Báo cáo nghiên cứu khoa học: " NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI CÁ CHẠCH (MISGURNUS ANGUILLICAUDATUS) ĐƯỢC CHUYỂN GEN HORMONE SINH TRƯỞNG NGƯỜI" docx

73

TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 55, 2009


NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI CÁ CHẠCH
(MISGURNUS ANGUILLICAUDATUS)
ĐƯỢC CHUYỂN GEN
HORMONE SINH TR
ƯỞNG NGƯỜI
Tr n Qu c Dung

Tr ng i h c S ph m, i h c Hu
TÓM TẮT
Tr ng và tinh trùng c a cá ch ch (Misgurnus anguillicaudatus) c thành th c hoá
b
ng cách tiêm não thu th cá chép. Phôi cá ch ch giai o n m t t bào thu nh n t s th
tinh nhân t
o c s d ng vi tiêm. Màng chorion c a tr ng th tinh c lo i b b ng
enzyme tripsin tr
c khi tiêm gen hormone sinh tr ng ng i (hGH). Tr ng sau khi tiêm c
chuy
n vào trong dung d ch Holtfreter bão hoà 100% không khí 27 - 28ºC. S mô t quá trình
phát tri
n c a phôi cá ch ch c chuy n gen hGH ch y u d a vào s quan sát các c i m
hình thái và sinh lý c
a phôi d i kính hi n vi. K t qu nghiên c u ã xác nh c m t s giai
o n phát tri n c a phôi cá ch ch c chuy n gen hGH l n l t di n ra nh sau: tr ng ch a
th

tinh, tr ng m t t bào, tr ng hai t bào, tr ng b n t bào, tr ng tám t bào, tr ng 32 t bào,
tr
ng nhi u t bào, th i k u phôi v , th i k gi a phôi v , th i k cu i phôi v , th i k phôi
th
n kinh, th i k b c m t, th i k m m uôi, th i k vây uôi, th i k c hi u ng, th i k tim
p và th i k n .
T
khoá: gen hormone sinh tr ng ng i, Misgurnus anguillicaudatus, s phát tri n
phôi, th
tinh nhân t o, vi tiêm.

1. M
ở đầu
M
ục đích của công tác chọn giống và nhân giống là cải tiến tiềm năng di truyền
c
ủa cây trồng, vật nuôi nhằm nâng cao năng suất, hiệu quả sản xuất nông nghiệp.
Trong công tác c
ải tạo giống cổ truyền, chủ yếu sử dụng phương pháp lai và chọn lọc để
c
ải tạo nguồn gen của sinh vật. Tuy nhiên, do quá trình lai tạo tự nhiên, con lai thu được
qua lai t
ạo và chọn lọc vẫn còn mang luôn cả các gen không mong muốn do tổ hợp hai
b
ộ nhiễm sắc thể đơn bội của giao tử đực và giao tử cái. Một hạn chế nữa là việc lai tạo
t
ự nhiên chỉ thực hiện được giữa các cá thể trong loài. Lai xa, lai khác loài gặp nhiều
khó kh
ăn, con lai thường bất thụ do sai khác nhau về bộ nhiễm sắc thể cả về số lượng
l

ẫn hình thái giữa bố và mẹ, do cấu tạo cơ quan sinh dục, tập tính sinh học giữa các
loài không phù h
ợp với nhau. Gần đây, nhờ những thành tựu trong lĩnh vực DNA tái tổ
h
ợp, công nghệ chuyển gen ra đời đã cho phép khắc phục những trở ngại nói trên. Nó


74

cho phép chỉ đưa những gen mong muốn vào động vật, thực vật để tạo ra những giống
v
ật nuôi, cây trồng mới kể cả việc đưa gen từ giống này sang giống khác, đưa gen của
loài này vào loài khác [1].
Bằng kỹ thuật tiên tiến nêu trên của công nghệ sinh học hiện đại, vào năm 1982
Palmiter và c
ộng sự đã chuyển được gen hormone sinh trưởng của chuột cống vào chuột
nh
ắt, tạo ra được chuột nhắt “khổng lồ”. Từ đó đến nay, hàng loạt động vật chuyển gen
đã được tạo ra như thỏ, lợn, cừu, dê, bò, gà, cá mang những tính trạng ưu việt như
t
ăng trưởng nhanh, có khả năng chống chịu bệnh Bằng kỹ thuật vi tiêm
(microinjection) ng
ười ta đã chuyển các gen định hướng vào phôi cá giai đoạn một tế
bào và
đã tạo ra hàng loạt cá chuyển gen (cá giếc, cá chép, cá vàng, cá medaka, cá
h
ồi…) [9, 10]. Để làm chủ kỹ thuật tạo cá chuyển gen, chúng tôi đã tiến hành nghiên
c
ứu đưa gen hormone sinh trưởng người (hGH) vào cá chạch (Misgurnus
anguillicaudatus) [1, 2, 3, 4, 5, 6] b

ằng phương pháp vi tiêm. Phôi cá chạch chuyển gen
hGH sau
đó được quan sát sự phát triển cho đến khi nở.
2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1. V
ật liệu nghiên cứu
Phôi cá ch
ạch (Misgurnus anguillicaudatus) được chuyển gen hormone sinh
tr
ưởng người giai đoạn một tế bào.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Tr
ứng và tinh dịch cá chạch được chủ động thu nhận sau khi cá bố mẹ được thúc
chín b
ằng tiêm não thuỷ thể cá chép và tiến hành thụ tinh nhân tạo [7]. Phôi giai đoạn
m
ột tế bào được đồng loạt tạo ra và được khử màng chorion bằng enzyme tripsin (Hình
1).
Vi tiêm
được tiến hành trên máy vi thao tác Olympus (Narishige, Nhật Bản) qua
các b
ước: chuyển phôi một tế bào vào buồng tiêm, gen hGH được nạp vào kim tiêm, lắp
kim tiêm và kim gi
ữ vào máy vi thao tác, giữ phôi vào đầu kim giữ bằng bằng lực hút
c
ủa syringe, điều chỉnh kính hiển vi để xác định đĩa phôi và bộ phận vi thao tác để đưa
đầu kim tiêm vào vị trí đĩa phôi, vặn nhẹ syringe để chuyển gen vào phôi. Vi tiêm gen
hormone sinh tr
ưởng người vào các phôi trần giai đoạn một tế bào. Sau khi vi tiêm gen
hormone sinh tr

ưởng người, phôi được cho vào trong dung dịch Holtfreter (NaCl 3,5%;
KCl 0,05%; CaCl
2
0,1%; NaHCO
3
0,2%) là dung dịch đẳng trương với phôi trần, bão
hoà 100% không khí, t
ạo điều kiện cho phôi phát triển thuận lợi, vì phôi trần rất dễ bị
v
ỡ khi ấp ở môi trường nước do tác dụng nhược trương. Phôi trần rất dễ bị tấn công bởi
các tác nhân gây b
ệnh từ môi trường bên ngoài nên môi trường đưa phôi vào phải được
vô trùng.
S
ự phát triển của phôi được mô tả chủ yếu dựa vào sự quan sát các đặc điểm
hình thái và sinh lý d
ưới kính hiển soi ngược Olympus, ở 27 - 28
0
C.


75

3. Kết quả và thảo luận

a) Tr
ng ch a kh màng chorion

b) Tr
ng ã kh màng chorion

Hình 1. Tr
ng cá ch ch giai o n m t t bào c ch p d i kính hi n vi ( phóng i 40x)
Sự phát triển của phôi cá chạch vi tiêm gen hormone sinh trưởng người được
quan sát, mô t
ả thành một số giai đoạn. Trước hết là giai đoạn trứng chưa thụ tinh (Hình
2.1).
Đặc điểm của giai đoạn này là trứng trương nước, to ra, noãn chất phân bố đồng
đều. Trứng tiếp tục trương nước. 15 phút sau thụ tinh, phôi chuyển sang giai đoạn trứng
m
ột tế bào (Hình 2.2). Vào lúc này quan sát thấy đĩa phôi phồng lên dạng thấu kính lồi,
noãn ch
ất tập trung về một đầu, đĩa phôi bắt đầu lồi lên, độ thấu quang của trứng tăng
lên. S
ự phân cắt lần thứ nhất xảy ra vào lúc 30 phút sau thụ tinh, chia đĩa phôi thành hai
t
ế bào có kích thước như nhau. Đây là giai đoạn trứng hai tế bào (Hình 2.3). Sau giai
đoạn trứng hai tế bào là giai đoạn trứng bốn tế bào: vào thời điểm sau thụ tinh khoảng
50 phút, x
ảy ra sự phân cắt lần thứ hai của phôi tạo thành trứng bốn tế bào (Hình 2.4).
S
ự phân cắt lần thứ ba của phôi diễn ra vào lúc 60 phút sau thụ tinh hình thành trứng
tám t
ế bào (Hình 2.5). Đến 1 giờ 10 phút kể từ lúc thụ tinh, phôi phân cắt lần thứ năm
t
ạo thành trứng 32 tế bào (Hình 2.6). Sự phân cắt tiếp tục xảy ra nhiều lần tạo thành
phôi nhi
ều tế bào (1 giờ 15 phút sau thụ tinh). Đặc điểm nổi bật của giai đoạn này là
kích th
ước tế bào ngày càng nhỏ so với các giai đoạn trước đó. Phôi nang hình thành
được quan sát thấy vào lúc 3 giờ 40 phút sau thụ tinh, với số tế bào phân chia nhiều

không th
ể đếm được (Hình 2.7). Tiếp đến là thời kỳ phôi vị với ba giai đoạn: thời kỳ
đầu phôi vị, giữa phôi vị và cuối phôi vị. Thời kỳ đầu phôi vị (4 giờ sau thụ tinh) với đĩa
phôi trùm xu
ống 1/2 khối noãn hoàng, xuất hiện vòng phôi (Hình 2.8). 4 giờ 40 phút
sau th
ụ tinh, phôi phát triển chuyển sang thời kỳ giữa phôi vị, đĩa phôi trùm xuống 2/3
kh
ối noãn hoàng, xuất hiện phôi thuẫn (Hình 2.9). Thời kỳ cuối phôi vị, 5 giờ 35 phút
sau th
ụ tinh. Lúc này đĩa phôi trùm xuống 4/5 khối noãn hoàng (Hình 2.10). Đến 7 giờ
30 phút sau th
ụ tinh, quan sát thấy ở phía lưng phôi thai có tấm thần kinh nổi lên. Giai
đoạn này được gọi là thời kỳ phôi thần kinh (Hình 2.11). Sau thời kỳ phôi thần kinh là
th
ời kỳ bọc mắt, quan sát được vào lúc 11 giờ 15 phút sau thụ tinh. Dễ dàng phát hiện
th
ấy sự xuất hiện của một tổ chức mới là bọc mắt. Sau đó, mầm đuôi của phôi hình
Màng chorion


76

thành, có thể thấy rõ các đốt thân, 12 giờ 10 phút sau thụ tinh (Hình 2.13). Tiếp theo
th
ời kỳ mầm đuôi là thời kỳ vây đuôi (13 giờ 55 phút sau thụ tinh). Đặc điểm của giai
đoạn này là vây đuôi xuất hiện, thân kéo dài (Hình 2.14). Đến 15 giờ 5 phút sau thụ tinh,
quan sát phôi
ở giai đoạn này thấy cơ bắt đầu co duỗi, đuôi dài thêm (thời kỳ cơ hiệu
ứng). Thời kỳ tim đập, 18 giờ 25 phút sau thụ tinh, tim bắt đầu co bóp, rung động một

cách t
ương ứng, phôi thể kéo dài (Hình 2.15, 2.16). 24 giờ sau thụ tinh, cá con vừa mới
n
ở.
S
ự phát triển của phôi cá chạch được chuyển gen hGH nhìn chung là giống với
phôi cá ch
ạch đối chứng không được chuyển gen. Thời gian ấp nở của cả hai loại phôi
đều là 24 tiếng [3]. So sánh với kết quả nghiên cứu của Melvin Weisbart (1993) [8] trên
cá pupfish (Cyprinodon macularius), m
ột loài cá sống chủ yếu ở nước lợ, phân bố ở
phía Nam Sanora, Mexico và d
ọc theo bờ biển Salton ở California, Mỹ thì quá trình
phát tri
ển phôi trải qua các giai đoạn: trứng chưa thụ tinh, trứng một tế bào (15 phút sau
th
ụ tinh), trứng hai tế bào (55 phút sau thụ tinh), trứng bốn tế bào (1 giờ 25 phút sau thụ
tinh), tr
ứng tám tế bào (1 giờ 50 phút sau thụ tinh)… và thời gian ấp nở là 108 giờ sau
th
ụ tinh. Như vậy, thời gian để đạt các giai đoạn phát triển khác nhau cũng như thời gian
ấp nở của phôi cá cá chạch là ngắn hơn nhiều so với cá pupfish.
4. Kết luận
K
ết quả nghiên cứu đã xác định được một số giai đoạn phát triển của phôi cá
ch
ạch (Misgurnus anguillicaudatus) được chuyển gen hormone sinh trưởng người lần
l
ượt diễn ra như sau: trứng chưa thụ tinh, trứng một tế bào, trứng hai tế bào, trứng bốn
t

ế bào, trứng tám tế bào, trứng 32 tế bào, trứng nhiều tế bào, thời kỳ phôi nang, thời kỳ
đầu phôi vị, thời kỳ giữa phôi vị, thời kỳ cuối phôi vị, thời kỳ phôi thần kinh, thời kỳ
b
ọc mắt, thời kỳ mầm đuôi, thời kỳ vây đuôi, thời kỳ cơ hiệu ứng, thời kỳ tim đập và
th
ời kỳ nở.


77



Hình 2.1

Hình 2.2

Hình 2.3

Hình 2.4

Hình 2.5

Hình 2.6

Hình 2.7

Hình 2.8

Hình 2.9

Hình 2.10

Hình 2.11

Hình 2.12
a phôi
T m th n
kinh
B c m t
Vòng phôi


78


Hình 2.13

Hình 2.14

Hình 2.15
Hình 2.16
Hình 2. M
t s giai o n phát tri n c a phôi cá ch ch (Misgurnus anguillicaudatus) c
chuy
n gen hormone sinh tr ng ng i
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Tr n Qu c Dung, Nghiên c u chuy n gen hormone sinh tr ng ng i vào cá ch ch
(Misgurnus anguillicaudatus) b
ng vi tiêm, Lu n án Ti n s Sinh h c, Tr ng i h c
S

ph m Hà N i, 2001.
2. Tr
n Qu c Dung, Quy n ình Thi, Nguy n Th Di u Thuý, Nguy n V n C ng, ng
H
u Lanh, Tinh s ch và ánh giá s b gen hormone sinh tr ng ng i chuy n vào
cá vàng và cá ch
ch, T p chí Di truy n h c và ng d ng S 2, (1999), 39-44.
3. Tr
n Qu c Dung, V V n Di n, Nguy n Kim , Quy n ình Thi, Nguy n Th Di u
Thuý, Nguy
n V n C ng, ng H u Lanh, T o cá ch ch mang gen hormone sinh
tr
ng ng i, T p chí Sinh h c 21(3), (1999), 24-28.
4. Nguy
n V n C ng, V V n Di n, Nguy n Kim , Nguy n Th Di u Thuý, Quy n
ình Thi, Tr n Qu c Dung, T o cá chuy n gen hormone sinh tr ng ng i. Báo cáo
khoa h
c. K y u H i ngh Công ngh sinh h c toàn qu c 9-10/12/1999, NXB Khoa
h
c và K thu t, Hà N i, (1999), 1429-1437.
Vây uôi
M m
uôi


79

5. Nguy n Kim , Nguy n V n C ng, Nguy n Th Di u Thuý, Tr n Qu c Dung, K t
qu
nghiên c u kh màng chorion c a phôi giai o n m t t bào chu n b cho k thu t

vi tiêm vào cá ch
ch Misgurnus anguillicaudatus. K y u Vi n Công ngh sinh h c,
Trung tâm KHTN và CNQG, NXB Khoa h
c và K thu t, Hà N i, (1997), 267-272.
6. Nguyen Kim Do, Nguyen Van Cuong, Nguyen Thi Dieu Thuy, Tran Quoc Dung, Some
results on generation of transgenic animal: Fish by methallothionein human growth
hormone (MThGH) gene microinjection. Proceedings, Third Asian Symposium of
Korean Society of Animal Reproduction, Korea 11-14/12, (1997), 108-114.
7. Chung Lân, Lý H u Qu ng, Tr ng Tùng ào, L u Gia Chi u, Tr n Ph n X ng
(Ng
i d ch: D ng Tu n, Nguy n Kim , Tr n Nguy t Thu, Tr n Nh t Anh), Sinh
v
t h c và sinh s n nhân t o các loài cá nuôi, NXB Khoa h c và K thu t, Hà N i,
1969.
8. Melvin Weisbart, Egg development: from gametes to embryonic development and
hatching, Transgenic Fish, World Scientific, (1993), 1-26.
9. Patrick J. Babin, Joan Cerda, Esther Lubzens, The Fish Oocyte: From Basic Studies to
Biotechnological Applications, Published by Singer, The Neitherlands, 2007.
10. Zhu Z., Generation of fast growing transgenic fish: method and mechanism,
Transgenic Fish, World Scientific, (1993), 93-119.


INVESTIGATION OF THE DEVELOPMENT OF LOACH EMBRYO
(MISGURNUS ANGUILLICAUDATUS) TRANSFERRED HUMAN GROWTH
HORMONE GENE
Tran Quoc Dung

College of Pedagogy, Hue University
SUMMARY
Eggs and spermatozoa of loach (Misgurnus anguillicaudatus) were stimulated to

mature by injection of carp pituitary. The embryos at one-cell stage obtained by artificial
fertilization were used for microinjection. Before microinjection, the chorion membranes of the
fertilized eggs were eliminated by tripsin. After microinjected with human growth hormone gene
(hGH), the eggs were incubated in Holtfreter solution with 100% air saturation at 27 - 28ºC.
The description of embryonic development of the loach transferred hGH gene was based on
morphological and physiological features that can be readily observed under the inverted
microscope in the living embryo. The results show that the embryonic development of the loach
includes the following stages: unfertilized ovum, one-celled egg, two-celled egg, four-celled egg,
thirty two-celled egg, multiple-celled egg, balstula, early gastrula, intermediate gastrula, late


80

gastrula, formation auditory placodes, formation of optic vesicles, development of dermal fin
rays in the caudal fin, effected muscle, heart beat and hatching.

Key words: embryonic development, human growth hormone gene, microinjection,
Misgurnus anguillicaudatus.