Định vị miễn dịch hiển vi điện tử các kháng nguyên trong tế bào pptx

TCNCYH 26 (6) - 2003
Định vị miễn dịch hiển vi điện tử các kháng nguyên
trong tế bào

Nguyễn Kim Giao
Viện Vệ sinh dịch tễ trung ơng

Sự kết hợp các kỹ thuật miễn dịch với kỹ thuật hiển vi điện tử đã đợc sử dụng từ lâu
trong sinh học tế bào (TB). Hiện nay phơng pháp miễn dịch hiển vi điện tử (MDHVĐT)
đợc áp dụng rộng rãi đặc biệt là nghiên cứu chẩn đoán vi sinh vật.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật đánh dấu miễn dịch bằng vàng
gián tiếp sau khi đúc với tế bào Vero nuôi cấy nhiễm vi rút sởi và tế bào TVP nuôi cấy
nhiễm vi rút rota SA11. Theo dõi các hạt đen trên ảnh, chúng tôi đã định vị đợc các vi rút
rota trong tế bào TVP và nhận biết đợc quá trình hình thành của vi rút sởi trong TB Vero.


I. Đặt vấn đề
Miễn dịch hiển vi điện tử là phơng
pháp kết hợp kỹ thuật miễn dịch với kỹ
thuật hiển vi điện tử để định vị các thành
phần miễn dịch đặc hiệu, các đại phân tử
sinh vật.
Phơng pháp định vị hiển vi điện tử các
thành phần miễn dịch trong tế bào có thể
tiến hành theo nhiều phơng pháp khác
nhau. Trớc tiên tế bào cần cắt mỏng tại
nhiệt độ thấp (không đúc) hoặc tại nhiệt độ
phòng (có đúc). Việc đánh dấu miễn dịch
có thể thực hiện trực tiếp hoặc gián tiếp
trớc khi đúc, sau khi đúc hoặc trên lát cắt
lạnh [1, 3].

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài nhằm:
1. Lựa chọn và xác định đợc những
điều kiện, những thông số tốt nhất làm tiêu
bản miễn dịch hiển vi điện tử phát hiện
kháng nguyên mặt ngoài tế bào phù hợp
với điều kiện Việt Nam.
2. Nghiên cứu xác định sự tồn tại của
vi rút rota trên tế bào TVP và sự nhân lên
của vi rút sởi trên tế bào Vero trong quá
trình nuôi cấy
II. Vật liệu, mẫu, thiết bị và qui
trình kỹ thuật nghiên cứu
1. Nguyên lý chung

chất đúc WF
lát cắt
tế bào
tiêu bản
chất cố định
(4,5% PFA
0,1% GA)
lới
cắt lát mỏng
cố định
đúc
Khử nớc
tím
lới
lới

Quan sát
HVĐTTQ
p
arafilm rửa
đánh dấu miễn d
ị
ch
Nhu
ộ
m dơn
g
bản

6
TCNCYH 26 (6) - 2003
Hình 1: Qui trình làm tiêu bản định vị kháng nguyên trong tế bào sau đúc mẫu

Những tế bào hoặc mô đợc cố định và đúc trong
những khuôn đúc bằng những chất đặc biệt để giữ cấu
trúc và bảo toàn chức năng miễn dịch.
Những mẫu đúc đợc cắt thành những lát cực mỏng
và đặt lên trên các lới nicken. Tiếp đó những lát cắt đ-
ợc bộc lộ tới cả kháng thể thứ nhất, kháng thể thứ hai rồi
đợc rửa và nhuộm trớc khi kiểm tra ở kính hiển vi điện
tử truyền qua tại độ phóng đại cao.
Kỹ thuật cắt cực mỏng không những cho phép định vị
những kháng nguyên ở phía trong mẫu mà còn tiếp cận
đợc tới những protein, những kháng nguyên và những
đại phân tử khác trên bề mặt của lát cắt vì chúng sẽ bị
bộc lộ trong quá trình cắt.

Hình 1 là sơ đồ chung làm tiêu bản để định vị kháng
nguyên trong tế bào sau đúc mẫu .
Hình 2 là sơ đồ đánh dấu miễn dịch hiển vi điện tử
trên lát cắt mỏng. Điều cần chú ý ở đây là kháng kháng
thể hoặc kháng thể thứ hai đợc thay bằng ProteinA-Au.

Hình 2: Sơ đồ định vị kháng nguyên trên lát
cắt bằng đánh dấu miễn dịch gắn vàng gián tiếp



2. Vật liệu
- Hoá chất: paraformaldehyde,
glutaraldehyde, OsO4, đệm PBS, BSA,
ethanol, uranyl acetate, lead citrate .
- Lới nicken, giấy ảnh đen trắng
Sterlin. phim FUJI-FG
3. Mẫu nghiên cứu
- Tế bào nuôi cấy TVP nhiễm vi rút
Rota dòng SA11 và kháng thể đặc hiệu
(nhận từ POLYOVAC)
- Tế bào vero nuôi cấy nhiễm vi rút sởi
chủng vác xin Moraten và kháng thể đặc
hiệu (nhận từ Khoa vi rút Viện VSDTTW)
4. Thiết bị nghiên cứu
4.1. Máy cắt tiêu bản siêu mỏng:
Ultramicrotome III (LKB, Thuỵ Điển).
4.2. Kính hiển vi điện tử truyền qua:
JEM 1010 (JEOL, Japan) với các thông
số:

+ Điện áp gia tốc điện tử 30-100KV,
+ Độ phóng đại x 50-600.000,
+ Độ phân giải 3A
0
Các ảnh chụp trên phim FUJI-FG, in
trên giấy ảnh Sterlin hoặc lu trên đĩa cứng
của hệ Digital camera-Computer kèm với
JEM1010.
5. Qui trình kỹ thuật
Qui trình kỹ thuật gồm hai bớc nh

7
TCNCYH 26 (6) - 2003
sau.
5.1. Cố định, đúc và cắt mẫu
a. Cố định: 3% paraformaldehyde+0,2%
glutaraldehyde trong đệm phosphate
pH 7,2-74 tại 4
0
C. trong 40 phút đến 1
giờ
b. Rửa: 0,1M đệm phosphate 2 lần 10
phút
c. Rửa: trong dung dịch NH
4
Cl 0,05M
hoặc 0,1M đệm phosphate (pH 7,2-74).
d. Khử nớc:
+ 30% ethanol (10 phút)
+ 50% ethanol (10 phút)

+ 70% ethanol (2 lần, 20 phút,)
+ 90% ethanol (2 lần, 20 phút,)
+ 100% ethanol (2 lần, 30phút)
e. Tẩm:
+ 2/3 ethanol+1/3 LRWhite, 30 phút
+ 1/2 ethanol+1/2 LRWhite, 30 phút
+ 1/3 ethanol+2/3 LRWhite, 30 phút
f. Ngâm:
+ LR White, 1 giờ
+ LR White, 18 giờ
+ LR White qua đêm
+ LRWhite, 1-3 giờ
g. Đúc: trong khuôn đúc nh capsule
gelatin
h. Làm cứng: để tủ ấm 40-45
0
C, từ 1-3
ngày.
i. Cắt tiêu bản trên máy cắt siêu mỏng
với độ dầy 400-500A
0
k. Đặt mảnh cắt trên lới nicken có
màng formvar phủ các bon
5.2. Thực hiện đánh dấu miễn dịch và
nhuộm dơng bản
a. Rửa lới nickel với lát cắt bằng 2-3
giọt PBS pH-7.2
b. Đặt nổi lới trên giọt 1% hydrogen
peroxide (v/v) trong 5 phút. Quá trình ăn
mòn này làm bộc lộ nhiều hơn các kháng

nguyên của lát cắt. Rửa kỹ lới trong nớc
cất.
c. Đặt nổi lới trên giọt 2% PBS-BSA
trong 20 phút để phóng bế các vị trí kháng
nguyên không đặc hiệu.
d. Lới đợc đặt nổi trên giọt kháng thể
đặc hiệu thứ nhất pha loãng trong 0,5%
PBS-BSA và ủ trong 20 phút.
e. Rửa thận trọng bằng 0,2% PBS -
BSA,
f. Các lới lại đợc ủ tiếp trong proteinA
gắn hạt vàng (d=5-10nm) trong 20 phút.
h. Rửa trong PBS một số lần
i. Cố định nhanh bằng hơi OsO4.
k. Rửa kỹ với ammonium acetate 0,1%
l. Nhuộm dơng 2 lần theo phơng
pháp Reynold (uranyl acetate 5%, lead
citrtate 1%). Các lới đợc làm khô từ từ
trớc khi quan sát.
Chú ý: Trong suốt quá trình tiến hành,
các lới không đợc để khô và thận trọng
giữ cho nó nổi trên mặt giọt.
Iii. Kết quả


8
TCNCYH 26 (6) - 2003

100 nm
Hình 3. Một phần của tế bào TVP với vi rút rota đợc nhân lên

0,5
à

Hình 4. Quá trình hình thành của vi rút sởi trong tế bào Vero

1. Tế bào nuôi cấy TVP nhiễm vi rút
rota dòng SA11
Trong một nghiên cứu về sự nhân lên
của các chủng vi rút rota trên các dòng tế
bào nuôi cấy, chúng tôi nhận đợc mẫu tế
bào nuôi cấy TVP nhiễm vi rút rota dòng
SA11. Thực hiện việc định vị kháng
nguyên vi rút rota theo qui trình trên và
nhận đợc hình 3. Những hạt vàng tròn
đen đậm có tại những cấu trúc trên ảnh
(x) xác nhận rằng những cấu trúc đó là

9
TCNCYH 26 (6) - 2003
những vi rút rota đợc nhân lên trong tế
bào nuôi cấy TVP.
2. Xác định quá trình hình thành của
vi rút sởi trong tế bào Vero
Hình 4 là lát cắt mỏng của tế bào Vero
đã bị huỷ hoại do nhiễm và nhân lên của vi
rút rota. Bằng kỹ thuật đánh dấu miễn dịch
hiển vi điện tử trên lát cắt mỏng, ta có thể
theo dõi đợc vi rút trong quá trình hình

thành. Các hạt chấm đen là hạt vàng chỉ
các kháng nguyên vi rút sởi nằm rải rác
trong bào tơng. Tại một số vùng bào
tơng sát màng tế bào hình thành
nucleocapcid và chuẩn bị đâm chồi ().
Các hạt vi rút sởi tách rời khỏi màng và tập
trung ở bên ngoài tế bào (x).
IV. Bàn luận
Nh đã trình bầy trong phần mở đầu,
miễn dịch hiển vi điện tử là kết hợp đồng
thời hai phơng pháp nghiên cứu, phơng
pháp hiển vi điện tử và phơng pháp miễn
dịch.
Đứng về mặt sinh học và sinh hoá học,
có ba yêu cầu cần thực hiện để định vị
chính xác bất cứ đại phân tử miễn dịch nào
trong mô, tế bào hoặc ngay trên các vi rút.
Đó là có đợc các kháng thể đặc hiệu và
các chất đánh dấu, các kháng nguyên có
mặt trong mẫu với một số lợng đáng kể
và siêu cấu trúc vi sinh vật, tế bào đợc
giữ tốt [2, 3].
Về mặt bảo toàn siêu cấu trúc: mẫu
sinh vật sẽ giữ đợc siêu cấu trúc với điều
kiện là lấy mẫu và cố định mẫu tức thời và
xử lý tiếp mẫu theo phơng pháp thờng
qui. Có một số chất cố định đợc sử dụng.
Tuy nhiên những chất cố định này (nh
OsO4) có thể làm giảm tính kháng nguyên
của các phân tử quan tâm nên trong

nghiên cứu MDHVĐT ngời ta thờng hạn
chế sử dụng. Nhng điều bất lợi là không
chỉ các tế bào không cố định tốt mà ảnh
điện tử sẽ không có độ tơng phản cao vì
OsO4 là chất tán xạ điện tử mạnh [4].
Về các kháng nguyên có mặt trong
mẫu: các kháng nguyên có thể còn rất ít
sau cố địmh với glutaraldehyde, do đó các
mô hoặc tế bào thờng cố định bằng
formaldehyde (paraformaldehyde) hoặc
bằng hỗn hợp của formaldehyde với
glutaraldehyde (tỷ lệ formaldehyde là từ 2-
8 % và glutaraldehyde là 0.1-0.5%). Một
điều quan trọng là các kháng nguyên nội
bào cần dễ dàng tiếp cận đợc với các
kháng thể bằng cách tăng tính thẩm thấu
qua các màng hoặc bằng cách cắt mẫu
thành các lát cắt siêu mỏng.
Các tế bào có thể đợc làm tăng tính
thấm bằng các dung môi hữu cơ nh
aceton, chlorofom, chất tẩy nh saponin
hoặc Twen80.
Vế kỹ thuật đánh dấu: Trong nghiên
cứu này chúng tôi đã sử dụng cách đánh
dấu miễn dịch gián tiếp để khắc phục
những khó khăn kỹ thuật (kháng thể thứ
nhất rất khó thu đợc nhiều, sự cộng hợp
của kháng thể thứ nhất với đích điện tử lại
rất khó, hiệu suất kém và có thể làm ảnh
hởng xấu tới sự kết hợp của kháng thể

thứ nhất với kháng nguyên). Việc dễ dàng
có đợc kháng thể thứ hai mà ở đây chúng
tôi sử dụng ProteinA-Au (đã gắn đích điện
tử Au với đờng kính lựa chọn và có bán
trên thị trờng) đảm bảo cho nghiên cứu ít
bị rủi ro [3]
Xuất phát từ yêu cầu bảo toàn siêu cấu
trúc sinh vật và giữ đợc tính kháng
nguyên của mẫu đồng thời lại có thể thực
hiện trong phòng thí nghiệm HVĐT của
Viện Vệ sinh dịch tễ trung ơng, chúng tôi
đã chọn cách cố định mẫu bằng dung dịch
cố định 3-4% paraformaldehyde +0,2%
glutaraldehyde trong dung dịch đệm PBS,
thời gian 30-40 phút tại 4
0
C, đúc mẫu bằng
LR White tại 37-40
0
C và đánh dấu miễn

10
TCNCYH 26 (6) - 2003
dịch gián tiếp trên lát cắt mỏng với kháng
thể thứ hai thay bằng proteinA-Au là thích
hợp.
Những hình ảnh HVĐTTQ của các mẫu
chụp đợc xác thực việc lựa chọn của
chúng tôi là đúng đắn.
V. Kết luận

- Thông qua nghiên cứu áp dụng,
chúng tôi đã chọn đợc cách cố định mẫu
bằng dung dịch cố định 3-4%
paraformaldehyde +0,2% glutaraldehyde
trong dung dịch đệm PBS, thời gian 30-40
phút tại 4
0
C, đúc mẫu bằng LR White tại
37-40
0
C và đánh dấu miễn dịch gián tiếp
trên lát cắt mỏng với kháng thể thứ hai
đợc thay bằng proteinA-Au.
- Bằng kỹ thuật định vị miễn dịch hiển
vi điện tử kháng nguyên trong tế bào, đã
xác định đợc chắc chắn vi rút rota có
trong tế bào nuôi cấy TVP thông qua sự
chỉ điểm của các hạt vàng.
- Thấy rõ quá trình nhân lên của vi rút
sởi trên tế bào Ve ro, từ giai đoạn tổng hợp
các thành phần acide nucleic và protein
của vi rút trong tế bào đến giai đoạn những
virion hoàn chỉnh nh mọc chồi để tách
khỏi tế bào ở đó vỏ ngoài của vi rút sởi
đợc tạo ra bởi màng tế bào.
Tài liệu tham khảo
1. Bozzola, J. J., and L. D. Russell.
(1992). Electron Microscopy. Jones and
Bartlett, Boston, MA. 132 pp.
2. Dawes, C. J. (1971). Biological

Techniques in Electron Microscopy.
Barnes and Noble Inc., New York. 240 pp.
3. Hayat, M. A. (1989). Principles and
Techniques of Electron Microscopy:
Biological Applications. CRC Press, Boca
Raton, FL 469 pp.
4. Miller SE. Detection and
identification of viruses by electron
microscopy. J Electron Microsc Tech,
1986; 4:265-301.
5. Payne CM. Electron microscopy in
the diagnosis of infectious diseases. In:
Connor DH, Chandler FW, Payne CM.
Electron microscopy in the diagnosis of
infectious diseases. In: Connor DH,
Chandler FW.

Summary
Immunoelectronmicroscopic localization of
Antigen in cells
The Combination between Immunological techniques and Electron microscopy had
been used in cellular biology for a long time. At present, Immunoelectronmicroscopic
methods (IEM) are applied more, specially in the microbial diagnosis.
In this study, We had used indirect immunogoldlabelling technique after embedding on
Vero cells infected by measles viruses and TVP cells infected by rotavirus SA11.
According to black particles in Immuno-electron microscopic figures, We localized
rotaviruses in the TVP cells and realized the formaton of measles virus in the Vero cells.


11