THIẾT KẾ QUY TRÌNH SẢN UẤT ENZYME PECTIN METHYLESTERASE TỪ Aspergillus niger ĐẠT CÔNG SUẤT 200 TẤNNĂM

C ƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Tổng quan về enzyme pectin methylesterase

1.1.1. Tổng quan enzyme pectin methylesterase
Enzyme pectin methylesterase (PME, EC 3.1.1.11) còn đƣợc gọi là pectinesterase
(PE) là một trong những enzyme thuộc nhóm enzyme pectinase. Ngồi enzyme pectin
methylesterase, polygalacturonases và pectinlyase cũng thuộc nhóm enzyme pectinase
(Kohli và cộng sự, 2015). Chúng là những enzyme thủy phân chất pectin có trong thực
vật. Chính vì khả năng này mà chúng đóng một vai trị quan trọng trong q trình bảo
quản trái cây và hoa quả chỉ đứng sau enzyme amylase và protease.
Liên kết methyl ester của pectin đƣợc thủy phân và giải phóng methanol nhờ vào
xúc tác của PME, từ đó hình thành pectin có độ methoxyl thấp là các acid peptic. Hiệu
suất phân giải pectin của PME có thể đạt đến 98% do PME là enzyme đặc hiệu (Nguyễn
Đức Lƣợng và cộng sự, 2010). Các PME có nguồn gốc từ thực vật và vi khuẩn có pH tối
ƣu là 6 – 8. Tuy nhiên, do hiệu quả kinh tế khá thấp khi thu PME từ 2 nguồn gốc trên,
ngƣời ta tiến hành nhiều nghiên cứu và chứng minh đƣợc rằng PME cịn có thể thu nhận
đƣợc từ nguồn nấm, cụ thể là từ Aspergillus sp., an toàn và đem lại hiệu quả kinh tế hơn.
Cũng vì thế mà phƣơng pháp thu nhận PME từ Aspergillus sp. đƣợc áp dụng rộng rãi, đặc
biệt trong ngành chế biến đồ uống nƣớc trái cây (Gonzalez, Rosso, 2011).
1.1.2. Đặ đ ểm
PME có phân tử khối vào khoảng 25 – 54 kDa. Điểm đẳng điện (pI) của PME
khác nhau tùy thuộc vào nguồn gốc thu nhận PME. pI của PME hầu hết là trung tính đến
kiềm khi PME đƣợc chiết xuất từ thực vật (Marian Bordenave, 1996). Trong khi PME
sinh tổng hợp từ nấm mốc phần lớn có pI là acid.
Hoạt độ của ezyme PME sinh ra bởi A. niger đạt tối đa ở pH 4,5 ở 40ºC. Các PME
kiềm làm hình thành các pectin đƣợc đề ester hóa có thể tạo gel yếu với ion calcium.
Trong khi các PME acid tạo ra pectin đƣợc đề ester hóa tạo gel mạnh với ion calcium. Vì
vậy có thể nói các PME acid và kiềm methyl hóa chất pectin theo cùng một kiểu (Nguyễn
Đức Lƣợng và cộng sự, 2010).

1.1.3. Cơ

ế tác dụng


Pectin chiếm khoảng 35% trọng lƣợng khô của thành tế bào vì vậy cũng giữ vai
trị quan trọng trong việc quyết định kích thƣớc, dạng, liên quan đến sự tăng trƣởng và
phát triển của tế bào (Micheli, 2001). Cũng vì pectin chiếm tỷ lệ khá lớn và có vai trị liên
kết các tế bào lại là tác nhân làm cho dịch quả bị đục và nhớt, ảnh hƣởng không tốt và
giảm hiệu quả kinh tế trong sản xuất nƣớc trái cây. Tuy nhiên, PME cũng giúp phân hủy
một phần tế bào, tạo điều kiện cho việc tách chiết các chất màu, chất thơm dễ dàng hơn
giúp làm tăng chất lƣợng cảm quan của dịch quả (Đặng Thị Thu và cộng sự, 2012).

Hình 1. 1. Phản ứng thủy phân của PME
(Fabienne Micheli, 2001)
PME tấn cơng vào các nhóm ester methyl của đơn vị galacturonate nằm kề đơn vị
khơng bị ester hóa, phân cắt các nhóm methoxy (COOCH3) đứng cạnh các nhóm –COOH
tự do tạo thành acid peptic và methanol. PME thƣờng đƣợc hoạt hóa các ion Ca2+ và
Mg2+ (Nguyễn Đức Lƣợng và cộng sự, 2010).
Các nghiên cứu liên quan cũng cho thấy phản ứng PME thuộc trƣờng hợp đơn
giản nhất chỉ có một cơ chất theo phƣơng trình:

Trong đó :


E: enzyme, S: cơ chất, P: sản phẩm.



k1, k-1: là hằng số tốc độ phản ứng tạo thành cơ chất ES và phân ly phức

chất ES thành E và S.


k2: hằng số tốc độ phản ứng tạo thành E và P

1.1.4. Ứng dụng


Từ năm 1930 đến nay, trong sản xuất rƣợu vang và nƣớc trái cây PME đƣợc sử
dụng khá phổ biến do dễ sản xuất. Nấm Aspergillus niger là nguyên liệu phổ biến để sản
xuất PME ứng dụng vào công nghiệp thực phẩm (Kohli và cộng sự, 2015). Do vách tế
bào thực vật có lớp pectin nên để làm tăng hiệu suất trích ly ngƣời ta thƣờng phá vỡ cấu
trúc của pectin để giảm đi độ nhớt và làm trong dịch chiết. Để đạt hiệu quả cao khi phá
vỡ cấu trúc pectin, PME cũng sử dụng kết hợp với một số loại pectinase khác nhƣ
pectinlyase, polygalacturonase hay các loại callulase, hemicellulase.
Sự kết hợp của PME là CaCl2 là phƣơng pháp tối ƣu trong bảo quản rau quả và trái
cây. Cơ chế của phƣơng pháp này theo Trần Thanh Trúc (2013) đƣợc nêu nhƣ sau: Khi
có mặt của icon Ca2+, pectin trong mô thực vật bị khử ester tạo gel giúp thành tế bào trở
nên cứng hơn; khi khơng có mặt ion Ca2+,các enzyme polygalacturonase và pectinlyase
hoạt động và thủy phân ngẫu nhiên mạch polymer của pectin do đó rau quả sẽ mềm hơn
(sự đề methyl hóa của pectin).
Hiện nay, trong sản xuất cà phê, để sinh tổng hợp callulase và pectinase giúp phân
hủy vỏ cà phê giảm ô nhiễm môi trƣờng, ngƣời ta sử dụng chế phẩm đƣợc kết hợp hai
chủng nấm mốc Trichoderma viride và Aspergillus niger (Trần Thị Thanh Thuần,
Nguyễn Đức Lƣợng, 2009).
1.1.5. Nguồn thu nhận
Hiện nay để sản xuất enzyme nguồn nguyên liệu chủ yếu là vi sinh vật. Hơn ½
tổng lƣợng enzyme cơng nghiệp đƣợc sản xuất từ nấm men và nấm mốc, 1/3 tổng hợp từ
vi khuẩn, còn lại từ thực vật và động vật.

Chủ yếu vi sinh vật hiếu khí có khả năng tổng hợp pectinase: nấm men
(Sacharomyces

fragilis),

nấm

mốc

(Aspergillus

sp,

Penicillium

glaucum,

Trichodermasp...) và vi khuẩn (Bacillus polymyxa, Bacillus felineus, Flavobacterium
pectinovorum…).
Theo Lê Thị Thu Trang (2011), các loài này dễ nuôi cấy, thời gian sinh trƣởng
ngắn phát triển nhanh, nấm mốc là loại đƣợc sử dụng phổ biến để thu enzyme pectinase
thƣơng mại, chủng Aspergillus niger sinh enzyme pectinase nhiều nhất.
1.2.

Tổng quan về nấm Aspergillus niger


1.2.1. Giới thiệu
Aspergillus niger là loài phổ biến, phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong các sản
phẩm nông-công nghiệp và ở các đại lý. Trong công nghiệp sản xuất enzyme, chế biến

thực phẩm, công nghiệp sản xuất một số acid hữu cơ Aspergillus niger là loài đƣợc sử
dụng nhiều nhất.
1.2.2. Phân loại

Hình 1. 2. Aspergillus niger

Giới (Kingdom): Fungi
Ngành (Phylum): Ascomycota
Lớp (Class): Eurotiomycetes
Bộ (Order): Eurotiales
Ho (Family): Trichocomaceae
Chi (Genus): Aspergillus
Loài (Species): Aspergillus niger
1.2.3. Đặ đ ểm


Aspergillus niger dạng sợi còn gọi là khuẩn ty. Cấu trúc của Aspergillus niger gồm
có bào tử dính dài trơn khơng màu hoặc nâu, túi nấm trịn đầu xịa, thể bình hai đáy.
Thành của khuẩn ty cấu tạo hình sợi, chitin và glucan là hai thành thành hóa học chính.
Cơ quan sinh sản của Aspergillus niger có dạng hình hoa cúc, cuống bào tử trơn
nhẵn có phần phình ở đầu dạng hình cầu, trong suốt hoặc màu nâu nhạt. Trên đầu có mọc
thể bình là cơ quan tạo bào tử đính (conidi) và từ thể ngon sinh ra chuỗi bào tử đính
(conidia). Để phân biệt Aspergillus niger với các lồi khác trong chi Aspergillus ngƣời ta
dựa vào khối bào tử đính đen.
Hình thức sinh sản của Aspergillus niger gồm có 2 hình thức chính: sinh sản sinh
dƣỡng và sinh sản vơ tính. Các bào tử đều đƣợc sinh ra trực tiếp trên khuẩn ty, đặc biệt là
ở cuống bào tử trần.
Aspergillus niger có khả năng đồng hóa tốt các loại đƣờng nhƣ glucose, fructose,
saccharose; đồng hóa khá tốt đối với đƣờng sorbose và glactose và đồng hóa đƣờng
lactose ở mức trung bình.

Ngồi ra, Aspergillus niger cũng có khả năng sinh tổng hợp các loại enzyme nhƣ
amylase, protease, peptinase…
1.2.4. Phân bố
Aspergillus niger có nhiều trong tự nhiên và xác bã động-thực vật. Aspergillus
niger khơng có khả năng quang hợp tạo chất hữu cơ mà phải sống nhờ khả năng hấp thục
các chất qua bề mặt khuẩn ty. Do đó thƣờng Aspergillus niger sống hoạt sinh hoặc ký
sinh trên vật chủ.
1.3.

Các yếu tố ản

1.3.1. Ản


ƣởn đến quá trình sản xuất

ƣởng của thành ph n môi t ƣờng
Nguồn carbon

Để vi sinh vật phát triển tốt carbon là thành phần không thể thiếu. Cũng nhƣ các
enzyme khác trong nhóm pectinase, trong q trình sinh tổng hợp PME nguồn carbon
giàu pectinsex có độ methoxyl hóa cao nhƣ acid pectic, D-galacturonate và một số nguồn
khác (Sajjaanantakul và Pitifer, 1991). Khơng chỉ đảm nhận vai trị là nguồn carbon mà


cịn đóng vai trị là chất cảm ứng, xúc tác cho quá trình sinh tổng hợp PME
(Sajjaanantakul và Pitifer, 1991; Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).


Nguồn n tơ

Phân tử enzyme có cấu tạo từ các acid amin, do đó acid amin cũng có ảnh hƣởng
đến q trình tổng hợp enzyme. Hơn nữa, acid amin cũng có thể vừa là nguồn carbon vừa
là ngồn nitrogen. Nito cũng tham gia trong các trình tạo protein và các loại aicd nucleic.
Khi trong mơi trƣờng có tỉ lệ carbon và nito tối ƣu thì thu nhận enzyme nhiều nhất
(Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).


Nguồn ơ

ất

Sự có mặt của chất cảm ứng là đặc điểm của môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật thu
enzyme pectinase (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).


Nguồn k oán d n dƣỡng

Sự sinh trƣởng và tổng hợp enzyme pectinase bị ảnh lớn lớn từ các nguyên tố đa vi
lƣợng.
Để tổng hợp cấc thành phần quan trọng của tế bào và các coenzyme khơng thể
thiếu phospho, ngồi ra phospho còn ảnh hƣởng trực tiếp đến sự sinh sản của nấm sợi.
Để kích thích sự hình thành enzyme, lƣu huỳnh cũng có mặt trong các acid amin.
Độ bền của enzyme cũng bị ảnh hƣởng bởi cation Mg2+.
Ngoài ra sự tổng hợp enzyme cũng bị ảnh hƣởng bới calcium, mangan, corban…
(Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
1.3.2. Ản

ƣởng của nhiệt độ

Một trong những yếu tố quan trọng trong sinh trƣởng vi sinh vật và tổng hợp
enzyme là nhiệt độ. Nhiệt độ thích hợp để phát triển của Aspergillus niger là 28-32ᵒC
(Nguyễn Thị Lý Hằng, 2010).
Khi nhiệt độ vƣợt ngƣỡng tối đa và tối thiểu sẽ dẫn đến hạn chế hoặc ức chế sự
phát triển của nấm mốc.
1.3.3. Ản

ƣởng của pH

pH môi trƣờng cũng là một trong các yếu tổ ảnh hƣởng lớn đến quá trình sinh
trƣởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Mơi trƣờng có pH từ 4,0-6,5 thích hợp để


ni cấy Aspergillus niger sinh PME. Nguồn nitrogen cũng có ảnh hƣởng đến pH môi
trƣờng. Khi sử dụng các muối amonium mơi trƣờng dễ bị acid hóa, khi sử dụng nitrate
mơi trƣờng dễ bị kiềm hóa, khi đó sinh khối không bị ảnh hƣởng nhƣng sự tạo thành
enzyme pectinase bị kiềm hãm (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
1.3.4. Thời gian nuôi cấy
Thời gian nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger tƣơng đối dài khoảng 72-144 giờ
do Aspergillus niger đƣợc nuôi cấy bằng phƣơng pháp bề mặt sâu. Do nấm mốc khó tiếp
xúc với nguồn chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng nuôi cấy nên gia đoạn sinh trƣởng và
phát

triển

kéo

dài

(Joshi

và

cộng

sự,

2006).


2.1.

C ƢƠNG 2 P ÂN TÍC , LỰA CHỌN
VÀ ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ
Quy trình cơng nghệ sản xuất

Sơ đồ công nghệ

Chuẩn bị
nguyên liệu

Nhân giống

Gieo giống

Nuôi cấy giống mốc thu
enzyme

Bã

Lọc khung bản

Kết tủa

Ly tâm

Enzyme
kỹ thuật

Bao gói

Sấy phun


2.2.

Thuyết minh quy trình cơng nghệ

2.2.1. Chuẩn b ngun liệu
Thành phần môi trƣờng nuôi cấy Aspergillus niger gồm:
àm lƣợng

STT

Thành ph n

1

Pectin

20 g/L

2

Glucose

60 g/L

3

KH2PO4

0,5 g/L

4

MgSO4

0,25 g/L

5

(NH4)2SO4

10 g/L

6

pH

4,0

7

Dung dịch pha môi trƣờng
(Đệm citrate)

0,1M

Môi trƣờng đƣợc hấp tiệt trùng ở 121ᵒC trong 20 phút.
Làm nguội gần đến nhiệt độ nuôi cấy nhằm tạo điều kiện thích hợp cho vi sinh vật
phát triển. Đây là giai đoạn để kiểm tra và loại bỏ các thành phần quá ƣớt hoặc quá khô
so với yêu cầu.
Lƣu ý quá trình này cần làm nhanh để tránh bị nhiễm vi sinh vật tạp (Nguyễn Thị
Lý Hằng, 2010).
2.2.2. Nhân giống

Mục đích:
Kích hoạt giống gốc và cho giống vi sinh vật làm quen với môi trƣờng lên men sẽ
sản xuất ở quy mô công nghiệp.
Tạo đủ lƣợng giống để sản xuất ở quy mô công nghiệp.
Tế bào sinh dƣỡng và bào tử là 2 dạng giống thƣờng đƣợc dùng để tăng số lƣợng
tế bào vi sinh vật. Trƣờng hợp ở đây giống là bào tử.


Cách tiến hành:

Sau khi việc làm nguội kết thúc, từ mơi trƣờng sản xuất trích ra 10% chuyển qua
phòng nhân giống để nhân giống sản xuất. Q trình nhân giống đƣợc thực hiện trong
phịng nhân giống.

Nấm mốc đƣợc nhân giống và nuôi cấy ở mô trƣờng vô trùng để tránh nhiễm tạp.
Tỉ lệ nhân giống khoảng 0,2-2%.
Giống Aspergillus niger trong ống nghiệm đƣợc giữ ở trạng thái hoạt động bằng
cách cấy chuyền trong các môi trƣờng thạch Czapek với tần suất mỗi tháng một lần.
Bảng 2.1. Thành phần môi trƣờng Czapek
Saccharose

30g

NaNO3

3g

K2HO4

1g

MgSO4

0,5g

KCl

0,5g

FeSO4

0,1g

Nƣớc

1000mL

pH

4-5

Và 10mL dịch tự phân nấm men.
2.2.3. Gieo giống

Mục đích:
Giống đƣợc phân bố đều trên môi trƣờng để tạo điều kiện thuận lợi cho giống phát
triển.


Cách thực hiện:

Sau khi làm nguội môi trƣờng đến 28-32ᵒC thì tiến hành gieo giống với tỉ lệ là
16,5% w/v.
2.2.4. Ni cấy giống


Mục đích:

Thu nhận enzyme pectin methylesterase (PME).


Cách thực hiện:

Sau khi gieo giống, canh trƣờng nấm mốc đƣợc chuyển qua cân định lƣợng và đƣa
vào bình lên men có cánh khuấy và sục khí liên tục (Đặng Thị Thu và cộng sự, 2004).


Giống Aspergillus niger đƣợc ni cấy trong phịng thí nghiệm với độ ẩm từ 5060%, nhiệt độ thích hợp là 28-32ᵒC và thời gian là 88h (Nguyễn Thị Lý Hằng, 2010).


Cơ sở lý thuyết:

Q trình ni cấy Aspergillus niger để thu nhận PME có có nhiều phƣơng pháp
lên men khác nhau: lên men bề mặt trên môi trƣờng rắn (SSF) hoặc lỏng (SmF) và lên
men chìm trên mơi trƣờng lỏng. Ở đây, nhóm chọn lên men trong mơi trƣờng lỏng.
2.2.5. Lọc khung bản


Mục đích:

Để thu nhận dung dịch enyme nội bào, enzyme ngoại bào hòa tan và tách thành
phần rắn ra khỏi dung dịch.


Cách thực hiện:

Việc thu hồi sản phẩm với hiệu suất cao có ý nghĩa quyết định đối với tính kinh tế
của quy trình cơng nghệ. Vì vậy việc tách, thu hồi sản phẩm phải đƣợc tính tốn ngay từ
khi chọn giống chủng vi sinh vật để lên men, chọn nguyên liệu cũng nhƣ môi trƣờng nuôi
dƣỡng. Khi quá trình lên men kết thúc, ngƣời ta tiến hành thu hồi sản phẩm. Các sản
phẩm của quá trình tổng hợp vi sinh vật thƣờng đƣợc tích lũy hoặc ở trong tế bào hoặc ở
trong dung dịch nuôi cấy. Việc xử lý tiếp theo phụ thuộc vào mục tiêu của cơng nghệ, tùy

theo mục đích mà có các phƣơng pháp thu nhận khác nhau. Ngày nay, lọc là phƣơng
pháp phổ biến nhất đƣợc sử dụng trong việc tách sinh khối vi sinh vật.
Phƣơng pháp lọc là phƣơng pháp phân riêng hỗn hợp không đồng nhất qua lớp
lọc, bã đƣợc giữ lại, dung dịch đi qua lọc, trong phƣơng pháp lọc có thể có hoặc khơng sử
dụng các chất trợ lọc.
Thiết bị lọc thƣờng là máy lọc khung bản, là thiết bị làm việc theo nguyên tắc nén
áp suất. Thiết bị lọc gồm 2 phần chính, phần thứ nhất là bộ phận lọc và phần thứ 2 là bộ
phận bơm để hút và nén dung dịch lọc qua vật liệu lọc.
Phần thứ nhất của thiết bị lọc bao gồm các khung và các tấm lọc (tấm vải lọc
khung bản) đƣợc ép lại với nhau nhờ một đĩa quay bằng tay. Số tấm lọc sử dụng tối đa có
thể đến 50-100 tấm. Tấm vải lọc khung bản hay còn gọi là vải lọc khung bản này đƣợc


làm bằng vật liệu polypropylene (PP), có độ bền, khả năng chịu trong mơi trƣờng hóa
chất cao.
Phần thứ hai là bộ phận hút và nén dung dịch lọc gồm bơm nén áp suất cao và hai
thùng chứa bằng thép không rỉ. Mỗi thùng có dung tích 200 lít, có chỉ thị mức dung dịch
trong thùng. Một thùng đựng dung dịch đục (hỗn hợp lọc), một thùng đựng dịch lọc
(Filtrat). Ngoài ra, cịn có thùng thứ 3 cũng đƣợc nối với máy dùng để chứa hỗn hợp nƣớc
và diatomit, chất này nhằm phủ lên màng lọc một lớp màng cho chất lỏng đi qua đƣợc dễ
dàng.

Hình 2. 1. Thiết bị lọc khung bản


Nguyên lý hoạt động:



Đây là thiết bị lọc áp lực làm việc gián đoạn nghĩa là nhập liệu vào liêu tục,

nƣớc lọc tháo ra liên tục nhƣng bã đƣợc tháo ra chu kì.


Nó đƣợc cấu tạo chủ yếu là khung và bản. Khung giữ vai trò chứa bã lọc và

là nơi nhập huyền phù vào. Bản tạo ra bề mặt lọc với các rãnh dẫn nƣớc lọc hoặc là các lỗ
lọc. Khung và bản thƣờng đƣợc chế tạo dạng hình vng và phải có sự bịt kín tốt khi
ghép khung và bản. Khung và bản đƣợc xếp liên tiếp nhau trên giá đỡ. Giữa khung và
bản là vách ngăn lọc. Ép chặt khung và bản nhờ cơ cấu đai vít xoắn nhờ tay quay. Lỗ dẫn
huyền phù nhập liệu của khung và bản đƣợc nối liền tạo thành ống dẫn nhô ra để ghép


với hệ thống cấp liệu. Nƣớc lọc chảy ra từ bản qua hệ thống đƣờng ống và lấy ra ngoài.
Bã đƣợc giữ lại trên bề mặt vách ngăn lọc và đƣợc chứa trong khung. Khi bã trong khung
đầy thì dừng quá trình lọc để tiến hành rửa và tháo bã.Trong quá trình lọc, chất rắn trong
huyền phù đƣợc giữ lại nhờ một lớp vật liệu lọc (giấy lọc hoặc màng bán thấm). Độ dày
của lớp chất rắn này tăng theo thời gian và tạo thành một lớp bánh học có tác dụng nhƣ
một màng lọc mới làm tăng chất lƣợng của quá trình lọc. Độ lọc hiệu dụng phụ thƣợc vào
kích cỡ của hạt rắn và chiều cao của lớp bã lọc, lớp bã lọc này kết tụ lại tạo thành các lỗ
rất nhỏ trên vật liệu lọc thì chất lƣợng lọc mới tốt đƣợc, nhƣng lớp bã lọc này cũng tạo ra
một sự cản trở của dòng chảy khi lọc, độ cản trở tăng theo độ dày của lớp bã lọc.


Màng lọc hoạt động trên cơ chế chuyển động của các phần tử nƣớc nhờ lực

nén của máy bơm tạo ra một dịng chảy mạnh.
Có thể dùng các vật liệu lọc khác nhau, tùy theo kích thƣớc của các tiểu phân chất
rắn trong dung dịch, tùy theo tính chất, lƣợng dung dịch cần lọc và độ trong muốn có. Vải
lọc khung bảng thƣờng đƣợc sử dụng trong công nghiệp với chất lƣợng chủ yếu là vải

Polypropylen (PP), Polyester (PE). Vải lọc với chất liệu PE (Polyester) với kích thƣớc lỗ
lọc 0,5µm-800µm, chịu nhiệt từ 120-150ᵒC, khả năng chống thủy phân, acid và kiềm tốt,
đặc tính cơ học cao đã đƣợc lựa chọn để sử dụng làm vật liệu lọc cho thiết bị lọc khung
bản. Cách tiến hành: canh trƣờng sau khi lên men đƣợc bơm vào thiết bị lọc để loại bỏ
sinh khối thu dịch lọc.
2.2.6. Kết tủa enzyme


Mục đích:

Thu nhận kết tủa protein trong dịch enzyme thơ.


Cách thực hiện:



Trong khi tiến hành kết tủa, ta phải làm lạnh cả dung dịch enzyme thô và cả

những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính enzyme.


Khi đổ chất làm kết tủa enzyme vào dung dịch enzyme thô phải hết sức từ

từ để tránh hiện tƣợng biến tính.




Trong quá trình kết tủa ngƣời ta dùng cồn hoặc sunfat amon với liều lƣợng

nhƣ sau: Cứ một phần dung dịch enzyme thô, ta cho 2 đến 2,5 lần cồn hoặc sulfat amon.
Khi cho chất kết tủa vào dung dịch enzyme thơ, tiến hành khuấy nhẹ sau đó để n trong
điều kiện nhiệt độ lạnh (thƣờng là 4-7ᵒC) ,theo thời gian các enzyme sẽ đƣợc tạo kết tủa
và lắng xuống đáy, tiến hành gạn và lọc thu nhận kết tủa dạng paste (độ ẩm lớn hơn
70%W), ở trạng thái này enzyme rất dễ bị biến tính vì cịn nhiều nƣớc.


Để dễ bảo quản ngƣời ta sấy kết tủa enzyme PME cho đến khi độ ẩm cuối

cùng đạt W = 5-8%.


Cơ sở lý thuyết:



Kết tủa bằng muối là một trong các cách thức phổ biến nhất để tách protein.

Khả năng hòa tan của protein tùy thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính lý hóa tự nhiên của
protein, pH, nhiệt độ, nồng độ của muối…


Hiệu quả tủa protein của các anion muối khác nhau thì khác nhau, có thể

xếp theo thứ tự giảm dần nhƣ sau:
Citrate > phosphate > sulphate > acetate/chloride > nitrate > thiocyanate.


Đối với các cation muối hiệu quả kết tủa tăng dần theo thứ tự: Na+ < K+ <

NH4+…


Trong công nghệ tinh chế enzyme, ngƣời ta thƣờng dùng ethanol (cồn) và

sunfat amon (NH4)2SO4. Hai tác nhân kết tủa này dễ tìm kiếm và giá rẻ so với những tác
nhân gây kết tủa khác.


Trong nhiều trƣờng hợp chế phẩm enzyme PME ở dạng kết tủa vẫn hoàn

toàn chƣa sạch về mặt hóa học vì trong đó cịn chứa một số enzyme ta quan tâm.
2.2.7. Ly tâm


Mục đích:

Loại bỏ dịch tạp chất, thu tủa enzyme có hoạt tính cao.


Cách thực hiện:

Ly tâm là phƣơng pháp tách các phân tử có khối lƣợng riêng (ρ) khác nhau,
thƣờng tách các pha rắn ra khỏi pha lỏng khi nồng độ pha rắn lớn nhờ lực ly tâm. Vật liệu


đƣa vào q trình là một hỗn hợp khơng đồng nhất.Trong công nghiệp chủ yếu là hỗn
hợp rắn-lỏng, hoặc lỏng-lỏng có khối lƣợng riêng khác nhau. Vật liệu đƣa vào ly tâm
phải dễ phân ly, có khả năng tách khỏi nhau, tính keo và độ nhớt của dung dịch khơng

q lớn, pha rắn ở dạng to và chắc. Sản phẩm sau q trình là chất rắn có độ tinh khiết
cao nhƣng cịn ẩm. Các chất lỏng có khối lƣợng riêng khác nhau.
Sau quá trình ly tâm hỗn hợp đƣợc tách biệt chủ yếu là thay đổi trạng thái, khơng
có biến đổi hóa học, hóa lý, hóa sinh đáng kể. Tuy nhiên chất lƣợng của sản phẩm đƣợc
tăng lên tách đƣợc các tạp chất hịa tan khơng phải dạng tinh thể, đặc biệt là các chất
màu, nên sau khi ly tâm sản phẩm sẽ sạch hơn, chất lƣợng đƣợc nâng cao.
Trong công nghiệp, phƣơng pháp ly tâm liên tục thƣờng đƣợc ứng dụng khá rộng
rãi, có những ƣu điểm là thời gian thu nhận sản phẩm nhanh, liên tục và không gây ảnh
hƣởng đến hoạt tính của enzyme. Phƣơng pháp ly tâm liên tục để thu nhận dung dịch này
chứa các enzyme ngoại bào, còn enzyme nội bào nằm trong tế bào sinh vật muốn thu
nhận ta phải tiến hành một giai đoạn phá vỡ tế bào.
Khi aspartic proteinase đƣợc sản xuất bằng phƣơng pháp lên men chìm, ngƣời ta
thƣờng tách sợi nấm (sinh khối) bằng cách thực hiện phƣơng pháp ly tâm. Enzyme dễ bị
mất hoạt tính ở nhiệt độ quá cao, quá trình ly tâm sẽ sinh ra nhiệt dễ gây biến tính
enzyme. Để đảm bảo hoạt tính cho chymosin nên thực hiện ly tâm lạnh ở nhiệt độ thấp (<
5ᵒC).
Trong công nghiệp thiết bị ly tâm thƣờng đƣợc sử dụng là máy ly tâm dạng ống và
máy ly tâm dạng đĩa:


Ly tâm dạng ống: có số vịng quay lớn mặc dù đƣờng kính roto nhỏ, hoạt

động theo chu kỳ, cần phải tháo lắp thƣờng xuyên, tháo chất lắng và rửa roto bằng
phƣơng pháp thủ công, truyền động bằng dây đai.


Ly tâm dạng đĩa: mức độ phân ly cao, thể tích roto lớn, có thể làm việc gián

đoạn hoặc liên tục, có khả năng tự tháo lắng, dùng để phân ly huyền phù có hàm lƣợng
pha rắn nhỏ hoặc phân ly nhũ tƣơng khó phân ly.

Dựa vào tính chất cũng nhƣ các đặc tính của thiết bị ly tâm dùng để phân tách vi
sinh vật và qua quá trình tính tốn chi tiết kỹ thuật. Để đạt đƣợc cơng suất 200 tấn/ năm,


nhóm chúng tơi đã chọn thiết bị ly tâm loại đĩa. Vì máy ly tâm dạng đĩa có mức độ phân
ly cao, phù hợp với kích thƣớc Pichia, việc tháo rửa cũng đơn giản hơn, nhƣng nếu dùng
máy ly tâm dạng ống thì khá tốn nhiều thời gian cho việc tháo lắp, rửa liên tục. Cấu tạo
thiết bị ly tâm dạng đĩa gồm có thùng quay, bên trong có gắn hình nón cụt. Dịng chất
lỏng đi vào đi qua đƣờng ống xuống phần dƣới của thùng rồi qua lỗ ở các đĩa phân thành
lớp mỏng. Chất rắn (protein tủa) trong chất lỏng theo lực ly tâm sẽ lắng xuống đáy đĩa và
đƣợc đƣa ra ngồi để thực hiện q trình sau, phần chất lỏng phía trên đƣợc tháo bỏ ra
ngồi theo ống dẫn.
2.2.8. Sấy phun


Mục đích:

Làm giảm khối lƣợng vật liệu, tăng độ bền và bảo quản sản phẩm đƣợc lâu hơn.


Cách thực hiện:

Sau khi kết thúc quá trình ly tâm, hòa trộn cặn lắng thu đƣợc với 12%
maltodextrin, sau đó chuyển hỗn hợp này vào thiết bị sấy phun liên tục và thực hiện quá
trình sấy ở 160ᵒC là nhiệt độ đầu vào, nhiệt độ đầu ra là 85ᵒC.


Cơ sở lý thuyết:



Cấu tạo cơ bản:

Tất cả các thiết bị sấy phun đều bao gồm:


Cơ cấu phun: Có chức năng đƣa nguyên liệu (dạng lỏng) vào buồng dƣới

dạng hạt mịn (sƣơng mù). Quá trình tạo sƣơng mù sẽ quyết định kích thƣớc các giọt lỏng
và sự phân bố của chúng trong buồng sấy, do đó sẽ ảnh hƣởng đến giá trị bề mặt truyền
nhiệt và tốc độ sấy. Cơ cấu phun có các dạng nhƣ: cơ cấu phun áp lực, cơ cấu phun bằng
khí động, đầu phun ly tâm.


a. Cơ cấu phun áp lực

b. Cơ cấu phun bằng khí động

Hình 2.2. Thiết bị sấy phun


Buồng sấy: Là nơi hòa trộn mẫu sấy (dạng sƣơng mù) và tác nhân sấy

(khơng khí nóng).


Tác nhân sấy: Khơng khí nóng là tác nhân sấy thông dụng nhất. Hơi là tác

nhân gia nhiệt phổ biến nhất. Nhiệt độ hơi sử dụng thƣờng dao động trong khoảng 150250ᵒC . Nhiệt độ trung bình của khơng khí nóng thu đƣợc thấp hơn nhiệt độ hơi sử dụng
là 10ᵒC.



Hệ thống thu hồi sản phẩm: Bột sau khi sấy phun đƣợc thu hồi tại cửa đáy

buồng sấy. Để tách sản phẩm ra khỏi khí thốt, ngƣời ta có thể sử dụng nhiều phƣơng
pháp khác nhau: lắng xốy tâm, lọc, lắng tĩnh điện… Phổ biến nhất là phƣơng pháp lắng
xoáy tâm, sử dụng cyclon.


Quạt: Để tăng lƣu lƣợng tác nhân sấy, ta sử dụng quạt ly tâm. Ở quy mô

công nghiệp, các hệ thống sấy phun đƣợc trang bị hai quạt. Quạt chính đƣợc đặt sau thiết
bị thu hồi bột sản phẩm. Còn quạt phụ đặt trƣớc thiết bị gia nhiệt khơng khí trƣớc khi vào
buồng sấy. Ƣu điểm của hệ thống hai quạt là ta có thể kiểm sốt dễ dàng áp lực trong
buồng sấy.

Hình 2. 3. Sơ đồ hệ thống sấy phun


Nguyên lý hoạt động:

Một hệ phân tán mịn của nguyên liệu từ chất lỏng hòa tan, nhũ tƣơng, huyền phù
đã đƣợc cô đặc trƣớc (40-60% ẩm) đƣợc phun để hình thành những giọt mịn, rơi vào


trong dịng khí nóng cùng chiều hoặc ngƣợc chiều ở nhiệt độ khoảng 150-300ᵒC trong
buồng sấy lớn. Kết quả là hơi nƣớc đƣợc bốc đi nhanh chóng. Các hạt sản phẩm đƣợc
tách ra khỏi tác nhân sấy nhờ một hệ thống thu hồi riêng.
2.2.9. Bao gói
Sau khi thu đƣợc chế phẩm enzyme dạng bột, ta đem đi đóng gói bằng thiết bị bao

gói tự động khối lƣợng định sẵn thu nhận thành phẩm enzyme kỹ thuật.


C ƢƠNG 3 TÍN

TỐN CÂN ẰNG VẬT CHẤT

 Tính tốn cân bằng vật chất cho từn

đoạn

Bảng 3.1. Tỉ lệ hao hụt trong từng cơng đoạn

3.1.

Hiệu suất q

Q trình

Tỉ lệ tổn thất

Lên men

2%

80%

Lọc

2%

85%

Kết tủa

2%

62,23%

Ly tâm

1,8%

85%

Sấy

2%

Bao gói

0,5%

trình

Tài liệu tham khảo
Keshavarz và
Khalesi, 2016
Lê Văn Hoàng, 2004
Trần Thanh Trúc,

2013
Phạm Thị Thúy An
và cộng sự, 2015
Murray Moo-Young
và cộng sự, 1986

Kế hoạch sản xuất
Giả sử thời gian làm việc một năm là 330 ngày
Thời gian nghỉ là tnghỉ= 12h
Theo (Tran và Nguyen,2010), thời gian lên men một mẻ cố định là tMẻ = 96 giờ
Vậy số mẻ lên men trong 1 năm
Số mẻ =

= 73,3 (mẻ)

Vậy khối lƣợng sinh khối thu đƣợc theo mẻ (năng suất) là:
mPME
3.2.

=

= 2,739 (tấn/mẻ)

Bao gói
Giả sử tỷ lệ tổn thất 0,5 %
Lƣợng sản phẩm trƣớc bao gói là
mTrƣớc bao gói =

= 2,753 (tấn/mẻ)

3.3.

Quá trình sấy
Lƣợng sản phẩm sau sấy : mSau sấy = mTrƣớc bao gói = 2,753 (tấn/mẻ)
Theo (Tran và Nguyen,2010), Độ ẩm trƣớc sấy W1 = 60% và độ ẩm sau sấy W2 =

4% và quá trình sấy phun bổ sung 12% mantodextrin
Ta có : mTrƣớc sấy = mSau sấy + W
W=

mTrƣớc sấy (Sổ tay quá trình và thiết bị cơng nghệ hóa chất tập 2,

Nguyễn Bin và cộng sự,2006)
=

2,753-W)

Lƣợng ẩm bay hơi là:

W= 3,854 (tấn/mẻ)

Vì trong quá trình sấy có bổ sung 12% mantodextrin nên:
mMantodextrin = mTrƣớc sấy x 12% = 6,607 x 12% = 0,79284 (tấn/mẻ)
Giả sử tỷ lệ tổn thất là 2% và hiệu suất quá trình 90%
Ta có: mTrƣớc sấy = mSau sấy + W+ mMantodextrin (Nguyễn Bin và cộng sự,2006)
= (2,753+ 3,854+0,89) x

x

= 8,5 (tấn/mẻ)

Vậy lƣợng sản phẩm trƣớc sấy là: mTrƣớc sấy = 8,5 (tấn/mẻ)
3.3.

Ly tâm
Giả sử tỷ lệ tổn thất của quá trình là 1.8% và hiệu suất quá trình đạt 85%
Lƣợng sản phẩm trƣớc quá trình ly tâm:
=
= 8500

= 10183,299 (kg/mẻ)

Sau quá trình kết tủa ta thu đƣợc 10183,299 kg emzyme trong đó có cịn khối
lƣợng muối bổ sung vào là

=

(kg)

Khối lƣợng riêng của enzyme PME là: 1,05 kg/l => thể tích của emzyme là:

Ta có khối lƣợng riêng của muối
kết tủa là:

là 1,77 g/

, thể tích của muối đã

Tổng thể tích trong q trình ly tâm là:

Tổng khối lƣợng trong q trình ly tâm:

Ta có:

(tấn/mẻ)
(tấn/mẻ)



3.4.

(tấn/mẻ)

Kết tủa
Giả sử tỷ lệ tổn thất của quá trình là 2% và hiệu suất quá trình đạt 62,23%
Lƣợng sản phẩm trƣớc quá trình kết tủa:

= 10183,299

= 16697,929 (kg/mẻ)

Giả sử sau quá trình lọc khung bản, tồn bộ dung dịch đƣợc đem đi trích ly để
tránh làm mất hoạt tính của enzyme. Sau đó thực hiện q trình kết tủa có bổ sung thêm
muối để thu nhận enzyme, tỷ lệ bổ sung muối là

: PME thô từ 55 : 65 (w/v)

[Trần Thanh Trúc, 2013]

Khối lƣợng riêng của enzyme: 1,05 kg/l, thể tích của emzyne là:

Vậy khối lƣợng muối cần sử dụng là:

Với hiệu suất của quá trình kết tủa là 62,23% trong

kg muối thì có

62,23% lƣợng muối kết tủa với enzyme. Vậy lƣợng muối đã kết tủa với enzyme là:


13456,207 62,23% = 8373,798 (kg)
3.5.

Lọ
Tỷ lệ tổn thất 2% và hiệu suất quá trình đạt H = 85%
Lƣợng sản phẩm sau khi lọc:
mSloc = mTKT
(kg/mẻ)
Lƣợng sản phẩm trƣớc khi lọc:
PTLoc = PSLoc
(kg/mẻ)
Khối lƣợng riêng của enzyme ρ = 1,05 kg/l
Thể tích enzyme đem đi lọc:
VTLoc = VSLM =

3.6.

= 22918,34 (L)

Lên men
Tỉ lệ tổn thất là 2%, hiệu suất quá trình H% = 80%.
Khối lƣợng môi trƣờng sau lên men: MSLM = PTLoc =

(kg/mẻ)

Khối lƣợng mơi trƣờng trƣớc lên men:
MTLM =

×

= 30694,21 (kg/mẻ)

Giả sử hoạt lực enyme trƣớc lên men bằng hoạt lực sau sấy là 5U/mg
Tổng hoạt độ enzyme thu đƣợc trƣớc quá trình lên men của 1 mẻ:
5000

1000 =

(U)

Nhƣ vậy để thu đƣợc năng suất đặt ra là 200 tấn/năm thì ta phải xây dựng quy
trình sản xuất với năng suất enzyme của quá trình lên men là 30694,21 (kg/năm) với tổng
hoạt lực enzyme thu đƣợc là

(U).

Hoạt lực enzyme PME sau khi kết thúc quá trình lên men là 103,33 U/mL (Naveen
Kumar Arora và cộng sự, 2020).
Với tổng hoạt lực enzyme thu đƣợc là

tích là:

(U) thì ta cần lên men với thể


VMôi trƣờng =

= 1161,33 (m3)

 VLàm việc = VMôi trƣờng + VGiống = 1161,33 +

VMôi trƣờng = 1184,56 (m3)

Nồng độ sinh khối trong canh trƣờng nuôi Aspergillus niger là X = 14,9 g/L
(Nguyễn Thị Phƣơng Mai, 2012)
1g sinh khối sẽ tạo ra

= 6934,90 (UI/ g sinh khối)

Khối lƣợng sinh khối cần để sinh ra đƣợc

U trong quá trình lên men

là
MSinh khối =

= 17303,78 (kg)


C ƢƠNG 4 TÍN

4.1.

T n tốn t ết

TỐN T

ẾT

l nm n

Với tỉ lệ hao hụt trong các quá trình tinh sạch nhƣ trên thì để đạt năng suất 200
tấn/năm thì ta cần thiết kế bể lên men để thu đƣợc năng suất 30694,21 kg/mẻ và tổng hoạt
lực enzyme thu đƣợc là

UI.

Nồng độ sinh khối trong canh trƣờng nuôi Aspergillus niger là X = 14,9 g/L
(Nguyễn Thị Mai Phƣơng, 2012)
Hoạt lực enzyme PME sau khi kết thúc quá trình lên men là 103,33 U/mL (Naveen
Kumar Arora và cộng sự, 2020).
Hệ số chứa đầy của bể lên men là 70% (Lê Văn Hoàng, 2004).
1g sinh khối sẽ tạo ra

= 6934,90 (UI/ g sinh khối)

1 L canh trƣờng sẽ có = 103,33 x 1000 = 103330 (UI)
Với tổng hoạt lực enzyme thu đƣợc là

UI thì thể tích bể lên men:
(m3)

V bể =

Khối lƣợng sinh khối sinh ra đƣợc 7.1 x 1011UI trong 1 mẻ lên men:
m sinh khối =

(kg)

Tỉ lệ cấy giống là 1% (w/v) cho bể nhân giống ban đầu và lấy dịch nhân giống cấy
vào bể lên men với tỉ lệ 10% (v/v).
Thể tích bể nhân giống 1% (v/v):
(m3)

V giống =

Lựa chọn bể lên men dạng thân hình trụ bằng thép khơng gỉ, đáy lồi. bên trong
gồm các cảm biến, có đầu dị các thơng số điều kiện ni cấy, 2 cánh khuấy dạng mái
chèo và ống sục khí.
Với thể tích bể lên men là

m3, với thể tích này khó có thể thiết kế và xây

dựng nên ta sẽ chia ra thành nhiều bể hoạt động cùng lúc.
Một bể có thể tích 120 m3 phù hợp với quy mơ cơng nghiệp và thích hợp với các
thiết kế về tốc độ cánh khuấy (Lê Văn Hoàng, 2004).


Số bể lên men hoạt động là:
Số tank =

9,68

(bể)

4.1.1. Tính tốn thiết kế 1 bể lên men
Tổng thể tích 1 bể lên men:
171 (m3)
Chọn tỉ lệ chiều cao (HT) và đƣờng kính (DT) là 2:1 (Nguyễn Hồng Lộc, 2006).
HT = 2DT
Thể tích bể hình trụ trịn:
=

=


DT = 5 (m)



HT = 10 (m)

(m3)

Vậy đƣờng kính của 1 bể lên men cần xây dựng là 5 (m) và chiều cao của bể là 10
(m).
Với thể tích nhân giống là

m3, chon thiết bị nhân giống thể tích

2000L/2340L (CCT-SLP-2000 là bể lên men hình nón áp suất thấp áp suất thấp với thể

tích sử dụng đƣợc là 2000 lít và tổng khối lƣợng 2340 lít cho Lên men và trƣởng thành
bia, rƣợu táo, rƣợu và các loại đồ uống khác)
Số tank nhân giống với thể tích 4.06 m3 là :
Số tank =

(bể)

Thiết bị nhân giống: />4.1.2. Thiết kế cánh khuấy
Giả sử tỉ lệ đƣờng kính cánh khuấy (Dck) và đƣờng kính bể (DT) là 0.3 (Dck =
0.3DT) (Nguyễn Hồng Lộc, 2006).
Đƣờng kính cánh khuấy:
Dck = 0.3 x DT = 0.3 x 5 = 1.5 (m)