng chày thủy tinh, li tâm 4000 vòng/phút trong 1 phút, thu phần dịch nổi.

Tiếp tục thêm 1 mL acetone 90 % và lặp lại quy trình cho đen khi khi phần dịch thu

được là không màu. Thêm acetone 90 % đế thu được thế tích sau cùng là 5 mL trong

ong falcon đậy nắp kín. Quy trình được thực hiện trong tối hoặc ánh sáng khuếch tán
yếu. Phần dịch chiết sắc tố được đo quang phổ ở các bước sóng 530 nm.

14


Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Phương trình đường chuẩn: y = 0,665x + 0,008236 34, trong đó y là giá trị đo OD,
X là nồng độ astaxanthin (pg.mL-1).

Phương pháp xử lý bột tảo

Chọn ra phương pháp phá vỡ vách tế bào vi tảo tối ưu nhất đe giải phóng chất

dinh dưỡng trong tế bào: (1) hap autoclave, (2) nghiền cơ học, (3) hóa chat HC1,
NaOH.

Hap autoclave: Sử dụng bột vi tảo 0,001 g cho vào cối nghiền nhỏ sau đó cho
vào ống nhựa và hấp trong vịng 15 phút. Lấy ra cho 3 viên bi vào mồi ống và lắc đều,
thực hiện trong vòng 1 tiếng và lặp lại 3 lấn như nhau mồi lần đều phải ly tâm và thu

dịch nối, sau đó sử dịch noi của ba lần cộng lại đo OD, phần cặn thu được cho vào
Iml nước cất và xem mẫu trên kính hiển vi, xem và đem hồng cầu vỡ và hồng câu

nguyên.

Nghiền cơ học sử dụng hóa chat HC1, NaOH : Sửa dụng bột vi tảo 0,01 g cho
vào cối nghiền nhở sau đó cho vào ống nhựa và sử dụng 3 viên bi cho vào mồi ống lắc

đều, thực hiện trong vòng 1 tiếng và lặp lại 3 lần như nhau, mồi lần đều phải ly tâm và

thu dịch nổi, sau đó sử dụng dịch nổi của 3 lần cộng lại đo OD, phần cặn thu được cho
vào 1 ml nước cất và xem mầu trên kính hiến vi xem và đếm tế bào tảo.

Phương pháp bố trí thí nghiệm đối với cá Koi Nhật

Cá Koi Nhật khoảng 16-20 tuần tuổi sè bắt đầu phát triển kiểu dáng vây, màu
sắc đặc trưng cho cá và có thể thu hoạch. Do đó, cá Koi Nhật khoảng 8 tuần tuổi được

chọn ni cho nghiên cứu này. Cá trước khi thí nghiệm được ni ổn định 2 tuần
trong các bể chứa 100 lít, 5 cá thể/bể. Loại bỏ những cá thể chết, cá thể kém ăn, dị tật.

Tiến hành thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức bao gom 1 be đối chứng (cá ăn thức ăn cơng
nghiệp khơng có bổ sung bột vi tảo) và 4 bể thí nghiệm. Lượng thức ăn hàng ngày cho

cá là 7 - 10 % trọng lượng cá, cho ăn 2 lần vào buổi sáng và chiều. Theo dõi thường
xuyên các chỉ tiêu môi trường: pH (toi ưu là 7 - 8), nhiệt độ nước (20 - 27 °C), hàm
lượng oxy hịa tan >2,5 mg/1). Mồi nghiệm thức thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Thời

gian thí nghiệm là 8 tuần. Định kỳ thu 5 cá the trong bê đe đánh giá so sánh màu sắc
của các nghiệm thức và đối chứng theo phương pháp so màu bằng cảm quan và so

15