Khảo sát một số hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa và kháng ung thư của cao chiết nấm vân chi đỏ pycnoporus sanguineus
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.71 MB, 37 trang )
ĐẠI HỌC
NGUYEN TẤT THÀNH
ọ
o>ì
H
•o
ƠQ
r
ị»ỉ
£
a
o
NGUYEN TAT THANH
THỤC HỌC - THỤC HÀNH - THỤC DANH - THỤC NGHIỆP
KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
s?
H
■o>
H
CZI
O’5
p
•>
H
H
z
I
KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP
KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH
KHÁNG KHUẨN, KHÁNG OXY HÓA
VÀ KHÁNG UNG THƯ CỦA CAO
CHIẾT NẤM VÂN CHI ĐỎ
PYCNOPORUS SANGUINEUS
Sinh viên thực hiện : Đồ Trọng Lễ
NJ
o
NJ
o
MSSV
: 1711542598
GVHD
: ThS. Nguyễn Thị Phương
TP. HCM, 2020
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN.......................................................................................................... i
MỤC LỤC............................................................................................................... ii
TÓM TẮT.............................................................................................................. iv
SUMMARY........................................................................................................... vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH.......................................................................... vii
DANH MỤC BẢNG BIẾU................................................................................. viii
DANH MỤC CHƯ VIẾT TẤT............................................................................ ix
ĐẶT VẤN ĐỀ......................................................................................................... X
CHƯƠNG 1. TÓNG QUAN TÀI LIỆU................................................................ 1
1.1 Đặc điêm của p. sanguineus.................................................................................... 1
1.2 Phân loại.................................................................................................................... 2
1.3 Phân bố.......................................................................................................................2
1.4 Tác dụng và các nghiên cứu trong y học.............................................................. 3
1.5 ứng dụng trong công nghiệp.................................................................................. 7
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu......................9
2.1 Địa điểm thực hiện đề tài......................................................................................... 9
2.2 Vật liệu nghiên cứu.................................................................................................. 9
2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu................................................................... 9
2.3.1 Phương pháp tách chiết cao thô từ p. sanguineus............................................ 9
2.3.2 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn.........................................................................10
2.2 .3 Hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết từ p. sanguineus bằng phương pháp
DPPH....................... ........................................................... ....................
11
2.3 .4 Phương pháp xác định hoạt tính gây độc của các cao chiết từ p. sanguineus
12
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...................................................... 14
3.1 Ket quả hiệu suất tách chiết cao chiết từ p. sanguineus.................................... 14
3.2 Ket quả hoạt tính kháng khuẩn............................................................................. 14
ii
3.2.1 Phương pháp xác định vòng kháng khuẩn........................................................ 14
3.2.2 Phương pháp pha loăng xác định nong độ ức chế tối thiêu (MIC)............... 16
3.3 Ket quả hoạt tính kháng oxy hóa.......................................................................... 17
3.4 Ket quả hoạt tính kháng ung thư...........................................................................19
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ................................................................................. 21
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................. 22
iii
TÓM TẤT
Các nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra một số đặc tính dược học của nấm Vân chi
đở Pycnoporus sanguineus (P. sanguineus') như gây độc tế bào ung thư, kháng khuẩn,
kháng viêm, kháng oxy hóa và kháng virus. Tuy nhiên, các dừ liệu tập trung vào việc
khai thác hoạt tính sinh học ở giai đoạn quả the của của nấm p. sanguineus thu nhận từ
tự nhiên. Nghiên cứu này được thực hiện để xác định hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy
hóa và kháng ung thư của p. sanguineus nuôi cấy ở giai đoạn tiền quả thể, nhằm đánh
giá và mở rộng tiềm năng loại nấm này. Nam p. sanguineus trước tiên được tách chiết
bằng phương pháp ngấm kiệt hai dung môi Methanol (MeOH) và Ethanol (EtOH). Khả
năng kháng khuẩn của cao chiết được xác định bằng phương pháp xác định vịng kháng
khuẩn và phương pháp pha lồng xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC). Hoạt tính
kháng oxy hóa được xác định bằng phương pháp DPPH (2,2-diphenyl-1 - picrylhydrazy).
Hoạt tính gây độc tế bào được khảo sát bằng phương pháp MTT (3-(4,5-Dimethyl-2-
thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide). Ket quả cho thấy hiệu suất tách chiết
p. sanguineus bằng dung môi Methanol là 4,72%, Ethanol là 2,37%. Cao chiết p.
sanguineus có hoạt tính kháng khuẩn trên cả bốn chủng vi khuẩn gây bệnh (E. coli, p.
aeruginosa, s. aureus, B. cereus) với MIC là 2,5 mg/ml, thấp hơn kháng sinh
Streptomycin 25 lần. Ket quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa cùa cao chiết p.
sanguineus cho thấy hai loại cao chiết MeOH và EtOH đều có khả năng loại bỏ gốc tự
do DPPH IC50 lần lượt là 3,41 pg/ml; 3 pg/ml tương đương hoạt tính kháng oxy hóa của
Ascorbic acid (Vitamin C) thương mại. Ket quả khảo sát hoạt tính kháng ung thư của
cao chiết p. sanguineus trên ba dòng te bào cho thấy cao chiết p. sanguineus có hoạt
tính gây độc tế bào tốt. Hoạt tính kháng ung thư thơng qua giá trị IC50 của cao chiết
MeOH trên tế bào ung thư gan Hep G2 và ung thư vú MCF7 lần lượt là 72,02 pg/ml và
59,27 pg/ml. Tương tự, ICsocủa cao chiết EtOH trên tế bào ung thư gan Hep G2 và ung
thư vú MCF7 lần lượt là 46,73 pg/ml và 36,09 pg/ml. Thêm vào đó, IC50 của cao chiết
p. sanguineus trên tế bào không ung thư HEK 293 khá cao, cao chiết MeOH với IC50 là
80,27 pg/ml, cao chiết EtOH với IC50 là 84,01 pg/ml. Điều đó chứng tỏ cao chiết p.
sanguineus có hoạt tính gây độc tế bào ung thư cao hơn khả năng ảnh hưởng đến tế bào
không ung thư. Nhìn chung, cao chiết p. sanguineus đều có hoạt tính sinh học đáng chú
IV
ý. Ngoài ra, p. sanguineus được tách chiết trong dung mơi Ethanol có hoạt tính sinh học
tốt hơn dung mơi Methanol.
V
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Pycnoporus sanguineus (L.) Murrill 1904....................................................... 2
Hình 3.1 Vịng kháng khn cùa cao chiết từ p. sanguineus........................................... 15
Hình 3.2 Hình ảnh thử nghiệm của phương pháp pha lỗng cao chiết từ p. sanguineus
................................................................................................................................................. 17
Hình 3.3 Hiệu suất loại bỏ gốc tự do DPPH của cao chiết từ p. sanguineus và
Vitamin c............................................................................................................................... 18
Hình 3.4 Biểu đồ so sánh giá trị IC50 gây độc tế bào của cao chiết từ p. sanguineus.. 19
vii
DANH MỤC BẢNG BIẾU
Bảng 3.1 Hiệu suất tách chiết nấm từ p. sanguineus trên 2 loại cao chiết.................... 14
Bảng 3.2 Đường kính vịng kháng khuẩn của cao chiết từ p. sanguineus.................... 14
Bảng 3.3 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết từ p. sanguineus................... 16
Bảng 3.4 Khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH cùa cao chiết từ p. sanguineus và Vitamin
c............................................................................................................................................... 18
Bảng 3.5 Giá trị IC50 cao chiết từ p. sanguineus và chứng dương Doxorubicin.........19
viii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẤT
Tên viết tắt
Tên đầy đủ
ATCC
Ngân hàng giống vi sinh vật (American Type Culture Collection)
DMSO
Họp chất hữu co lưu huỳnh (Dimethyl sulfoxit)
DPPH
Họp chất hóa học hữu co (2,2-diphenyl-l-picrylhydrazyl).
DOX
Kháng sinh thuộc nhóm anthracyclin (Doxorubicin).
EtOH
Rượu etylic hay Etanol (hydroxyetan).
Ft
Feet (đơn vị độ cao, ft =0,3048 mét).
MeOH
Rượu metylic hay Methanol (Ancol metylic).
MTT
Xét nghiệm do màu (3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-
tetrazolium bromide).
IX
ĐẶT VẤN ĐÈ
Nấm là nguồn thực phẩm với hàm lượng dinh dưỡng cao, hơn cả dinh dưỡng của
động vật và thực vật. Ngồi giá trị dinh dưỡng, nấm cịn được biết đến là nguồn dược
liệu quý hiếm. Trong đó, nấm Vân Chi đỏ Pycnoporus Sanguineus (P. sanguineus') phân
lập từ tự nhiên đã được chứng minh có hoạt tính sinh học đáng qua tâm như khả năng
kháng ung thư cao, kháng được virus, kháng vi khuân, kháng oxy hóa và kháng viêm.
Các chiết xuất từ p. sanguineus phân lập từ tự nhiên mang lại hiệu quả cao trong
nhiều lĩnh vực khác nhau. Trong đó, hoạt chất polyscacharide của p. sanguineus có hoạt
tính kháng ung thư cao. Do đó, hoạt chất này có tiềm năng trong ứng dụng điều trị ung
thư, cùng với các loại thuốc điều trị hiện tại góp phần làm giảm nguy cơ kháng thuốc.
Hoạt chat laccase đang được ứng dụng khử màu thuốc nhuộm trong ngành công nghiệp
dệt may, nhằm mục đích giảm bớt nguồn hóa chất tổng họp nguy hiếm và gây ô nhiễm
môi trường. Đặc biệt, hoạt chat Cinnabarin được tách chiết từ nấm còn được chứng minh
có khả năng chống virus, tiềm năng ứng dụng trị bệnh có nguồn gốc virus trong tương
lai. Các chiết xuất từ nấm Vân Chi đỏ còn the hiện nhiều hoạt tính sinh học đáng chú ý
như kháng vi sinh vật (kháng vi khuẩn và kháng nấm), kháng oxy hóa và kháng viêm.
Do đó, nghiên cứu về hoạt tính sinh học của nấm Vân Chi đỏ p. sanguineus được coi là
hướng nghiên cứu tiềm năng trong y dược học.
Tại Việt Nam, cơng trình nghiên cứu về lồi nấm p. sanguineus còn hạn chế do
một số bất cập về nguồn nguyên liệu khơng có sằn hoặc ít thơng tin về lồi nấm này ở
Việt Nam. Do đó, hướng nghiên cứu về hoạt tính sinh học của nấm p. sanguineus ni
cấy được coi là cần thiết nhằm chứng minh tiềm năng, giá trị cùa nguồn nấm nuôi cấy.
Vỉ vậy, đề tài: “Khảo sát một số hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa và
kháng ung thư cua cao chiết nấm Vân chi đỏ (P. sanguineus)” được thực hiện nhằm
góp phần tăng thêm dữ liệu thơng tin về các lồi nấm có tính sinh học cao tại Việt Nam.
Mục tiêu ciia đề tài
Xác định hoạt tính sinh học của cao chiết nấm Vân chi đỏ p. sanguineus ni cấy
bao gồm hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa và kháng ung thư.
X
Nội dung nghiên cứu
1. Tách chiết cao chiết thô từ nấm p. sanguineus ni cấy.
2. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết p. sanguineus thông qua phương
pháp khuếch tán đìa thạch và phương pháp pha lỗng xác định MIC - nồng độ
ức chế tối thiếu trên một số chủng vi khuẩn.
3. Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết p. sanguineus thông qua phương
pháp DPPH.
4. Khảo sát hoạt tính kháng ung thư của cao chiết p. sanguineus thông qua phương
pháp MTT.
XI
Chương 1. Tổng quan tài liệu
CHƯƠNG 1. TÔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Đặc điểm của p. sanguineus
Thế giới nấm cung cấp một lượng lớn nguồn đa dạng sinh học hấp dẫn khác nhau,
dường như là vô tận và tạo thành một nguồn khai thác phong phú. Cho đến nay, gần
75.000 loài nấm sợi được biết đến nhưng có thế cịn hàng ngàn lồi nữa. Trong số các
loại nấm, nhóm Polyporale, đại diện tốt nhất của nấm mũ có tiềm năng phân hủy lignin
và cellulose cao đã được công nhận. Trong số đó, p. sanguineus đang được quan tâm
nghiên cứu về các hoạt chất sinh học tách chiết từ loài nấm này1.
Chi Pycnoporus là các polypores dở, bao gơm bơn lồi: Pycnoporus cỉnnabarinus
có nguồn gốc ở Vùng ơn đới Bắc, Pycnoporus cocconeus xuất hiện chủ yếu ở các quốc
gia giáp với Ấn Độ Dương và Thái Bình Dương, p. sanguineus được tìm thấy ở vùng
nhiệt đới phía Nam và cận nhiệt đới và Pycnoporus Puniceus ở Châu Phi và Án Độ2.
Nấm Vân Chi đỏ (P. sanguineus) được xem là một trong 25 lồi nấm dược liệu
chính trên thế giới có giá trị dược tính rất cao được người tiêu dùng ở nhiều quốc gia
trên thế giới ưu chuộng3, p. sanguineus mang lại hiệu quả cao trong phòng và hồ trợ
điều trị một số bệnh ung thư, đái tháo đường, rối loạn lipit máu, các bệnh lý về tim mạch,
hô hấp, đồng thời giúp tăng cường hệ miền dịch, bảo vệ gan, ức chế HIV type l4.
p. sanguineus có màu dở đặc trưng là một loại nấm được tìm thấy ở độ cao từ 0 8,704 ft ở các vùng nhiệt đới hoặc cận nhiệt đới trên thế giới. p. sanguineus phát triển
chù yếu trên gồ chết hoặc mục nát, thân cây có thể phát triển riêng lẻ hoặc cụm. p.
sanguineus có nắp và thân. Mũ nấm đặc trưng bở một màu dở hoặc cam sáng và có the
thay đổi về đường kính và độ dày2.
Hình thái hệ sợi nấm p. sanguineus thuộc hệ sợi trimitic trong suốt không màu.
Sợi dinh dưỡng với thành mỏng, có vách ngăn, phân nhánh. Sợi cứng có thành rất dày,
không vách ngăn, rất hiếm phân nhánh. Sợi bên cũng có thành dày, khơng vách ngăn,
phân nhánh nhiều5.
Hình thái quả thể nụ nấm xuất hiện thành từng u lồi tròn màu đỏ cam theo đường
rạch bịch, về sau tai nấm mọc thành nhiều tầng xếp chồng lên nhau. Quả the nấm p.
sanguineus trưởng thành hình bán nguyệt có đường kính mũ từ 3 - 14cm mặt dưới màu
1
Chương 1. Tổng quan tài liệu
đậm hơn mặt trên, mặt trên quả thể tạo các vân đồng tâm, mép hơi quăn, mặt dưới tạo
các lồ nhỏ li ti và có thể dày tới 1 - 5mm rất dai hương thơm dề chịu. Trung bình, thân
cây dao động từ 2 - 7cm, nhưng đơi khi khơng có thân, tùy thuộc vào vị trí của nấm trên
nguồn dinh dưỡng khác nhau5.
Hình 1.1 Pycnoporus sanguineus (L.) Murrill 1904
1.2 Phân loại
p. sanguineus hay còn gọi là nấm Vân Chi đỏ ở Việt Nam được xếp vào họ
Polyporaceae, tức họ nấm lồ. Dựa vào đặc diem hình thái và di truyền, hệ thống phân
loại của p. sanguineus được trình bày như sau:
-
Giới: Fungi
-
Ngành: Basidiomycota
-
Lớp : Agaricomycetes
-
Bộ : Polyporales
-
Họ : Polyporaceae
-
Chi: Pycnoporus
-
Loài : sanguineus
1.3 Phân bố
p. sanguineus được phát hiện lần đầu vào năm 1904 trên đảo Guana, một phần của
Quần đảo Virgin (Thuộc Anh), the hiện các đặc tính chịu nhiệt cao, p. sanguineus được
2
Chương 1. Tổng quan tài liệu
tìm thấy chủ yếu trong môi trường nhiệt đới và cận nhiệt đới. Nhiệt độ tăng trưởng tối
ưu là 28"c, có nhiều nơi trên khắp thế giới có thể tim thấy p. sanguineus phát triển. Một
số khu vực bao gồm: phía Nam cùa Bắc Mỹ, Án độ và hầu hết các khu vực ở úc, Nam
và Trung Mỹ. Việt Nam cũng đang nghiên cứu và phát triển lồi nấm này. p. sanguinues
được tìm thấy trong các khu rừng mưa và rừng rụng lá khi gồ chết hoặc mục nát. Điều
kiện môi trường thuận lợi cho sự phát triến của p. sanguinues bao gồm khí hậu ấm, ẩm
hoặc khô. Thông thường nấm phát triển trong mùa thu và mùa đông ở Bắc Mỹ2.
1.4 Tác dụng và các nghiên cứu trong y học
Hoạt tính kháng ung thư. Nhiều hoạt chất tách chiết từ nấm p. sanguineus được
miêu tả có tính chất điều hịa miễn dịch, bảo vệ gan, thuốc chống nhiễm trùng, thuốc trị
đái tháo đường, thuốc chống virus, thuốc chống ung thư. Polysacharide được tách chiết
từ tai (mũ) cùa nấm p. sanguineus có đặc tính chống ung thư và kích thích hệ miễn dịch.
Các polysacharide kích thích tế bào T và hoạt động của chúng trung gian qua cơ chế
miễn dịch phụ thuộc tuyến ức6.
Theo nghiên cứu của Smania và cộng sự năm 2003 trên p. sanguinues tại Brazil
cho thấy hoạt chất Cinnabarin tách chiết từ p. sanguinues có tác dụng gây độc tế bào
ung thư. Cụ thể, Cinnabarin có tác dụng gây độc tế bào u nguyên thần kinh chuột (tế
bào NA, ATCC clone C-1300) ở nồng độ cao 0,62 mg/1 và 1,25 mg/ml. Nghiên cứu còn
cho thấy tác động gây độc cùa họp chất này không đáng ke trên sức sống chuột in vivo.
Không xảy ra trường họp phản ứng viêm, u hạt hoặc ton thương trong các cơ quan ở
chuột sau khi thử nghiệm với Cinnabarin7.
Mười ba loài nấm đại thu nhận tại Nam Phi the hiện hoạt tính gây độc te bào mạnh
được chửng minh các dòng tế bào tế bào ung thư HeLa, HT-29, MCF-7, MIA PaCa và
PC-3 bằng thử nghiệm MTT (3-(4,5-dimethyl-2-thiazolul)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium
bromide), các giá trị IC50 được xác định ở các vi sinh vật có nồng độ gây độc te bào cao
nhất. Trong đó, p. sanguineus có giá trị IC50 lần lượt là 24,2, 48,1, 32,7 <10 và 28,6 trên
các dòng tế bào ung thư HeLa, HT-29, MCF-7, MIA PaCa-2 và PC-3 tương ứng. Quá
trình apoptosis của tế bào ung thư HeLa được xác định bằng cách sử dụng thuốc nhuộm
Hoechst và phalloidin. Những thay đổi về hình thái bao gồm chất nhiễm sắc bị cơ đặc,
màng tế bào phình ra8.
3
Chương 1. Tổng quan tài liệu
Hoạt tính kháng virus. Cũng từ nghiên cứu của Smania và cộng sự năm 2003,
Cinnabarin được tách chiết từ p. sanguineus cịn có tác dụng lên virus dại. Nghiên cứu
cho thấy cinnabarin làm giảm bốn lần nhân đôi số chuẩn độ của virus dại ở nồng độ 0,31
mg/ml. Cụ thể, IC50 trong điều kiện tiêu chuẩn là 128, cinnabarin ở mức 0,155 và 0,310
mg/ml làm giảm khả năng nhiễm virus dại xuống còn 64 và 32 tương ứng7.
Hai laccase chịu nhiệt (Lacl và LacII) được tinh chiết từ p. sanguineus cịn thể
hiện đặc tính phân hủy các chất gây rối loạn nội tiết (EDCs). Lacl và LacII đã được thử
nghiệm để làm giảm các loại EDCs, nonylphenol và triclosan đến hơn 95% sau 8 giờ xừ
lý với 100 Ư/L ở pH 5, được xác định bằng phương pháp HPLC9.
Hoạt tính kháng oxy hóa. Đe giảm các gốc tự do trên tế bào, việc sử dụng các
chất chống oxy hóa tự nhiên được nghiên cứu rộng rài. Một số lồi nấm có chứa một
lượng lớn phân tử giúp loại bỏ các gốc tự do hoặc các phản ứng oxy hóa. Các nhà nghiên
cứu đang quan tâm trong việc tìm kiếm chất chống oxy hóa tự nhiên đe sử dụng trong
các sản phẩm thực phẩm và dược phẩm trong tương lai. Các nghiên cứu gần đây nhằm
thay thế các chất chống oxy hóa tổng hợp như Butylhydroxytoluene (BHT) và
Butylhydroxyanisole (BHA), đã bị cấm do khả năng gây ung thư và các vấn đề sức khỏe
khác bao gom tăng trọng lượng gan và tăng sinh cùa mạng lưới nội chất10.
Trong khi đó, các nghiên cứu gần đây đã cơng bố một số họp chất có hoạt tính sinh
học thu được từ nấm Pyncoporus sanguineus11, đặc biệt là chất chống oxy hóa12. Các
chất này có tác dụng làm chậm đáng kể hoặc ngăn chặn quá trinh oxy hóa cơ chất ở
nồng độ thấp13.
Theo nghiên cứu của Costa và cộng sự năm 2011, các họp chất có hoạt tính kháng
oxy hóa bởi tách chiết từ p. sanguineus trong ni cấy lên men chìm trong mơi trường
dextrose khoai tây bo sung pentone. Chiết xuất thu được từ sợi nấm ở các thời điếm
canh tác khác nhau (5, 10, 15, 20, 25 và 30 ngày) đã thể hiện tiềm năng kháng oxy hóa
thơng qua phương pháp DPPH và hệ thống p-carotene/axit linoleic. Hoạt tính chống oxy
hóa cao nhất đã được xác định trong giai đoạn cân bang, của các chất chiết xuất thu
được sau 30 ngày nuôi cấy với khả năng kháng oxy hóa tương tự như BHT tong họp14.
4
Chương 1. Tổng quan tài liệu
Các đặc tính kháng oxy hóa và kháng khuẩn của các chất chuyến hóa thứ cấp có
trọng lượng phân tử thấp (ex-LMS) từ p. sanguineus nuôi cấy trong các điều kiện nhiệt
độ khác nhau (25°c [ex-LMSa] và 30°C [ex-LMSb]) đã được báo cáo. Các đặc tính
kháng oxy hóa đã được nghiên cứu bằng cách sử dụng phép đo quang hóa, thử nghiệm
ABTS và DPPH với đối chứng dương là Trolox và axit ascorbic (Vitamin C). Ket quả
cho thấy ex-LMSb cao hơn đáng kể so với ex-LMSa 97%, 52% và 31% tương ứng với
phép đo quang hóa, ABTS và DPPH ở nồng độ 50 p/ml. Giá trị IC50 được xác định là
4,17 pg/ml đối với thử nghiệm hóa trị, 47,25 pg/ml đối với thử nghiệm ABTS và 51,46
pg/ml đối với thử nghiệm DPPH15.
Hoạt tính kháng viêm. Trong nghiên cứu của Lu và cộng sự (2010), dòng tế bào
BV-2 được sử dụng làm mơ hình viêm để sàng lọc các họp chất bảo vệ thần kinh từ sợi
nấm p. sanguineus. Có bốn loại steroids bao gom ergosta-7,22-dien-3p-ol (1), 3p,5a-
dihydroxyergosta-7,22-dien-6-one (2), 3p,5a,9a-trihydroxy-ergosta-7,22-dien-6-one
(3), và 3p,5a,6a-trihydroxy-ergosta-7,22-diene (4) được cô lập từ sợi nấm p.
sanguineus. Trong đó, các họp chất (2), (3) và (4) là các họp chất mới được cô lập ở loài
này. Họp chat (1) cho thấy sự ức chế đáng kế việc sản xuất nitric oxyde (NO) do
lipopolysaccharide (LPS) trong các tế bào BV-2, ở nồng độ 15 pM với giá trị 43,5%16.
Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm. p. sanguineus có khả năng tổng họp một
số sắc tố, trong đó, cinnabarin có đặc tính kháng khuẩn17, với tiềm năng điều trị tốt và
ứng dụng dược lý. Cinnabarin là một chất kháng sinh được sản xuất bởi Pycnoporus
sanguinues. Họp chất này là một sắc tố màu cam có cấu trúc phenoxazin-3-one, với
nhóm carbonyl ở C-1, nhóm amin ở C-2 và nhóm hydroxyl ở C-97. p. sanguineus có
hoạt tính kháng khuân cao với B. cereus và L. plantarum bị ức chế bởi nồng độ thấp
nhất của cinnabarin (0,0625 mg/ml). Các giá trị MBC và MIC đã được báo cáo trên
Enterococcus faecalis, Listeriaplantarum, Salmonella sp, Salmonella typhimurium và
Staphylococcus aureusi&.
Nghiên cứu của Rosa (2005) đã báo cáo về quá trình chiết xuất các hợp chất từ các
lồi nấm mũ ni cấy trong mơi trường lỏng và tồn bộ mơi trường ni cấy được chiết
xuất với ethyl acetate. Chiết xuất thô từ p. sanguineus thể hiện hoạt hoạt tính kháng nấm
Candida krusei, vi khuân Listeria monocytogenes và Staphylococcus aureus. Hoạt tính
5
Chương 1. Tổng quan tài liệu
kháng khuẩn của p. sanguineus đối với Staphylococcus aureus được thể hiện trong phân
đoạn ex-LMSb (vùng ức chế 23,5 mm; nồng độ ức chế tối thiếu 0,12 mg/mL). Hình ảnh
qt kính hiền vi điện từ cho thấy sự phá vỡ của các tế bào vi khuẩn khi nuôi trong phân
đoạn ex-LMSb so với đối chứng. Ket quả cho thấy chiết xuất thu được từ p. sanguineus
ni cấy chìm có thể là một nguồn chống oxy hóa và kháng khuấn tốt15.
Nghiên cứu của Al-Fatomi và cộng sự năm 2013 công bố kết quả sàng lọc các nấm
đại có hoạt tính sinh học ở Yemen cho thấy chiết xuất methanol của p. sanguineus có
hoạt tính kháng khuấn, chống lại 3 loại vi khuan Gram dương (Staphyloccocus aureus,
Bacillus subtilis, Micrococcus flavus) và hai loại vi khuân Gram âm (Escherichia coll,
Pseudomonas aeruginosa). Các chiết xuất methanol của p. sanguineus cho thây hoạt
tính kháng nấm đáng ke chống lại sáu loài nấm gây bệnh ở người (Candida albicans,
Candida
krusei,
Aspergillus fumigatus,
Mucor sp.,
Microsporum
gypseum,
Trichophyton mentagrophytes) và một loại nấm không gây bệnh cho người (Candida
maltosa)™.
Tại Việt Nam nấm Vân Chi đỏ (P. sanguineus) đang được biết đến và có những
nghiên cứu hữu ích giúp phát triển ngành nấm của nước ta. Trong đó, nghiên cứu về
hiệu quả thay thế mùn cưa cây cao su bằng cùi bắp đe trồng p. sanguineus được thực
hiện. p. sanguineus được trồng chủ yếu trên mùn cưa cây cao su loại cơ chất phổ biến
ở vùng Đông Nam Bộ. Tuy nhiên, các phụ phẩm nông nghiệp ở đồng bằng sông Cửu
Long chứa hàm lượng cellucose cao (cùi bắp, vỏ trấu...) có tiềm năng được tận dụng đe
thay thế mùn cưa cao su vừa mang lại hiệu quả kinh tế cao, vừa giảm thiếu ô nhiễm môi
trường. Hệ sợi giống cấp 1 có tốc độ phát triển nhanh nhất (1,78 cm/ngày) trên môi
trường PDA bổ sung 10% nước dừa. Khoai mì là mơi trường tốt nhất cho sự phát triển
của hệ sợi giống cấp 3 (0,544 cm/ngày). Công thức phối trộn chứa 50% cùi bắp và 50%
mùn cưa cây cao su không bố sung dinh dưỡng được xem là cơ chất phù hợp nhất cho
sự sinh trưởng, phát triển của p. sanguineus đạt năng suất cao (103 g/bịch phơi)5.
Ngồi ra, các nghiên cứu đảng chú ý khác tiềm năng ứng dụng của nấm p.
sanguineus đã được quan tâm nghiên cứu trong thời gian gần đây. Trong đó, nghiên cứu
của Đinh Thị Thu Hằng và cộng sự (2015) đà chứng minh khả năng loại màu thuốc
nhuộm của Laccase từ p. sanguineus tong hợp và màu thuốc nhuộm thương mại20.
6
Chương 1. Tổng quan tài liệu
Nghiên cứu cùa Trần Minh Long và cộng sự (2018) đà chứng minh khả năng của hệ sợi
tơ nấm giúp p. sanguineus loại bỏ đến 99% vi khuẩn Vibrio parahaemoỉyticus, một loại
vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy dẫn đến tỷ lệ chết 100% tôm thẻ trong thời gian ngắn
ở các trang trại nuôi tôm21.
1.5 Úng dụng trong công nghiệp
p. sanguineus đang được sử dụng nhiều cho mục đích cơng nghiệp và dược phẩm
trên tồn thế giới. Việc các ngành cơng nghiệp sử dụng một lượng lớn thuốc nhuộm,
chủ yếu trong các ngành dệt dần đến sự gia tăng các chất có màu gây ô nhiễm môi trường
cao. Nước thải chứa hồn hợp phức tạp của thuốc nhuộm và muối có độc tính cao và nhu
cầu oxy sinh hóa và hóa học. Khoảng mười nghìn loại thuốc nhuộm tong hợp được sử
dụng trong các ngành công nghiệp dệt, giấy, in và thuộc da tương ứng với 7 X 105 tấn
mồi năm. Các phương pháp xử lý thuốc nhuộm vật lý, hóa học thường liên quan đen xử
lý sinh học thông qua hệ thống bùn hoạt tính. Tuy nhiên, phương pháp này khơng phải
lúc nào cũng đạt hiệu quả để loại bỏ thuốc nhuộm, nó tạo ra một lượng lớn bùn và đòi
hởi phương pháp xử lý bổ sung với chi phí cao như quá trình oxy hóa.22
Hướng ứng dụng enzyme ngoại bào như laccase, mangan peroxydase (MnP),
lignin peroxydase (LiP) có khả năng xúc tác các phản ứng oxy hóa khử được xem là
biện pháp hiệu quả trong việc xử lý thuốc nhuộm và có tiềm năng ứng dụng cao23. Vì
vậy, laccase được tách chiết từ nấm p. sanguineus tiềm năng oxy hóa cao giúp khử màu
thuốc nhuộm trong các ngành công nhiệp dệt may được quan tâm nghiên cứu. Hoạt tính
Laccase được đánh giá bằng q trình oxy hóa
ImM 2,2’-azino-bis (3-
ethybenzothiazoline-6-sulfonate) (ABTS). Chiết xuất enzym Laccase đã được kiểm tra
hoạt tính khử màu thuốc nhuộm trên Remazol Brilliant Blue R (80%), Reactive Blak 5
(2%), Reactive Red 195 (6%) và Reactive Yellow 145 (9%)24.
Trong so các chi Pycnoporus, được biết đến với việc sản xuất laccase, chủng p.
sanguineus đã được chứng minh là tạo ra một phenoloxydase khác, một tyrosinase
monomeric mới với hoạt tính cụ thể là protein 30 và 84 u/mg cho monophenolase và
diphenolase tương ứng. Nghiên cứu này xác định p. sanguineus là nhà sản xuất tiềm
7
Chương 1. Tổng quan tài liệu
năng của một tyrosinase đã chứng minh tính hiệu quả trong việc tơng họp các phân tử
chống oxy hóa và trong liên kết ngang protein25.
Tyrosinase một enzym oxy hóa được tách chiết từ nấm p. sanguineus có tiềm năng
cao cho các ứng dụng cơng nghệ thực phàm. Các hoạt động monophenolase và
diphenolase của tyrosinase được đo từ lysate tế bào. Chúng p. sanguineus cho thấy khả
năng sản xuất protein cao nhất 45,4 u/gđối với monophenolase và 163,6 u/g đối với
diphenolase. Tyrosinase có thể chuyển đổi p-tyrosol và p-coumaric acid thành
hydroxytyrosol và axit caffeic và nó cũng có thể xúc tác cho sự hình thành liên kết các
protein25.
Nam p. sanguineus đã được chứng minh có chứa các hoạt chất có hoạt tính sinh
học cao như kháng ung thư, kháng oxy hóa, kháng viêm và kháng vi sinh vật. Tại Việt
Nam, khơng có nhiều nghiên cứu về các lồi nấm được ni cấy cho ra các cao chiết
hoặc hợp chất có hoạt tính sinh học cao, trong đó có nấm p. sanguineus. Ngồi ra, trên
thế giới cũng chưa có nhiều họp chất có hoạt tính sinh học được phát hiện và cơ lập từ
lồi nấm này. Do đó, đề này này được thực hiện nhằm bước đầu chứng minh hoạt tính
sinh học của cao chiết thơ tách chiết từ p. sanguineus, tạo tiền đề cho việc phát hiện và
cơ lập các hợp chất có hoạt tính sinh học sau này.
8
Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1 Địa điểm thực hiện đề tài
Viện Kỳ thuật Công Nghệ cao - Trường Đại học Đại học Nguyễn Tất Thành. Địa
chỉ: MM2 Hoàng Diệu, phường 13, Quận 4, thành phố Ho Chí Minh.
2.2 Vật liệu nghiên cứu
Nguyên liệu nấm p. sanguineus nuôi cấy giai đoạn tiền quả thể đã được định danh
bằng hình thái và phương pháp sinh học phân tử được cung cấp bởi Viện Kỳ thuật Công
nghệ cao - Trường Đại học Đại học Nguyền Tất Thành26.
Các chủng vi khuẩn được sử dụng trong thử nghiệm kháng khuẩn là hai chủng vi
khuẩn Gram âm (Escherichia coỉi (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC
9027)) và hai chùng vi khuẩn Gram dương (Bacillus cereus (ATCC 10876),
Staphylococcus aureus (ATCC 25923)) được lưu trừ tại Viện Kỳ thuật Công Nghệ CaoNTT Trường Đại học Nguyền Tất Thành. Các dòng tế bào được sử dụng trong nghiên
cứu hoạt tính kháng ung thư bao gồm dịng tế bào thận nguồn gốc phôi người HEK 293
(ATCC CRL-1573), tế bào ung thư vú MCF7 (ATCC HTB-22) và tế bào ung thư gan
Hep G2 (ATCC HB-8065) được cung cấp bởi phịng Cơng Nghệ Sinh học Y Dược,
Trung tâm CNSH TP.HCM.
2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp tách chiết cao thô từP. sanguineus
Nam p. sanguineus sau nuôi cấy được nghiền nhỏ, sau đó được ngâm trong các
dung mơi Ethanol và Methanol theo tỷ lệ 10% (100g nấm tương ứng trong 1 lít dung
mơi) và ủ ở 60°C trong 24 giờ. Bã nấm sau đó được chiết lần hai trong dung môi tương
ứng ở 60°C trong 24 giờ. Dịch chiết sau đó được ly tâm bỏ cặn và cơ quay đuối dung
mơi đến khi có bột cao thơ.
Cao thơ trong dung mơi con Ethanol và Methanol của p. sanguineus sau đó được
cho vào bình hút ẩm đến khối lượng khơng đổi. Khối lượng và độ ẩm của mồi cao chiết
được ghi nhận. Bột cao thô được bảo quản ở nhiệt độ -20°C. Hiệu suất tách chiết được
tính theo cơng thức:
9
Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
H (%) = khối lượng cao chiết thô/khối lượng nấm ban đầu
Cao chiết Ethanol (EtOH) và cao chiết Methanol (MeOH) từ p. sanguineus được
pha trong dung môi dimethyl sulfoxyde (DMSO) ở nong độ 50 mg/ml. Các cao chiết
sau khi hòa tan được lọc vơ trùng với kích thước lồ lọc là 0,22 pm và trữ ở điều kiện -
20°C cho tới khi sử dụng.
2.3.2 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn
2.3.2.1 Phương pháp xác định vòng kháng khuẩn
Khả năng kháng khuẩn cùa cao chiết từ p. sanguineus được xác định dựa trên khả
năng kháng khuấn thơng qua sự khuếch tán chất trong đìa thạch, qua đó sự hình thành
vịng vơ khuấn xung quanh đìa giấy tấm cao chiết tượng trưng cho khả năng kháng
khuẩn của cao chiết so với đối chứng dương.
Dịch cao chiết Ethanol (EtOH) và Methanol (MeOH) 0,5 mg từ p. sanguineus
được thấm vào từng đĩa giấy có đường kính 6 mm. Sau đó đặt từng đìa giấy trên đìa mơi
trường thạch MHA đã được cấy trải dịch vi khuẩn ở nồng độ 105CFU/ml. Đối chứng
dương được sử dụng trong thử nghiệm là kháng sinh Kanamycin và Streptomycin với
lượng 1,0 pg/đìa giấy, đối chứng âm là đĩa giấy tẩm DMSO. Các đĩa vi khuẩn thử
nghiệm sau đó được ủ ở 37°c. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Sau 24 giờ, đường kính vịng kháng khuẩn xuất hiện xung quanh đĩa giấy được ghi
nhận. Đường kính vịng kháng khuẩn thực được tính theo cơng thức sau:
d (mm) = D - dDMSO
Trong đó, D: đường kính vịng vơ khuẩn của cao chiết
dDMso: đường kính vịng vơ khuấn của DMSO
2.3.1.2 Phương pháp pha lỗng xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
Phương pháp pha lỗng các cao chiết thực vật trên đìa 96 giếng và chất chỉ thị màu
resazurin được sử dụng để xác định nồng độ ức chế tối thiếu (MIC, Minimum Inhibitory
Concentration) của các cao chiết đang khảo sát.
10
Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Đe khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, các cao chiết từ p. sanguineus được pha loàng
trong dung dịch DM so thành các nồng độ khảo sát khác nhau. Vi khuẩn được nuôi cấy
qua đêm và pha lỗng trong mơi trường MH (Muller Hilton) đến mật độ 5 X 106
CFU/mL. Mồi giếng được thêm vào 50 pl dịch vi khuẩn và 50 pl cao chiết ở các nồng
độ pha loãng khác nhau trong dung dịch DMSO. Các giếng đối chứng chứa dịch vi
khuẩn, môi trường và DMSO. Các giếng nền (Blank) chứa môi trường và cao chiết. Các
mẫu thừ nghiệm và đối chứng được ủ ở nhiệt độ 37°c Sau 24 giờ cho 20 pl thuốc thử
resazurin 0.1% cho vào mồi giếng. Quan sát sự thay đổi màu và ghi nhận kết quả.
Chất chỉ thi resazurin có màu xanh trong dung dịch. Các giếng có sự đoi màu
resazurin từ xanh sang hồng chứng tỏ vi khuẩn đang phát triển. Nồng độ ức chế tối thiểu
(MIC) là nồng độ thấp nhất trong thử ngiệm ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn (chất
chỉ thị khơng đoi màu).
2.2.3 Hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết từ p. sanguineus bằng phương pháp
DPPH
DPPH là phương pháp được sử dụng để kiểm tra khả năng loại bỏ gốc tự do chỉ
thị cho khả năng kháng oxy hóa của cao chiết từ p. sanguineus. Phương pháp đánh giá
khả năng kháng oxy hóa dựa trên hàm lượng chất kháng oxy hóa và hoạt tính kháng oxy
hóa được thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH.
Nguyên lý. Phương pháp được dựa trên phản ứng khử 2,2-diphenyl-lpicrylhydrazy (DPPH) thành 2,2-diphenyl-l-picrylhydrazin (DPPH - H). DPPH là một
gốc tự do bền, dung dịch có màu tím, có bước sóng hấp thụ cực đại tại Ầ = 517 nm. Các
chất có khả năng kháng oxy hóa sẽ trung hịa gốc DPPH bằng cách cho ion H+, làm giảm
mật độ hấp thụ tại bước sóng cực đại, làm màu của dung dịch sè nhạt dần và chuyến từ
tím sang vàng nhạt.
Cách tiến hành. Dung dịch DPPH được pha loãng trong Methanol đến nồng độ
50 mg/ml. Mầu đối chứng là Ascorbic acid (vitamin C) được pha trong Methanol đến
nồng độ 2 mg/ml. Các cao chiết từ p. sanguineus (50 mg/ml) sau đó được chuẩn bị theo
các nồng độ khác nhau nhằm xây dựng đường kháng oxy hóa tuyến tính. Mầu đối chứng
Vitamin c chuẩn bị theo nồng độ 0, 1, 2, 4, 5 pg/ml. Mầu đối chứng và các cao chiết
11
Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
được thêm vào dung dịch DPPH và các mẫu cao chiết dùng để làm nền thay DPPH bằng
methanol. Các mẫu thí nghiệm được giữ trong điều kiện tránh ánh sáng tại nhiệt độ 25°c
trong 60 phút. Sau đó, các mẫu cao chiết và mẫu đối chứng được đo mật độ quang ở
bước sóng hấp thụ cực đại tại À = 517 nm bằng thiết bị đo OD- JenWay Genova Plus.
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Khả năng ức chế gốc tự do DPPH của các cao chiết từ p. sanguineus được xác
định thơng qua phần trăm ức chế (1%) tính theo cơng thức sau:
Ị 0/0 =
*1-6*2-^)
x 1OO0/o
I: Phần trăm ức chế gốc tự do DPPH.
Ai: Giá trị mật độ quang của Methanol trong DPPH.
A2: Giá trị mật độ quang của mẫu thử sau phản ứng với DPPH.
A3: Giá trị mật độ quang của nền (chỉ chứa cao chiết trong Methanol, không chứa
DPPH).
Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50%). Giá trị IC50 là nồng độ mà tại đó cao chiết bắt
50% gốc DPPH. Hiệu quả loại bỏ gốc tự do cùa các cao chiết được xác định thông qua
giá trị IC50 được tính tốn dựa trên số liệu đo mật độ quang tại bước sóng 517 nm bằng
máy quang phổ và so sánh hiệu quả kháng oxy hóa với đối chứng dương Ascorbic acid.
2.3.4 Phương pháp xác định hoạt tính gây độc cua các cao chiết từ p. sanguineus
Nguyên lý phương pháp. Thử nghiệm MTT được dựa trên nguyên tắc là MTT
[3- (4,5- dimethylthiazol - 2- yl) - 2,5 - diphenyl tetrazolium bromid tham gia phản ứng
oxy hoá khử với ty thể của tế bào và tạo thành các formazan màu tím dạng tinh thể. Phản
ứng chỉ xảy ra trong các tế bào sống khỏe mạnh. Ty thể sẽ không phân cắt MTT nếu tế
bào bị chết. Phương pháp dùng đe đánh giá khả năng gây độc tế bào cùa các hợp chất
trong nghiên cứu.
Ni cấy tế bào. Dịng tế bào thận HEK 293 của phôi người, tế bào ung thư vú
MCF7 và tế bào ung thư gan Hep G2 được nuôi trong mơi trường DMEM có bổ sung
10% huyết thanh thai bò (FBS), 100 pg/ml kháng sinh Penicillin/Streptomycin và ủ ở
37°c, 5% CO2. Te bào sau khi đạt mật độ bám trải đến 80% thì tế bào được tách ra khỏi
bề mặt ni cấy bằng phương pháp Trypsin-EDTA 0,25%. Pha lỗng tế bào sau khi tách
12
Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
đến mật độ 105 tế bào/ml trong môi trường nuôi cấy. 100 pl tế bào đã được pha loãng
được cho vào mồi giếng trong đĩa 96 giếng (Corning). Sau đó, ủ đìa tế bào ở tủ ấm
(37°c, 5% co2) trong 24h.
Thử nghiệm MTT. Các cao chiết Ethanol và Methanol (10 mg/ml trong DMSO)
từ p. sanguineus và chứng dương Doxorubicin được pha loãng ra các nồng độ: 100; 50;
25; 12,5 pg/ml trong môi trường chứa tế bào, với nồng độ DMSO tương ứng: 1%; 0,5%;
0,25%; 0,125%. Đồng thời, các nồng độ của chứng dương được đặt vào giếng khơng có
tế bào được sử dụng để làm nền cho các giếng trong phương pháp MTT. Chứng âm
(DMSO) được pha loãng ra các nồng độ: 1%; 0,5%; 0,25%; 0,125% trong môi trường
nuôi cấy. Phương pháp được lặp lại 3 lần tại mồi nồng độ của cao chiết. Sau khi xử lý
với dung dịch MTT (5mg/ml) sau 48 giờ thử nghiệm, độ hấp thụ quang học ở bước sóng
570 nm của các giếng thử nghiệm được đo bằng máy đọc ELISA (Biotek). Đồ thị the
hiện phần trăm số tế bào chết được vẽ bằng phần mem Prism v5.0. Phần trăm tế bào
chết = 100% - % tế bào cịn sống.
Tỷ lệ ức chế (1%) được tính theo công thức sau:
|(%) = 1OO-
Với
L
X B—c / J
A là OD570 nm của mầu
B là OD570 nm của chứng âm DM so
c là OD570 nm cùa chứng trắng
Giá trị được thế hiện là giá trị trung bình là giá trị trung bình cộng (mean) cùa 3
lần lặp lại thí nghiệm và sử dụng độ lệch chuẩn (SD) de thế hiện sự biến thiên của dừ
liệu. Giá trị IC50 the hiện nồng độ mà tại đó cao chiết hoặc hóa chất giết được 50% số tế
bào ung thư được tính bằng phần mem Prism.
13
Chương 3. Kết quả và thảo luận
CHƯƠNG 3. KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Kết quả hiệu suất tách chiết cao chiết tù’ p. sanguineus
Từ 39,3g mẫu nấm tươi, các mầu nấm được chia thành hai phần ngâm trong dung
môi Methanol (MeOH) và Ethanol (EtOH) trong 48 giờ. Dịch chiết được thu nhận và
cô quay đuổi dung môi đến khối lượng không đổi. Độ ẩm cao chiết EtOH và MeOH lần
lượt là 2,88 ± 0,14% và 4,41 ± 0,37%. Kết quả thu được 0,929g cao chiết từ dung môi
Methanol (cao chiết MeOH) và 0.467g cao chiết từ dung môi Ethanol (cao chiết EtOH).
Hiệu suất tách chiết được trình bày trong Bảng 3.1. Trong hai loại cao được tách chiết
có thể thấy cao chiết MeOH có hiệu suất tách chiết (4,72%) cao hơn cao chiết EtOH
(2,37%).
Bảng 3.1 Hiệu suất tách chiết nấm từ p. sanguineus của hai loại dung môi
Loại cao
Cao chiết MeOH
Cao chiết EtOH
Khối lượng nấm tươi (g)
19,65
19,65
Khối lượng cao thô (g)
0,929
0,467
Hiệu suất tách chiết (%)
4,72%
2,37%
3.2 Ket quả hoạt tính kháng khuẩn
3.2.1 Phưong pháp xác định vịng kháng khuẩn
Hoạt tính kháng khuẩn của p. sanguineus được khảo sát bằng phương pháp khuếch
tán chất trong đĩa thạch đối với bốn loại vi khuan: Escherichia coli (E. coỉỉ),
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), Bacillus cereus (B. cereus), Staphylococcus
aureus (S. aureus). Đường kính vịng kháng khuẩn của cao chiết từ p. sanguineus được
trình bày trong Bảng 3.2. Với kết quả đường kính vịng kháng khn, cao chiết EtOH
và MeOH thể hiện khả năng kháng khuẩn trên hai chủng vi khuẩn gram dương bao gồm
B. cereus và s. aureus cao hơn hai chủng vi khuẩn gram âm bao gồm E. coli và p.
aeruginosa.
14
Chương 3. Kết quả và thảo luận
Bảng 3.2 Đường kính vòng kháng khuẩn của 2 loại cao chiết, DMSO và Streptomycin
Loại cao
^^^chiết
Vi khuẩn
Đường kính vịng kháng khuấn (mm)
Cao chiết MeOH
Cao chiết EtOH
Streptomycin
Escherichia coll
2
3
7
Pseudomonas aeruginosa
1
1
6
Bacillus cereus
3
8
12
Staphylococcusus aureus
2
12
8
Kết quả cho thấy cao chiết từ p. sanguineus có hoạt tính kháng khuẩn tốt với lượng
cao chiết là 0,5 mg cao chiết/đìa giấy. Trong đó, hiệu quả kháng khuẩn của cao EtOH
trên vi khuẩn 5. aureus là cao nhất và trên p. aeruginosa là thấp nhất ở cùng một nồng
độ. Tương tự, hiệu quả kháng khuẩn của cao chiết MeOH là cao nhất trên Bacillus
cereus, thấp nhất trên p. aeruginosa. Thử nghiệm này cho thấy hoạt tính kháng khuẩn
của cao chiết EtOH tốt hơn cao chiết MeOH.
CaoMeOH
Cao EtOH
Streptomycin
DMSO
Hình 3.1 Hình ảnh vịng kháng khuấn của cao chiết từ p. sanguineus
15
