Nghiên cứu sơ bộ về tình trạng kháng kháng sinh ở vi khuẩn phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống ở Việt Nam
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.55 MB, 27 trang )
NTTU-NCKH-04
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH
BÁO CÁO TỐNG KÉT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP co SỞ
NĂM 2021- 2022
Tên đề tài: Nghiên cứu sơ bộ về tình trạng kháng kháng sinh ở vi khuẩn phân lập
từ thực phẩm lên men truyền thống ở Việt Nam
Mã đề tài: 2021.01.105
Chủ nhiệm đề tài: Vũ Thị Nam Anh
Đơn vị công tác: Viện kỳ thuật công nghệ cao NTT- Đại học Nguyền Tất Thành
Thời gian thực hiện: 9 tháng
TP. Hồ Chí Minh, ngày 28 tháng 3 năm 2022
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIÉT TẮT..................................................... iii
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU......................................................................................... iv
TÓM TẮT KÉT QUẢ NGHIÊN cứu................................................................................. V
MỞ ĐẦU................................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TÔNG QUAN TÃI LIỆU...............................................................................2
1.1.
Sơ lược về tình hình kháng kháng sinh............................................................................ 2
1.2.
Giới thiệu về thực phẩm lên men truyền thống của Việt Nam...................................... 3
1.3. Tinh hình nghiên cứu về tính kháng kháng sinh trong thực phâm lên men truyền
thống Việt Nam.............................................................................................................................. 4
CHƯƠNG 2. NỘI DƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu..................................... 6
2.1. Vật liệu nghiên cứu.............................................................................................................. 6
2.2. Phương pháp nghiên cứu.....................................................................................................6
2.2.1.
Phân lập vi sinh vật kháng thuốc............................................................................... 6
2.2.2.
Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử...................................................... 6
2.2.3.
Thử nghiệm sinh hóa................................................................................................... 8
2.2.4.
Đánh giá tính kháng kháng sinh của vi sinh vật phân lập được.......................... 10
CHƯƠNG 3. KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...................................................................... 12
3.1. Sự phổ biến của các kiểu hình kháng thuốc.................................................................... 12
3.2. Đánh giá tính kháng kháng sinh của vi sinh vật phân lập được................................... 14
CHƯƠNG 4. KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ..................................................................... 18
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................... 19
PHỤ LỤC 3: MINH CHỨNG ĐI KÈM........................................................................... 23
PHỤ LỤC 4: (thuyết minh đề cương)............................................................................... 39
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIÉT TẤT
Tên viết tắt
Tên đầy đủ
AR
Kháng kháng sinh
MDR
Đa kháng thuốc
ARGs
Gen kháng kháng sinh
LAB
Vi khuân axit lactic
TSA
Tryptic soy agar
MH
Mueller Hinton Agar
TE
Tetracycline
SMX
Sulfamethoxazole
GE
Gentamicin
IPM
Imipenem
Met
Methicillin
KAN
Kanamycin
Sin
Streptomycin
Am
Ampicillin
Rf
Rifampicin
TMP
Trimethoprim
Cm
Chloramphenicol
CFU
Colony Forming Unit
DANH MỤC CÁC BÂNG BIẺU
Bảng 1. Tỷ lệ vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh trong các thực phâm lên men khác nhau... 12
Bảng 2. Ket quả của các thử nghiệm khuếch tán đĩa kháng sinh đối với các chủng kháng thuốc
được chọn từ các mầu thực phẩm lên men khác nhau................................................................. 14
Bảng 3. Bảng kết quả định danh các chủng kháng kháng sinh theo phương pháp Sanger dựa
trên gene 16S..................................................................................................................................... 15
Bảng 4. Bảng đặc tính của các chủng thu được từ thực phâm lên men truyền thống Việt Nam.
........................................................................................................................................................... 15
TĨM TẮT KÉT Q NGHIÊN cứu
STT
Cơng việc thực hiện
Kết quả đạt được
Phân lập vi sinh vật kháng thuốc Phân lập được 16 chủng từ thực phâm
1
từ thực phẩm lên men truyền thống lên men truyền thống
Định danh vi khuẩn bằng phương Bảng định danh vi khuân kháng thuốc
2
pháp sinh học phân tử và thử cùng kiêu hình kháng thuốc
nghiệm sinh hóa
Đánh giá tính kháng kháng sinh Thu được 3 chủng vi khuân kháng từ
3
của vi sinh vật phân lập được
3 loại kháng kháng sinh trở lên từ 3
loại thực phâm đã chọn
STT
Sản phẩm đạt được
Sản phẩm đã đăng ký
1
01 bản thảo bài báo tiếng Anh
01 bài báo đăng trên Tạp chí khoa
học cơng nghệ đại học Nguyễn Tất
Thành
Thời gian thực hiện: 03/2021 - 12/2021
Thời gian nộp cuốn báo cáo: 20/02/2022
MỞ ĐÀU
Kháng sinh Penicillin là phát minh có tính lịch sử của Sir Alexander Fleming trong thế
kỉ XX và được sử dụng như tác nhân trị liệu hóa học tiềm năng nhằm chống lại vi khuẩn gây
bệnh. Từ đó đen nay, nhiều loại kháng sinh đã được phát hiện ra và được đưa vào sử dụng
ngày càng rộng rãi trong y học như một tác nhân quan trọng trong việc cứu chữa bệnh. Tuy
nhiên, như một tác nhân diệt khuân mạnh mè, việc sử dụng kháng sinh không chỉ dừng lại ở
lĩnh vực y học mà còn được sử dụng có rộng rãi trong chăn ni, ni trồng thủy sản và nông
nghiệp. Việc lạm dụng kháng sinh trong cuộc sống làm gia tăng các mầm bệnh và nguy cơ
kháng thuốc dẫn đen nguy cơ ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng.
Dưới sự áp lực chọn lọc do kháng sinh gây ra đã dần đến sự xuất hiện và lây lan của vi
khuẩn kháng thuốc và các gen kháng thuốc của chúng. Hậu quả là ngày càng có nhiều trường
hợp mắc bệnh, điều trị thất bại, nhiều ca tử vong hơn và chi phí điều trị cao hơn cho xã hội.
Do sự xuất hiện của kháng kháng sinh nên việc tìm kiếm các cách thức mới nhằm giảm thiểu
sự hình thành kháng kháng sinh đang trở thành chủ đề trọng tâm của nhiều cơng trình nghiên
cứu từ nhiều nơi trên thế giới trong đó có ủy ban Khoa học Châu Âu về Dinh dường Động
vật (SCAN), Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Tổ chức Nông Lương Liên Hợp Quốc (FAO),
Tổ chức Thú y Thế giới (OIE).
Việt Nam là một đất nước có lịch sử lâu đời với các sản phẩm lên men truyền thống.
Ở Việt Nam, các thực phẩm lên men truyền thống phô biến như dưa muối, nem chua, sữa
chua... được tiêu thụ rộng rãi ở khắp mọi nơi trên cả nước. Tuy nhiên, hầu hết là tự chế, khơng
được kiêm sốt tốt về mặt vi sinh, tiềm ân nhiều nguy cơ cho sức khỏe cộng đồng. Đã có
những trường hợp ghi nhận về nguy cơ truyefn ngang gen kháng kháng sinh thông qua những
vi khuân không gây bệnh tới vi khuân gây bệnh. Vì vậy, việc nghiên cứu sự xuất hiện của các
kiểu hình đa kháng thuốc (MDR) và gen kháng kháng sinh (ARGs) trong một số thực phàm
lên men truyền thống ở Việt Nam là rất cần thiết.
1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. So' lược về tình hình kháng kháng sinh
Kháng kháng sinh (AR) là khả năng vi khuân hoặc các vi sinh vật khác chống lại tác
động của thuốc kháng sinh 1. Thuốc kháng sinh luôn được coi là một trong những khám phá
thần kỳ của thế kỷ 20, nó đã thành cơng trong việc cứu sống hàng triệu người và giảm bớt
nhiều gánh nặng cho con người. Tuy nhiên, sự gia tăng của tình trạng kháng kháng sinh trong
bệnh viện, cộng đồng và môi trường diễn ra đồng thời với việc sử dụng chúng. Khả năng di
truyền bất thường của vi khuẩn được hưởng lợi từ việc con người sử dụng quá mức thuốc
kháng sinh để khai thác mọi nguồn gen kháng thuốc. Kháng kháng sinh trong các mầm bệnh
do vi khuân gây ra đã và đang là một mối đe dọa đen sức khởe toàn cầu. Thế giới đang lo lắng
ve sự dai dẳng và lây lan của chúng đã xuất hiện trên toàn trái đất. WHO báo cáo ước tính có
khoảng 480.000 trường hợp mắc bệnh lao do đa kháng thuốc, trong đó phần lớn là không được
điều trị. Các bệnh nhiễm trùng kháng thuốc kháng sinh hiện đã cướp đi sinh mạng của gần
50.000 người mồi năm chỉ riêng ở Hoa Kỳ và Châu Âu, chưa kể hàng trăm nghìn người được
báo cáo là chết ở các khu vực khác 2.
Việt Nam đã và đang phải đấu tranh với mối hiểm họa nghiêm trọng của hiện tượng
kháng thuốc kháng sinh do trạng thái sử dụng quá mức và không hợp lý ở nhiều các hệ thống
chăm sóc y tế, trong cơng cộng, chăn nuôi cũng như sản xuất thực phâm và nông nghiệp. Theo
WHO, một số chuyên gia đã ước tính rang đến năm 2050, tình trạng kháng thuốc kháng sinh
có thể gây nên tử vong cho 10 triệu người trên toàn cầu vào mồi năm, tương đương với tỷ lệ
cứ 3 giây sẽ có 1 trường hợp từ vong- lớn hơn so với người bệnh tử vong do mắc ung thư hiện
___
3
nay .
Thực phẩm nói chung và thực phâm lên men nói chung cũng là một nguồn chứa vi sinh
vật có khả năng kháng kháng sinh. Có nhiều nguyên nhân ân chứa những mầm bệnh trong đó
có thể kể đến nội sinh (động vật, thực vật), ngoại sinh (nhân sự, nước, hoặc môi trường) hoặc
do lây nhiễm chéo, về yếu tố nội sinh và ngoại sinh, một trong những nguyên nhân của yếu
tổ này là do trong quá trình sinh trưởng và phát triên của động vật ngồi mơi trường, kháng
sinh được sừ dụng đê trị bệnh cũng như kích thích tăng trưởng, do đó kháng thuốc kháng sinh
ở động vật có thể lây truyền sang con người thơng qua chuồi thức ăn. Cũng như ở thực vật,
các vi khuân kháng kháng sinh tồn tại trong mơi trường có thể chưa được vệ sinh sạch sẽ nên
vẫn còn tồn đọng trong q trình lên men 4. Thêm vào đó, đã có những nghiên cứu báo về
2
thành phần chính của nem chua là thịt lợn sống có thê chứa Lactobacillus', Lactobacillus
fermentum, Pediococcus acidilactici. Những vi khuân này, cũng như các gen kháng thuốc
kháng sinh (aplĩA3, erm, erm (B), tet (M). Erm (C), cat, Tn554) 4 có thể được chuyên ngang
gen sang người thông qua trực tiếp và tiếp xúc gián tiếp với nguồn lây nhiễm 5. Hơn nữa, có
sự tiếp hợp vi khuân giữa plasmid pRE25 của Enterococcus faecalis mang một số gen kháng
với vi khuân axit Lactic (LAB) trong nem chua đã được báo cáo trong nghiên cứu của
Sukmarini và cộng sự 6. Do đó, về mặt tự nhiên, nem chua có thể hoạt động như một phương
tiện để các gen kháng kháng sinh lây lan sang các vi khuân khác trong hệ thống thực phâm và
cả trong đường tiêu hóa.
1.2. Giói thiệu về thực phẩm lên men truyền thống của Việt Nam
Thực phẩm lên men rất phơ biến ở các nước châu Á nói chung và Việt Nam nói riêng.
Thực phẩm lên men bắt nguồn từ quá trình tự nhiên chủ yếu liên quan đến vi khuẩn axit lactic
(LAB) và nấm men có trong nguyên liệu, đặc trưng bởi sự khác biệt về vùng địa lý và quy
trình chế biến. Quá trình lên men khơng chỉ giảm thiểu độc tính của ngun liệu thực phẩm
mà còn làm tăng chất lượng của sản phâm. Thực phâm được lên men thường có hương vị
hương vị đặc biệt, giúp kéo dài thời gian bảo quản; tăng mùi thơm và thành phần dinh dưỡng;
ức chế sự phát triển của vi khuẩn không mong muốn; và loại bỏ các chất kháng dinh dường 7.
Trong quá trình lên men, việc sản xuất các axit hữu cơ khác nhau, carbon dioxide, peptit kháng
khuẩn và vi khuân ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật hư hỏng và quá trình này hoạt động
như một chất bảo quản tự nhiên.
Một phần thiết yếu của các món ăn truyền thống ở Việt Nam là thức ăn lên men. Ngày
nay, thực phâm lên men ngày càng trở nên hấp dẫn đoi với người tiêu dùng do được chế biến
khơng thêm hóa chất, phụ gia. Tuy nhiên, khách hàng Việt Nam lo ngại về chất lượng của
thực phẩm lên men vì các cộng đồng vi sinh vật trong ngun liệu thơ có thể tiềm ân nguy cơ
gây hại cho sức khỏe của họ 5.
Nem chua
Nem chua là một trong những thực phẩm lên men truyền thống rủi ro nhất vì nó sử
dụng thịt sống mà khơng qua xử lý nhiệt trong q trình lên men lactic ngắn. Thành phần
chính của nem chua bao gồm nạc lợn xay mịn, thịt lợn luộc và thái mỏng, bột gạo rang, muối
và gia vị (tiêu và tỏi). Nem chua được chuẩn bị như sau: các nguyên liệu được trộn theo cơng
thức và hồn hợp này sau đó được tạo thành hình khối hoặc hình trụ nhỏ, sử dụng thêm một số
loại rau có tính khử khn như lá ổi hoặc lá đinh lãng và miếng tỏi hoặc ớt (tùy từng địa
3
phương). Sau đó gói bằng lá chuối bằng cách gấp chặt hai đầu rồi phủ một miếng lá chuối to
hơn 8.
Dưa chua
Dưa chua cũng là một trong những nguồn tiềm ẩn chứa mầm bệnh cho con người.
Phương pháp truyền thống để ngâm chua rất đơn giản và bao gồm các bước sau: rau được làm
sạch, phơi khô và ngâm nước muối để lên men từ 1-3 ngày trong thùng kín đê đạt được độ
chua tối ưu 8.
Tương bần
Tương bần là một loại thực phẩm lên men truyền thống điển hình. Nguyên liệu chính
đê làm tương bần là đậu tương, gạo nếp, muối và nước. Thông thường, gạo hấp được ủ với
môi trường ban đầu chủ yếu chứa Aspergillus oryzae ở khoảng 30° c trong 4-5 ngày 8.
1.3. Tình hình nghiên cún về tính kháng kháng sinh trong thực phẩm lên men
truyền thống Việt Nam
Trong những năm gần đây, kháng kháng sinh được coi là một vấn đề lớn trong sức
khỏe cộng đồng, nên việc hiểu biết về sự xuất hiện và phát triển của kháng thuốc trong các
môi trường không thuộc lâm sàng đã được các nhà nghiên cứu trên khắp thế giới quan tâm.
Bên cạnh đất và nước, thức ăn lên men và thức ăn đường phố đã trở thành nguồn cung cấp vi
khuẩn kháng kháng sinh quan trọng do tầm quan trọng của chúng trong chế độ ăn uống của
con người, đặc biệt là ở các nước đang phát triển 9’10.
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra các kiêu hình kháng với Kanamycin, Streptomycin,
Tetracylin, Erythromycin, Chloramphenicol... được phân lập trong khi ARGs chủ yếu là gen
tet và erm ở Lactobacilli và Enterococci được tìm thấy trong các sản phẩm lên men truyền
thống khác nhau như trong sản phâm sữa, thịt lên men và rau lên men IM4. Bên cạnh LAB,
các mầm bệnh khác liên quan đến thực phâm lên men truyền thống như Staphylococcus
aureus, Escherichia coll, Salmonela sp.... Cũng được báo cáo là có khả năng kháng các loại
kháng sinh khác nhau (ví dụ: 0-lactams, cephalosporin, aminoglycosides và trimethoprim
sulfamethoxazole...) 15. Hiện nay trên thế giới các loại thực phẩm lên men truyền thống, chủ
yếu là sản phâm từ sữa, thịt và rau lên men chứa LAB và các nguồn bệnh từ thực phẩm khác
đã được báo cáo là có bản chất kháng nhiều loại kháng sinh và cũng có khả năng kháng thuốc
bổ sung. Từ góc độ an tồn thực phẩm, một số báo cáo đã được Cơ quan An tồn Thực phâm
Châu Âu cơng bố trong những năm gần đây (liên quan đen việc thực phâm có nguồn gốc động
vật là nguồn gây ra kháng kháng sinh quan trọng do một số nguyên nhân, chẳng hạn như việc
4
sử dụng kháng sinh trong quá khứ để thúc đẩy tăng trưởng ở động vật thực phẩm hoặc như
điều trị dự phòng và điều trị 16.
Mặc dù các nghiên cứu về vi khuẩn kháng kháng sinh đã phát triền trên the giới trong
nhiều thập kỷ qua và đã có những kết quả nghiên cứu nhất định. Ở Việt Nam cũng đã có rất
nhiều những nghiên cứu về kháng kháng sinh trên nhiều lĩnh vực như y học và môi trường.
Đã có một vài các nghiên cứu về kháng kháng sinh trong các quán ăn lề đường được nhóm
nghiên cứu Malaysia công bổ 17. Tuy nhiên ở Việt Nam, đây vẫn là một lình vực chưa được
đề cập nhiều. Đây là một hướng nghiên cứu liên quan tới sự liên hệ giữa sản phâm nông
nghiệp và y tế, là một chủ đề chưa được quan tâm đúng mức, cần được tiếp tục nghiên cứu
đào sâu để đưa ra những giải pháp đồng bộ và hiệu quả. Thực phâm là một trong những nguồn
chính cung cấp vi sinh vật cho cơ thể nên vệ sinh an toàn thực phẩm liên quan mật thiết với
các yếu tổ vi sinh ảnh hưởng tới sức khỏe con người.
5
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1. Vật liệu nghiên cún
Các thực phâm lên men được mua từ các chợ ở địa phương ở Hà Nội. Mồi loại được
chọn ngầu nhiên từ những gian hang bán lẻ. Các sản phâm được làm thủ cơng qua q trình
lên men tự nhiên, mồi mẫu lấy 3 sản phẩm bất kì. Các mầu được giữ ở 4-10 °C và không quá
24 giờ trước khi phân tích. Mồi thí nghiệm được lặp lại ba lần.
2.2. Phuong pháp nghiên cún
2.2.1. Phân lập vỉ sinh vật kháng thuốc
Các chủng vi sinh vật sẽ được phân lập từ các thực phẩm lên men truyền thống được
thu thập ngẫu nhiên từ các chợ địa phương. Vi khuân được lấy ra từ các sản phâm lên men
bằng cách nghiền 1 g mẫu trong 9 ml dung dịch (0,8% NaCl) và lắc trong 1 phút. Hỗn hợp
nem chua đã đồng nhất được pha loãng trong lần lượt trong 0,8% NaCl. Tổng số vi sinh dị
dường được đếm trên mơi trường TSA 1/10 (Tryptic Soil Agar pha lỗng mười lần) có bổ
sung chất chong nấm nystatin 200 mg/L). Các vi khuân kháng sinh dị dưỡng được thống kê
trên cùng mơi trường có bổ sung kháng sinh (sulfamethoxazole ở nồng độ 60 mg/L). Lấy 100
pl trong số dung dịch pha loãng 10’2 được trải trên các đĩa chứa kháng sinh SXM 60 mg/L
thích hợp cho hệ vi sinh dị dưỡng kháng thuốc và 10'4 được trải cho toàn bộ hệ vi sinh dị
dường.
2.2.2. Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử
Các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh được phân lập từ mẫu thực phẩm lên men tiếp
theo được định danh bằng phương pháp giải trình tự (phương pháp Sanger) dựa trên gene 16S
rRNA.
a. Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn mục tiêu
•
Ly trích DNA của các dịng vi khuẩn kháng kháng sinh đã phân lập sử dụng kit
theo hướng dẫn của nhà sản xuất TopPƯRE® genomic DNA extraction kit (ABT Việt Nam).
•
Lượng DNA được xác định bang phương pháp quang phơ
•
Nồng độ DNA có trong mầu được tính theo công thức:
A (ng/pl) = 50 X OD260mil X n
Trong đó:
6
A260/280nm-
OD260nm :
độ hấp thụ của dung dịch DNA ở bước sóng 260 nm
50: hệ số chuyển đổi của dung dịch có nồng độ DNA sợi đơi
n: hệ số pha lỗng
b. Thu nhận gene 16S
•
Phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi 27F/1492R18
5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ’ 5’- GGTTACCTTGTTACGACTT-3 ’ với tổng thể
tích là 20 pl, trong đó chứa các thành phần và nồng độ của các chất tham gia phản ứng như
sau:
Bảng: Thành phần phản ứng PCR
Thành phần phản ứng
Thể tích (pl)
PCR Master Mix 2X
10
Mồi xuôi (10 pM)
1
Mồi ngược (10 pM)
1
DNA
5
Nước cất khử ion
3
Tổng thể tích
20
Phản ứng được thực hiện theo chu trình nhiệt gồm 30 chu kỳ (PCR Techne Prime) theo
hướng dẫn của nhà sản xuất (Mytaq HS Mix) TopPURE® genomic DNA extraction kit (ABT
Việt Nam).
•
Điện di trên gel agarose
Sản phàm PCR được nhận biết thơng qua kích thước phân tử của chúng qua q trình
điện di nhờ vị trí của các vạch DNA trên gel agarose 1%. Quá trình điện di được thực hiện
trên bộ điện di Bio-Rad (Richmond, CA, Hoa Kỳ) với dòng điện 100 mA và 135 V trong 25
phút.
•
Kiểm tra kết quả
Ket thúc q trình điện di, kết quả điện di được kiểm tra dưới ánh sáng xanh của bàn
soi gel (ƯltraSlim LED illuminator) và ghi nhận hình ảnh bằng máy chụp hình Canon. Gene
mục tiêu sau khi được xác nhận bằng phương pháp điện di, được gửi giải trình tự tại Cơng ty
Macrogen (Hàn Quốc).
c. Định danh vi khuẩn
7
Các trình tự gene nhận được sau giải trình tự được so sánh trên ngân hàng dừ liệu NCBI
sử dụng cơng cụ BLAST. Các lồi vi khuẩn được định danh dựa trên điểm cao nhất đối với
các thông số độ tương đồng (identity), độ bao phủ dừ liệu (query cover), giá trị mong đợi (E-
value).
2.2.3. Thử nghiệm sinh hóa
a. Nhuộm Gram
Nhuộm gram là kỳ thuật để phân biệt 2 nhóm vi khuẩn là Gram dương (+) và Gram âm
(-) dựa trên cấu tạo vách tế bào của vi khuẩn.
Quy trình nhuộm gram:
•
Dàn đều bệnh phâm hoặc vi khuân lên lam kính sạch;
•
Cố định mầu bệnh phâm bang cách hơ trên ngọn lừa đèn cồn và đê nguội;
•
Các bước nhuộm:
1. Đầu tiên phủ dung dịch tím (Crystal Violet) để khoảng 60 giây sau đó
rửa dưới vịi nước chảy nhẹ.
2. Tiếp theo phủ dung dịch Lugol đê cố định màu, cũng đê khoảng 60 giây
rồi rửa dưới vòi nước.
3. Tẩy màu bằng cồn 950 để khoảng 30 giây và rửa nước.
4. Cuối cùng phủ dung dịch đỏ Fuchsin 1/10 của Gram để khoảng 30 giây
rồi rửa dưới vịi nước.
5. Đê khơ tự nhiên.
6. Soi dưới vật kính dầu.
b. Thử nghiệm Citrate
Xác định khả năng sử dụng citrate như là nguồn carbon duy nhất trong quá trình biến
dường của vi sinh vật dựa vào mơi trường có chứa muối ammonium vơ cơ.
Vi sinh vật có khả năng sử dụng citrate làm nguồn Carbon duy nhất thì có khả năng sử dụng
muối Amonium làm nguồn Nitơ và sinh NH3 làm môi trường trở nên kiềm.
• Cấy khuẩn vào mơi trường Simmon và đọc kết quả sau khi để ở 35 - 37 °C trong
vòng 18-24 giờ.
c. Thử nghiệm Methyl Red and Voges-Proskauer
8
Methyl red nhằm kiểm tra khả năng tạo và duy trì acid được tạo ra từ quá trình lên men
glucose của vi sinh vật. Voges - Proskauer nhằm xác định khả năng sinh acetylmethylcarbinol
(acetoin) trong quá trình lên men glucose của một số vi sinh vật.
• Mơi trường: Sử dụng mơi trường MR - VP Broth
• Thuốc thử:
Methyl Red:
o Đỏ methyl 0.1 g
o Etanol 95 300 ml
o Nước cất 2000 ml
Voges-Proskauer:
1. Alpha-naphthol, chất tạo màu 5%
2. Kali Hydrooxide, 40%, chất oxy hóa
• Các kiểm sốt dương tính và âm tính nên được thực hiện sau khi chuân bị từng
lô môi trường và từng lơ thuốc thử. Các kiểm sốt được đề xuất bao gồm: Kiểm sốt dương
tính: s.aureus. Kiểm sốt âm tính: Escherichia colỉ
•
Quy trình thử nghiệm:
Methyl Red:
Cấy mẫu thuần vào ống MR - VP broth của sinh vật thử nghiệm, ủ trong 24 giờ ở
35°c. Sau khi ủ, nhỏ 1 giọt thuốc thừ vào dịch nuôi cấy, nếu chuyển đỏ là dương tính, vàng
là âm tính.
Voges-Proskauer:
Cấy mẫu thuần vào ống MR - VP broth của sinh vật thử nghiệm, ủ trong 24 giờ ở
35°c. Sau khi ủ, hút 1 ml dung dịch vào ống nghiệm sạch. Thêm 0.6 mL alpha naphthol 5%,
tiếp theo là 0,2 mL KOH 40% theo thứ tự. Lắc nhẹ ống để môi trường tiếp xúc với oxy trong
khí quyển và để ống yên trong 10 đen 15 phút. Neu ống chuyển đỏ nâu là dương tính, vàng
nhạt là âm tính.
d. Thử nghiệm Calatase
Thử nghiệm Catalase được dùng đê thử nghiệm khả năng thủy phân H2O2 thành H2O
và 02, tạo ra bọt khí dựa vào cơ chế vi khuân sinh enzym catalase để thủy phân.
9
Lấy khuân lạc trét lên trên mặt 1 lam kính sạch rồi nhỏ H2O2 30%. Quan sát sau l-2s:
nếu có bọt khí xuất hiện thì phản ứng dương tính, nếu khơng có bọt khí xuất hiện là phản ứng
âm tính.
e. Thử nghiệm Oxidase
Thừ nghiệm oxidase được sử dụng để xác định vi khuẩn sinh cytochrome oxidase c,
một enzyme của chuồi vận chuyển điện tử vi khuẩn.
Lấy 1 que cấy lấy khuẩn lạc miết trên miếng giấy đã tẩm sằn hóa chất phản ứng miết.
Quan sát kết quả trong vòng 10s đầu. Phản ứng dương tính cho kết quả màu xanh tím.
f. Thử nghiệm khả năng di động
Thử nghiệm nhằm xác định khả năng di động của vi sinh vật.
Nuôi khuẩn trong môi trường thạch mem (Semi-Nutrient Agar) 0.5% thạch trong ống
nghiệm, u trong 24 giờ ở 35°c, nếu thấy đường cấy khơng bị xê dịch là âm tính, đường cấy
mọc lan ra mơi trường là dương tính.
2.2.4. Đánh giá tính kháng kháng sinh của vi sinh vật phân lập được
Tiến hành sàng lọc và chọn các chủng đa kháng thuốc sử dụng phương pháp khuếch
tán đìa thạch dựa theo hướng dần của Viện Tiêu chn Phịng thí nghiệm Lâm sàng (CLSI,
2015) 19. Các xét nghiệm sẽ được thực hiện trên thạch Mueller Hinton, đối với các loại thuốc
kháng sinh thường được sử dụng. Hoạt tính kháng khuẩn của mỗi loại kháng sinh sẽ được
kiểm tra cho tất cả các chủng phân lập và kết quả sè được giải thích theo hướng dẫn về xét
nghiệm độ nhạy của đĩa kháng sinh do Viện Tiêu chn Phịng thí nghiệm và Lâm sàng cung
cấp và kết quả sẽ được ghi là nhạy, kháng trung gian và kháng. Các chủng kháng ít nhất 2 loại
kháng sinh khác nhau sẽ được coi là chủng đa kháng thuốc (MDR) và sẽ định danh, số lượng
các chủng MDR phân lập từ mồi mẫu sẽ được ghi lại.
Các kháng sinh sau đây đã được thử nghiệm vì chúng thuộc các họ riêng biệt:
gentamicin (GE) ở nồng độ đĩa kháng sinh là 10 pg; methicillin (Met) ở nồng độ đìa kháng
sinh là 5 pg; kanamycin (Km) ở nồng độ đĩa kháng sinh là 30 pg; tetracyclin (TE) ở nồng độ
đĩa kháng sinh là 30 pg; imipenem (IPM) ở nồng độ đìa kháng sinh là 10 pg; streptomycin
(Sm) ở nồng độ đĩa kháng sinh là 10 pg; ampicillin (Am) ở nồng độ đĩa kháng sinh là 10 pg;
Rifampicin (Rf) ở nồng độ đĩa kháng sinh là 30 pg; trimethoprim (TMP) ở nồng độ đìa kháng
sinh là 1,25 pg và chloramphenicol (Cm) ở nồng độ đìa kháng sinh là 30 pg. Nồng độ kháng
10
sinh đối với các chủng kiêm tra được lựa chọn dựa trên dữ liệu tài liệu cũng như dừ liệu của
Viện Tiêu chuân Lâm sàng và Xét ngiệm (CLSI) 20.
Tất cả các khuân thu được từ việc phân lập trong thực phẩm lên men truyền thống được
nuôi lại trên đĩa MH ủ qua 24h ở 37°c. Sau đó, lấy vi khuẩn đã tăng sinh pha trong dung dịch
nước muối 0.9% ở nồng độ 0.5 McFarlane trải lên đĩa MH rồi đặt đĩa kháng sinh ủ trong 24
giờ. Sau quá trình ủ, tiến hành đo đường kính của vịng vi khn tạo thành.
11
CHƯƠNG 3. KẾT QUÃ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Sự phổ biến của các kiểu hình kháng thuốc
Sau khi ủ trong thạch TSA khoảng 24 giờ ở 37°c, sử dụng phương pháp quan sát và
đếm khuẩn lạc cho thấy: nhìn chung, các hình thái chính của tồn bộ chủng là hình trịn, lồi,
nhằn và không trong suốt. Hầu hết tất cả các khuẩn lạc vi khuân có màu trắng và một số trong
số chúng có màu vàng. Đánh giá sự phong phú của vi khuẩn dị dưỡng kháng sulfamethoxazole
(SMX) từ nem chua, dưa chua và tương bần tại Hà Nội (Bảng 1). Trong nem chua, số lượng
vi khuẩn kháng SMX là 0.35x1 o4 (CFU/g) và tổng số lượng vi sinh dị dưỡng là 1.37xl06
(CFU/g). Ỏ dưa chua, số lượng vi khuẩn kháng SMX là 0.76x1 o4 (CFU/g) và tổng số lượng
vi sinh dị dường là 1.89xlO6 (CFU/g). Trong tương bần, số lượng vi khuẩn kháng SMX là
0.53x1 o4 (CFU/g) và tổng số lượng vi sinh dị dường 3.19xl06 (CFU/g)
Bảng 1. Tỷ lệ vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh trong các thực phâm lên men khác nhau
Sản phâm
Vi khuẩn kháng
SMX (CFU/g)
Tổng số vi sinh vật dị
dưỡng (CFU/g)
Tỉ lệ
Nem chua
(0.35 ±0.2) X 104
(1.54 +0.28) X 106
0.24%+ 0.18
Dưa chua
(0.76 +0.23) X 104
(1.89 ± 0.72) X 106
0.45% + 0.27
Tương bần
(0.53 + 0.36) xio4
(3.19 +0.8) X 106
0.17%+ 0.11
12
Hình 1. Tỷ lệ vi khuân kháng thuốc trong ba loại thực phâm. Các giá trị trung bình của chín
lần lặp lại được sừ dụng đê đại diện cho sự phân bố trong mỗi loại thực phâm. Các chừ cái
khác nhau chỉ ra sự khác biệt đáng kể (Tukey’s HSD test, p <0,05)
Dựa vào kết quả trên, vi khuẩn kháng thuốc được tìm thấy trong tất cả các mầu thực
phâm với sự khác nhau về mức độ phong phú giữa các loại thực phâm (Bảng 1). Nhìn chung,
tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh tương đối ít; dao động từ 0,17% đến 0,45%. Tỷ lệ kiểu hình
kháng thuốc cao nhất được quan sát thấy trong mẫu dưa chua (0,45% ± 0,27). Trong khi nem
chua (0,24% ± 0,18) và tương bần (0,17% + 0,11), thấp hơn rõ rệt so với dưa chua (thử
nghiệm Tukey HSD, p <0,05). Những dữ liệu này cho thấy dưa chua có khả năng xuất hiện
vi khuân với kiểu hình kháng kháng sinh cao nhất trong số ba loại thực phẩm lên men được
kiểm tra. Tỷ lệ vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh cao được tìm thấy ở đây có thê là do vệ sinh
cá nhân kém, tồn dư kháng sinh trong nguyên liệu thô, sừ dụng nước bị ô nhiễm và vệ sinh
thiết bị và bề mặt như dao, đĩa hoặc hộp đựng không đạt tiêu chuẩn. Ket quả của chúng tôi đã
cho thấy thực trạng cảnh báo tình trạng kháng kháng sinh trong thực phàm lên men tại Hà Nội
có nguy cơ tiềm ẩn gây nên các bệnh lý nghiêm trọng gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe cộng
đồng. Cần đánh giá tỷ lệ vi khuân kháng các loại kháng sinh khác thường dùng trong chăn
ni như gentamycin, tetracyclin, ampicillin để hồn thiện hình ảnh kháng kháng sinh trong
thực phẩm lên men của Việt Nam.
13
3.2. Đánh giá tính kháng kháng sinh của vỉ sinh vật phân lập được
Từ mồi mầu, các kiểu hình kháng thuốc đại diện cho các hình thái khác nhau được
phân lập và đặc biệt, 3 chủng AR ở nem chua, 3 chủng AR ở dưa chua và 3 chủng AR ở tương
bần được chọn đê thử nghiệm tính đa kháng thuốc. Chín chủng phân lập kháng thuốc đại diện
cho các kiêu hình thái khác nhau đã được chọn từ ba loại mẫu. Tính nhạy với kháng sinh đồ
được thử nghiệm đối với tất cả các chủng phân lập bằng cách sử dụng 10 loại kháng sinh và
kết quả được giải thích theo hướng dẫn được cung cấp bởi CLSI20.
Bảng 2. Ket quả của các thử nghiệm khuếch tán đĩa kháng sinh đối với các chủng kháng thuốc
được chọn từ các mầu thực phẩm lên men khác nhau. Trong đó:
Km: kanamycin (30 pg)
GE: gentamicin (10 pg)
TMP: trimethoprim (1.25 pg)
Met: methicillin (5 pg)
Sm: streptomycin (10 pg)
Am: ampicillin (10 pg)
Cm: chloramphenicol (30 pg)
R: resistant (kháng)
TE: tetracyclin (30 pg)
S: susceptible (không kháng)
IMP: imipenem (10 pg)
I: intermediate (trung gian)
Rf: rifampicin (30 pg)
STT
Mau
Tính nhạy với kháng sinh
Kí hiệu
chủng
Km
TMP Cm
Rf
GE
Am
IMP
Sm
TE
Met
V2
s
s
s
s
s
s
s
s
s
I
2
C3
s
R
s
I
s
R
s
R
R
R
3
V3
s
R
s
I
s
s
s
s
I
s
V7
R
R
R
R
R
R
s
R
R
R
V4
s
s
s
s
s
s
s
s
s
I
V6
s
s
s
s
s
I
s
I
s
R
1
4
5
6
Dưa chua
Nem
chua
14
7
8
Tương
V8
s
s
R
I
s
I
s
s
s
R
bần
C2
s
s
s
s
s
s
s
s
I
R
Vll
s
s
s
s
s
s
s
R
s
s
9
Có tơng cộng 6 chủng kháng từ 2 loại kháng sinh trở lên trên tổng số 9 chủng thu được
từ ba loại thực phâm lên men truyền thống (do các chủng đã được phân lập từ mơi trường có
chứa SMX), chiếm xấp xỉ 66.67%. So với các nghiên cứu trước đây được công bố ở Malaysia
về khả năng kháng thuốc do vi khuân Salmonella từ thịt tươi bán lẻ (khoảng 80% (70/88)
chủng thu được cho thấy khả năng kháng ít nhất hai loại kháng sinh đa kháng) '7, do đó 66.67%
chủng khuân kháng đa thuốc được tìm thấy trong thực phâm lên men thấp hơn đáng kể. Tuy
nhiên, những nguy cơ tiềm ân của những chủng kháng kháng sinh có trong thực phâm lên
men truyền thống vẫn là một mối lo ngại đối với vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm.
Chủng tiềm năng đồng thời được định danh bằng phương pháp giải trình tự (phương
pháp Sanger) dựa trên gene 16S. Sau khi giải trình tự gen các chủng đa kháng kháng sinh, thu
được kết quả như bảng 4.
Bảng 3. Bảng kết quả định danh các chủng kháng kháng sinh theo phương pháp Sanger dựa
trên gene 16S.
STT
Kí hiệu
Nguồn thực
Khả năng kháng kháng
mẫu
phẩm
sinh
C3
Dưa chua
Kết quả định danh
Klebsiella aerogenes
1
5 loại (AmR, SmR,
MetR,TMPR, TEr)
Klebsiella
2
V7
Nem chua
9 loại (AmR, SmR, KmR,
pneumoniae
TMPr, RfR, GER, TEr,
MetR)
Enterobacter
3
V8
Tương bần
2 loại (CmR, MetR)
ludwigii
Bảng 4. Bảng đặc tính của các chủng thu được từ thực phâm lên men truyền thống Việt Nam.
15
C3 (Klebsiella
aerogenes)
V7 (Klebsiella
pneumoniae)
V8 (Enterobacter
ludwigii)
Ruột các loài động
vật, đất, nước,
nước thài, thực vật
21
Đất, niêm mạc
động vật, thực vật,
.' , 22
nước
Đất 23, thực vật 24,
25
Hình que
Hình que
Hình que, có khả
năng chun động
Nhuộm Gram
-
-
-
Citrate
+
+
+
MR (methyl Red)
-
-
-
VP (VogesProskauer)
+
+
+
Calatase
+
+
+
Oxidase
-
-
-
Di động
+
-
+
Đặc tính vi khuẩn
Nguồn gốc
Hình dạng
Tính
chất sinh
hóa
Dựa vào bảng kết quả có thể thấy rằng phần lớn các chủng kháng kháng sinh có nguồn
gốc từ mơi trường (đất, nước,..). Việc những thực phẩm lên men không thơng qua q trình
gia nhiệt khiến những vi khuẩn kháng kháng sinh có cơ hội xâm nhập vào cơ thể khi chúng ta
ăn những thực phẩm này. Vi khuẩn gây bệnh từ sản phẩm có thể xuất hiện từ các yếu tố nội
sinh (động vật, thực vật) và ngoại sinh (nhân sự, nước hoặc môi trường). Việc xuất hiện
K.aerogenes trong nguồn thức ăn và hậu quả nghiêm trọng do chúng gây ra. K.aerogenes có
thể xâm nhập vào ruột của con người bất kể tình trạng miễn dịch của họ, gây ra tình trạng lây
nhiễm chéo giữa người với người gây ra bệnh nghiêm trọng cho những người khác 26,27. Trong
các nghiên cứu gần đây, Atarashi và cộng sự28 cùng với Cao và cộng sự29 đã có báo cáo rằng
sự xâm nhập đường ruột của K. pneumoniae từ khoang miệng đã gây ra tế bào T helper 1 và
gây ra tình trạng viêm ruột nghiêm trọng. Các tác giả đã cho rằng khoang miệng có thê đóng
vai trị như một nguồn chứa các mầm bệnh đường ruột tiềm ân. Thêm vào đó, báo cáo của
Tominaga và cộng sự 30 đã cho thấy rằng bánh ngọt và các loại thịt có thể là ơ chứa trước cho
bệnh viêm đường ruột. Do đó, chúng ta phải giám sát các loại thực phâm như vậy đê ngăn
16
chặn sự xâm nhập của K. pneumoniae trong khoang miệng và sự tiêu hóa của các vi khuẩn có
hại khác có thể gây ngộ độc thực phâm khi ăn qua bánh ngọt và các loại thịt, chẳng hạn như
s. aureus, Salmonella spp. và Clostridium perfringens 31. Sự nhiễm khuân E. ludwigii qua
đường miệng cũng đã được nhắc đến trong nghiên cứu của Priyadarsini và cộng sự về việc
gây ảnh hưởng xấu đến bệnh nhân tiểu đường 32. Nghiêm trọng hơn, việc ăn phải E. ludwigii
có thể dần đến hậu quả thay đơi q trình sản xuất histamnine - một bioamine quan trọng
đóng vai trị nền tảng, tham gia vào nhiều hoạt động sống của cơ thê liên quan mật thiết đến
hệ miễn dịch cục bộ cũng như việc duy trì chức năng sinh lý của ruột33. Có thể thấy rằng,
tiềm ân phơi nhiễm với các chủng vi sinh kháng kháng sinh là rất lớn và hậu quả khi phơi
nhiễm cũng rất nghiêm trọng, ảnh hưởng nặng nề đến sức khỏe của con người.
Hiện nay chưa xuất hiện nhiều các báo cáo về vi khuẩn kháng kháng sinh trên thực
phâm lên men truyền thống, tuy nhiên thế giới cũng đã có các báo cáo liên quan đến nguồn vi
sinh vật kháng kháng sinh xuất hiện ở thực phẩm như báo cáo của Van và cộng sự 34 về sự
xuất hiện của Salmonella spp. kháng kháng sinh trên các quầy bán lẻ thịt và trong các món ăn
đường phố ở Thành phố Hồ Chí Minh. Haryani và cộng sự 35 đã khảo sát các loại thức ăn
đường phố ở các địa điềm khác nhau trên Malaysia và đã phát hiện được Enterobacter cloacae
kháng 6 loại kháng sinh. Một nghiên cứu khác về hệ vi sinh vật kháng thuốc của Ashang và
cộng sự 36 cho thấy nhiều vi khuân kháng kháng sinh trong các mầu thực phâm ăn liền bán ở
Calabar Metropolis, Nigeria. Ngoài ra, nguồn vi khuân kháng kháng sinh cũng được phát hiện
trên nhiều các loại nguyên liệu thực phâm tươi như rau củ, thịt, cá 24'26. Cũng như các loại
thực phẩm khác, các món ăn lên men truyền thong cũng là một nguồn tiềm ẩn các vi sinh vật
kháng kháng sinh và đồng thời cũng là nguồn quan trọng đê chuyên gen sang các vi khuân
gây bệnh khác cũng như trở thành tác nhân gây nên nên sự chuyên gen ở các vi khuẩn không
gây bệnh nhưng mang gen kháng kháng sinh.
Hiện nay chúng ta vẫn chưa có giải pháp ngăn chặn tình trạng vi khuẩn kháng kháng
sinh một cách triệt để do đó những kết quả của đề tài này có thê góp phần kiêm sốt nguồn vi
khuẩn kháng kháng sinh và giảm khả năng lan rộng trong cộng đồng.
17
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Thực phẩm là một trong những nguồn chính cung cấp vi sinh vật cho cơ thể nên vệ
sinh an toàn thực phâm liên quan mật thiết với các yếu tố vi sinh ảnh hưởng tới sức khỏe con
người. Nghiên cứu này cho thấy sự phổ biến đáng kể của vi khuẩn kháng thuốc trong ba loại
thực phâm lên men truyền thống ở Việt Nam nói chung và Hà Nội nói riêng. Thử nghiệm tính
nhạy cảm với kháng sinh cho thấy 33.3% số phân lập đề kháng với ít nhất ba loại kháng sinh.
Các chủng MDR này được cho là mầm bệnh từ nguồn nguyên liệu thơ, là kết quả của q
trình sử dụng kháng sinh trong việc chăn nuôi hoặc vệ sinh chưa đạt tiêu chuẩn khiến thực
phâm vẫn cịn tồn tại từ mơi trường. Mặc dù các nghiên cứu về vi khuân kháng kháng sinh đã
phát triển trên thế giới trong nhiều thập kỷ qua và đã có những kết quả nghiên cứu nhất định,
tuy nhiên những nghiên cứu về vi khuẩn kháng kháng sinh trong thực phẩm ở Việt Nam còn
rất hạn chế. Đây là một hướng nghiên cứu liên quan tới sự liên hệ giữa sản phẩm nông nghiệp
và y tế, là một chủ đe chưa được quan tâm đúng mức, cần được tiếp tục nghiên cứu đào sâu
đê đưa ra những giải pháp đồng bộ và hiệu quả. Ket quả của đề tài sẽ cung cấp các thơng tin
hữu ích cho việc nhận thức về sự phô biến của vi sinh vật kháng kháng sinh từ đó nâng cao ý
thức vệ sinh an toàn thực phâm trong thực tế và có những biện pháp nhằm hạn che những sự
lây nhiễm nguồn vi khuẩn kháng kháng sinh từ đồ ăn sang cơ thể người. Ngoài ra, việc sử
dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi cần được điều chỉnh mạnh mẽ đê giảm thiểu cơ hội
cho các sinh vật phát triển sức đề kháng. Chúng tôi đề xuất thêm những nghiên cứu chi tiết
hơn về sinh học phân tử đê xác định và đặc tính di truyền của các chủng kháng thuốc, cũng
như để hiểu rõ hơn và kiềm sốt tình hình kháng kháng sinh trong thực phẩm lên men truyền
thống của Việt Nam.
Chủ nhiệm đề tài
Vũ Thị Nam Anh
18
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.
Bush, K.; Courvalin, p.; Dantas, G.; Davies, J.; Eisenstein, B.; Huovinen, p.; Jacoby,
G. A.; Kishony, R.; Kreiswirth, B. N.; Kutter, E.; Lerner, s. A.; Levy, s.; Lewis, K.;
Lomovskaya, o.; Miller, J. H.; Mobashery, s.; Piddock, L. J.; Projan, s.; Thomas, c.
M.; Tomasz, A.; Tulkens, p. M.; Walsh, T.R.; Watson, J. D.; Witkowski, J.; Witte, w.;
Wright, G.; Yeh, p.; Zgurskaya, H. L, Tackling antibiotic resistance. Nat Rev Microbiol
2011,9 (12), 894-6.
2.
O’Neill, J. J. A. R. p., AMR Review Paper-Tackling a crisis for the health and wealth
of nations. 2014, 1,2-14.
3.
Viet
Nam:
Together
and
Stronger
against
antimicrobial
resistance.
1-2016-viet-nam-together-and-stronger-
against-antimicrobial-resistance.
4.
Abriouel, H.; Knapp, c.; Galvez, A.; Benomar, N., Antibiotic resistance profile of
microbes from traditional fermented foods. In Fermented foods in health and disease
prevention, Elsevier: 2017; pp 675-704.
5.
Anal, A. K.; Perpetuini, G.; Petchkongkaew, A.; Tan, R.; Avallone, s.; Tofalo, R.;
Nguyen, H. V.; Chu-Ky, s.; Ho, p. H.; Phan, T. T.; Wache, Y., Food safety risks in
traditional fermented food from South-East Asia. Food Control 2020, 109.
6.
Sukmarini, L.; Mustopa, A. z.; Normawati, M.; Muzdalifah, I., Identification of
Antibiotic-Resistance Genes from Lactic Acid Bacteria in Indonesian Fermented Foods.
HAYATI Journal of Biosciences 2014, 21 (3), 144-150.
7.
Xiang, H.; Sun-Waterhouse, D.; Waterhouse, G. I.; Cui, c.; Ruan, z. J. F. s.;
Wellness, H., Fermentation-enabled wellness foods: A fresh perspective. 2019, 8 (3), 203243.
8.
La Anh, N., Health-promoting microbes in traditional Vietnamese fermented foods: A
review. Food Science and Human Wellness 2015, 4 (4), 147-161.
9.
Forslund, K.; Sunagawa, s.; Kultima, J. R.; Mende, D. R.; Arumugam, M.; Typas,
A.; Bork, p., Country-specific antibiotic use practices impact the human gut resistome.
Genome Res 2013, 23 (7), 1163-9.
19
10. Gong, A. n.; Shi, A.-m.; Liu, H.-z.; Yu, H.-w.; Liu, L.; Lin, w.-j.; Wang, Q.,
Relationship of chemical properties of different peanut varieties to peanut butter storage
stability. Journal of Integrative Agriculture 2018, 17 (5), 1003-1010.
11. Tran D., L. H., Ngo p, Antibiotic resistance of lactobacillus spp. Isolated from
fermented foods and supplement food supervision at Hochiminh City. Ho Chi Minh City
Journal of Medicine 2019, 23, 483-489.
12. Nawaz, M.; Wang, J.; Zhou, A.; Ma, c.; Wu, X.; Moore, J. E.; Millar, B. c.; Xu,
J., Characterization and transfer of antibiotic resistance in lactic acid bacteria from
fermented food products. CuiT Microbiol 2011, 62 (3), 1081-9.
13. Federici, s.; Ciarrocchi, F.; Campana, R.; Ciandrini, E.; Blasi, G.; Baffone, w.,
Identification and functional traits of lactic acid bacteria isolated from Ciauscolo salami
produced in Central Italy. Meat Sci 2014, 98 (4), 575-84.
14. Ammor, M. s.; Mayo, B., Selection criteria for lactic acid bacteria to be used as
functional starter cultures in dry sausage production: An update. Meat Sci 2007, 76 (1),
138-46.
15. Zdolec, N.; Filipovic, I.; Fleck, z. c.; Maric, A.; Jankuloski, D.; Kozacinski, L.;
Njari, B., Antimicrobial susceptibility of lactic acid bacteria isolated from fermented
sausages and raw cheese, veterinarski arhiv 2011, 81 (1), 133-141.
16. The maintenance of the list of QPS microorganisms intentionally added to food or feed
- Scientific Opinion of the Panel on Biological Hazards. EFSA Journal 2008, 6 (12).
17. Thong, K. L.; Modarressi, s. J. F. R. L, Antimicrobial resistant genes associated with
Salmonella from retail meats and street foods. 2011, 44 (9), 2641-2646.
18. Frank, J. A.; Reich, c. I.; Sharma, s.; Weisbaum, J. s.; Wilson, B. A.; Olsen, G. J.,
Critical evaluation of two primers commonly used for amplification of bacterial 16S rRNA
genes. Appl Environ Microbiol 2008, 74 (8), 2461-70.
19. Jean B. Patel, p., D(ABMM); Melvin p. Weinstein, M.; George M. Eliopoulos, M.;
Stephen G. Jenkins, p., D(ABMM), F(AAM); James s. Lewis II, p.; Brandi Limbago, p.;
Amy J. Mathers, M.; Tony Mazzulli, M., FRCP (C), FACP; Robin Patel, M.; Sandra s.
Richter, M., D(ABMM); Michael Satlin, M., MS; Jana M. Swenson, M.; Maria M.
Traczewski, B., MT(ASCP); John D. Turnidge, M.; Barbara L. Zimmer, p., Performance
Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 2017.
20. Ml00: Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing.
20
