Khảo sát ảnh hưởng bã hèm mật rỉ lên sự sinh trưởng và khả năng tích lũy Astaxanthin của tảo Haematococcus Pluvialis

NTTU-NCKH-04

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

BÁO CÁO TÕNG KẾT

ĐÈ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP co SỞ
NĂM 2021

Tên đề tài: KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG BÃ HÈM MẬT RỈ LÊN sụ SINH

TRƯỞNG

VÀ

KHẢ

NĂNG

TÍCH

LŨY

ASTAXANTHIN

HAEMA TOCOCCUS PLUVIALIS
Mà đề tài: 2021.01.108

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Ngọc

Đơn vị công tác: Viện Kỳ thuật CNC NTT
Thời gian thực hiện: 06 tháng

TP. Hồ Chỉ Minh, neàv

thảng năm 2021

CỦA

TẢO


MỤC LỤC
MỞ ĐẢU
CHƯƠNG 1. TÓNG QUAN TÀI LIỆU..........................................................................

CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu.................................
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................................

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...........................................................................................
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................................

PHỤ LỤC

1


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Từ nguyên

OHM

Optimal Haematococcus medium

BBM

Bold Basal medium

N

Nitơ

p

Photpho

B

Bo

Fe

Sắt

2


DANH MỤC CÁC BẢNG BIẾU, sơ ĐỊ, HÌNH ẢNH

Hình 1. 1. Tê bào tảo Haematococcus pluvialis.................................................................. 6
Hình 2. 1. Tảo Haematococcus pluvỉalis sau khi được hoạt hóa........................................ 9

Hình 3. 1. Dịch ni cấy tảo Haematococcus Phivialis.................................................... 12
Hình 3. 2. Hình thái te bào tảo Haematococcus Pluvialis................................................. 16
Hình 3. 3. Mật độ tế bào tảo ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau..................................... 17
Hình 3. 4. Tốc độ tăng trưởng đặc hiệu của tảo................................................................ 17
Hình 3. 5. Trọng lượng khơ của tảo Haematococcuspỉuvỉalis ở các điều kiện ni cấy. 17
Hình 3. 6. Hàm lượng astaxanthin được tích lũy ở các điều kiện nuôi cấy....................... 17

3


TĨM TẮT KỂT QUẢ NGHIÊN cứu

01

Kết q đạt được

Cơng việc thực hiện

STT

Nôi dung 1: Khảo sát nồng độ

Chọn được nồng độ CMS tối ưu.

CMS

Đánh gia được hàm lượng

Astaxanthin

02

Nội dung 2: Xử lý số liệu và viết 01 bài báo đăng tạp chí trong nước

bài báo, báo cáo.

STT

01

bản thảo

Sản phẩm đã đạt được

Sản phẩm đăng ký

Bài báo

Bản thảo

Thời gian thực hiện:
Thời gian nộp cuốn báo cáo :

4

MỞĐẢƯ
Hiện nay, ngành công nghiệp sản xuất cồn của Việt Nam khá phát trien do có nguồn

nguyên liệu phong phú và dồi dào. Bã hèm mật rỉ (Condensed molasses solubles:CMS) là
sản phẩm thừa cịn sau q trình lên men mật mía để sản xuất ethanol. CMS được coi là

thuộc loại nước thải ô nhiễm nặng, hàm lượng hữu cơ rất cao (ở dạng đậm đặc nước thải
có COD từ 50.000 mg/1 đến 100.000 mg/1), pH giá trị rất thấp (từ 4,2 đến 4,5), ngoài ra

nhiệt độ cũng khá cao (từ 75°c đến 85°C); và trong 1 tấn mật rỉ sè thải ra 3m3 CMS. Do
đó, việc giảm thiểu nồng độ ô nhiễm đạt tiêu chuẩn là hết sức khó khăn, đòi hởi phải kết

họp nhiều phương pháp và nhiều ban ngành.

Tảo H.pluvialis là nguồn astaxanthin tự nhiên dồi dào. Hàm lượng astaxanthin được
tạo ra phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nuôi cấy. Hầu hết tế bào vi tảo đều duy trì ở
trạng thái sinh dường, tích lũy rất ít hoặc khơng tích lũy astaxanthin khi ni ở điều kiện

thích họp. Tuy nhiên, dưới điều kiện stress, tế bào chuyển sang dạng bào nang khơng

chuyển động và khi được kích thích phù hợp tế bào tảo có thể tích lũy một lượng lớn
astaxanthin. Vì vậy, điều kiện cho tế bào sinh trưởng và tong hợp astaxanthin là rất khác

nhau. Việc xác định rõ ràng pha sinh trưởng tế bào và pha tong họp astaxanthin là cần
thiết đe đạt được mật độ tế bào và hàm lượng astaxanthin cao. Trong đó yếu tố về dinh

dưỡng môi trường rất quan trọng. Sự thiếu hụt nitơ có cảm ứng đen q trình tạo
astaxanthin [1], tuy nhiên khi bồ sung lượng nitơ cao gấp 4 lần mơi trường ni cấy cơ
bản RM thì mật độ tế bào tảo đạt cao nhất. Ngoài ra, photpho hoặc dư thừa acetate hoặc

bổ sung các tiền chất carotenoit khác nhau đã được chứng minh có ảnh hưởng đến quá

trình tạo astaxanthin [1], [2].
Trước thực trạng và các yếu tố ảnh hưởng đã nêu trên, chúng tôi sừ dụng bã hèm
mật rỉ để nuôi cấy tảo H.pỉuvialỉs nhằm sử dụng đường cũng như protein và khoáng chất
trong CMS là nguồn dinh dưỡng thay thế cho tảo sinh trưởng, tích lũy astaxanthin; từ đó

xây dựng một quy trình ni cấy tiết kiệm và hiệu quả vừa giải quyết vấn đề về xử lý
nước thải vừa có thêm nguồn thức ăn cung cấp cho thủy sản hoặc phân bón cho nơng

nghiệp.

Kết quả thực nghiệm cho thấy, tảo H.pluvialis có thể sinh trưởng trong mơi trường
có chứa CMS. Trọng lượng khơ được tích lũy cao nhất sau q trình ni cấy ở điều kiện

CMS 0,2 % đạt 209,3 mg/L và tốc độ tăng trưởng đặc hiệu đạt 0,06 mg/L/ngày. Hàm
lượng astaxanthin cao nhất đạt 2,5 % so với trọng lượng khô ở điều kiện CMS 0,01 %.
5


CHƯƠNG 1. TĨNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tảo Haematococcus Pluvialìs
Tảo Heamatococcus pluvialis là tảo lục đơn bào, chu kỳ tế bào được chia làm hai giai

đoạn dựa trên hình thái và sinh lý tế bào là: giai đoạn di động và giai đoạn không di động.
Te bào H. pluvialis trong giai đoạn di động có thành mỏng, hai roi và chủ yếu phát triển
bằng cách tăng sinh tế bào. Ngược lại, tế bào của H. pluvialis trong giai đoạn không di

động có vách dày, khơng roi và xảy ra q trình tích tụ astaxanthin [3].

Dạng roi di động

Khơng roi tích lũy Astaxanthin
Hình 1. 1. Tê bào tảo Haematococcus pluvialis

Hàm lượng astaxanthin được tích lũy từ 0,5 - 4% trên trọng lượng khô của
H.pluvialis [4] cao hơn rất nhiều so với một số loại vi tảo lục khác như: Neochloris

wimmeri, Protosiphon botryoides, Scotiellopsis oocystiformis, Chorella zofingiensis và
Scenedesmus vacuolatus (0,27 -1,92% trọng lượng khô) [5].

Khi tiếp xúc với điều kiện môi trường khẳc nghiệt H.pluvialis tạo ra một lượng lớn
ketocarotenoid astaxanthin. Trong điều kiện tăng trưởng tối ưu, tế bào sinh dưỡng của tảo

vẫn tích lũy các carotenoid sơ cap (P- carotene, lutein, violaxanthin, neoxanthin và
zeaxanthin) thường được chứa trong lục lạp. Tuy nhiên, khi tảo tiếp xúc với các điều kiện

hạn chế tăng trưởng thì tế bào bắt đầu tổng hợp astaxanthin, hình thái bắt thay đổi để

thích ứng với mơi trường khắc nghiệt. Sự hình thành của astaxanthin trong H.pluvialis có
liên quan đến những thay đổi lớn trong hình thái, sinh lý và đặc điểm quang hợp. Những
thay đồi này được biểu hiện qua việc rụng roi, tạo ra các bào tử trứng bất động, các cơ
quan tích tụ lượng lớn lipid trong nguyên sinh chất có chứa astaxanthin, thành tế bào
sporopollenin dày có khả năng chống lại sự phân hủy oxy hóa và giảm khả năng quang

hợp. Trong điều kiện môi trường khắc nghiệt, các ketocarotenoid như canthaxanthin,
echinenone, adonirubin và p-carotene cũng được tìm thấy trong tế bào tuy nhiên chỉ

6

chiếm một lượng nhỏ khoảng một vài phần trăm so với lượng carotenoid tổng.

Carotenoid chứa các nhóm hydroxy (ví dụ:astaxanthin) thường xuất hiện ở tảo như
Haemato-coccus spp., Oocystis spp., v.v. ờ dạng hồn hợp phức tạp của acid béo mono- và

bis-este. Những carotenoidacyl este có thể chiếm tới 98% tổng số carotenoid trong chủng
tảo đặc biệt này. Tỷ lệ chính xác cùa mono: bis-este phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy
[1].
1.2. Astaxanthin và ứng dụng
Astaxanthin [(3S,3'S)-3,3'-dihydroxy-p,p-carotene-4,4'-dione] là một xanthophyll

ketocarotenoid có đặc tính chống oxy hóa mạnh hon P-carotene và Vitamin E, gần đây
các ứng dụng của astaxanthin trong dược phẩm đã được nghiên cứu như bảo vệ chống lão

hóa do sự oxy hóa của tia ƯV và viêm [6]. Do đặc tính chống ung thư, chat carotenoid
nàycũng tìm thấy ứng dụng để tăng cường phản ứng miễn dịch và cải thiện tổn thương

mơ, trong ngồi tác dụng điều trị các bệnh tim mạch, tiêu đường, viêm loét dạ dày và
tăng huyết áp [7].

1.3. Bã hèm mật rỉ (Condensed molasses solubles:CMS)

Thành phần CMS bao gồm một lượng nhỏ đường, chất hữu cơ và tro vô cơ. Lượng

lớn CMS cùa các nhà máy đường, ethanol thải ra môi trường sẽ là nguy cơ gây ô nhiễm

môi trường nước; bởi chất hữu cơ như các hợp chất cùa cacbon nitơ, phốt-pho dề bị phân
hủy bởi các vi sinh vật, gây mùi hôi thối cho khơng khí và nguồn nước. Mặt khác, phần

lớn các chất rắn lơ lửng dạng vô cơ, khi thải ra mơi trường có khả năng lắng và tạo thành
một lóp dày ở đáy nguồn nước, phá hủy hệ sinh vật. Các khí độc trong q trình phân hủy
sè gây thiếu hụt oxy trong nước, tác động xấu đến hệ sinh thái.

1.4. Các nghiên cứu trong và ngoài nước

Các nghiên cứu ngồi nước
Astaxanthin là một xanthophyll carotenoid có hoạt tính chống oxy hóa mạnh, gấp 54

lần so với p- carotene, 14 lần so với vitamin E và 65 lần so với vitamin c. Khả năng vô

hiệu quá các oxy đơn phân tử mạnh hơn vitamin E là 550 lần, vitamin c 6000 lần [8].
Chính vì the, astaxanthin đã được ứng dụng trong nhiều chế phẩm bảo vệ sức khỏe như:

tăng cường sức khỏe, giảm nguy cơ mắc các bệnh mạn tính, giảm nguy cơ mắc các bệnh

ung thư, bệnh thần kinh, giảm các nguy cơ về các biến chứng bệnh tiểu đường, phụ hồi

teo cơ,...[9].

7


Tảo Heamatococcus pluvỉalỉs được xem là nguồn cung cấp astaxanthin tự nhiên

hiệu quả. Hàm lượng astaxanthin so với trọng lượng khô chiếm khoảng 0,5 - 4,0% cao
hơn gấp 2-3 lần so với một số loại vi tảo khác [5]. Chính vì vậy, các nghiên cứu về yếu

to ảnh hưởng đến khả năng tích lũy astaxanthin được thực hiện nhằm tìm ra môi trường

nuôi cấy tảo hiệu quả. Nghiên cứu của Mark Harker và các cộng sự đã chỉ ra rằng, yếu to
dinh dưỡng và vật lý có ảnh hưởng để khả năng tích lũy astaxanthin của H.pluvỉalis. Khi
ni cấy tảo dưới các điều kiện khắc nghiệt như: thiếu nitơ, độ mặn và cường độ ánh
sáng cao kích thích tảo tạo ra lượng astaxanthin khác nhau [1]. Bên cạnh đó, việc giảm

chi phí ni trồng cũng rất quan trọng. Một số nguồn carbon, nitơ “xanh” như: bã hèm
mật rỉ, chất thải cồn từ các nhà máy đã được sử dụng trong ni cấy tảo nói chung và tảo

H.pluvialỉs nói riêng. Mật độ tế bào tảo H.pluvialis khi nuôi trong điều kiện nồng độ chất
thải con sinh học 60% tăng khoảng 10,5% so với môi trường nuôi cay chuan M1B1 [10].

Một nghiên cứu khác, đã sử dụng mật mía trong ni cấy tảo Chlorella zofingiensis đe

sản xuất astaxanthin, kết quả cho thấy hàm lượng astaxanthin tăng 42,2% và sinh khối

tăng 29,3% khi nuôi cấy trong môi trường chứa 5g/L mật rỉ đường [11]. Qua các nghiên

cứu cho thấy, các nguồn carbon, nitơ này cho hiệu quả cao về năng suất, đồng thời vừa

tiết kiệm chi phí vừa góp phần bảo vệ mơi trường.

Các nghiên cứu trong nước
Với giá trị sinh học cao và tiềm năng về kinh tế, tảo H.pỉuvỉalis đã và đang được
quan tâm ở Việt Nam. Các sản phẩm từ tảo được nghiên cứu và ứng dụng để làm thực

phẩm, thức ăn chăn nuôi để tăng sản lượng và chất lượng thủy hải sản có giá trị về kinh tế

cao. Ví dụ như khi ni cá hồi bằng thức ăn có bồ sung H.pluvialis, chất lượng thịt cá hồi
được cải thiện rõ rệt, hàm lượng canxi và DHA cao gấp 4,26 và 1,69 lần so với khi sử

dụng cám nhập ngoại và cám trong nước [12].

Ngoài ra, các nghiên cứu về điều kiện ức chế đe tăng hàm lượng astaxanthin cũng như sự
tăng trưởng trong nuôi cấy tảo H.pluvialis cũng đã được thực hiện. Trong các điều kiện,
ánh sáng và nồng độ nitrat có ảnh hưởng mạnh đến khả năng sinh trưởng và tích lũy

astaxanthin của H.pluvialis [13], [14], Mới gần đây, công nghệ nuôi cấy cố định trên hệ
thống quang sinh học hai lớp màng theo phương ngang đã được thiết lập và tối ưu hóa

điều kiện ni, kết quả cho thấy tăng sinh khối đạt tối đa là 6,08 g/ngày/m2 với tỷ lệ
astaxanthin đạt mức 1,75% lượng sinh khối khô của tế bào và việc thu hoạch tảo được

đơn giản hóa hơn.

8


CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN củu
2.1. Đối tượng nghiên cứu

Tảo Heamatococcus pluvỉaỉis ƯTEX2505 được nuôi cấy tại Viện Kỳ thuật Công

nghệ cao trường Đại học Nguyền Tất Thành. Được nuôi cấy trong môi trường OHM dưới
điều kiện ánh sáng trắng cường độ 100 gmol/photon/m2/s chiếu sáng và sục khí liên tục ở
nhiệt độ 25°c±2 (Hình 2).

Các vật liệu và phưong pháp thực hiện trong có thế được hiệu chình và sửa đối trong quá

trình thực hiện đề tài.

Hình 2. 1. Tảo Haematococcus pluvialis sau khi được hoạt hóa
2.2. Nội dung nghiên cứu: Khảo sát nồng độ CMS

Mục đích: Chọn được nồng độ CMS tối ưu để ni cấy tảo H.pluviaỉis đạt hàm lượng
astaxanthin cao.
Trong nội dung nghiên cứu này sử dụng bà hèm mật rỉ đã được xử lý của Công ty Huy

Việt Tây Đô dưới dạng chất lỏng sệt. Thành phần của CMS đã được xác định như bảng 1.

Lấy 1 lượng tảo cho vào erlen 500 mL, bo sung dung dịch môi trường đã được hấp
vô trùng vừa đù đe đạt mật độ tế bào IxlO5 tế bào/mL. Nuôi cấy dưới ánh sáng trắng

cường độ 100 |imol/photon/m2/s (với chu kỳ sáng: tối, 12 giờ: 12 giờ).
❖

Thí nghiệm được bố trí với các nghiệm thức sau:
-

Dung dịch CMS nồng độ 0,01%

-

Dung dịch CMS nồng độ 0,05%

-

Dung dịch CMS nồng độ 0,1%

-

Dung dịch CMS nồng độ 0,2%

-

Môi trường OHM
9


Xác định được sinh khối khô, mật độ tế bào và tốc độ tăng trưởng đặc hiệu ở từng
nghiệm thức khác nhau sau 3 ngày nuôi cấy.
❖ Thu sinh khối và định lượng Astaxanthin

-

Thu sinh khối: Dịch tảo sau khi đã đạt mật độ và quan sát tế bào bằng kính hiển vi
có màu đỏ đậm đều hết các tế bào sè được lọc qua màng lọc nylon monofilament

với đường kính lồ lọc là 25 |im. Sau đó rửa tảo nhiều lần với nước cất hấp vô trùng,
đem đi đông khô và bảo quản ở tủ -20°C.

- Lấy sinh khối tảo khô tiến hành định lượng Astaxanthin.
Bảng 1. Thành phần của CMS
Chỉ tiêu

Đơn vị

kiểm nghiệm

tính

1

As

mg/Kg

0,18

2

B

mg/Kg

3,01

3

Ca

mg/Kg

14300

4

Cd

mg/Kg

Khơng phát hiện (MDL=0,l)

5

Cu

mg/Kg

2,06

6

Fe

mg/Kg

1000

7

Hg

mg/Kg

Khơng phát hiện (MDL=0,01)

8

K2O

mg/Kg

64094

9

Mg

mg/Kg

8462

10

Mn

mg/Kg

126

11

P2O5

mg/Kg

1696

12

Pb

mg/Kg

Không phát hiện (MDL=1)

13

Zn

mg/Kg

14,5

14

N

%

1,66

15

Chất hừu cơ

%

53,6

16

4-Hydroxyproline

g/100g

Không phát hiện (MDL=0,01)

17

Acid amin

g/100g

2,69

STT

10

Ket quả


2.3. Phương pháp nghiên cứu

• Quan sát hình thái tế bào H.pluvialỉs

Hình thái tế bào H.pluvialis được quan sát bằng kính hiến vi quang học với độ phóng

đại lOOx sau các ngày ni cấy.

• Xác định trọng lượng khơ của H.pỉuvialis

Lấy 10 mL dịch nuôi cấy tảo lọc qua màng lọc, với đường kính màng là 47 mm,

đường kính lồ 20 Jim. Sau đó tảo được rửa với 20 mL nước cất hấp vô trùng, và sấy khô
ở 103°C suốt 6 tiếng hoặc cho đến khi trọng lượng khô không đổi (g).
• Xác định mật độ tế bào tảo

Sử dụng buồng đen hồng cầu, thêm 1 OpL dung dịch tảo vào mồi buồng đếm. Đem 5
ô lớn. Mật độ tế bào được tính theo cơng thức: N= 0,25a X 106 tế bào/mL (a: là số tế bào
trung bình đếm được.
• Xác định tốc độ tăng trưởng đặc hiệu

Trọng lượng khô tế bào ở hai thời điểm khác nhau trong quá trình tăng trưởng của
mầu tảo được dùng để tính tốc độ tăng trưởng đặc hiệu (p: g/L/ngày) trong khoảng thời

gian đó theo cơng thức:
In (Dry weight2 / Dry weighty)
I1 = —::------ :t—
.tỵ—:“
2
Trong đó: Dry weight 1, Dry weight 2: Trọng lượng khô tại thời diem 1 và 2

ti, t?: thời diem 1 và 2
• Định lượng Astaxanthin

- Xây dựng đường chuẩn Astaxanthin
- Tách chiết Astaxanthin: cân lOmg cho thêm 1mL HC14M, ủ 70°C trong 5 phút.

Ly tâm 6000 vòng/5 phút, bỏ dịch. Rửa lại cắn với nước cất hấp vô trùng 2 lần, ly

tâm lấy cắn. Nghiền cho tơi can, cho ImL aceton và trộ đều; đánh siêu âm 20

phút ở nhiệt độ lạnh. Ly tâm thu dịch chiết. Lấy dịch chiết cho phản ứng với

enzyme Cholesterol esterase. Định lượng astaxathin trong dung dịch chiết sau khi
phản ứng bằng phương pháp HPLC.

11


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Hình thái tể bào tảo Haentatococcus Pluvìalìs

Ket quả khảo sát cho thấy, nồng độ CMS trong mơi trường ni cấy có ảnh hưởng

rõ ràng đến hình thái, màu sắc và mật độ tế bào tảo. Khi nuôi cấy với CMS, màu sắc dịch
tế bào đậm hơn so với mầu đối chứng được nuôi trong môi trường OHM. ớ nồng độ

CMS 0,01% màu sắc tế bào tảo hầu hết đã chuyển sang màu đỏ và kích thước tế bào lớn
sau 03 ngày ni cấy. Các điều kiện CMS 0,05% và 0,1% tế bào dần chuyển sang màu dở
sau 06 ngày nuôi cấy. Bên cạnh đó, tế bào tảo duy trì màu xanh cho đen ngày nuôi cay 18
và bắt đầu chuyển dần sang màu đỏ khi nuôi cấy trong mô trường CMS 0,2% và OHM

(hình 3.2).
Màu sắc dịch ni cấy cũng có sự khác biệt rõ ràng, ở điều kiện môi trường OHM và

CMS 0,2% màu sắc dung dịch đậm hơn so với ban đầu. Các điều kiện CMS 0,05% và
0,1% màu sắc dung dịch ni cấy khơng có sự thay đổi khác biệt, tuy nhiên ở điều kiện

0,01% màu sắc dịch nuôi cấy chuyển sang màu đỏ chỉ sau 5 ngày nuôi cấy (hình 3.1)

Hình 3. 1. Dịch ni cây tảo Haematococcus Pluvialis

12


Nghiên cứu của Mark Harker và các cộng sự đã chỉ ra rằng, yếu tố dinh dưỡng và

vật lý có ảnh hưởng để khả năng tích lũy astaxanthin của H.pluvialis. Trong đó, yếu tố về

dinh dường trong mơi trường ni cấy là một trong những yếu to rất quan trọng. Sự thiếu
hụt nitơ có cảm ứng đến q trình tạo astaxanthin [1], trong điều kiện CMS 0,01% hàm

lượng dinh dưỡng thấp làm sự sinh trưởng của tảo bị ức chế dẫn đen việc thay đổi màu
sắc của tế bào trong một thời gian ngắn. Ngược lại, khi trong môi trường giàu dinh dưỡng

như OHM và ở các nồng CMS cao hơn nhiều dinh dường hơn kích thích tảo tăng trưởng
cho đến khi hàm lượng các chất dinh dưỡng trong dung dịch nuôi cấy bị cạn kiệt tế bào

dần chuyến sang màu đỏ.

13


14


15

Hình 3. 2. Hình thái tê bào tảo Haematococcus Pluvialis

16


3.2. Sự tăng trưởng của tảo Haematococcus pluvìalìs
Ket quả thí nghiệm cho thấy, tảo H.pỉuviaỉis có the sinh trưởng được trong mơi

trường có CMS, tuy nhiên do hàm lượng chất khoáng khá thấp dần đến sự tăng trưởng
của tảo thấp hon nhiều so với mầu đối chứng môi trong môi trường OHM.

Nồng độ CMS có ảnh hưởng lên sự tăng trưởng của quần thể tảo H.pluvialis. Khi
tăng dần nong độ CMS mật độ tế bào và trọng lượng khô tăng tỷ lệ thuận theo. Sau 12

ngày nuôi cấy ở nồng độ CMS 0,2% tảo cho mật độ cao nhất là 19,3x 104 tế bào/mL với
trọng lượng khô là 192,689 mg/L. Ket quả này cao hơn gấp 2 lần khi nuôi cấy tảo
H.pluvỉalis trong mơi trường có bổ sung nước thải sắn 2,5 % với mật độ tế bào tối đạt

9,13 X104 tế bào/mL do tác giả OHC Rodrigues đã công bo. Tuy nhiên, mật độ tế bào khi

nuôi cấy ở nồng độ CMS này vẫn thấp hơn mẫu đối chứng khi ni cấy trong mơi trường
OHM có the giải thích do trong điều kiện CMS hàm lượng các chất khoáng thấp không

cung cấp đủ chất dinh dưỡng đế tảo sinh trưởng và tăng sinh số lượng te bào. Thực
nghiệm cho thấy, thời gian của giai đoạn tăng trưởng tỷ lệ thuận với nồng độ CMS. Tốc

độ tăng trưởng đặc hiệu khi nuôi cấy ở điều kiện CMS 0,1% là 0,06 mg/L/ngày cao hơn
không đáng ke so với các điều kiện còn lại và thấp hơn 2 lần so với mầu đối chứng (hình
3.3, 3.4 và 3.5, bảng 3.1).

Hình 3.3. Mật độ tế bào tảo ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau
Trong thành phần của CMS có chứa các chất dinh dưỡng (nitơ, phospho) và các vi

lượng sắt (Fe) và bo (B) là những yếu tố cần thiết cho sự sinh trưởng của vi tảo

H.pỉuvialỉs, do đó tảo vần có thể sinh trưởng trong môi trường CMS mặc dù môi trường

này khá nghèo nàn về mặt dinh dường. Theo nghiên cứu của Bahareh Nahidian và các
cộng sự đà cho thấy, N và p rất cần thiết cho quá trình phân chia tế bào do là hai yếu tố

17


quan trọng cho sự tổng hợp thành tế bào. Khi giảm nồng độ N xuống 50% so với lượng N
ban đầu trong môi trương BBM, không ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển của tế bào;
nhưng khi tăng nồng độ N lên gấp 2 - 3 lần làm tăng tỉ lệ tăng trưởng cùa tảo lần lượt

86% và 14% [15]. Trong thí nghiệm này, khi sử dụng CMS đe nuôi cấy cho thấy mật độ
tế bào cũng như khối lượng sinh khối khô của tảo cũng không ảnh hưởng đáng kể mặc dù

nồng độ N và p rất thấp. Mặt khác, tảo H. pluvialis được môi cấy trong môi trường giàu
dinh dưỡng OHM có mật độ tế bào tăng liên tục và cao hơn rất nhiều so với môi trường

CMS. Tốc độ tăng trưởng của tảo Haemetococcus pluvialis tăng khi tăng nong độ Fe 3+
có the do Fe là xúc tác oxy hóa khử trong hệ thống quang hợp tảo và do đó là sự đồng

hóa phân tử NADPH năng lượng cao [15]. Ket quả thực nghiệm của đề tài có xu hướng
giống với nghiên cứu của Bahareh Nahidian.

(OHM)

Điêu kiện ni cây

Hình 3. 5. Tốc độ tăng trưởng đặc hiệu của tảo

Hình 3. 4. Trọng lượng khơ của tảo Haematococcuspỉuvialis ở các
điều kiện nuôi cấy

18


Bảng 3.1. Khối lượng sinh khối khô của Haematococcusphtvialis ở các điều kiện nuôi cấy

Điều kiện về nồng độ CMS (%)

Ngy 0
ã2

Ngy 3
".

Cm

o
u

Ngy 6
Ngy 9

<â

X
g
â
C

40
X
2

Ngy 12
Ngy 15

Ngxy 18
Ngy 21
Ngy 24

0,01

0,05

0,1

0,2

OHM

99,667

99,667

99,667

99,667

99,667

0,333 la

0,333 Ia

0,333 la

0,333 la

0,333 la

133,221±

144,517±

149,500±

147,174±

262,123±

2,877 lb

5,754 12bc

2,179 2bc

2,075 12b

1.9583b

141,859±

156,144 ±

165,779±

177,074±

408,966±

0,879 lc

1,448 lcd

0,332 2c

0,575 3c

4,395 4c

150,497±

162,789 ±

150,164 ±

186,044±

1127,064±

4,395 12d

0,575 2d

0,332 lbc

1,661 3cd

3,469 4d

146,178±

147,839 ±

153,819±

192,689±

1282,378±

0,332 2d

1,661 lbc

3,469 12bc

3,3223e

0,575 4e

139,866±

146,676±

149,666 ±

189,034±

1249,156±

0,439 lc

1,163 lbc

1,297 lbc

0,3322de

1,602 3ed

133,553±

145,513±

151,493±

185,380±

1259,122±

0,575 lb

3,045 2bc

1,151 2bc

3,045 3cd

2,877 4ed

131,228±

140,862±

139,533±

179,400±

1249,156±

1,758 lb

0,879 lb

5,754 lb

5,754 2cd

3,045 3ed

131,560±

148,503±

136,211±

183,387±

1252,478±

2,302 lb

2,075 Ibc

8,790 lb

3,045 2cd

3,322 3ed

Các số trung bình trong hàng với các mâu tự số khác nhau khác biệt có ỷ nghĩa ờ mức p < 0,05

Các số trung bình trong cột với các mâu tự chữ khác nhau khác biệt có ỷ nghĩa ớ mức p < 0,05

19


3.3. Hàm lượng astaxanthin

Hàm lượng astaxanthin trong tảo Haematococcus pỉuvialis có bị ảnh hưởng bởi
các mơi trường có nồng độ CMS khác nhau. Hàm lượng astaxanthin được tích lũy ở điều

kiện CMS 0,01% là 3,1% (so với trọng lượng sinh khối khô) cao hơn khi nuôi cấy ở các
điều kiện ni cấy có nồng độ CMS cao hơn (0,05%; 01,%, 0,2%). Bên cạch đó, thời

gian te bào tảo bắt đầu bị ức che để tạo astaxanthin tỷ lệ thuận với nong độ CMS có trong

mơi trường ni cấy. Cụ thể, tảo sau 15 ngày nuôi cấy ở điều kiện CMS 0,2% mới bắt
đầu đổi màu và tích lũy dan astaxanthin, trong khi đó ở các điều kiện CMS có nồng độ

thấp hơn (0,1%; 0,05% và 0,01%) có thời gian chuyển pha tích lũy astaxanthin ngắn hơn;
đặc biệt là nồng độ CMS 0,01% chỉ sau 3 ngày nuôi cấy tế bào dần chuyển sang đỏ và
tích lũy astaxanthin (hình 3.6).
■ CMS 0.01%

■ CMS 0.05%

Hình 3. 6. Hàm lượng astaxanthin được tích lũy ở các điều kiện nuôi cấy

Khi tiếp xúc với điều kiện mơi trường khắc nghiệt, Haematococcus pỉuvialỉs sè
tích lũy một lượng lớn astaxanthin. Trong điều kiện tăng trưởng tối ưu tế bào sinh dường

của tảo vẫn tồn tại và chứa các carotenoid thường được tìm thấy trong lục lạp như là flcarotene, lutein, violaxanthin, neoxanthin và zeaxanthin (thường được gọi chung là
carotenoide sơ cấp). Tuy nhiên, khi tảo tiếp xúc với các điều kiện hạn chế tăng trưởng tế

bào bắt đầu tong họp astaxanthin, đồng thời sẽ có những thay đổi về hình thái, tế bào trịn
và to hơn có vách dày và chuyển dần sang màu đỏ để tồn tại được trong môi trường điều

kiện khắc nghiệt. Sự hình thành astaxanthin ở H. pluvialis có liên quan đến nhừng thay
đổi lớn trong đặc điểm hình thái, sinh lý và quang họp của tảo.
20


Dinh dưỡng và các thông số môi trường là những yếu tố có thế gây ra sự hình

thành astaxanthin trong tế bào của H. pỉuvialis. Khi được nuôi cấy trong mơi trường
OHM, tảo duy trì trạng thái xanh và tăng trưởng mạnh và chỉ khi các thành phần dinh
dường và vi lượng trong môi trường như nitrat bị cạn kiệt khiến sự phát trien trở nên hạn
chế, các tế bào bị ức chế và tích lũy astaxanthin. Trong nghiên cứu của Mark Harker và

các cộng sự đà chỉ ra rõ, khi giảm nong độ N và p trong môi trường ni cấy kích thích

tảo tạo astaxanthin [1]. Trong mơi trường CMS nồng độ N và p thấp hơn rất nhiều so với

mơi trường OHM, do đó đã tạo ra một mơi trường khắc nghiệt làm tảo H.pluvialis kích
thích tạo astaxanthin. Nồng độ CMS càng thấp thời gian tảo chuyển dạng tích lũy
astaxanthin càng ngắn.

21


CHƯƠNG 4, KẾT LƯẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Ket luận

Môi trường CMS có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và khả năng tích lũy
astaxanthin của tảo Haematococcus pluvialis. Cụ thể, mật độ tế bào và khối lượng khơ có
xu hướng tăng khi tăng nong độ CMS từ 0,01 % lên 0,2% tuy nhiên, so với mẫu đối

chứng nuôi trong môi trường OHM năng suất về sinh khối còn thấp hon rất nhiều. Ngược

lại, ở nồng độ CMS càng thấp tảo có xu hướng tạo asxanthin nhiều và nhanh hơn để tồn
tại trong môi trường nghèo nàn các chất dinh dường và vi khoáng.

Dựa vào kết quả này, tùy vào mục tiêu nghiên cứu ta có thể lựa chọn các nồng độ
CMS để nuôi cấy tảo. Nếu muốn tăng sinh khối tảo có thể sử dụng CMS ở nồng độ cao,
cịn nếu mục tiêu dùng để ức chế thúc đẩy tạo astaxanthin thì lựa chọn nong độ CMS

thấp.
4.2. Kiến nghị

Khảo sát các yếu tố bổ sung thêm vào môi trường CMS 0,2% để tăng sinh khối,

đồng thời ứng dụng nuôi cấy tảo Haematococcus pluvialis trong môi trường CMS 0,01%

ở quy mô túi lớn 5L đánh giá hiệu quả gây ức chế tế bào đe tạo astaxanthin.

Chủ nhiệm đề tài

(Ký và ghi rõ họ tên)

22

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]

M. Harker, A. J. Tsavalos, and A. J. Young, "Factors responsible for astaxanthin
formation in the Chiorophyte Haematococcus pluvialis," Bioresource Technology,
vol. 55, pp. 207-214, 1996/03/01/ 1996.

[2]

T. Gõksan, i. Ak, and c. Kihẹ, "Growth Characteristics of the Alga

Haematococcus pluvialis Flotow as Affected by Nitrogen Source, Vitamin, Light
and Aeration," Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, vol. 11, pp.

377-383,09/01 2011.

[3]

c. Zhang, J. Liu, and L. Zhang, "Cell cycles and proliferation patterns in

Haematococcus pluvialis," Chinese Journal of Oceanology and Limnology, vol.
35, pp. 1205-1211, 2017/09/01 2017.

[4]

K. Chekanov, E. Lobakova, I. Selyakh, L. Semenova, R. Sidorov, and A.

Solovchenko, "Accumulation of Astaxanthin by a New Haematococcus pluvialis

Strain BM1 from the White Sea Coastal Rocks (Russia)," Marine Drugs, vol. 12,
pp. 4504-4520, 08/01 2014.

[5]

M. Orosa, J. F. Valero, c. Herrero, and J. Abalde, "Comparison of the
accumulation of astaxanthin in Haematococcus pluvialis and other green
microalgae under N-starvation and high light conditions," Biotechnology Letters,

vol. 23, pp. 1079-1085, 2001/07/01 2001.

[6]

T.-B. Zou, Ọ. Jia, H.-W. Li, C.-X. Wang, and H.-F. Wu, "Response surface
methodology

for

ultrasound-assisted

extraction

of

astaxanthin

from

Haematococcuspluvialis," Marine drugs, vol. 11, pp. 1644-1655, 2013.

[7]

s. Dong, Y. Huang, R. Zhang, s. Wang, and L. Yun, "Four Different Methods

Comparison for Extraction of Astaxanthin from Green Alga Haematococcus
pluvialis," TheScientificWorldJournal, vol. 2014, p. 694305, 01/19 2014.

[8]

J. Igielska-Kalwat, J. Goscianska, and I. Nowak, "Carotenoids as natural

antioxidants," Postẹpy higieny i medycyny doswiadczalnej (Online), vol. 69, pp.
418-28,01/02 2015.

[9]

M. Sztretye, B. Dienes, M. Gonczi, T. Czirjak, L. Csemoch, L. Dux, et al.,

"Astaxanthin: A Potential Mitochondrial-Targeted Antioxidant Treatment in

23


Diseases and with Aging," Oxidative medicine and cellular longevity, vol. 2019,
pp. 3849692-3849692, 2019.

[10]

F. Haque, A. Dutta, M. Thimmanagari, and Y. w. Chiang, "Intensified green

production of astaxanthin from Haematococcus pluvialis" Food and Bioproducts
Processing, vol. 99, pp. 1-11, 2016/07/01/ 2016.

[11]

J. Liu, z. Sun, Y. Zhong, H. Gerken, J. Huang, and F. Chen, "Utilization of cane
molasses towards cost-saving astaxanthin production by a Chlorella zofingiensis

mutant," Journal ofApplied Phycology, vol. 25, 10/01 2013.
[12]

Lưu Thị Tâm, Lê Thị Thơm, Nguyền cẩm Hà, Lê Hà Thu, and Đ. D. Hồng,

"BƯỚC ĐẦU NGHIÊN cứu ÚNG DỤNG SINH KHỐI TẢO Haematococcus
pluvialis GIÀU ASTAXANTHIN LÀM THÚC ÀN Bố SUNG CHO CẢ HỒI

VÂN ở VIỆT NAM " TẠP CHỈ SINH HỌC, vol. 37, pp. 470-478, 2015.

[13]

Đặng Diễm Hồng, Đinh Thị Ngọc Mai, Bùi Đình Lãm, Lưu Thị Tâm, Nguyễn Thị

Thu Thủy, Nguyền cẩm Hà, et al., "ẢNH HƯỞNG KÉT HỢP CỦA NỒNG ĐỘ

NITRATE VÀ CHẾ ĐỘ CHIẾU SÁNG LÊN SINH TRƯỞNG CỦA VI TẢO
Haematococcus pluvỉaỉis," TẠP CHỈ SINH HỌC, vol. 34, pp. 493-499, 2013.

[14]

Trịnh Ngọc Nam, Trương Ngọc Bảo Trân, Huỳnh Thị Hiếu, Nguyễn Thị Duy

Hiền, and T. T. B. Liên, "NÂNG CAO sự TÍCH LŨY ASTAXANTHIN ở VI

TẢO Haematococcus pluvialis BỞI CÁC ĐIÊU KIỆN STRESS CỦA MỊI
TRƯỜNG NI CẤY," Tạp chỉ Khoa học công nghệ và Thực phẩm, vol. 13, pp.

48-59, 2017.

[15]

B. Nahidian, F. Ghanati, M. Shahbazi, and N. Soltani, "Effect of nutrients on the

growth and physiological features of newly isolated Haematococcus pluvialis

TMU1," Bioresource Technology, vol. 255, pp. 229-237, 2018/05/01/ 2018.

24