NGHIÊN CỨU THU NHẬN GIAO TỬ VÀ PHÔI CÁ CHẠCH (Misgurnus anguillicaudatus) MỘT TẾ BÀO

TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 52, 2009

NGHIÊN CỨU THU NHẬN GIAO TỬ
VÀ PHÔI CÁ CHẠCH (Misgurnus anguillicaudatus) MỘT TẾ BÀO
Trần Quốc Dung
Trường Đại học Sư phạm, Đại học Huế

TĨM TẮT
Cá chạch là lồi cá nước ngọt. Khơng như các loài cá khác, chúng đẻ trứng suốt từ
mùa xuân cho đến mùa thu. Vì vậy, cá chạch được sử dụng làm đối tượng nghiên cứu chuyển
gen trong các phịng thí nghiệm. Để làm chủ thời gian chuyển gen vào phơi cá đang phát triển
thì thụ tinh nhân tạo là một bước bắt buộc trong kỹ thuật vi tiêm. Cá chạch đực và cái được
phân biệt bằng cách dựa vào sự khác biệt hình thái của vây ngực. Sau khi gây kích thích bằng
hormone qua đêm, trứng thành thục và tinh dịch được thu nhận từ cá bố mẹ. Thụ tinh nhân tạo
được tiến hành trong đĩa Petri với tỉ lệ 100 l tinh dịch/100 trứng. Kết quả nghiên cứu cho thấy
kích thích sinh sản nhân tạo bằng cách tiêm não thùy thể cá chép hai lần vào xoang thân và thụ
tinh nhân tạo bằng phương pháp thứ ba (vừa lấy trứng vừa lấy tinh dịch) cho hiệu quả tốt hơn.
Từ khoá: Misgurnus anguillicaudatus, não thùy thể cá chép, thụ tinh nhân tạo, vi tiêm.

I. Mở đầu
Cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus) thuộc lớp Cá chạch, là cá nước ngọt. Ở
nước ta, cá chạch là loài cá rất thường gặp ở các ao, hồ, kênh mương, đồng ruộng...
Khác với các loài cá khác, cá chạch đẻ trứng suốt từ mùa xuân đến mùa thu. Do vậy,
chúng được sử dụng trong các phịng thí nghiệm để nghiên cứu chuyển gen [7, 9]. Với
mục đích làm chủ thời gian chuyển gen vào phơi cá đang phát triển thì thụ tinh nhân tạo
là một bước bắt buộc trong kỹ thuật vi tiêm [10]. Để góp phần vào việc hồn thiện
phương pháp nghiên cứu chuyển gen vào cá chúng tôi tiến hành nghiên cứu thu nhận
giao tử và phôi một tế bào chuNn bị cho kỹ thuật vi tiêm DNA vào cá chạch.
II. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
- Cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus) (Hình 1) sử dụng trong các thí nghiệm
nghiên cứu được thu thập ở Nghĩa Ðô, Cầu Giấy, Hà Nội.

- Não thùy thể cá chép do Công ty Dịch vụ và Nuôi trồng thuỷ sản trung ương
(Ngọc Khánh, Ba Đình, Hà Nội) cung cấp.
- Phương pháp thu nhận giao tử và thụ tinh nhân tạo được tiến hành theo Chung
Lân và cs (1969):
29


+ Phân biệt đực, cái: Dựa vào vây ngực (Hình 2).
+ Chọn cá bố mẹ: chọn cá khỏe mạnh đang ở độ tuổi thành thục sinh dục.
+ Liều lượng tuyến yên cá chép dùng để tiêm cho cá chạch là 0,5 cái cho mỗi
con cái, lượng tiêm cho cá đực bằng nửa cá cái.
+ Phương pháp tiêm: tiêm vào xoang thân và tiêm bắp thịt
+ Số lần tiêm: tiêm một lần và tiêm hai lần. Với cách tiêm hai lần thì lần đầu
được tiêm vào buổi trưa, lần thứ hai vào hai giờ sáng để điều khiển cá đẻ lúc rạng đơng.

Hình 1: Cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus)
+ Thụ tinh nhân tạo: thụ tinh khô với 4 phương pháp khác nhau.
Phương pháp 1: sau khi lấy trứng, cho tinh dịch đã lấy sẵn vào cốc nhỏ có nước
muối sinh lý (lượng nước muối sinh lý gấp 10 lần tinh dịch) lắc đều, rồi tưới đều lên
trứng.
Phương pháp 2: đổ tinh dịch đã hòa với nước muối sinh lý vào khay thụ tinh sau
đó cho trứng vào, lắc nhẹ khay thụ tinh làm cho trứng và tinh trùng sớm tiếp xúc với
nhau.
Phương pháp 3: vừa lấy trứng vừa lấy tinh dịch. Trong khi lấy trứng thì đồng
thời có một số người khác lấy tinh dịch và tưới nhanh vào trứng.
Phương pháp 4: lấy trứng trước, lấy tinh dịch sau. Sau khi lấy trứng, trực tiếp
vuốt ngay tinh dịch của cá đực vào trứng.
Bất kỳ áp dụng phương pháp nào, sau khi đã trộn lẫn tinh dịch với trứng cũng
cần dùng lông gà khuấy nhẹ để thúc đNy quá trình thụ tinh.

Vây ngực cá đực

Vây ngực cá cái
Hình 2: Vây ngực cá chạch đực và cá chạch cái
30


III. Kết quả và thảo luận
3.1. Số lần tiêm não thùy thể cá chép
Ðể chủ động thu nhận trứng, tinh dịch và thụ tinh nhân tạo, cá chạch được kích
thích sinh sản bằng cách tiêm não thùy thể cá chép (bảo quản trong dịch thể). Hiện nay,
trong phương pháp kích thích sinh sản cá ni người ta có thể tiêm một lần hoặc hai lần.
Chúng tơi đã tiến hành thí nghiệm so sánh hiệu quả kích thích sinh sản bằng cách tiêm
một lần và tiêm hai lần để chọn ra phương pháp cho kết quả tốt, phù hợp với các điều
kiện nghiên cứu trong phịng thí nghiệm.
Bảng 1: Hiệu quả kích thích sinh sản cá chạch bằng số lần tiêm não thùy thể cá chép
Tiêm 1 lần

Tiêm 2 lần
Số cá
cho
trứng
(con)

Tỉ lệ cá
cho
trứng
(%)

Tỉ lệ

trứng
nở

(%)

Số cá
kích
thích
(con)

38,46

67,00

13

7

53,84

69,00

5

62,50

65,00

8

6

75,00

72,00

9

6

66,66

68,00

9

9

100,00

78,00

4

16

10

62,50

72,00

16

14

87,50

85,00

5

14

7

50,00

76,00

14

10

71,42

89,00

6

12

6

50,00

80,00

12

10

83,33

91,00

Trung
bình

72

39

55,02

71,33

72

56

78,52

80,67

Số cá
kích
thích
(con)

Số cá
cho
trứng
(con)

Tỉ lệ
cá cho
trứng
(%)

Tỉ lệ
trứng
nở

1

13

5

2

8

3

Đợt thí
nghiệm

(%)

Kết quả ở bảng 1 cho thấy, tỉ lệ đẻ trứng và tỉ lệ nở của cá chạch được tiêm một
lần trung bình đạt 55,02% (từ 38,46 - 66,66%) và 71,33% (từ 65,00 - 80,00%); tiêm hai
lần là 78,52% (từ 53,84 - 100%) và 80,67% (từ 69,00 - 91,00%). Như vậy, tỉ lệ cho
trứng và tỉ lệ nở của cá chạch được tiêm hai lần đạt 142,71% và 113,09% so với tỉ lệ
cho trứng và tỉ lệ nở của cá chạch tiêm một lần. Kết quả này cho thấy hiệu quả kích
thích sinh sản cá chạch bằng cách tiêm não thùy thể cá chép hai lần cao hơn cách tiêm
một lần. Như chúng ta đã biết, quá trình thành thục của trứng từ cuối giai đoạn IV
chuyển sang giai đoạn V cần có một thời kỳ quá độ. Do đó, trong trường hợp sử dụng
cách tiêm một lần toàn bộ lượng thuốc, nhìn chung, nhất định sẽ có ảnh hưởng khơng
tốt, tạo nên những phản ứng sinh lý vội gấp, cơ năng sinh dục khơng được điều hịa, như
có hiện tượng bụng cá phình lên quá nhanh, quá to làm giảm tỉ lệ cho trứng và tỉ lệ nở.
Hơn nữa, dùng cách tiêm hai lần cịn có thể coi lần tiêm thứ nhất là lần sát hạch cuối
cùng để lựa chọn cá bố mẹ thành thục.

31


3.2. Vị trí tiêm não thùy thể cá chép
Về phương pháp tiêm cá thì hiện nay có hai cách tiêm: tiêm vào xoang thân và

tiêm vào bắp thịt. Kết quả kích thích sinh sản nhân tạo cá chạch bằng hai phương pháp
tiêm khác nhau được trình bày ở bảng 2.
Bảng 2: Hiệu quả kích thích sinh sản cá chạch bằng các phương pháp tiêm khác nhau

Đợt thí
nghiệm
1
2
3
4
5
6
Trung
bình

Tiêm vào xoang thân
Số cá
Số cá
Tỉ lệ
Tỉ lệ
được
cho
cá cho trứng
tiêm
trứng trứng
nở
(con)
(con)
(%)
(%)

10
7
70,00
79,00
6
4
66,66
85,00
12
8
66,66
72,00
8
7
87,50
70,00
10
8
80,00
89.00
8
6
75,00
84,00
54

40

74,30

79,83

Số cá
được
tiêm
(con)
10
6
12
8
10
8
54

Tiêm vào bắp thịt
Số cá
Tỉ lệ
cho
cá cho
trứng trứng
(con)
(%)
6
60,00
4
66,66
5
41,66
7
87,50

7
70,00
5
62,50
34

64,72

Tỉ lệ
trứng
nở
(%)
80,00
82,00
68,00
65,00
85,00
80,00
76,67

Bảng 2 cho thấy tỉ lệ cá cho trứng và tỉ lệ nở của cá chạch được tiêm não thùy
thể cá chép bằng phương pháp tiêm vào xoang thân là 74,30% (từ 66,66 - 87,50%) và
79,83% (từ 70,00 - 89,00%); của cá chạch được tiêm não thùy thể cá chép bằng phương
pháp tiêm bắp thịt tương ứng là 64,72% (từ 41,66 - 87,50%) và 76,67% (từ 65,00 85,00%). Như vậy, tỉ lệ cá cho trứng và tỉ lệ nở của cá chạch được tiêm não thủy thể cá
chép vào xoang thân đạt 117,64% và 104,13% so với cá chạch được tiêm não thùy thể
cá chép vào bắp thịt. Kết quả này cho thấy kích thích sinh sản cá chạch bằng phương
pháp tiêm vào xoang thân cho hiệu quả tương đối chắc chắn hơn phương pháp tiêm vào
bắp thịt.
3.3. Phương pháp thụ tinh nhân tạo
Bảng 3: Kết quả thụ tinh nhân tạo cá chạch theo các phương pháp thụ tinh khác nhau

Phương pháp
thụ tinh

Phương pháp 1

Đợt
thí nghiệm
1
2
3
4
5

Số trứng thụ
tinh (cái)
100
100
100
100
100
∑ = 500
32

Số trứng nở
(cái)
76
68
71
65
82

∑ = 362

Tỉ lệ nở
(%)
76,00
68,00
71,00
65,00
82,00
x = 72,40


Phương pháp 2

1
2
3
4
5

100
100
100
100
100
∑ = 500

69
72
78

64
75
∑ = 358

69,00
72,00
78,00
64,00
75,00
x = 71,60

Phương pháp 3

1
2
3
4
5

100
100
100
100
100
∑ = 500

86
92
72
80

78
∑ = 408

86,00
92,00
72,00
80,00
78,00
x = 81,60

Phương pháp 4

1
2
3
4
5

100
100
100
100
100
∑ = 500

83
69
74
78
75

∑ = 379

83,00
69,00
74,00
78,00
75,00
x = 75,80

Trứng và tinh dịch được thu nhận vào đầu chu kỳ sáng để tiến hành thụ tinh
nhân tạo với tỉ lệ 100 2l tinh dịch/100 trứng. Kết quả thụ tinh nhân tạo cá chạch theo các
phương pháp khác nhau được trình bày ở bảng 3.
Nhìn vào bảng 3 ta thấy các phương pháp thụ tinh nhân tạo 1, 2, 3 và 4 cho tỉ lệ nở
lần lượt là 72,40%; 71,60%; 81,60% và 75,80%. Như vậy, phương pháp thụ tinh thứ 3
cho tỉ lệ nở cao nhất. Trong hai phương pháp thụ tinh 1 và 2 đều lấy tinh trùng trước, thời
gian tiến hành thụ tinh dài. Ở phương pháp thụ tinh 4 lấy trứng trước và vuốt ngay tinh
dịch của cá đực vào trứng nên có thể giảm bớt thời gian lấy tinh dịch. Trong khi đó, đối
với phương pháp thụ tinh 3, vừa lấy trứng vừa lấy tinh dịch, do đó, thời gian thụ tinh là
ngắn nhất. Mặt khác, các thí nghiệm này được tiến hành vào mùa nóng (tháng 5, 6, 7) nên
trứng sau khi ra khỏi cơ thể mẹ mất khả năng thụ tinh rất nhanh. Thời gian thụ tinh càng
dài tỉ lệ trứng mất khả năng thụ tinh càng lớn do đó tỉ lệ nở càng giảm. Tóm lại, trong 4
phương pháp thụ tinh nhân tạo nói trên, phương pháp thứ 3 cho hiệu suất cao nhất.
IV. Kết kuận
- Kích thích sinh sản nhân tạo cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus) bằng
phương pháp tiêm não thùy thể cá chép hai lần cho hiệu quả cao hơn tiêm một lần và
phương pháp tiêm vào xoang thân cho hiệu quả cao hơn tiêm vào bắp thịt.
- Trong các phương pháp thụ tinh nhân tạo, phương pháp 3 (vừa lấy trứng vừa
lấy tinh dịch) cho hiệu quả thu nhận phôi cá chạch một tế bào cao nhất.
33

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Văn Cường, Vũ Văn Diễn, Nguyễn Kim Độ, Nguyễn Thị Diệu Thúy, Quyền
Đình Thi, Trần Quốc Dung, Tạo cá chuyển gen hormone sinh trưởng người, Kỷ yếu
Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc 9-10/12/1999. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà
Nội, (1999), 1429-1437.
2. Trần Quốc Dung, Nghiên cứu chuyển gen hormone sinh trưởng người vào cá chạch
(Misgurnus anguillicaudatus) bằng vi tiêm, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học
Sư phạm Hà Nội, 2001.
3. Trần Quốc Dung, Quyền Đình Thi, Nguyễn Thị Diệu Thúy, Nguyễn Văn Cường, Đặng
Hữu Lanh, Tinh sạch và đánh giá sơ bộ gen hormone sinh trưởng người để chuyển vào
cá vàng và cá chạch, Tạp chí Di truyền học và Ứng dụng, Số 2, (1999), 39-44.
4. Trần Quốc Dung, Vũ Văn Diễn, Nguyễn Kim Độ, Quyền Đình Thi, Nguyễn Thị Diệu
Thúy, Nguyễn Văn Cường, Đặng Hữu Lanh, Tạo cá chạch mang gen hormone sinh
trưởng người, Tạp chí Sinh học, 21(3) (1999), 24-28.
5. Nguyễn Kim Độ, Nguyễn Văn Cường, Nguyễn Thị Diệu Thúy, Trần Quốc Dung, Kết
quả nghiên cứu khử màng chorion của phôi giai đoạn một tế bào chu#n bị cho kỹ thuật
vi tiêm vào cá chạch Misgurnus anguillicaudatus, Kỷ yếu Viện Công nghệ sinh học,
Trung tâm KHTN và CNQG, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, (1997), 267-272.
6. Nguyen Kim Do, Nguyen Van Cuong, Nguyen Thi Dieu Thuy, Tran Quoc Dung, Some
results on generation of transgenic animal: Fish by methallothionein human growth
hormone (MThGH) gene microinjection, Proceedings, third Asian Symposium of
Korean Society of Animal Reproduction, Korea 11-14/12/1997, (1997), 108-114.
7. Chung Lân, Lý Hữu Quảng, Trương Tùng Đào, Lưu Gia Chiếu, Trần Phấn Xương
(Người dịch: Dương Tuấn, Nguyễn Kim Độ, Trần Nguyệt Thu, Trần Nhất Anh), Sinh
vật học và sinh sản nhân tạo các lồi cá ni, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội,
1969.
8. Patrick J. Babin, Joan Cerda, Esther Lubzens, The Fish Oocyte: From Basic Studies to
Biotechnological Applications, Published by Singer, The Netherlandsm, 2007.
9. Nguyễn Khoa Diệu Thu, Văn Thị Hạnh, Nguyễn Hằng, Xây dựng phương pháp thu

nhận giao tử và phôi một tế bào chu#n bị cho kỹ thuật vi tiêm DNA vào cá vàng
Carassius auratus, Tạp chí Khoa học và Cơng nghệ XXXII, 2 (1994), 6-11.
10. Zhu Z., Generation of fast growing transgenic fish: Method and mechanism,
Transgenic fish, World Scientific, (1993), 93-119.

34


THE COLLETION OF GAMETES AND MONOCELLULAR
EMBRYOS OF LOACH (Misgurnus anguillicaudatus)
Tran Quoc Dung
College of Pedagogy, Hue University

SUMMARY
Loach is a fresh water fish species. Unlike other fish species, loach spawns from spring
to fall. It has been used in the laboratory for the study of transgenesis. In order to control the
time course of gene introduction into developing fish embryo, artificial fertilzation is required.
Females and males are identified by the morphology of the pectoral fin. After an overnight
hormonal induction, the mature eggs and milt were striped from parent fish. About one hundred
eggs were collected in Pestri dish and mixed with 100 l milt. The outcomes show that fish
injected intraperitoneally two times by carp pituitary with the third artificial fertilization way
(collect eggs and milt at the same time) are better.
Keywords: Misgurnus anguillicaudatus, carp pituitary, artificial fertilization,
microinjection.

35