Phát hiện nhanh virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRSV) bằng phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt Polymerase spiral reaction

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

BÁO CÁO TỎNG KÉT ĐÈ TÀI NCKH
DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2020

Tên đề tài: Phát hiện nhanh virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở

lợn (PRRSV) bằng phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt Polymerase spiral

reaction
Số hợp đồng: 2021.01.38

Chủ nhiệm đề tài: Trần Hồng Diễm
Đơn vị công tác: Viện kỹ thuật công nghệ cao NTT

Thời gian thực hiện: 01/2021 - 06/2021

TP. Hồ Chí Minh, ngày

i

tháng

năm 2021


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU...................................................................................................................................... V
CHUÔNG 1. TÔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................... 1

1.1. Tống quan về hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ớ lợn (bệnh heo tai xanh PRRS)............................................................................................................................................1

1.1.1. Khái quát về PRRS......................................................................................................... 1
1.1.2. Tác nhân gây bệnh.......................................................................................................... 1

1.1.3. Sự xâm nhiễm của virus và gây bệnh trên lợn........................................................... 2
1.1.4. Phương pháp phát hiện bệnh PRRS............................................................................. 3
1.2. Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt vòng xoan Polymerase spiral reaction (PSR) ...4
1.2.1 . Tống quan về phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt................................................... 4
1.2.2 Nguyên lí hoạt động của PSR........................................................................................ 5

CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu.................................. 7

2.1. Thời gian và địa điếm....................................................................................................... 7
2.2. Nội dung nghiên cứu........................................................................................................ 7
2.3. Vật liệu nghiên cứu............................................................................................................ 7

2.3.1 Thiết bị, dụng cụ...............................................................................................................7

2.3.2 Hóa chất............................................................................................................................ 9
2.3.3 Vật liệu sinh học.............................................................................................................. 9

2.4. Phương pháp nghiên cứu................................................................................................. 10
2.4.1 . Phương pháp xác định trình tự các thành phần phản ứng PSR............................. 10
2.4.2 Phương pháp phát hiện trình tự đặc trưng của PRRSV bàng PSR......................... 11

2.4.3 Phương pháp đọc kết quá PSR .................................................................................... 12

2.4.4 Khảo sát điều kiện phản ứng........................................................................................ 13
2.4.4.1 Phương pháp khảo sát nhiệt độ toi ưu cho phản ứng PSR................................... 13
2.4.4.2 Phương pháp khảo sát thời gian của phản ứng PSR..............................................14

i


2.4.5 . Phương pháp khảo sát giới hạn phát hiện của phản ứng PSR............................... 14
2.4.6 Khảo sát tính đặc hiệu của mồi phản ứng PSR........................................................ 15

2.4.7 . Phương pháp tách chiết RNA..................................................................................... 15
2.4.8 . Phương pháp PSR trực tiếp với mẫu bệnh phẩm - mẫu huyết thanh lợn bệnh... 15
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................... 16

3.1. Ket quả kiểm tra mồi và các thành phần phản ứng PSR........................................... 16
3.2 Kết quả khảo sát thời gian cho phán ứng PSR.............................................................16

3.3. Ket quả khảo sát nhiệt độ................................................................................................ 18
3.4. Giới hạn phát hiện của phương pháp PSR.................................................................. 20

3.5. Tính đặc hiệu của bộ moi thiết kế đối với PRRSV.................................................... 21
3.6. Hoạt động của PSR đối với RNA bộ gen được tách chiết.......................................... 22

3.7. Hoạt động của PSR đối với RNA hiện diện trong mẫu bệnh phẩm - mẫu huyết thanh

23

CHƯƠNG 4. KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ..................................................................... 25

4.1. Kết luận............................................................................................................................. 25

4.2. Kiến nghị.......................................................................................................................... 28
TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................................... 29

ỉi


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHŨ VIẾT TÁT

CSFV

Classical Swine Fever virus

DNA

Deoxyribonucleic acid

LAMP

Loop-mediated Isothermal Amplification

M

Membrane

NCBI

National Center for Biotechnology Information

PCR

Polymerase Chain Reaction

PEDV

Porcine Epidemic Diarrhea virus - virus gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn

PRRS

Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - hội chứng rối loạn sinh
và hô hấp sản ở lợn

PRRSV

Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus - virus gây hội
chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn

qPCR

Real-time - Polymerase Chain Reaction

RNA

Ribonucleic acid

RT-PSR

Reverse transcription-

RT-PCR

Reverse transcription - Polymerase Chain Reaction

TCID50

Median Tissue Culture Infectious Dose

iii


DANH MỤC CÁC BẢNG BIÉƯ, sơ ĐỒ, HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Cấu trúc PRRSV....................................................................................................... 2
Hình 1.2. Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt vịng xoan PSR......................................... 6
Hình 2.1. Sơ đồ hoạt động của mồi PSR.............................................................................. 11

Hình 2.2. Màu của phản ứng PSR........................................................................................... 13
Hình 3.1. Kct quả kiểm tra mồi quan sát bằng màu sắc và SYBR..................................... 16

Hình 3.2. Kết quả khảo sát thời gian phản ứng quan sát bằng màu sắc sau phản ứng và
soi SYBR....................................................................................................................................18

Hình 3.3. Ket quả khảo sát nhiệt độ phản ứng quan sát bằng màu sac sau phản ứng và soi
SYBR.......................................................................................................................................... 19
Hình 3.4 Kết quả khảo sát giới hạn phát hiện của phương pháp PSR đối với mục tiêu

dạng tổng họp........................................................................................................................... 20
Hình 3.5. Kết quả khảo sát giới hiện phát hiện của phương pháp PSR đối với RNA bộ
gen của PRRSV........................................................................................................................ 21

Hình 3.6. Ket quả khảo sát tính đặc hiệu của bộ mồi được thiết ke................................... 22

Hình 3.7. Khả năng phát hiện của PSR đối với các mẫu RNA có nồng độ khác nhau ...23

Hình 3.8. Khả năng phát hiện của PSR phát hiện trực tiếp mầu bệnh phẩm khơng tách
chiết RNA

Hình 4.1. Quy trình phát hiện mẫu huyết thanh bệnh phẩm chứa PRRSV bằng PSR ....25

Bảng 2.1 Danh mục thiết bị sử dụng trong nghiên cứu......................................................... 8
Bảng 2.2 Danh mục dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu........................................................ 8
Bảng 2.3 Danh mục hoá chất sử dụng trong nghiên cứu....................................................... 9
Bảng 2.4 Các chủng vi sinh vật được sử dụng trong nghiên cứu......................................... 9
Bảng 2.5 Các trình tự sử dụng trong nghiên cứu................................................................. 11

Bảng 2.6 Chương trình phản ứng PSR................................................................................... 12
Bảng 2.7 Thành phần phản ứng PSR..................................................................................... 12
Bảng 3.1. Ket quả khảo sát thời gian trong ba lần lặp lại.................................................... 17

iv


Bảng 3.2. K.ết quả khảo sát nhiệt độ trong ba lần lặp lại..................................................... 18

Hình 4.1. Quy trình phát hiện mẫu huyết thanh bệnh phẩm chứa PRRSV bằng PSR.......
.....................................................................................................................................................27

V


TĨM TẤT KẾT QUẢ NGHIÊN củ u

STT
1

Kết q đạt được

Cơng việc thực hiện

Phát triển, tối ưu quy trình

Xác định trình tự mồi đặc trưng, các

khuếch đại đẳng nhiệt PSR để

thành phần phản ứng, tối ưu nhiệt độ,

phát hiện chính xác PRRSV

2

thời gian phản ứng

Thực hiện trên mẫu bệnh phẩm

Quy trình PSR có khả năng phát hiện

trực ticp RNA virus trong mẫu bệnh
phẩm (huyết thanh)

3

STT
1

Hoàn thiện báo cáo đề tài

Báo cáo hoàn chỉnh

Sản phẩm đăng ký

Sản phẩm đã đạt được
Hoàn thành bản thảo

Bài báo khoa học

Thời gian thực hiện:
Thời gian nộp cuốn báo cáo :

vi


MỞ ĐẦU

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ớ lợn (PRRS) là một trong những bệnh phức tạp và
nguy hiếm nhất ở lợn với tỷ lệ tử vong cao do bệnh làm ảnh hưởng trực tiếp đến hệ thống

miễn dịch của phổi và kết hợp với sự lây nhiễm thứ cấp của các vi khuẩn và virus gây.
Tại Việt Nam, các đợt bùng phát PRRS với quy mô vừa và nhỏ vẫn xảy ra hàng năm ở

nhiều tỉnh thành, đe dọa thiệt hại về kinh tế của người chăn nuôi và rủi ro về sức khỏe

người tiêu dùng. Hiện nay, phương pháp phát hiện bệnh chủ yếu dựa vào chẩn đốn
thơng qua các triệu chứng lâm sàn, bên cạnh đó RT-PCR là đang là tiêu chuẩn vàng trong

chấn đốn bệnh, tuy nhiên RT-PCR địi hỏi thiết bị phức tạp, đắc tiền và chỉ có thế thực

hiện trong mơi trường phịng thí nghiệm chun biệt. Gần đây các phương pháp sinh học
phân tử khác như phương pháp khuếch đại đang nhiệt vòng xoắn PSR đang được nghiên
cứu phát hiện nhanh các loại mầm bệnh. PSR thừa hưởng tất cả ưu diem của PCR về độ
nhạy, độ đặc hiệu đồng thời kỹ thuật đon giản dễ thực hiện. Vì thế đề tài “Phát hiện

nhanh virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRSV) bằng phương pháp

khuếch đại đẳng nhiệt Polymerase spiral reaction” được thực hiện. Quy trình PSR được

tối ưu trong nghiên cứu có khả năng phát hiện trình tự mục tiêu PRRSV với giới hạn phát

hiện 10O 5TClD5O/ml, phản ứng được thực hiện tại một nhiệt độ cố định (65°C) trong thời
gian 40 phút. Đồng thời, phương pháp có thể phát hiện đối với trình tự mục tiêu hiện diện
trong mẫu phân khơng cần q trình tách chiết RNA, có thế đọc kết q nhanh bàng mắt

thường thông qua màu sắc của phán ứng, điều này cho thấy khả năng ứng dụng cao của
phương pháp đối với phát hiện nhanh bệnh tại chồ.

vii


CHƯƠNG 1. TÔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (bệnh heo tai xanh -

PRRS)
1.1.1. Khái quát về PRRS

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn là bệnh truyền nhiễm của lợn mọi

giong, mọi lứa tuổi (lợn nái, lợn con theo mẹ, lợn con sau cai sữa, lợn choai, lợn thịt và
lợn đực giống) [1], Bệnh có tính chất lây lan nhanh và gây chết nhiều lợn khi ghép hoặc
ke phát các bệnh truyền nhiễm nguy hiếm khác như: dịch tả lọn, phó thương hàn, tụ huyết

tràng...Đặc trưng của bệnh là gây sảy thai, thai chết lưu ở lợn nái chửa; lợn ốm có triệu
chứng điển hình sốt cao trên 40°C, viêm phổi nặng; đặc biệt là ở lợn con cai sữa viêm

phổi chết rất nhanh [1, 2].

1.1.2. Tác nhân gây bệnh

PRRS gây ra bởi Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
một loại Arterivirus, họ Arteriviridae [1].

Virus PRRS (PRRSV) là loại virus sợi đơn dương RNA, được bao bọc bên ngồi
một lớp vỏ có đường kính từ 50-65 nm, bồ mặt tương đoi nhằn, bên trong chứa

nucleocapsid hình khối có đường kính từ 25-35 nm, kích thước genome khoảng 15 kb
bao gồm tám khung đọc mở (ORF) [3,4]. Trong đó ORFla và ORFlb chiếm 80%

genome có chức năng cấu thành RNA polymerase cúa virus [3, 4]. Virus phát triển, tăng

nhanh về số lượng trong đại thực bào, phá hủy và giết chết tế bào đại thực bào, làm suy
giảm nghiêm trọng sức đề kháng của lợn bệnh; tạo điều kiện thuận lợi cho các vi khuẩn

thứ phát gây bệnh viên phổi như bệnh dịch tả lợn, suyễn, liên cầu khuân, tụ cầu khuẩn, tụ
huyết trùng phát sinh, phát triển và làm cho bệnh ngày càng trầm trọng hơn, lợn bệnh

chết chú yếu do các vi khuẩn kế phát [1,2].


RNA

ISkDa N protein (ORF 7 product)
24 - 26kDa E protein (ORF 5 product)

30 - 40kDa protein (ORF 4 product)

Q

18 - 19kDa M protein (ORF 6 product)

Lipid envelope

Hình 1.1. Cấu trúc PRRSV [3]

1.1.3. Sự xâm nhiễm của virus và gây bệnh trên lọn
Virus PRRS sau khi xâm nhập vào cơ thế thì đích tấn cơng của chúng chính là tế
bào đại thực bào phế nang (PAMs). Nó khơng tạo ra sự suy giảm miễn dịch tồn diện

nhưng nó làm cho các cơ chế phòng vệ của phổi bị tổn thương. Khi đó, các mầm bệnh hơ
hấp, phụ nhiễm dễ dàng xâm nhập vào phổi. Virus PRRS sinh sản trong tế bào đại thực
bào phế nang PAMs. Virus lưu hành lâu trong máu (~ 3 tuần), tồn nhiễm lâu (~ 157

ngày).

Độ lây nhiễm của virus PRRS cao, Sau khi xâm nhập vào cơ the lợn, trong 1 - 2
tuần virus PRRS đã tiêu diệt khoảng 50% tế bào đại thực bào phế nang. Virus gây ra

viêm vách phế nang dần đến viêm phổi kẽ, phù thũng phổi; trên phoi xuất hiện các lốm
đốm đỏ đến đỏ nâu. Khi vách phế nang bị viêm sẽ rất dễ dẫn đen các bệnh kế phát khác.

Virus PRRS xâm nhập vào máu từ đó theo máu đến các mơ và khư trú tại đó, virus xâm

nhập vào nhau thai gây lên sảy thai vào giai đoạn cuối, đẻ non, thai chết lưu, động dục
giả, ...
Một khi đàn lợn đã bị nhiễm virus PRRS, virus có xu hướng lưu hành vĩnh viễn,

rất khó để bài trừ. Kháng thể mẹ truyền không đủ để báo hộ cho lợn con chống lại virus

PRRS, nếu có thì thời gian miền dịch rất ngắn.

2


1.1.4. Phương pháp phát hiện bệnh PRRS

PRRS được phát hiện thơng qua các triệu chứng lâm sàng có thế quan sát trực tiếp,
sử dụng định nghĩa ca bệnh lâm sàng theo Cục Thú y như sau lợn sốt cao trên 40°C, khó

thở, có những vết bầm, thâm tím trên da, tai tím xanh, đồng thời kèm theo lợn chích

kháng sinh nhiều ngày khơng giảm, có nhiều lợn nái sẩy thai, hoặc sốt nằm đờ đẫn, hôn

mê, lọn con, heo cai sữa cả đàn có biếu hiện ửng dở tồn thân hoặc tai tím bầm [5, 6].

Các biểu hiện của bệnh thường không đặc trưng và dễ nhầm lẫn khi kế phát với các bệnh
khác. Tuy nhiên, các biểu hiện của bệnh thường không đặc trưng và dễ nhầm lẫn khi kế
phát với các bệnh khác.

Do đó, cần kết hợp các phương pháp khác trong chân đoán bệnh như phát hiện
kháng thè bang phương pháp ELISA (Enzyme linked immonosorbent assay) [6] có sẵn

trên thị trường, phương pháp IPMA (Immunoperoxidase monolayer assay) [6] - phương
pháp sử dụng một thảm te bào đã gây nhiễm virus chuan đề phát hiện kháng thể, nếu
huyết thanh có kháng the thì có sự kết hợp của kháng nguyên, kháng thể và kháng kháng

thể, khi cho cơ chất vào sẽ xuất hiện màu đỏ đậm, đó là phản ứng dương tính, phân ứng
âm tính nếu thảm tế bào có màu hồng nhạt [6]. Mặc khác, hiện nay RT-PCR vẫn được coi

là tiêu chuẩn vàng trong việc chẩn đốn sự có mặt của PRRSV. RT-PCR có thể cho kết
quả với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là sự

đòi hỏi về máy móc đắt tiền trong phịng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn xét nghiệm và an toàn
sinh học, cũng như kỹ thuật viên có kinh nghiệm về sinh học phân tử. Đây là các điều

kiện khó có thê đạt được với tuyến cơ sở và sẽ giới hạn khả năng phản ứng của các địa
phương trong trường hợp bệnh dịch bùng phát. Chính vì vậy, song song với việc phát
triển kit xét nghiệm multiplex realtime RT-PCR để tăng hiệu quá định lượng virus trong

các phịng thí nghiệm trung tâm thì việc phát triến phương pháp sàng lọc có khả năng xét

nghiệm nhanh virus với các yêu cầu tối thiểu về trang thiết bị và đào tạo nhân sự chuyên
môn ở thực địa và các tuyến cơ sở là cần thiết đế bổ sung cho bộ máy y tế dự phòng.

3


1.2. Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt vòng xoắn Polymerase spiral reaction
(PSR)

1.2.1 . Tổng quan về phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt

Các kĩ thuật phân tử phát hiện gần đây trong các nghiên cứu, một trong những
phương pháp gần đây là chuỗi polymerase (PCR) đã thu hút các nhà nghiên cứu. Phương

pháp này nhanh và nhạy, có khả năng khuếch đại số lượng DNA hàng triệu bậc độ lớn,

bên cạnh các ưu điêm trên, phương pháp này có những hạn chế như là sử dụng chu trình
nhiệt để nhân giống 30 - 40 chu kì, sử dụng các thiết bị đẳt tiền. Vì vậy phương pháp này
chỉ áp dụng với dụng cụ cao với sự trang bị máy móc, thiết bị hiện đại, đòi hỏi đội ngũ

nhân viên chuyên nghiệp và có chun mơn.
Một loạt các kỹ thuật khuếch đại đang nhiệt đã được báo cáo đế khuếch đại DNA

hoặc RNA trong 20 năm qua, bao gồm hệ thống khuếch đại dựa trên phiên mã (TAS) [7],

phản ứng sao chép trình tự tự duy trì (3SR) [8], khuếch đại dịch chuyển sợi (SDA) [9],
sao chép vòng tròn lăn (RCR) [10], khuếch đại đắng nhiệt qua trung gian vòng (LAMP)

[11], khuếch đại đẳng nhiệt đơn (SP1A) [12] khuếch đại -priming (CPA) [13] . Trong các
phương pháp này, TAS, 3SR, NASBA, SDA, HDA và SPIA yêu cầu nhiều enzyme (ba

hoặc nhiều hơn) và tối ưu hóa nghiêm ngặt. Chỉ một vài trong số các phương pháp
khuếch đại đẳng nhiệt này (ví dụ, RCR, LAMP và CPA) có thể được thực hiện hiệu quả ở

nhiệt độ không đoi bằng cách sử dụng một enzyme. Tuy nhiên, phương pháp RCR chỉ có
the khuếch đại DNA vịng trong khi bốn hoặc nhiều mồi khơng thê thiếu để bắt đầu phản
ứng LAMP hoặc CPA.

Trong khi đó PSR được giới thiệu vào năm 2015 thừa hưởng các ưu diem của PSR

và CPA về độ nhạy, độ đặc hiệu. Tuy nhiên, PSR chi cần hoạt động của một cặp mồi và
một loại enzyme, phản ứng xảy ra ở một nhiệt độ cố định và kết quả có thế quan sát trực
tiếp qua việc quan sát sự thay đối màu của sản phấm sau phản ứng sau khi cho chất chỉ

thị màu. PSR là phương pháp đẳng nhiệt mới được phát triển trong thời gian gần đây với
nhiều ưu điểm đế phát triển phát hiện nhanh, tại chồ.

4


1.2.2 Nguyên lí hoạt động của PSR
Dựa vào sự tổng hợp DNA thay thế sợi đôi, nhiệt độ 60 - 65 °C, thời gian 30 - 60

phút với sự có mặt của enzyme Bst DNA polymerase, dNTPs, các cặp mồi đặc hiệu,

DNA khuôn, gồm các bước:
PSR chỉ sử dụng dụng một loại enzyme duy nhất, sử dụng một cặp mồi được thiết
kế đặc trưng và DNA polymerase de khuếch đại trình tự DNA mục tiêu dưới điều kiện

đang nhiệt. Cặp mồi được thiết kế cho phản ứng PSR bao gồm mồi xuôi FP và mồi ngược
BP theo sơ đồ trong Hình 1.2 [14], Trong đó, FP bao gồm trinh tự N và trinh tự F theo
chiều 5’-3’, trình tụ F có chiều dài từ 15 - 30 bp được xác định và là trình tự bơ sung

chính xác cho một vùng trinh tự tại đầu 3’ của trình tự mục tiêu; BP bao gồm trinh tự N’
và trình tự B theo chiều 5’-3’, B được xác định và bo sung hồn tồn cho 15-30

nucleotide của trình tự mục tiêu tại đầu 5’; trình tự N’ là trình tự đảo ngược khơng bo

sung của trình tự N, N khơng nhận dạng hay bổ sung cho F, N’ không nhận dạng hay bồ

sung cho B. Phản ứng PSR có thế xảy ra ở nhiệt độ 60 - 65°c, trong đó, mạch đơi của
trình tự mục tiêu bị biến tính thành hai mạch đơn nhờ sự hiện diện của Betaine, trình tự F
của FP sẽ bắt vào trình tự Fc của mạch đơn tại mạch 3’-5’ của trình tự mục tiêu, nhờ sự

hoạt động của DNA polymerase, mạch mới sẽ được tong hợp kéo dài từ F tạo mạch mới
chứa trình tự Bc, qua đó trình tự B của BP sẽ liên kết và DNA polymerase kéo dài tổng
hợp mạch tạo mạc chứa Nc và N’ theo chiều 3’-5’, do trình tự N’ khi đả ngược lại sẽ

thành trình tự N - bố sung hồn tồn cho trình tự Nc, vì the mạch mới được tạo thành có
the đóng vịng, đầu 3’ của Nc có thế tiếp tục kéo dài mở rộng tạo cấu trúc vịng xoắn
[14], Q trình tương tự xảy ra với mạch 5’-3’ của trình tự mục tiêu ban đầu với sự hoạt

động của mồi BP.

5


Hình 1.2. Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt vịng xoắn PSR.

6


CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cưu

2.1. Thòi gian và địa điểm

Thời gian: 01/2021 -06/2021

Địa điểm: Viện kỹ thuật công nghệ cao NTT, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành.
Địa chí: MM2 Hồng Diệu phường 13, quận 4, Thành phố Hồ Chí Minh.
2.2. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Xác định trình tự mồi PSR đặc trưng phát hiện PRRSV

Dựa vào các tài liệu nghiên cứu trong và ngoài nước, tiến hành lựa chọn gen mục

tiêu đặc trưng cho PRRSV, qua đó sàng lọc để tìm trình tự mồi đặc trưng phát hiện gen
này.
Nội dung 2: Đánh giá hoạt động của mồi thiết kế

Bộ mồi thiết kế được kiểm tra với phản ứng PCR thông thường và phản ứng PSR
với RNA bộ gene, cùng các phương pháp đọc kết quả phản ứng PSR khác nhau.
Nội dung 3: Toi ưu quy trình PSR

Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PSR bao gồm nhiệt độ phản ứng, thời gian phản
ứng, nồng độ mồi.
Nội dung 4: Khảo sát giói hạn phát hiện, tính đặc hiệu của bộ mồi

Khảo sát tính đặc hiệu của mồi so với các chủng vi khuẩn, virus gần gũi khác

PRRSV
Khảo sát giới hạn phát hiện của phương pháp.
Nội dung 5: Khả năng hoạt động của PSR vói PRRSV hiện diện trong huyết thanh

lợn

Khảo sát khả năng phát hiện RNA virus trực tiếp từ mẫu bệnh phấm không tách
chiết bằng PSR
Nội dung 6: Hoàn thiện báo cáo.
2.3. Vật liệu nghiên cứu

2.3.1 Thiết bị, dụng cụ

7


Bảng 2.1 Danh mục thiết bị sứ dụng trong nghiên cứu

TÊN THIẾT BỊ

STT

STT

TÊN THIẾT BỊ

8

Máy đọc gel

Bộ máy điện di Mini-Sub
1

(Biorad - Mỹ)

Máy spin down PUR1SPIN

2

9

Máy gia nhiệt khô BDT (Grant)

(NOVAPRO - Hàn Quốc)

Máy vortex ZX3 (VELP -

Tủ sấy UN30 (Memmert Đức)

10

3

Italia)

Bàn soi gel BlooK LED

Máy ly tâm đa năng Z326
11

4

(GeneDirex - Đài Loan)

(Hermle - Đức)

Nồi hấp khử trùng HV - 50

Máy đo OD JENWAY Genova

12

5
(Hirayama - Nhật Bản)

Plus

Tú an toàn sinh học cap II

Máy PCR (Cole-Parmer Ltd, ƯK)

13

6

BSC-130011 B2-X

Mảy ủ nhiệt khô Biosan Bio
7

TDB-100

Bảng 2.2 Danh mục dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu

STT

TÊN DỤNG CỤ

STT

TÊN DỤNG CỤ

1

Tủ lạnh -80 c (Panosonic)

7

Ống đong chia độ

8

Bao tay cao su

9

Băng keo, kéo

10

Túi zip

11

Giấy bạc

Tủ lạnh -20 c (SANAKY 2

Việt Nam)

Tủ lạnh 4 c (SANAKY - Việt
3
Nam)

Micropipette các loại

4
(Eppendorf - Mỹ)

5

Eppendorf
8


Đầu tip các loại

6

Khẩu trang

12

2.3.2 Hóa chất
Bảng 2.3 Danh mục hố chất sử dụng trong nghiên cứu

STT

TÊN HỐ CHÁT

STT

TÊN HỐ CHẤT

1

Nuclease free water (Thermofisher)

10

CTAB( life sciecne)

2

Gelred 6X (Biotium)

1 1

HC1 (Bio Bssic Canada INC)

3

Agarose (Bioline)

12

EDTA (Bio Bssic Canada
INC)

DNA ladder 100 bp, Ikb (Sigma
4

NaCl (Biopharmaceuticals &

13
aidrich)

Titrimetry)

Ethanol (Xilong Sicentiffic
5

14

TBE buffer (Thermofisher)

Co.Ltd)

Phenol(Xilong Sicentiffic

2X warmstart colorimetric PSR

15

6

mastermix (NEB - Anh)

Co.Ltd)
Isopropanol (Xilong

7

Mecrapthoethanol( Thermo fisher)

16

Sicentiffic Co.Ltd)

Isoamyl alcohol (Xilong Sicentiffic
17

8

Trizol (Life technology)

Co.Ltd)
9

Chloroform (VN chemsosol.Co.Ltd)

2.3.3 Vật
• liệu
• sinh học
•

Bảng 2.4 Các chủng vi sinh vật được sử dụng trong nghiên cứu

STT

Dạng mẫu

Nguồn gốc

Số lượng

Samonella enterica

Khuân lạc

Phân lập

1

Staphylococus aureus

Khuân lạc

Phân lập

1

9


Pseudomonas aeruginosa

Khuẩn lạc

Phân lập

1

Listeria monocytogenes

Khuẩn lạc

Phân lập

1

Vibrio parahaemolyticus

Khuẩn lạc

Phân lập

1

PRRSV

RNA

Học viện Nông nghiệp
10

Việt Nam

Huyết

Học viện Nông nghiệp

thanh

Việt Nam

PRRSV

10
Học viện Nông nghiệp

Virus tả lợn châu Phi
RNA

(ASFV)

2

Việt Nam

Virus tả lợn cổ điển

Học viện Nông nghiệp

RNA

(CSFV)

2

Việt Nam

Virus tiêu chảy cấp ở lợn

Học viện Nông nghiệp
RNA

(PEDV)

7

Việt Nam

Nghiên cứu này sử dụng các chủng vi sinh vật trong Bảng 2.4 được cung cấp từ

Học viện Nơng nghiệp Việt Nam và phân lập từ phịng thí nghiệm vi sinh, Viện kỹ thuật
công nghệ cao NTT.
2.4. Phuong pháp nghiên cứu

2.4.1 . Phuong pháp xác định trình tự các thành phần phản ứng PSR
Dựa theo các nghiên cứu trước đó, gen M được lựa chọn làm gen mục tiêu phát

hiện do tính ổn định và độ bảo tồn cao của trình tự gen ở PRRSV. Trình tự gen có vị trí

từ 14510 đến 14805 trên bộ gen của PRRSV No. JX512910.2 được tổng hợp bởi Phù sa
(Việt Nam) dùng làm trình tự mục tiêu cho các bước đánh giá điều kiện ban đầu, đồng

thời làm chứng dương cho khảo sát, trình tự mồi PSR được thiết kế đặc trưng cho

PRRSV được thiết kế bằng phần mềm PrimerV5, các trình tự này cũng được tống hợp
bởi Phù sa (Việt Nam) và sử dụng làm mồi cho tất cả các thí nghiệm trong nghiên cứu

này. Các trình tự mồi được kiểm tra lại bằng PCR insilico bằng phần mềm Ugene và
NCBI Blast. Sơ đồ vị trí của một bộ mồi phản ứng PSR được thế hiện tại Hình 2.1.

10


Hình 2.1 Sơ đồ hoạt động cùa mồi PSR

Bảng 2.5. Các trình tự sử dụng trong nghiên cứu

Trình tự 5’-3’

Tên

ACGATTCGTACATAGAAGTATAGPRRS PSR F

AGAAAAACCCGGAGAAGCCC
GATATGAAGATACATGCTTAGCA-

PRRSPSRR

ATCTGACAGGGCACAAGTTCC
GGAGCAGTAGTTGCACTTCTTTGGGGAGTGTACTCAGC
CATAGAAACCTGGAAATTCATCACCTCCAGATGCCGTT

TGTGCTTGCTAGGCCGCAAGTACATCCTGGCCCCTGCC

CACCACGTCGAAAGTGCCGCGGGCTTTCATCCGATTGC
M_gblock

GGCAAATGATAACCACGCATTTGTCGTCCGGCGTCCCG

GCTCCACTACGGTCAACGGCACATTGGTGCCCGGGTTG
AAAAGCCTCGTGTTGGGTGGCAGAAAAGCTGTTAAGC
AGGGAGTGGTAAACCTTGTTAAATATGCCAA

2.4.2 Phương pháp phát hiện trình tự đặc trưng của PRRSV bằng PSR

Tất cả các phản ứng PSR thực hiện trong nghiên cứu này được thực hiện với the
tích cuối cùng là 15 pl. Các phản ứng PSR ban đầu trước khảo sát điều kiện tối ưu cho

phản ứng sẽ dùng chương trình phản ứng PSR thực hiện với thông số theo Bảng 2.6
(thông số theo nghiên cứu trước đó) và thành phần phản ứng được sử dụng theo Bảng 2.7
(thơng số theo nghiên cứu trước đó).

11


Trong mỗi lần thực hiện, thí nghiệm sẽ thực hiện cùng với mẫu đối chứng âm và

đối chứng dương (trong trường hợp khảo sát mẫu thực) đế kiếm soát phản ứng. Trong đó,
với đối chứng âm, nước được sử dụng thay thế cho trình tự mục tiêu, đối chứng dương sử
dụng DNA mục tiêu dạng tổng hợp cho phản ứng.
Bảng 2.6 Chương trình phản ứng PSR
STT

Bước thực hiện

1

Bắt cặp, kéo dài,
.
65 °C
taọ ra sản phẩm

Nhiệt độ

Thòi gian
45 phút

Bảng 2.7 Thành phần phản ứng PSR

Nồng
STT

Thành phần

độ

trong

Thể tích (pL)

phản ứng(pM[)
1

Mạch khn DNA

5

1 pg

2

NF

0,96

1,6

3

NR

0,96

1,6

4

Mastermix

7,5

IX

Nước sinh học phân
0,58

5

tứ
Tổng thể tích 15 pl/ phản ứng

2.4.3 Phuong pháp đọc kết quả PSR

Sản phẩm của phản ứng PSR trong nghiên cứu này được ghi nhận bàng hai
phương pháp: quan sát màu phản ứng và nhuộm huỳnh quang bằng thuốc nhuộm SYBR.

Sản phẩm PSR được quan sát trực tiếp bằng màu sắc phản ứng thông qua chỉ thị
pH. Sản phấm PSR được khuếch đại với lượng lớn trong kết quả cuối cùng, làm giảm pH
sau phản ứng, sự có mặt của chất chỉ thị pH - phenol red trong phản ứng giúp có thế quan

12


sát kết quả trực tiếp bằng mắt thường. Theo đó, màu hồng sáng của phản ứng ban đầu
thay đối thành vàng với phản ứng dương và giũ’ nguyên màu sắc ban đầu với phản ứng

âm (Hình 2.2A, Hình 2.2B). Đồng thời, sản phẩm PSR cũng có thế quan sát bàng nhuộm

bằng chất phát huỳnh quang SYBR và soi dưới ánh sáng 460 nm (Hình 2.2C).

Sau phản ứng

Trước phản ứng
I_________

I

)l

I

Hình 2.2. Màu của phản ứng PSR
Trong đó (A): Trước phản ứng; (B): Sau phản ứng; (C) Ket quả sau phản ứng nhuộm

SYBR

2.4.4 Khảo sát điều kiện phản ứng

2.4.4.1 Phương pháp khảo sát nhiệt độ tối ưu cho phản ứng PSR
Enzyme Bst DNA polymerase có dải nhiệt độ hoạt động kéo dài, enzyme được sử
dụng trong nghiên cứu này có dải nhiệt độ thích hợp cho phản ứng PSR là từ 56 -67 °C
và cũng là nhiệt độ tối ưu cho quá trình bắt cặp kéo dài tạo sản phẩm PSR. Việc xác định

nhiệt độ các phản ứng PSR được thực hiện với thế tích là 15 pl. Các bước thực hiện như

sau:

Bước 1: Chuấn bị mồi, mạch khuôn
Bước 2: Pha hỗn hợp phản ứng PSR
Bước 3: Trộn đều, spindown hồn hợp PSR

13

Bước 4: Hút 14 JJ.1 hồn hợp PSR đã trộn đều + 1 pl mạch khuôn

Bước 5: Thiết lập máy PCR ở gradiant nhiệt độ, bở mồi ống phản ứng ở mức nhiệt
độ tương ứng.

Bước 6: Quan sát kết quả. Đánh giá kết quả thí nghiệm.
2.4.4.2 Phương pháp khảo sát thời gian của phản ứng PSR
Thời gian kéo dài cùa phản ứng PSR quyết định tới số lượng DNA sản phẩm được

hình thành trong phản ứng. Các kết quả tối ưu trên được thực hiện trong thời gian 50 phút

phản ứng, theo hướng dẫn của nhà sản xuất, phản ứng xảy ra hoàn toàn trong 50 phút
phản ứng. Việc xác định thời gian các phản ứng PSR được thực hiện với thể tích là 15 pl,
được thực hiện trong bê ủ nhiệt, chúng tôi tiến hành khảo sát phản ứng trong khoảng 5-

50 phút phản ứng, mỗi khoảng cách nhau 5 phút. Các điều kiện khác không thay đổi, kết
quả được kiểm tra bàng màu sắc. Các bước thực hiện như sau:

Bước 1: Chuẩn bị mẫu, mồi, mạch khuôn.

Bước 2: Vệ sinh khu vực thực hiện thí nghiệm.
Bước 3: Pha hồn hợp phản ứng PSR.
Bước 4: Trộn đều, spindown hồn hợp PSR.

Bước 5: Hút 14 pl hỗn hợp PSR đã chuẩn bị trước đó + 1 pl mạch khn, hút 1 pl
chứng âm là nước.

Bước 6: Khảo sát thời gian 5-50 phút, đánh giá kết quả.

2.4.5 . Phương pháp khảo sát giới hạn phát hiện của phăn ứng PSR
Số bản sao của DNA mạch khn được tính tốn bằng chương trình Endmcm

; 309 bản sao trình tự gen M đích của PRRSV
dạng tổng hợp, được pha lỗng theo bậc 10 về các nồng độ cuối cùng 108 - 10'2 bản sao
và tiến hành thực hiện phản ứng với các điều kiện và thành phần theo nghiên cứu trước
đó. Sản phẩm được phân tích bàng màu sắc sau phản ứng và nhuộm SYBR.

Mầu RNA được tách chiết có nồng độ 105 ■ TCID50/ml cũng được pha loãng theo

bậc 10 về các nồng độ cuối cùng 104 5 - 10° TCID50/ml và tiến hành thực hiện phản ứng

14


với các điều kiện tối ưu. Sản phẩm được phân tích bằng màu sắc sau phản ứng và nhuộm
SYBR

2.4.6 Khảo sát tính đặc hiệu của mồi phản ứng PSR

Tính chuyên biệt của các thành phần bao gồm bộ mồi được lựa chọn chỉ bắt cặp và
cho phản ứng đặc hiệu với RNA mục tiêu được kiểm tra. Trong khảo sát này, RNA các

virus gây bệnh phổ biến trên lợn với các triệu chứng gây bệnh có nhiều điểm tương đồng

với PRRS (CSFV, PEDV, ASFV) các vi khuẩn thông thường phổ biến ngồi mơi trường
được sử dụng để thực hiện phản ứng PSR s. enterica, s. aureus, p. aeruginosa, L.

monocytogenes với các thành phần và điều kiện đã được khảo sát.
2.4.7 . Phương pháp tách chiết RNA

Các mẫu RNA virus sử dụng trong nghiên cứu được tách chiết bằng phương pháp
Trizol với các bước thực hiện:

Bước 1: Hỗn hợp mẫu 100 pl huyền phù + 1 ml trizol + 200 pl chloroform.

Bước 2: Trộn đều 2 phút (lắc nhẹ bằng tay).
Bước 3: ủ 20 phút ở nhiệt độ phịng, sau đó đem đi li tâm 12.000 vòng 15 phút ở
nhiệt độ 4 °C.

Bước 4: Thu phần dịch nổi ở trên + 600 pl isopropanol, ủ ở -20 °C (ủ ít nhất là 30

phút).
Bước 5: Ly tâm 12.000 vòng 10 phút sau đó rửa tủa bằng sau đó đe khơ.

Bước 6: Rửa mẫu vừa thu được bằng 10 pl nước sinh học phân tử, li tâm 7.500

vòng trong 10 phút trừ mẫu ở 4 °C.
Kết quả tách chiết được kiểm tra bằng phương pháp đo OD bằng máy JENWAY
Genova Plus. Mầu RNA được giữ ở -20 °C cho các lần sử dụng sau.

2.4.8 . Phuong pháp PSR trực tiếp vói mẫu bệnh phẩm - mẫu huyết thanh lọn bệnh

Phương pháp PSR được tối ưu trong nghiên cứu này được dùng với mục tiêu có

thể phát triển để phát hiện PRRSV trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm lọn, cụ thể là mẫu huyết
thanh bệnh. Mầu bệnh phấm chứa virus được pha loãng 50 lần và thực hiện phản ứng

PSR với thành phần và điều kiện đã tối ưu trước đó, đồng thời mẫu bệnh phấm không

15


chứa virus cũng được thực hiện song song để kiểm tra khả năng hoạt động chính xác của

phương pháp.

16


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THÁO LUẬN

3.1. Kết quả kiểm tra mồi và các thành phần phản ứng PSR

Trình tự của gen M được tống hợp cùa PRRSV được lựa chọn làm gen mục tiêu để

thực hiện phản ứng PSR, phản ứng này được thực hiện bới 2X warmstart LAMP
colorimetric mastermix dưới sự xuất hiện của chất chì thị pH. Ket quả kiểm tra cho thay

sau phản ứng 45 phút ở 65°C có sự thay đồi từ màu hồng sang vàng đối với mẫu dưong

chứa gen mục tiêu dạng tống họp, giữ nguyên màu hồng đối với mẫu âm Hình 3.1 A. Sự

thay đối màu sắc cho thấy sản phẩm khuếch đại đã được tạo ra và có thể quan sát bằng

mắt thường, chứng minh rằng bộ mồi được lựa chọn cho phản ứng PSR phát hiện thành
cơng trình tự mục tiêu của PRRSV. Mặt khác kết quả PSR với RNA tinh sạch của

PRRSV tại Hình 3.1 B cho thấy, PSR có khả năng khuếch đại RNA mục tiêu, thể hiện
màu sắc phản ứng rõ nét. Đồng thời, kết quả của phản ứng cũng có thế quan sát bằng

phương pháp nhuộm SYBR kết quả của phản ứng PSR phát quang khi nhuộm SYBR và

quan sát dưới đèn led bước sóng 460 nm, chứng âm khơng thế hiện tính hiệu phát quang.
Vì vậy bộ mồi này đã được chọn cùng với các thành phần phản ứng được áp dụng cho
các khảo sát tiếp theo.

Trước phàn ứng

Sau phàn ứng

Trước phán ứng

Hình 3.1. Kết quả kiểm tra mồi quan sát bằng màu sắc và SYBR.
3.2 Kết quả khảo sát thời gian cho phản ứng PSR

Thời gian kéo dài của phản ứng PSR quyết định tới số lượng sản phẩm được hình
thành trong phản ứng. Khảo sát thời gian của phản ứng PSR là khảo sát khoảng thời gian
17