NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO MỘT SỐ DÒNG CÀ PHÊ VỐI (Coffea canephora) CHỌN LỌC THÔNG QUA MÔ SẸO VÀ PHÁT SINH PHÔI SOMA pot

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO MỘT SỐ DÒNG
CÀ PHÊ VỐI (Coffea canephora) CHỌN LỌC THÔNG QUA MÔ SẸO
VÀ PHÁT SINH PHÔI SOMA
Nguyễn Thị Mai
1
, Vương Phấn
1
,
Trương Văn Tân
1
, Trần Thị Hoàng Anh
1


SUMMARY
Study on in vitro propagation of some selected Coffea canephora clones via callus
and somatic embryogenesis
The research was carried out to establish a protocol of micropropagation via callus and somatic
embryogenesis from cultured leaf of some selected Coffea canephora clones in WASI. The results
showed that 1g embryogenic callus could produce about 80g torpedo embryos within 4-5 months.
After about 5 months of germination phase, from 1g torpedo embryos we could select 160
plantlets, size ~10 mm, with one pair of true leaves and root for acclimatization in commercial
coconut fibres under a greenhouse. After 2-3 months of acclimatization, there were about 140
plantlets developed at least two pairs of true leaves available for transplanting into PE bags and
taken the same care as the seedlings.
Keywords: Coffea canephor, in vitro propagation, callus, somatic embryogenesis

1. ĐặT VấN Đề
Phng phỏp truyn thng nhõn ging cõy c phờ vi l dựng ht. Bờn cnh ú
phng phỏp ghộp ni ngn cng c ng dng rng rói ti cỏc vựng thõm canh c phờ.
Mc dự Vin Khoa hc K thut Nụng Lõm nghip (KHKT NLN) Tõy Nguyờn ó thit

lp mt s vn nhõn chi cõy ging cao sn nhng khụng ỏp ng lng cõy ging
tt.
Vic nuụi cy mụ cỏc loi c phờ trờn th gii ó t c nhng tin b ỏng k.
Quỏ trỡnh phỏt sinh phụi vụ tớnh cõy c phờ vi Coffea canephora c Staritsky bỏo cỏo
ln u tiờn vo nm 1970; Sondahl v Sharp, 1977 cng to c cõy c phờ chố Coffea
arabica t phụi vụ tớnh. Tip theo ú nhm mc ớch nhõn ging c phờ, nhiu tỏc gi ó
nghiờn cu s phỏt sinh phụi vụ tớnh cõy c phờ nh Staristky v Van Hasselt (1980);
Pierson v cng tỏc viờn (1983); Zamarripa v cng tỏc viờn (1991); Hatanaka v cng
tỏc viờn (1991); Van Boxtel v Berthouly (1996), Ducos v cng tỏc viờn (1999, 2003)
Cỏc cụng trỡnh nghiờn cu ny cho thy cú 3 tin trỡnh chớnh trong nhõn nhanh cõy c phờ
bng phng phỏp phỏt sinh phụi vụ tớnh, ú l: Nhõn t bo cú tim nng phỏt sinh phụi
v sn xut phụi (giai on thy lụi) trong mụi trng lng; giỳp phụi ny mm bng
cỏch lm ngp tm thi phụi (giai on cú lỏ mm) trong mụi trng lng; to iu kin
cho phụi ny mm phỏt trin thnh cõy con.
Vỡ vy, vic ng dng cỏc tin b trờn v k thut nhõn in vitro bng phng phỏp
nuụi cy phụi soma cho cỏc dũng vụ tớnh c phờ vi u tỳ ó c tuyn chn l iu vụ
cựng cn thit ỏp ng nhu cu cp bỏch v ging tt hin nay ca sn xut.
II. VậT LIệU Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU
1. Vt liu nghiờn cu
4 dũng vụ tớnh c phờ vi (TR10, TR11, TR12, TR13) cú nng sut cao, c ht ln v
kh nng khỏng bnh g st cao.
2. Phng phỏp nghiờn cu
- Vo mu, to callus t lỏ c phờ: Trc khi ly mu lỏ, phun thuc nm trờn lỏ,
ngy mt ln, trong 3 - 4 ngy. Hỏi lỏ bỏnh t, ra sch, x lý thuc nm v nhỳng vo
dung dch Ethanol 70% trong 30 giõy. Kh trựng bng Hypochlorite Calci 10% trong 15
phỳt, ra li bng nc ct kh trựng. Sau ú b gõn lỏ, rỡa lỏ, 2 phn u, uụi lỏ v ct
lỏ thnh mnh nh (mi mnh l mt mu cú kớch thc khong 1cm
2
). Cy mu lờn mụi
trng thch phỏt sinh callus, trong ti.

- hõn callus trong mụi trng lng: Chuyn callus ó chn lc sang mụi trng
lng nhõn callus, lc trũn (110 - 120 vũng/phỳt). Sau 2 tun, thay mi mụi trng v tng
th tớch mụi trng t 10 ml lờn 50 ml, 100 ml/bỡnh tam giỏc. Quỏ trỡnh lp li cho n
tun th 8, cỏc callus tng v s lng c s dng lm ngun vt liu cho quỏ trỡnh sn
xut phụi.
1
Vin Khoa hc K thut Nụng Lõm nghip Tõy Nguyờn.
- Tạo phôi cà phê dạng thủy lôi trong môi trường lỏng: Callus được chuyển sang
môi trường lỏng sản xuất phôi, lắc tròn. Thay mới môi trường, cho đến khi phôi phát triển
chủ yếu dưới dạng thủy lôi.
- Tái sinh cây từ phôi và tạo cây con hoàn chỉnh: Trên môi trường thạch tái sinh
cây, phôi vô tính cà phê ở dạng thủy lôi phát triển thành cây con có một cặp lá thật được
đưa ra huấn luyện trên bột xơ dừa cho đến khi phát triển thành cây con có ít nhất hai cặp
lá thật. Ra ngôi trong bầu đất PE, chế độ chăm sóc giống như đối với cây con trồng bằng
hạt.
III. KÕT QU¶ Vµ TH¶O LUËN
1. Khả năng phát sinh callus trên mẫu lá cà phê.
Bảng 1. Tỷ lệ phát sinh callus của 4 dòng vô tính cà phê vối sau 4-8 tháng vào mẫu (%)-
(ăm thực hiện: 2009)
DVT
Môi trường
TR10 TR11 TR12 TR13
1. Yasuda, 1985. 0 0 16,0 10,7
2. Yasuda cải tiến bổ sung BA 0 0 0 0
3. Pierson, 1983 0 0 100 0
4. Pierson cải tiến bổ sung BA 0 26,7 0 0
5. Murashige & Skoog, 1962 0 0 0 0
Kết quả cho thấy khả năng phát sinh callus của các dòng vô tính cà phê vối khác
nhau ở các môi trường thử nghiệm: Dòng TR10 không tạo callus có khả năng phát
sinh phôi ở cả 5 môi trường. Tỷ lệ phát sinh callus có khả năng phát triển thành phôi

của dòng TR11 trên môi trường Pierson cải tiến sau 4 tháng vào mẫu là 26,7%. Đối
với dòng TR12 tỷ lệ này là 100% trên môi trường Pierson sau 5 tháng vào mẫu và
16% trên môi trường Yasuda sau 8 tháng vào mẫu. Đối với dòng TR13 tỷ lệ này là
10,7% trên môi trường Yasuda sau 6 tháng vào mẫu.
2. Nhân callus trong môi trường lỏng
Callus có khả năng phát sinh phôi (màu vàng, dạng hạt) được chuyển qua nhân trong
môi trường lỏng. Khi sử dụng một lượng callus như nhau đưa vào nuôi cấy, sau 8 tuần
trọng lượng callus tăng lên không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, bình quân tăng 9,3
-10,6 lần so với trước khi nuôi cấy.
Bảng 2. Trọng lượng callus tăng sau nuôi cấy trên máy lắc 2 tháng (g)
(ăm thực hiện 2009 - 2010)
Dòng vô tính
Σ lượng callus trước
nuôi cấy (g)
Σ lượng callus sau nuôi
cấy (g)
Tỷ lệ tăng (%)
TR11 0,5 4,69 938
TR12 0,5 4,65 930
TR13 0,5 5,28 1056
TB 0,5
ns

3. Tạo phôi cà phê dạng thủy lôi trong môi trường lỏng
Trên môi trường thử nghiệm, có 2 dòng TR11 và TR13 phản ứng tốt.
Bảng 3. Khối lượng (g) và tỷ lệ (%) phôi dạng thủy lôi sau nuôi cấy
(ăm thực hiện 2009 - 2010)
Dòng vô tính
Σ lượng callus
nuôi cấy (g)

Σ lượng phôi sau
2-3 tháng (g)
Σ lượng phôi dạng
thủy lôi (g)
Tỷ lệ phôi dạng
thủy lôi (%)
TR11 2 21,60 17,45 80,8
TR13 2 22,50 19,20 85,3
Đối với dòng vô tính TR11, tổng lượng phôi thu được sau 2 tháng nuôi cấy tăng hơn 10,8
lần, có 80,8% phôi phát triển thành dạng thủy lôi màu trắng. Đối với dòng vô tính TR13, tổng
lượng phôi thu được sau 3 tháng nuôi cấy tăng 11,3 lần, tỷ lệ callus phát triển thành phôi
dạng thủy lôi chiếm 85,3%.
Phôi dạng thủy lôi (kích thước từ 1-2 mm) là nguồn vật liệu cần thiết, thông qua giai
đoạn phôi tiền nảy mầm và nảy mầm để tái sinh thành cây hoàn chỉnh.
4. Tái sinh cây từ phôi và tạo cây con hoàn chỉnh
Các phôi dạng thủy lôi được trải đều trên môi trường thạch tái sinh (1g phôi/đĩa
pétri). Sau 3-5 tháng, từ 1g phôi ban đầu phát triển thành 155-160 cây con (kích thước ~
10 mm, có một cặp lá thật, có rễ) và 500-550 phôi ở các giai đoạn khác nhau (kích thước
< 2mm, từ 2-5 mm hoặc từ 5-10mm; chưa có lá mầm hoặc có lá mầm phát triển tốt, có rễ
hoặc không có rễ). Chọn cây con có một cặp lá thật, có rễ đưa ra huấn luyện trên giá thể
bột xơ dừa.
Bảng 4. Tỷ lệ sống (%) và khả năng phát triển của cây con có một cặp lá thật trên giá thể
bột xơ dừa - (ăm thực hiện: 2010)
Chỉ tiêu Sau 1 tháng Sau 2 tháng Sau 3 tháng Sau 4 tháng
Tỷ lệ sống (%) 90 88,3 88,3 88,3
Tỷ lệ cây có ít nhất 2 cặp lá thật
(%)
- 58,8 100 100
Tỷ lệ sống sau hai tháng của cây con có 1 cặp lá thật trên giá thể bột xơ dừa là
88,3%. Sau 2 tháng đã có 58,8% cây có ít nhất hai cặp lá thật, tỷ lệ này tăng dần và đạt

100% sau 3 tháng. Cây con có ít nhất hai cặp lá thật được cấy trong bầu đất đặt trong
vườn ươm và chăm sóc như đối với cây trồng bằng hạt.
Như vậy từ 1 g phôi dạng thủy lôi, sau giai đoạn tái sinh và thích nghi trong giá thể
bột xơ dừa có khoảng 140 cây con sống sót có ít nhất hai cặp lá thật có thể cấy vào bầu
đất.
IV. KÕT LUËN Vµ §Ò NGHÞ
1. Kết luận
- Khả năng phát sinh callus của các dòng vô tính cà phê vối khác nhau trên các môi
trường, vì vậy cần phải tìm được môi trường phát sinh callus thích hợp.
- Trọng lượng callus sau 2 tháng nhân ở môi trường lỏng tăng từ 9,3 - 10,6 lần.
- Tỷ lệ callus chuyển sang phôi dạng thủy lôi từ 80 - 85,3%.
- Sau 5 tháng nuôi cấy trên môi trường thạch tái sinh, từ 1 g phôi dạng thủy lôi, tái
sinh 155-160 cây con (kích thước ~ 10 mm, có một cặp lá thật, có rễ). Sau giai đoạn thích
nghi trong giá thể bột xơ dừa từ 2-3 tháng có khoảng 140 cây con có ít nhất 2 cặp lá thật,
cấy vào bầu đất và chăm sóc như với cây trồng bằng hạt.
2. Đề nghị.
- Ứng dụng quy trình nhân giống cây cà phê bằng phương pháp tạo phôi soma trong
nghiên cứu hoặc sản xuất cây giống ở quy mô nhỏ (vài chục nghìn cây/năm).
- Tiếp tục nghiên cứu giai đoạn tái sinh cây từ phôi trong môi trường lỏng (thông qua
hệ thống Bioreactor) để giảm công cấy chuyền phôi trong môi trường thạch, góp phần
đưa quy trình ứng dụng trong sản xuất công nghiệp.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Ducos J.P., Gianforcaro M., Florin B., Petiard V., Deshayes A., 1999- A technically
and economically attractive way to propagate elite Coffee canephora clones: in vitro
somatic embryogenesis. ASIC, 18
e
Colloque, Helsinke, 295-300.
2. Hatanaka T., Arakawa O., Yasuda T., Uchida N., Yamaguchi T., 1991- Effect of plant
growth reglators on somatic embryogenesis in leaf cultures of Coffea canephora.
Plant Cell Reports. 17: 179-182.

3. Pierson E.S., Van Lammeren A.A.M., Schel J.H.N., Staritsky G., 1983- In vitro
development of embryoids from punched leaf dishes of Coffea canephora.
Protoplasma. 115: 208-216.
4. Sondhal M.R., Sharp W.R., 1977- High frequency induction of somatic embryos in
cultured leaf explants of C. arabica L. Zeitschrift fur Pflanzenphysiologie, 81: 395-
408.
5. Starisky G., 1970- Embryoid formation in callus cultures of coffee. Acta Bot Neerl.
19(4): 509-514.
Người phản biện:
PGS. TS. Nguyễn Văn Viết