Khảo sát một số hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa và kháng ung thư của cao chiết nấm vân chi đỏ pycnoporus sanguineus

Đỗ Trọng Lễ

ĐẠI HỌC
NGUYỄN TẤT THÀNH
THỰC HỌC - THỰC HÀNH - THỰC DANH - THỰC NGHIỆP

KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH …..CỦA CAO CHIẾT PYCNOPORUS SANGUINEUS

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH
KHÁNG KHUẨN, KHÁNG OXY HÓA
VÀ KHÁNG UNG THƯ CỦA CAO
CHIẾT NẤM VÂN CHI ĐỎ
PYCNOPORUS SANGUINEUS

Sinh viên thực hiện : Đỗ Trọng Lễ
MSSV

: 1711542598

GVHD

: ThS. Nguyễn Thị Phương

2020

TP. HCM, 2020

ĐẠI HỌC
NGUYỄN TẤT THÀNH
THỰC HỌC - THỰC HÀNH - THỰC DANH - THỰC NGHIỆP

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH
KHÁNG KHUẨN, KHÁNG OXY HĨA VÀ
KHÁNG UNG THƯ CỦA CAO CHIẾT
NẤM VÂN CHI ĐỎ PYCNOPORUS
SANGUINEUS
Sinh viên thực hiện : Đỗ Trọng Lễ
Mã số sinh viên

: 1711542598

Lớp

: 17DSH1A

Chuyên ngành

: Công nghệ Sinh học

Giáo viên hướng dẫn: ThS. Nguyễn Thị Phương

TP. HCM, 2020

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH
Khoa Công nghệ Sinh học
------------------

CỘNG HỊA XÃ HƠI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc
-----oOo-----

NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Họ và tên: Đỗ Trọng Lễ

MSSV: 1711542598

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Lớp: 17DSH1A

1. Đầu đề luận văn:
Khảo sát một số hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa và kháng ung thư của cao
chiết nấm Vân chi đỏ Pycnoporus sanguineus
2. Mục tiêu
Xác định hoạt tính sinh học của cao chiết nấm Vân chi đỏ (P. sanguineus) nuôi cấy

-

bao gồm hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa và kháng ung thư.
3. Nội dung:
-

Tách chiết cao chiết thô từ nấm vân chi đỏ P. sanguineus ni cấy.

-

Khảo sát hoạt tính kháng kh̉n của cao chiết từ P. sanguineus thông qua phương pháp

khuếch tán đĩa thạch và phương pháp pha loãng xác định MIC – nồng độ ức chế tối thiểu
trên một số chủng vi khuẩn.
-

Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết từ P. sanguineus thông qua phương

pháp DPPH.
-

Khảo sát hoạt tính kháng ung thư của cao chiết từ P. sanguineus thông qua thử nghiệm

MTT.
4. Thời gian thực hiện: tháng 6/2020 đến tháng 9/2020
5. Người hướng dẫn chính: ThS. Nguyễn Thị Phương
Nội dung và yêu cầu KLTN đã được thông qua Bộ môn.
TP. HCM, ngày…… tháng……năm20…
Khoa/Bộ môn

Cán bộ hướng dẫn

(Ký và ghi rõ họ tên)

(Ký và ghi rõ họ tên)

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn khoa Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Nguyễn
Tất Thành và đặc biệt là Viện Kỹ thuật Công Nghệ cao – Trường Đại học Đại học
Nguyễn Tất Thành đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và thực hiện đề tài tốt
nghiệp.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến cơ Th.S Nguyễn Thị Phương đã tận tình
chỉ bảo tơi trong khoảng thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học đã tận tụy giảng
dạy, trang bị cho tôi những kiến thức quý báu trong những năm vừa qua.
Con xin chân thành cảm ơn ông bà, cha mẹ đã luôn động viên ủng hộ con cả về
vật chất lẫn tinh thần trong suốt thời gian vừa qua.
Tôi xin cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của các anh chị, bạn bè, đờng nghiệp trong
q trình thực hiện đề tài. Mặc dù đã cố gắng thực hiện tốt nhất trong khả năng nhưng
sẽ không tránh khỏi những thiếu sót.
Tơi rất mong nhận được sự thơng cảm, góp ý tận tình chỉ bảo của q thầy cơ và
bạn bè.

Đỗ Trọng Lễ
Khoa Công nghệ Sinh học
Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ...........................................................................................................i
MỤC LỤC ............................................................................................................... ii
TÓM TẮT ...............................................................................................................iv

SUMMARY ............................................................................................................vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH .......................................................................... vii
DANH MỤC BẢNG BIỂU ................................................................................. viii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................ix
ĐẶT VẤN ĐỀ .......................................................................................................... x
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 1
1.1 Đặc điểm của P. sanguineus ...............................................................................1
1.2 Phân loại..............................................................................................................2
1.3 Phân bố................................................................................................................2
1.4 Tác dụng và các nghiên cứu trong y học ............................................................3
1.5 Ứng dụng trong công nghiệp ..............................................................................7
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 9
2.1 Địa điểm thực hiện đề tài ....................................................................................9
2.2 Vật liệu nghiên cứu .............................................................................................9
2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu ................................................................9
2.3.1 Phương pháp tách chiết cao thô từ P. sanguineus ...........................................9
2.3.2 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn .....................................................................10
2.2.3 Hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết từ P. sanguineus bằng phương pháp
DPPH ......................................................................................................................11
2.3.4 Phương pháp xác định hoạt tính gây độc của các cao chiết từ P. sanguineus
...............................................................................................................................12
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 14
3.1 Kết quả hiệu suất tách chiết cao chiết từ P. sanguineus ...................................14
3.2 Kết quả hoạt tính kháng khuẩn .........................................................................14
ii


3.2.1 Phương pháp xác định vòng kháng khuẩn .....................................................14
3.2.2 Phương pháp pha loãng xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) ................16
3.3 Kết quả hoạt tính kháng oxy hóa ......................................................................17

3.4 Kết quả hoạt tính kháng ung thư .......................................................................19
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................... 21
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 22

iii


TÓM TẮT
Các nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra một số đặc tính dược học của nấm Vân chi
đỏ Pycnoporus sanguineus (P. sanguineus) như gây độc tế bào ung thư, kháng khuẩn,
kháng viêm, kháng oxy hóa và kháng virus. Tuy nhiên, các dữ liệu tập trung vào việc
khai thác hoạt tính sinh học ở giai đoạn quả thể của của nấm P. sanguineus thu nhận từ
tự nhiên. Nghiên cứu này được thực hiện để xác định hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy
hóa và kháng ung thư của P. sanguineus nuôi cấy ở giai đoạn tiền quả thể, nhằm đánh
giá và mở rộng tiềm năng loại nấm này. Nấm P. sanguineus trước tiên được tách chiết
bằng phương pháp ngấm kiệt hai dung môi Methanol (MeOH) và Ethanol (EtOH). Khả
năng kháng khuẩn của cao chiết được xác định bằng phương pháp xác định vòng kháng
khuẩn và phương pháp pha loãng xác định nờng độ ức chế tối thiểu (MIC). Hoạt tính
kháng oxy hóa được xác định bằng phương pháp DPPH (2,2-diphenyl-1- picrylhydrazy).
Hoạt tính gây độc tế bào được khảo sát bằng phương pháp MTT (3-(4,5-Dimethyl-2thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide). Kết quả cho thấy hiệu suất tách chiết
P. sanguineus bằng dung môi Methanol là 4,72%, Ethanol là 2,37%. Cao chiết P.
sanguineus có hoạt tính kháng khuẩn trên cả bốn chủng vi khuẩn gây bệnh (E. coli, P.
aeruginosa, S. aureus, B. cereus) với MIC là 2,5 mg/ml, thấp hơn kháng sinh
Streptomycin 25 lần. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết P.
sanguineus cho thấy hai loại cao chiết MeOH và EtOH đều có khả năng loại bỏ gốc tự
do DPPH IC50 lần lượt là 3,41 µg/ml; 3 µg/ml tương đương hoạt tính kháng oxy hóa của
Ascorbic acid (Vitamin C) thương mại. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng ung thư của
cao chiết P. sanguineus trên ba dòng tế bào cho thấy cao chiết P. sanguineus có hoạt
tính gây độc tế bào tốt. Hoạt tính kháng ung thư thông qua giá trị IC50 của cao chiết
MeOH trên tế bào ung thư gan Hep G2 và ung thư vú MCF7 lần lượt là 72,02 µg/ml và

59,27 µg/ml. Tương tự, IC50 của cao chiết EtOH trên tế bào ung thư gan Hep G2 và ung
thư vú MCF7 lần lượt là 46,73 µg/ml và 36,09 µg/ml. Thêm vào đó, IC 50 của cao chiết
P. sanguineus trên tế bào không ung thư HEK 293 khá cao, cao chiết MeOH với IC50 là
80,27 µg/ml, cao chiết EtOH với IC50 là 84,01 µg/ml. Điều đó chứng tỏ cao chiết P.
sanguineus có hoạt tính gây độc tế bào ung thư cao hơn khả năng ảnh hưởng đến tế bào
không ung thư. Nhìn chung, cao chiết P. sanguineus đều có hoạt tính sinh học đáng chú

iv


ý. Ngoài ra, P. sanguineus được tách chiết trong dung môi Ethanol có hoạt tính sinh học
tốt hơn dung môi Methanol.

v


SUMMARY
Previous studies around the world have shown various medicinal properties of
Pycnoporus sanguineus (P. sanguineus) such as anticancer, antibacterial, antiinflammatory, anti-oxidant and antiviral activity. However, these studies focused on the
bioactivities of P. sanguineus fruiting body isolated from nature. Herein, this study was
conducted to determine the antibacterial, antioxidant and anticancer activity of cultured
P. sanguineus in the premodia formation stage. P. sanguineus obtained from previous
study was extracted by exhaustive extraction method in Methanol and Ethanol solvent.
The antibacterial ability of the extracts was determined by the agar diffusion and broth
dilution method to determine the minimum inhibitory concentration (MIC). Antioxidant
activity was determined by the DPPH method. Cytotoxic activity was investigated using
MTT assay. The results showed that the yield of extraction process using Methanol
(MeOH) solvent was 4.72%, and Ethanol (EtOH) was 2.37%. P. sanguineus extract
exhibited good antibacterial capacity against four strains of pathogenic bacteria (E. coli,
P. aeruginosa, S. aureus, and B. cereus) with MIC of 2.5 mg/ml, weaker than that of

Streptomycin by a factor of 25. IC50 of the MeOH and EtOH extracts of P. sanguineus,
capable of neutralizing free radicals DPPH+, was 3.41 µg/ml and 3.0 µg/ml respectively,
equivalent to the antioxidant activity of commercial Ascorbic acid (Vitamin C). In
addition, P. sanguineus extracts also exhibited good cytotoxic activity on three cell
lines. IC50 value of MeOH extract on Hep G2 liver cancer and MCF7 breast cancer were
72.02 µg/ml and 59.27 µg/ml, respectively. While, the IC50 of Ethanol extract on Hep
G2 and MCF7 cells were 46.73 µg/ml and 36.09 µg/ml, respectively. In addition, the
IC50 of P. sanguineus extract on HEK 293 was quite high, the MeOH extract with IC50
is 80.27 µg/ml, and the EtOH extract with IC50 is 84.01 µg/ml. This proved the positive
aspect of P. sanguineus extract by the good cytotoxicity and moderate effect on noncancerous cell survival. Overall, P. sanguineus extracts exhibited remarkable biological
activity like antibacterial, antioxidant and cytotoxci capacity. In addition, P. sanguineus
extract extracted using Ethanol solvent had better biological activity than Methanol
solvent.

vi


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Pycnoporus sanguineus (L.) Murrill 1904 .................................................... 2
Hình 3.1 Vịng kháng kh̉n của cao chiết từ P. sanguineus ....................................... 15
Hình 3.2 Hình ảnh thử nghiệm của phương pháp pha loãng cao chiết từ P. sanguineus
...................................................................................................................................... 17
Hình 3.3 Hiệu suất loại bỏ gốc tự do DPPH của cao chiết từ P. sanguineus và
Vitamin C ..................................................................................................................... 18
Hình 3.4 Biểu đồ so sánh giá trị IC50 gây độc tế bào của cao chiết từ P. sanguineus.. 19

vii


DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1 Hiệu suất tách chiết nấm từ P. sanguineus trên 2 loại cao chiết ................... 14
Bảng 3.2 Đường kính vịng kháng kh̉n của cao chiết từ P. sanguineus ................... 14
Bảng 3.3 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết từ P. sanguineus .................. 16
Bảng 3.4 Khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH của cao chiết từ P. sanguineus và Vitamin
C.................................................................................................................................... 18
Bảng 3.5 Giá trị IC50 cao chiết từ P. sanguineus và chứng dương Doxorubicin ......... 19

viii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt

Tên đầy đủ

ATCC

Ngân hàng giống vi sinh vật (American Type Culture Collection)

DMSO

Hợp chất hữu cơ lưu huỳnh (Dimethyl sulfoxit)

DPPH

Hợp chất hóa học hữu cơ (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl).

DOX

Kháng sinh thuộc nhóm anthracyclin (Doxorubicin).

EtOH

Rượu etylic hay Etanol (hydroxyetan).

Ft

Feet (đơn vị độ cao, ft =0,3048 mét).

MeOH

Rượu metylic hay Methanol (Ancol metylic).

MTT

Xét nghiệm do màu (3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2Htetrazolium bromide).

ix


ĐẶT VẤN ĐỀ
Nấm là nguồn thực phẩm với hàm lượng dinh dưỡng cao, hơn cả dinh dưỡng của
động vật và thực vật. Ngồi giá trị dinh dưỡng, nấm cịn được biết đến là nguồn dược
liệu quý hiếm. Trong đó, nấm Vân Chi đỏ Pycnoporus Sanguineus (P. sanguineus) phân
lập từ tự nhiên đã được chứng minh có hoạt tính sinh học đáng qua tâm như khả năng
kháng ung thư cao, kháng được virus, kháng vi khuẩn, kháng oxy hóa và kháng viêm.
Các chiết xuất từ P. sanguineus phân lập từ tự nhiên mang lại hiệu quả cao trong
nhiều lĩnh vực khác nhau. Trong đó, hoạt chất polyscacharide của P. sanguineus có hoạt
tính kháng ung thư cao. Do đó, hoạt chất này có tiềm năng trong ứng dụng điều trị ung
thư, cùng với các loại thuốc điều trị hiện tại góp phần làm giảm nguy cơ kháng thuốc.

Hoạt chất laccase đang được ứng dụng khử màu thuốc nhuộm trong ngành công nghiệp
dệt may, nhằm mục đích giảm bớt ng̀n hóa chất tổng hợp nguy hiểm và gây ô nhiễm
môi trường. Đặc biệt, hoạt chất Cinnabarin được tách chiết từ nấm còn được chứng minh
có khả năng chống virus, tiềm năng ứng dụng trị bệnh có nguồn gốc virus trong tương
lai. Các chiết xuất từ nấm Vân Chi đỏ còn thể hiện nhiều hoạt tính sinh học đáng chú ý
như kháng vi sinh vật (kháng vi khuẩn và kháng nấm), kháng oxy hóa và kháng viêm.
Do đó, nghiên cứu về hoạt tính sinh học của nấm Vân Chi đỏ P. sanguineus được coi là
hướng nghiên cứu tiềm năng trong y dược học.
Tại Việt Nam, cơng trình nghiên cứu về lồi nấm P. sanguineus cịn hạn chế do
một số bất cập về ng̀n ngun liệu khơng có sẵn hoặc ít thơng tin về lồi nấm này ở
Việt Nam. Do đó, hướng nghiên cứu về hoạt tính sinh học của nấm P. sanguineus nuôi
cấy được coi là cần thiết nhằm chứng minh tiềm năng, giá trị của ng̀n nấm ni cấy.
Vì vậy, đề tài: “Khảo sát một số hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa và
kháng ung thư của cao chiết nấm Vân chi đỏ (P. sanguineus)” được thực hiện nhằm
góp phần tăng thêm dữ liệu thơng tin về các lồi nấm có tính sinh học cao tại Việt Nam.
Mục tiêu của đề tài
Xác định hoạt tính sinh học của cao chiết nấm Vân chi đỏ P. sanguineus nuôi cấy
bao gồm hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa và kháng ung thư.

x


Nội dung nghiên cứu
1. Tách chiết cao chiết thô từ nấm P. sanguineus ni cấy.
2. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết P. sanguineus thông qua phương
pháp khuếch tán đĩa thạch và phương pháp pha loãng xác định MIC – nồng độ
ức chế tối thiểu trên một số chủng vi khuẩn.
3. Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết P. sanguineus thông qua phương
pháp DPPH.
4. Khảo sát hoạt tính kháng ung thư của cao chiết P. sanguineus thông qua phương

pháp MTT.

xi


Chương 1. Tổng quan tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Đặc điểm của P. sanguineus
Thế giới nấm cung cấp một lượng lớn nguồn đa dạng sinh học hấp dẫn khác nhau,
dường như là vô tận và tạo thành một ng̀n khai thác phong phú. Cho đến nay, gần
75.000 lồi nấm sợi được biết đến nhưng có thể còn hàng ngàn lồi nữa. Trong số các
loại nấm, nhóm Polyporale, đại diện tốt nhất của nấm mũ có tiềm năng phân hủy lignin
và cellulose cao đã được công nhận. Trong số đó, P. sanguineus đang được quan tâm
nghiên cứu về các hoạt chất sinh học tách chiết từ loài nấm này1.
Chi Pycnoporus là các polypores đỏ, bao gờm bốn lồi: Pycnoporus cinnabarinus
có ng̀n gốc ở Vùng ơn đới Bắc, Pycnoporus cocconeus xuất hiện chủ yếu ở các quốc
gia giáp với Ấn Độ Dương và Thái Bình Dương, P. sanguineus được tìm thấy ở vùng
nhiệt đới phía Nam và cận nhiệt đới và Pycnoporus Puniceus ở Châu Phi và Ấn Độ2.
Nấm Vân Chi đỏ (P. sanguineus) được xem là một trong 25 lồi nấm dược liệu
chính trên thế giới có giá trị dược tính rất cao được người tiêu dùng ở nhiều quốc gia
trên thế giới ưu chuộng3. P. sanguineus mang lại hiệu quả cao trong phòng và hỗ trợ
điều trị một số bệnh ung thư, đái tháo đường, rối loạn lipit máu, các bệnh lý về tim mạch,
hô hấp, đồng thời giúp tăng cường hệ miễn dịch, bảo vệ gan, ức chế HIV type 14.
P. sanguineus có màu đỏ đặc trưng là một loại nấm được tìm thấy ở độ cao từ 0 –
8,704 ft ở các vùng nhiệt đới hoặc cận nhiệt đới trên thế giới. P. sanguineus phát triển
chủ yếu trên gỗ chết hoặc mục nát, thân cây có thể phát triển riêng lẻ hoặc cụm. P.
sanguineus có nắp và thân. Mũ nấm đặc trưng bở một màu đỏ hoặc cam sáng và có thể
thay đổi về đường kính và độ dày2.
Hình thái hệ sợi nấm P. sanguineus thuộc hệ sợi trimitic trong suốt không màu.

Sợi dinh dưỡng với thành mỏng, có vách ngăn, phân nhánh. Sợi cứng có thành rất dày,
không vách ngăn, rất hiếm phân nhánh. Sợi bên cũng có thành dày, khơng vách ngăn,
phân nhánh nhiều5.
Hình thái quả thể nụ nấm xuất hiện thành từng u lời trịn màu đỏ cam theo đường
rạch bịch, về sau tai nấm mọc thành nhiều tầng xếp chồng lên nhau. Quả thể nấm P.
sanguineus trưởng thành hình bán nguyệt có đường kính mũ từ 3 – 14cm mặt dưới màu
1


Chương 1. Tổng quan tài liệu
đậm hơn mặt trên, mặt trên quả thể tạo các vân đồng tâm, mép hơi quăn, mặt dưới tạo
các lỗ nhỏ li ti và có thể dày tới 1 - 5mm rất dai hương thơm dễ chịu. Trung bình, thân
cây dao động từ 2 – 7cm, nhưng đôi khi không có thân, tùy thuộc vào vị trí của nấm trên
ng̀n dinh dưỡng khác nhau5.

Hình 1.1 Pycnoporus sanguineus (L.) Murrill 1904
1.2 Phân loại
P. sanguineus hay còn gọi là nấm Vân Chi đỏ ở Việt Nam được xếp vào họ
Polyporaceae, tức họ nấm lỗ. Dựa vào đặc điểm hình thái và di truyền, hệ thống phân
loại của P. sanguineus được trình bày như sau:
-

Giới : Fungi

-

Ngành : Basidiomycota

-

Lớp : Agaricomycetes

-

Bộ : Polyporales

-

Họ : Polyporaceae

-

Chi : Pycnoporus

-

Loài : sanguineus

1.3 Phân bố
P. sanguineus được phát hiện lần đầu vào năm 1904 trên đảo Guana, một phần của
Quần đảo Virgin (Thuộc Anh), thể hiện các đặc tính chịu nhiệt cao, P. sanguineus được
2


Chương 1. Tổng quan tài liệu
tìm thấy chủ yếu trong môi trường nhiệt đới và cận nhiệt đới. Nhiệt độ tăng trưởng tối
ưu là 28ºC, có nhiều nơi trên khắp thế giới có thể tìm thấy P. sanguineus phát triển. Một
số khu vực bao gờm: phía Nam của Bắc Mỹ, Ấn độ và hầu hết các khu vực ở Úc, Nam
và Trung Mỹ. Việt Nam cũng đang nghiên cứu và phát triển lồi nấm này. P. sanguinues
được tìm thấy trong các khu rừng mưa và rừng rụng lá khi gỗ chết hoặc mục nát. Điều

kiện môi trường thuận lợi cho sự phát triển của P. sanguinues bao gờm khí hậu ấm, ẩm
hoặc khô. Thông thường nấm phát triển trong mùa thu và mùa đông ở Bắc Mỹ2.
1.4 Tác dụng và các nghiên cứu trong y học
Hoạt tính kháng ung thư. Nhiều hoạt chất tách chiết từ nấm P. sanguineus được
miêu tả có tính chất điều hòa miễn dịch, bảo vệ gan, thuốc chống nhiễm trùng, thuốc trị
đái tháo đường, thuốc chống virus, thuốc chống ung thư. Polysacharide được tách chiết
từ tai (mũ) của nấm P. sanguineus có đặc tính chống ung thư và kích thích hệ miễn dịch.
Các polysacharide kích thích tế bào T và hoạt động của chúng trung gian qua cơ chế
miễn dịch phụ thuộc tuyến ức6.
Theo nghiên cứu của Smania và cộng sự năm 2003 trên P. sanguinues tại Brazil
cho thấy hoạt chất Cinnabarin tách chiết từ P. sanguinues có tác dụng gây độc tế bào
ung thư. Cụ thể, Cinnabarin có tác dụng gây độc tế bào u nguyên thần kinh chuột (tế
bào NA, ATCC clone C-1300) ở nồng độ cao 0,62 mg/l và 1,25 mg/ml. Nghiên cứu còn
cho thấy tác động gây độc của hợp chất này không đáng kể trên sức sống chuột in vivo.
Không xảy ra trường hợp phản ứng viêm, u hạt hoặc tổn thương trong các cơ quan ở
chuột sau khi thử nghiệm với Cinnabarin7.
Mười ba loài nấm đại thu nhận tại Nam Phi thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh
được chứng minh các dòng tế bào tế bào ung thư HeLa, HT-29, MCF-7, MIA PaCa và
PC-3 bằng thử nghiệm MTT (3-(4,5-dimethyl-2-thiazolul)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium
bromide), các giá trị IC50 được xác định ở các vi sinh vật có nờng độ gây độc tế bào cao
nhất. Trong đó, P. sanguineus có giá trị IC50 lần lượt là 24,2, 48,1, 32,7 <10 và 28,6 trên
các dòng tế bào ung thư HeLa, HT-29, MCF-7, MIA PaCa-2 và PC-3 tương ứng. Quá
trình apoptosis của tế bào ung thư HeLa được xác định bằng cách sử dụng thuốc nhuộm
Hoechst và phalloidin. Những thay đổi về hình thái bao gồm chất nhiễm sắc bị cô đặc,
màng tế bào phình ra8.
3


Chương 1. Tổng quan tài liệu
Hoạt tính kháng virus. Cũng từ nghiên cứu của Smania và cộng sự năm 2003,

Cinnabarin được tách chiết từ P. sanguineus cịn có tác dụng lên virus dại. Nghiên cứu
cho thấy cinnabarin làm giảm bốn lần nhân đôi số chuẩn độ của virus dại ở nồng độ 0,31
mg/ml. Cụ thể, IC50 trong điều kiện tiêu chuẩn là 128, cinnabarin ở mức 0,155 và 0,310
mg/ml làm giảm khả năng nhiễm virus dại xuống còn 64 và 32 tương ứng7.
Hai laccase chịu nhiệt (LacI và LacII) được tinh chiết từ P. sanguineus cịn thể
hiện đặc tính phân hủy các chất gây rối loạn nội tiết (EDCs). LacI và LacII đã được thử
nghiệm để làm giảm các loại EDCs, nonylphenol và triclosan đến hơn 95% sau 8 giờ xử
lý với 100 U/L ở pH 5, được xác định bằng phương pháp HPLC9.
Hoạt tính kháng oxy hóa. Để giảm các gốc tự do trên tế bào, việc sử dụng các
chất chống oxy hóa tự nhiên được nghiên cứu rộng rãi. Một số lồi nấm có chứa một
lượng lớn phân tử giúp loại bỏ các gốc tự do hoặc các phản ứng oxy hóa. Các nhà nghiên
cứu đang quan tâm trong việc tìm kiếm chất chống oxy hóa tự nhiên để sử dụng trong
các sản phẩm thực phẩm và dược phẩm trong tương lai. Các nghiên cứu gần đây nhằm
thay thế các chất chống oxy hóa tổng hợp như Butylhydroxytoluene (BHT) và
Butylhydroxyanisole (BHA), đã bị cấm do khả năng gây ung thư và các vấn đề sức khỏe
khác bao gồm tăng trọng lượng gan và tăng sinh của mạng lưới nội chất10.
Trong khi đó, các nghiên cứu gần đây đã cơng bố một số hợp chất có hoạt tính sinh
học thu được từ nấm Pyncoporus sanguineus11, đặc biệt là chất chống oxy hóa12. Các
chất này có tác dụng làm chậm đáng kể hoặc ngăn chặn quá trình oxy hóa cơ chất ở
nồng độ thấp13.
Theo nghiên cứu của Costa và cộng sự năm 2011, các hợp chất có hoạt tính kháng
oxy hóa bởi tách chiết từ P. sanguineus trong ni cấy lên men chìm trong môi trường
dextrose khoai tây bổ sung pentone. Chiết xuất thu được từ sợi nấm ở các thời điểm
canh tác khác nhau (5, 10, 15, 20, 25 và 30 ngày) đã thể hiện tiềm năng kháng oxy hóa
thông qua phương pháp DPPH và hệ thống β-carotene/axit linoleic. Hoạt tính chống oxy
hóa cao nhất đã được xác định trong giai đoạn cân bằng, của các chất chiết xuất thu
được sau 30 ngày nuôi cấy với khả năng kháng oxy hóa tương tự như BHT tổng hợp14.

4

Chương 1. Tổng quan tài liệu
Các đặc tính kháng oxy hóa và kháng khuẩn của các chất chuyển hóa thứ cấp có
trọng lượng phân tử thấp (ex-LMS) từ P. sanguineus nuôi cấy trong các điều kiện nhiệt
độ khác nhau (25°C [ex-LMSa] và 30ºC [ex-LMSb]) đã được báo cáo. Các đặc tính
kháng oxy hóa đã được nghiên cứu bằng cách sử dụng phép đo quang hóa, thử nghiệm
ABTS và DPPH với đối chứng dương là Trolox và axit ascorbic (Vitamin C). Kết quả
cho thấy ex-LMSb cao hơn đáng kể so với ex-LMSa 97%, 52% và 31% tương ứng với
phép đo quang hóa, ABTS và DPPH ở nờng độ 50 µ/ml. Giá trị IC 50 được xác định là
4,17 µg/ml đối với thử nghiệm hóa trị, 47,25 µg/ml đối với thử nghiệm ABTS và 51,46
µg/ml đối với thử nghiệm DPPH15.
Hoạt tính kháng viêm. Trong nghiên cứu của Lu và cộng sự (2010), dịng tế bào
BV-2 được sử dụng làm mơ hình viêm để sàng lọc các hợp chất bảo vệ thần kinh từ sợi
nấm P. sanguineus. Có bốn loại steroids bao gồm ergosta-7,22-dien-3β-ol (1), 3β,5αdihydroxyergosta-7,22-dien-6-one (2), 3β,5α,9α-trihydroxy-ergosta-7,22-dien-6-one
(3), và 3β,5α,6α-trihydroxy-ergosta-7,22-diene (4) được cô lập từ sợi nấm P.
sanguineus. Trong đó, các hợp chất (2), (3) và (4) là các hợp chất mới được cơ lập ở lồi
này. Hợp chất (1) cho thấy sự ức chế đáng kể việc sản xuất nitric oxyde (NO) do
lipopolysaccharide (LPS) trong các tế bào BV-2, ở nồng độ 15 µM với giá trị 43,5%16.
Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm. P. sanguineus có khả năng tổng hợp một
số sắc tố, trong đó, cinnabarin có đặc tính kháng khuẩn17, với tiềm năng điều trị tốt và
ứng dụng dược lý. Cinnabarin là một chất kháng sinh được sản xuất bởi Pycnoporus
sanguinues. Hợp chất này là một sắc tố màu cam có cấu trúc phenoxazin-3-one, với
nhóm carbonyl ở C-1, nhóm amin ở C-2 và nhóm hydroxyl ở C-97. P. sanguineus có
hoạt tính kháng khuẩn cao với B. cereus và L. plantarum bị ức chế bởi nồng độ thấp
nhất của cinnabarin (0,0625 mg/ml). Các giá trị MBC và MIC đã được báo cáo trên
Enterococcus faecalis, Listeriaplantarum, Salmonella sp, Salmonella typhimurium và
Staphylococcus aureus18.
Nghiên cứu của Rosa (2005) đã báo cáo về quá trình chiết x́t các hợp chất từ các
lồi nấm mũ ni cấy trong mơi trường lỏng và tồn bộ mơi trường nuôi cấy được chiết
xuất với ethyl acetate. Chiết xuất thô từ P. sanguineus thể hiện hoạt hoạt tính kháng nấm

Candida krusei, vi khuẩn Listeria monocytogenes và Staphylococcus aureus. Hoạt tính
5


Chương 1. Tổng quan tài liệu
kháng khuẩn của P. sanguineus đối với Staphylococcus aureus được thể hiện trong phân
đoạn ex-LMSb (vùng ức chế 23,5 mm; nồng độ ức chế tối thiểu 0,12 mg/mL). Hình ảnh
quét kính hiển vi điện tử cho thấy sự phá vỡ của các tế bào vi khuẩn khi nuôi trong phân
đoạn ex-LMSb so với đối chứng. Kết quả cho thấy chiết xuất thu được từ P. sanguineus
nuôi cấy chìm có thể là một nguồn chống oxy hóa và kháng khuẩn tốt15.
Nghiên cứu của Al-Fatomi và cộng sự năm 2013 công bố kết quả sàng lọc các nấm
đại có hoạt tính sinh học ở Yemen cho thấy chiết xuất methanol của P. sanguineus có
hoạt tính kháng khuẩn, chống lại 3 loại vi khuẩn Gram dương (Staphyloccocus aureus,
Bacillus subtilis, Micrococcus flavus) và hai loại vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa). Các chiết xuất methanol của P. sanguineus cho thấy hoạt
tính kháng nấm đáng kể chống lại sáu loài nấm gây bệnh ở người (Candida albicans,
Candida krusei, Aspergillus fumigatus, Mucor sp., Microsporum gypseum,
Trichophyton mentagrophytes) và một loại nấm không gây bệnh cho người (Candida
maltosa)19.
Tại Việt Nam nấm Vân Chi đỏ (P. sanguineus) đang được biết đến và có những
nghiên cứu hữu ích giúp phát triển ngành nấm của nước ta. Trong đó, nghiên cứu về
hiệu quả thay thế mùn cưa cây cao su bằng cùi bắp để trồng P. sanguineus được thực
hiện. P. sanguineus được trồng chủ yếu trên mùn cưa cây cao su loại cơ chất phổ biến
ở vùng Đông Nam Bộ. Tuy nhiên, các phụ phẩm nông nghiệp ở đồng bằng sông Cửu
Long chứa hàm lượng cellucose cao (cùi bắp, vỏ trấu…) có tiềm năng được tận dụng để
thay thế mùn cưa cao su vừa mang lại hiệu quả kinh tế cao, vừa giảm thiểu ô nhiễm mơi
trường. Hệ sợi giống cấp 1 có tốc độ phát triển nhanh nhất (1,78 cm/ngày) trên môi
trường PDA bổ sung 10% nước dừa. Khoai mì là môi trường tốt nhất cho sự phát triển
của hệ sợi giống cấp 3 (0,544 cm/ngày). Công thức phối trộn chứa 50% cùi bắp và 50%
mùn cưa cây cao su không bổ sung dinh dưỡng được xem là cơ chất phù hợp nhất cho

sự sinh trưởng, phát triển của P. sanguineus đạt năng suất cao (103 g/bịch phơi)5.
Ngồi ra, các nghiên cứu đáng chú ý khác tiềm năng ứng dụng của nấm P.
sanguineus đã được quan tâm nghiên cứu trong thời gian gần đây. Trong đó, nghiên cứu
của Đinh Thị Thu Hằng và cộng sự (2015) đã chứng minh khả năng loại màu thuốc
nhuộm của Laccase từ P. sanguineus tổng hợp và màu thuốc nhuộm thương mại20.
6


Chương 1. Tổng quan tài liệu
Nghiên cứu của Trần Minh Long và cộng sự (2018) đã chứng minh khả năng của hệ sợi
tơ nấm giúp P. sanguineus loại bỏ đến 99% vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, một loại
vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy dẫn đến tỷ lệ chết 100% tôm thẻ trong thời gian ngắn
ở các trang trại nuôi tôm21.
1.5 Ứng dụng trong công nghiệp
P. sanguineus đang được sử dụng nhiều cho mục đích công nghiệp và dược phẩm
trên tồn thế giới. Việc các ngành cơng nghiệp sử dụng một lượng lớn thuốc nhuộm,
chủ yếu trong các ngành dệt dẫn đến sự gia tăng các chất có màu gây ô nhiễm môi trường
cao. Nước thải chứa hỗn hợp phức tạp của thuốc nhuộm và muối có độc tính cao và nhu
cầu oxy sinh hóa và hóa học. Khoảng mười nghìn loại thuốc nhuộm tổng hợp được sử
dụng trong các ngành công nghiệp dệt, giấy, in và thuộc da tương ứng với 7 x 105 tấn
mỗi năm. Các phương pháp xử lý thuốc nhuộm vật lý, hóa học thường liên quan đến xử
lý sinh học thông qua hệ thống bùn hoạt tính. Tuy nhiên, phương pháp này không phải
lúc nào cũng đạt hiệu quả để loại bỏ thuốc nhuộm, nó tạo ra một lượng lớn bùn và đòi
hỏi phương pháp xử lý bổ sung với chi phí cao như quá trình oxy hóa.22
Hướng ứng dụng enzyme ngoại bào như laccase, mangan peroxydase (MnP),
lignin peroxydase (LiP) có khả năng xúc tác các phản ứng oxy hóa khử được xem là
biện pháp hiệu quả trong việc xử lý thuốc nhuộm và có tiềm năng ứng dụng cao23. Vì
vậy, laccase được tách chiết từ nấm P. sanguineus tiềm năng oxy hóa cao giúp khử màu
thuốc nhuộm trong các ngành công nhiệp dệt may được quan tâm nghiên cứu. Hoạt tính
Laccase được đánh giá bằng quá trình oxy hóa 1mM 2,2’-azino-bis (3ethybenzothiazoline-6-sulfonate) (ABTS). Chiết xuất enzym Laccase đã được kiểm tra

hoạt tính khử màu thuốc nhuộm trên Remazol Brilliant Blue R (80%), Reactive Blak 5
(2%), Reactive Red 195 (6%) và Reactive Yellow 145 (9%)24.
Trong số các chi Pycnoporus, được biết đến với việc sản xuất laccase, chủng P.
sanguineus đã được chứng minh là tạo ra một phenoloxydase khác, một tyrosinase
monomeric mới với hoạt tính cụ thể là protein 30 và 84 U/mg cho monophenolase và
diphenolase tương ứng. Nghiên cứu này xác định P. sanguineus là nhà sản xuất tiềm

7


Chương 1. Tổng quan tài liệu
năng của một tyrosinase đã chứng minh tính hiệu quả trong việc tổng hợp các phân tử
chống oxy hóa và trong liên kết ngang protein25.
Tyrosinase một enzym oxy hóa được tách chiết từ nấm P. sanguineus có tiềm năng
cao cho các ứng dụng cơng nghệ thực phẩm. Các hoạt động monophenolase và
diphenolase của tyrosinase được đo từ lysate tế bào. Chủng P. sanguineus cho thấy khả
năng sản xuất protein cao nhất 45,4 U/g đối với monophenolase và 163,6 U/g đối với
diphenolase. Tyrosinase có thể chuyển đổi p-tyrosol và p-coumaric acid thành
hydroxytyrosol và axit caffeic và nó cũng có thể xúc tác cho sự hình thành liên kết các
protein25.
Nấm P. sanguineus đã được chứng minh có chứa các hoạt chất có hoạt tính sinh
học cao như kháng ung thư, kháng oxy hóa, kháng viêm và kháng vi sinh vật. Tại Việt
Nam, không có nhiều nghiên cứu về các lồi nấm được ni cấy cho ra các cao chiết
hoặc hợp chất có hoạt tính sinh học cao, trong đó có nấm P. sanguineus. Ngoài ra, trên
thế giới cũng chưa có nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học được phát hiện và cơ lập từ
lồi nấm này. Do đó, đề này này được thực hiện nhằm bước đầu chứng minh hoạt tính
sinh học của cao chiết thô tách chiết từ P. sanguineus, tạo tiền đề cho việc phát hiện và
cô lập các hợp chất có hoạt tính sinh học sau này.

8

Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Địa điểm thực hiện đề tài
Viện Kỹ thuật Công Nghệ cao – Trường Đại học Đại học Nguyễn Tất Thành. Địa
chỉ: MM2 Hoàng Diệu, phường 13, Quận 4, thành phố Hồ Chí Minh.
2.2 Vật liệu nghiên cứu
Nguyên liệu nấm P. sanguineus nuôi cấy giai đoạn tiền quả thể đã được định danh
bằng hình thái và phương pháp sinh học phân tử được cung cấp bởi Viện Kỹ thuật Công
nghệ cao – Trường Đại học Đại học Nguyễn Tất Thành26.
Các chủng vi khuẩn được sử dụng trong thử nghiệm kháng khuẩn là hai chủng vi
khuẩn Gram âm (Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC
9027)) và hai chủng vi khuẩn Gram dương (Bacillus cereus (ATCC 10876),
Staphylococcus aureus (ATCC 25923)) được lưu trữ tại Viện Kỹ thuật Công Nghệ CaoNTT Trường Đại học Nguyễn Tất Thành. Các dòng tế bào được sử dụng trong nghiên
cứu hoạt tính kháng ung thư bao gờm dịng tế bào thận nguồn gốc phôi người HEK 293
(ATCC CRL-1573), tế bào ung thư vú MCF7 (ATCC HTB-22) và tế bào ung thư gan
Hep G2 (ATCC HB-8065) được cung cấp bởi phịng Cơng Nghệ Sinh học Y Dược,
Trung tâm CNSH TP.HCM.
2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp tách chiết cao thô từ P. sanguineus
Nấm P. sanguineus sau nuôi cấy được nghiền nhỏ, sau đó được ngâm trong các
dung môi Ethanol và Methanol theo tỷ lệ 10% (100g nấm tương ứng trong 1 lít dung
môi) và ủ ở 60ºC trong 24 giờ. Bã nấm sau đó được chiết lần hai trong dung môi tương
ứng ở 60ºC trong 24 giờ. Dịch chiết sau đó được ly tâm bỏ cặn và cô quay đuổi dung
môi đến khi có bột cao thô.
Cao thô trong dung môi cồn Ethanol và Methanol của P. sanguineus sau đó được
cho vào bình hút ẩm đến khối lượng không đổi. Khối lượng và độ ẩm của mỗi cao chiết
được ghi nhận. Bột cao thô được bảo quản ở nhiệt độ -20ºC. Hiệu suất tách chiết được

tính theo công thức:
9


Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
H (%) = khối lượng cao chiết thô/khối lượng nấm ban đầu
Cao chiết Ethanol (EtOH) và cao chiết Methanol (MeOH) từ P. sanguineus được
pha trong dung môi dimethyl sulfoxyde (DMSO) ở nồng độ 50 mg/ml. Các cao chiết
sau khi hòa tan được lọc vô trùng với kích thước lỗ lọc là 0,22 µm và trữ ở điều kiện 20ºC cho tới khi sử dụng.
2.3.2 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn
2.3.2.1 Phương pháp xác định vòng kháng khuẩn
Khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ P. sanguineus được xác định dựa trên khả
năng kháng khuẩn thông qua sự khuếch tán chất trong đĩa thạch, qua đó sự hình thành
vịng vơ kh̉n xung quanh đĩa giấy tẩm cao chiết tượng trưng cho khả năng kháng
khuẩn của cao chiết so với đối chứng dương.
Dịch cao chiết Ethanol (EtOH) và Methanol (MeOH) 0,5 mg từ P. sanguineus
được thấm vào từng đĩa giấy có đường kính 6 mm. Sau đó đặt từng đĩa giấy trên đĩa môi
trường thạch MHA đã được cấy trải dịch vi khuẩn ở nồng độ 108 CFU/ml. Đối chứng
dương được sử dụng trong thử nghiệm là kháng sinh Kanamycin và Streptomycin với
lượng 1,0 µg/đĩa giấy, đối chứng âm là đĩa giấy tẩm DMSO. Các đĩa vi khuẩn thử
nghiệm sau đó được ủ ở 37ºC. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Sau 24 giờ, đường kính vịng kháng kh̉n x́t hiện xung quanh đĩa giấy được ghi
nhận. Đường kính vòng kháng khuẩn thực được tính theo công thức sau:
d (mm) = D – dDMSO
Trong đó, D: đường kính vịng vơ kh̉n của cao chiết
dDMSO: đường kính vịng vơ kh̉n của DMSO
2.3.2.2 Phương pháp pha loãng xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
Phương pháp pha loãng các cao chiết thực vật trên đĩa 96 giếng và chất chỉ thị màu
resazurin được sử dụng để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC, Minimum Inhibitory
Concentration) của các cao chiết đang khảo sát.

10


Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Để khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, các cao chiết từ P. sanguineus được pha lỗng
trong dung dịch DMSO thành các nờng độ khảo sát khác nhau. Vi khuẩn được nuôi cấy
qua đêm và pha loãng trong môi trường MH (Muller Hilton) đến mật độ 5 × 106
CFU/mL. Mỗi giếng được thêm vào 50 µl dịch vi khuẩn và 50 µl cao chiết ở các nờng
độ pha lỗng khác nhau trong dung dịch DMSO. Các giếng đối chứng chứa dịch vi
khuẩn, môi trường và DMSO. Các giếng nền (Blank) chứa môi trường và cao chiết. Các
mẫu thử nghiệm và đối chứng được ủ ở nhiệt độ 37ºC Sau 24 giờ cho 20 µl thuốc thử
resazurin 0.1% cho vào mỗi giếng. Quan sát sự thay đổi màu và ghi nhận kết quả.
Chất chỉ thi resazurin có màu xanh trong dung dịch. Các giếng có sự đổi màu
resazurin từ xanh sang hờng chứng tỏ vi khuẩn đang phát triển. Nồng độ ức chế tối thiểu
(MIC) là nồng độ thấp nhất trong thử ngiệm ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn (chất
chỉ thị không đổi màu).
2.2.3 Hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết từ P. sanguineus bằng phương pháp
DPPH
DPPH là phương pháp được sử dụng để kiểm tra khả năng loại bỏ gốc tự do chỉ
thị cho khả năng kháng oxy hóa của cao chiết từ P. sanguineus. Phương pháp đánh giá
khả năng kháng oxy hóa dựa trên hàm lượng chất kháng oxy hóa và hoạt tính kháng oxy
hóa được thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH.
Nguyên lý. Phương pháp được dựa trên phản ứng khử 2,2-diphenyl-1picrylhydrazy (DPPH) thành 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazin (DPPH - H). DPPH là một
gốc tự do bền, dung dịch có màu tím, có bước sóng hấp thụ cực đại tại  = 517 nm. Các
chất có khả năng kháng oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho ion H+, làm giảm
mật độ hấp thụ tại bước sóng cực đại, làm màu của dung dịch sẽ nhạt dần và chuyển từ
tím sang vàng nhạt.
Cách tiến hành. Dung dịch DPPH được pha loãng trong Methanol đến nồng độ
50 mg/ml. Mẫu đối chứng là Ascorbic acid (vitamin C) được pha trong Methanol đến

nồng độ 2 mg/ml. Các cao chiết từ P. sanguineus (50 mg/ml) sau đó được chuẩn bị theo
các nồng độ khác nhau nhằm xây dựng đường kháng oxy hóa tún tính. Mẫu đối chứng
Vitamin C ch̉n bị theo nờng độ 0, 1, 2, 4, 5 µg/ml. Mẫu đối chứng và các cao chiết
11