Tách chiết và phân lập các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học

NGUYỄN VÃN CƯỜNG (Chủ biên)

NGUYỄN NGỌC TUẤN - PHẠM THỊ HỐNG PHƯỢNG

LÊ TIẾN DŨNG - VŨ ĐÌNH HỒNG - TRẨN ĐÌNH THẮNG

TÁCH CHIẾT VÀ PHÂN LẬP
CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN có
HOẠT TÍNH SINH HỌC
■

1

343

■ NHÀ XT BÀN ĐẠIH(?c CGNG nghiẹp

XJH

THÀNH PHỊ HỊ CHÍ MINH


NGUYỆN VÃN CƯỜNG (chủ biên)
NGUYỄN NGỌC TUẤN - LÊ TĨÉN DŨNG - PHẠM THỊ HĨNG
PHƯỢNG - VŨ ĐÌNH HỒNG - TRÀN ĐÌNH THẢNG

TÁCH CHIẾT VÀ PHÂN LẬP CÁC
HỢP CHÁT THIÊN NHIÊN CĨ
HOẠT TÍNH SINH HỌC

•G ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP TP.HCM

/HƯVÌẸN
8 MA VẠCH:...................

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP
THÀNH PHỔ HỊ CHÍ MINH


Lời nói đâu
Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ các
ngn khác nhau, chăng hạn như thực vật, năm, địa y, vi sinh vật,
sinh vật hiên,... đã trở thành một phân không thê thiêu của y học
ngày nay. Chủng đã được sử dụng rộng rãi như một nguồn thuốc từ
thời cô đại dưới nhiêu hĩnh thức khác nhau trong y học cô truyên.

Ngày nay, trong y học chúng ta cũng đang sử dụng các sản phẩm từ
thiên nhiên hoặc các họp chất hoạt tính sinh học có nguồn gốc thiển
đê bảo vệ sức khỏe. Một so họp chất có hoạt tính sình học từ thiên
nhiên bao gồm alkaloid, glycoside, polyphenol, saponin, tannin,
terpenoit và tinh dầu. Đáng chủ ỷ, các họp chất thiên nhiên cải thiện
sức khỏe của con người mà không gãy tác dụng phụ bát lợi so với
các loại thuốc tơng họp. Ngồi ra, chúng tương đối rẻ hơn và dê
dàng có sẵn.
Các họp chất thiên nhiên thê hiện tính đa dạng với các cấu trúc phân
tử đặc biệt và có thê đuợc sử dụng như chất dân đường trong tông
họp và bán tơng họp thuốc đê tăng hoạt tính sinh học. Các họp chât
thiên nhiên có hoạt tính sinh học được chiết xuất bang cách sử dụng
các kỹ thuật chiết xuất khác nhau. Có hai phương pháp chiết xt
chính đuợc sử dụng cho các họp chat có hoạt tính sinh học: phương
pháp cơ điên và phương pháp lĩìện đại. Các phương pháp cô điên

bao gồm chiết soxhlet, ngâm dầm, ngâm chiết, tham, hâm, săc, háp
và chưng cất lôi cuốn hơi nước. Các phương pháp hiện đại hay còn
là phương pháp xanh như: chiết xuất bằng sóng siêu ám, enzym, vi
sóng và diện trường, chiết chất lỏng có áp suất và chiết chất lỏng
siêu tới hạn.

Nhìn chung, các họp chât thiên nhiên có hoạt tính sinh học biêu hiện
hiệu quả khác nhau trong việc điều trị các vấn để sức khỏe con
người. Các họp chất hoạt tính sinh học này thế hiện các hoạt động
dược lý phong phú, bao gồm các đặc tỉnh kháng khuân, hoạt động
chổng viêm, hoạt động kích thích miễn dịch, hoạt động chơng ung
thư, hoạt động chổng oxy hóa,... Hoạt tính sinh học của hợp chât từ
thiên nhiên được xác định bằng cách sử dụng thử nghiệm in vitro và
in vivo. Tuy nhiên, thuốc có nguồn gốc từ' thiên nhiên phải vượt qua

3


các thư nghiệm lãm sàng đê được đưa vào sử dụng. Từ năm 1981
đen nam 2019, có 1881 họp chất từ thiên nhiên hoặc bán tông họp
được sử dụng như thuốc chữa các bệnh: ưng thư (247), tiêu đường
(63), tác nhân da xơ cứng (13), tăng nhãn áp (19), chống viêm (53),
chong ký sinh trùng (20), kháng vi rút (186), kháng nam (34), khảng
khuân (162)...
Nham đáp ứng nhu cầu giáng dạy, học tập cho sinh viên đại học và
sau đại học ngành Cơng nghệ Kỹ thuật Hóa học - Trường đại học
Cơng nghiệp TP Hơ Chi Minh, nhóm tác giả đã biên soạn giáo trình
này làm tài liệu học tập đông thời cũng là tài liệu tham khảo cho các
nha nghiên cứu, sinh viên đại học và sau đại học nghiên cứu hóa học
và dược lý học cua các họp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học.

Nội dung giáo trĩnh bao gồm: 7 chương.
Chương 1: Mơ đầu;
Chương 2: Kỹ thuật chiết tách các họp chất thiển nhiên có hoạt
tính sinh học;

Chương 3: Các kỹ thuật phân lập các họp chất thiển nhiên cổ hoạt
tính sinh học;
Chương 4: Phân lập các họp chất thiên nhiên có nguồn gơc từ
thực vật;
Chương 5: Phân lập các họp chất thiên nhiên có nguồn gốc từ
sinh vật biên;

Chương 6: Phân lập các họp chất thiên nhiên có nguồn gốc từ vi
sinh vật;

Chương 7: Phân lập các họp chát thiên nhiên có ngn góc từ nám.
Trong q trình biên soạn giáo trình khó tránh khỏi thiếu sót, nhóm
tác giả rất mong nhận được ý kiến đóng góp xây dựng của quỷ độc
giả đế giáo trĩnh được hoàn chỉnh hơn trong các lần tái bản sau.

Thư góp ý xin gửi về địa chì email:

Thay mặt nhỏm tác giá
NGUYỄN VĂN CƯỜNG

4


MỤC LỤC
Chương 1. Mỏ’ đầu....................................................................

....13
1.1. Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học............................ 13
1.1.1. Lịch sử phát triển - Khái niệm............................................... 13
1.1.2. Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học từ ngn
dược liệu phong phú của Việt Nam................................ 15
1.2. Tách chiết các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học.......... 17
1.2.1. Mục tiêu của việc tách chiết các hợp chất thiên nhiên.......... 17
1.2.2. Các kỹ thuật tách chiết............................................................. 18
1.3. Phân lập các họp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học.............. 19
1.4. Thử nghiệm hoạt tính sinh học cua các hợp chất thiên nhiên......21
1.4.1. Khái niệm..................................................................................21
1.4.2. Phân loại thử nghiệm hoạt tính sinh học................................23
1.4.3. Một số nguyên tắc cơ bản trong tìm kiếm, sàng lọc các
chât có hoạt tính sinh học................................................ 23
1.4.4. Các xu hướng chính trong nghiên cứu, tìm kiếm các họp
chất mói có hoạt tính sinh học....................................... 25
Tài liệu tham khảo....................................................................................... 26
Chng 2. Kỹ thuật chiết tách các họp chất thiên nhiên có
hoạt
♦ tính sinh học
• ...............................................27
2.1. Giới thiệu chung..................................................................................27
2.2. Các q trình xảy ra trong chiết tách họp chất thiên nhiên.............. 28
2.3. Xử lý nguyên liệu............................................................................... 29
2.4. Dung môi............................................................................................. 30
2.4.1. Dung môi phân cực và không phân cực................................. 30
2.4.2. Chất tan trong nước và dung môi phân cực........................... 31
2.4.3. Chất tan trong diethyl ether và dung môi không phân cực... 32
2.5. Các kỹ thuật chiết tách truyền thống................................................. 32
2.5.1. Chiết bàng phương pháp ngấm kiệt (Percolation)................. 32

2.5.2. Chiết bằng phương pháp ngâm (Maceration)........................ 32
2.5.3. Chiết bằng phương pháp ngấm kiệt ngược dòng................... 33
2.5.4. Chiết bang phương pháp Soxhlet............................................ 33
2.5.5. Chiết bằng cách đun hồi lưu................................................... 34
2.5.6. Phương pháp chiết lôi cuốn hơi nước..................................... 35
2.6. Các kỹ thuật chiết tách hiện đại........................................................ 35
2.6.1. Chiết bằng phương pháp siêu âm........................................... 35

5


2.6.2. Chiết bằng enzyme (EAE)...................................................... 36
2.6.3. Chiết sử dụng vi sóng..............................................................38
2.6.4. Chiết sử dụng xung điện trường (PEF)...................................39
2.6.5. Chiết lỏng siêu tới hạn (SFE) ................................................. 40
2.6.6. Chiết lỏng điều áp (pressurized liquid extraction)................. 43
2.7. Các yêu tô ảnh hưởng đến q trình chiết xt................................ 44
Tài liệu tham khảo.......................................................................................46
Chng 3. Các kỹ thuật phân lập các họp chất thiên nhiên
có hoạt tính sinh học......................................... 48
3.1. Giới thiệu chung........................
48
3.1.1. Khái niệm về phương pháp sắc ký......................................... 49
3.1.2. Các bước của quá trình sắc ký................................................ 49
3.1.3. Phân loại các phương pháp sắc ký......................................... 50
3.2. Sắc ký lớp mỏng..................................................................................51
3.2.1. Nguyên tắc.............................................................................. 51
3.2.2. Chất hấp phụ dùng trong sắc ký lớp mỏng............................ 52
3.2.3. Dung môi triển khai................................................................ 54
3.2.4. Các kỹ thuật sắc ký lóp mỏng................................................. 58

3.2.5. Các ứng dụng của sắc ký lóp mỏng........................................ 59
3.3. Sắc ký cột............................................................................................ 59
3.3.1. Nguyên tắc............................................................................... 60
3.3.2. Kỹ thuật triển khai................................................................... 61
3.3.3. Sắc ký cột nhanh (Flash chromatography)............................ 67
3.3.4. Sắc ký nhanh -cột khô (Dry-column flash
chromatography)...............................................................69
3.4. Sac ký trao đối ion............................................................................. 71
3.4.1. Nguyên tắc cơ bản................................................................... 71
3.4.2. Các tiêu chí lựa chọn các điều kiện IEC.................................72
3.4.3. Các loại nguyên liệu đế làm nhựa trao đổi ion và đặc
tính của nó..................................................................... 75
3.4.4. Sắc ký cột trao đổi ion và các bước thực hiện....................... 77
3.5 Sac ký lọc gel...................................................................................... 85
3.5.1. Giới thiệu về sắc ký lọc gel.................................................... 85
3.5.2. Các loại hạt gel dùng trong sác ký gel.................................... 86
3.5.3. Lựa chọn các điều kiện hoạt động..................................... .....91
3.5.4. Thực hành sắc ký cột lọc gel.................................................. 92
3.5.5. Các ứng dụng của kỹ thuật sắc ký gel.................................... 96
6


3.6. Kỹ thuật ghép nối............................................................................. 104
3.6.1. Giới thiệu............................................................................... 104
3.6.2. Các kỹ thuật kết nối có sẵn................................................... 105
Tài liệu tham khậọ...................................................................................... 118
Chng 4. Phân lập các họp chất thiên nhiên có nguôn gôc
từ thực vật......................................................... 119
4.1. Giới thiệu chung................................................................................ 119
4.2. Thành phần các hợp chất có hoạt tính sinh học có ngn

gốc từ thực vật............................................................................. 120
4.3. Quỵ trình chung chiết tách và phân lập các họp chất thiên
nhiên có nguồn gốc từ thực vật.................................................. 121
4.3.1. Thu mẫu - định danh mẫu thực vật...................................... 121
4.3.2. Các kỹ thuật chiết tách........................................................... 122
4.3.3. Các kỹ thuật phân lập............................................................ 128
4.4. Phân lập một số họp chất có hoạt tính sinh học có nguồn
gốc từ thực vật............................................................................ 129
4.4.1. Alkaloid.................................................................................. 129
4.4.2. Coumarin................................................................................ 130
4.4.3. Flavonoid và isoflavonoid..................................................... 131
4.4.4. Iridoid và secoiridoid............................................................. 133
4.4.5. Saponin................................................................................... 134
4.4.6. Carotenoid............................................................................... 134
4.4.7. Ecdysteroid.................................... ._....................................... 135
4.4.8. Tinh dầu và các hợp chất dễ bay hơi.................................... 137
Tài liệu tham khảo.....................................................................................138
Chuông 5. Phân lập các họp chất thiên nhiên có nguồn gốc
tù’ sinh vật biến................................................. 139
5.1. Giới thiệu chung................................................................................ 139
5.2. Thành phần các hợp chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc
từ sinh vật biển.......................................................................... 141
5.3. Quy trình chung chiết tách và phân lập các họp chất có hoạt
tính sinh học từ sinh vật biển..................................................... 144
5.3.1. Thu mẫu - định danh mẫu sinh vật biển..............................144
5.3.2. Các kỹ thuật chiết tách và phân lập..................................... 146
5.4. Phân lập một số họp chất có hoạt tính sinh học có nguồn
gốc từ sinh vật biển ở Việt Nam................................................152
5.4.1. Phân lập một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ các
loài hải miên (Sponge)...................................................152

7


5.4.2. Phân lập các hợp chất có hoạt tính sinh học từ các
lồi san hơ mem (Soft coral)......................................... 153
5.4.3. Phân lập các hợp chất có hoạt tính sinh học từ các lồi
da gai (Echinodermata)...................................................154
5.4.4. Phân lập các hợp chất có hoạt tính sinh học từ các lồi
vi sinh vật biển (marine microogarnism)................................ 155
Tài liệu tham khảo.....................................................................
156
Cbirong 6. Phân lập các hợp chất thiên nhiên có nguồn gốc
tù’ vi sinh vật................................................... 158
6.1. Giới thiệu về vi sinh vật................................................................... 158
6.2. rách chiêt và phân lập các hợpchất từ vi sinh vật.......................... 159
6.2.1 . Quy trình phân lập penicillin bằng phưong pháp lên
men lỏng.......................................
159
6.2.2 Quy trình phân lập một số hợp chất từ vi sinh vật bang
sắc ký phân bố ngược dòng........................................... 162
6.2.3 Quy trình phân lập một số họp chất từ vi sinh vật băng
sac ký trao đối ion........................................................... 166
6.2.4 Quy trình phân lập một số họp chất từ vi sinh vật bằng
nhựa hấp phụ................................................................ ..167
Tài liệu tham khảo..................................................................................... 173
Chuông 7. Phân lập các 11Ọ’P chất thiên nhiên có nguồn gốc
tù’ nấm............................................................. 175
7.1. Giới thiệu chung................................................................................ 175
7.2. Các ứng dụng từ nấm........................................................................177
7.2.1. Thành phần dinh dưỡng của nấm......................................... 178

7.2.2. ứng dụng của nấm làm thuốc................................................180
7.2.3. Nấm như một hoạt chất kháng khuân................................... 182
7.2.4. Nấm là chất chống khối u...................................................... 182
7.2.5. Kháng viêm............................................................................. 183
7.2.6. Nấm là chất chống oxy hóa...................................................183
7.3. Quy trình chiết tách và phân lập một số họp chất có hoạt
tính sinh học từ nâm.................................................................. 183

8


Danh mục bảng
Bảng 1.1. Lịch sứ phát triển của các hợp chất thiên nhiên................................. 13
Bảng 2.1. Các dung môi thường dùng được sáp xếp tăng dần tương dối
theo chỉ số phân cực........................................................... 30
Bảng 3.1. Các chất hấp phụ dùng trong SKLM (sắp xếp theo Stahl)............... 53
Bảng 3.2. Các loại Silica gel dùng trong SKLM................................................ 54
Bảng 3.3. Các hệ dung môi và thuốc thử trong SKLM các họp chất
thiên nhiên.......................................................................... 54
Bảng 3.4. Hướng dẫn tỷ lệ silica/mẫu phụ thuộc vào khả năng tách trên
bản mỏng [BioMediaViet nam]......................................... 62
Báng 3.5. Một số hỗn họp dung môi thường dùng cho các họp chất phân
cực (dùng cho sác ký cột và sắc ký lóp mỏng)..................66
Báng 3.6. Sự tương quan giữa đường kính cột, lượng mẫu, thê tích
dung mơi............................................................................. 67
Bảng 3.7. Các loại silica gel dùng trong FC........................................................ 68
Bảng 3.8. Áp dụng FC để tách các họp chất thiên nhiên.................................. 69
Bảng 3.9. Các dung dịch dệm thơng dụng........................................................... 74
Bảng 3.10. Các đặc tính tổng qt của các loại nhựa trao đổi ion...................... 76
Bảng 3.11. Một số loại nhựa trao đổi ion thương mại........................................ 76

Bảng 3.12. Nhựa trao đổi anion yếu................................................................... 81
Bảng 3.13. Nhựa trao đổi anion mạnh................................................................ 82
Bảng 3.14. Nhựa trao đối cation yếu.................................................................. 83
Bảng 3.15. Nhựa trao đối Cation mạnh.............................................................. 84
Bảng 3.16. Các loại gel Sephadex và khả năng phân đoạn của gel.................... 89
Bảng 3.17. Các loại gel Bio-Gel và khả năng phân đoạn của gel....................... 90
Bảng 3.18. Thòi gian trương nở ngâm gel Sephadex trong dung mơi.............. 93
Bảng 3.19. Thể tích gel Sephadex trương nở trong các loại dung môi............ 95
Báng 3.20. Một so protein được sử dụng làm chất chuân đê đo trọng
lượng phân tử......................................................................97
Bâng 3.21. Một số loại gel thương mại sử dụng cho sắc ký gel..................... 102
Bảng 3.22. Một số loại gel thương mại của nhà sản xuất Pharmacia............. 103
Bảng 4.1 Bảng thu mẫu thực vật nghiên cứu................................................... 121
Bảng 5.1. Một hợp chất hoạt tính sinh học được phân lập từ vi sinh vật
và thực vật phù du biển................................................... 142
Bảng 5.2. Một hợp chất hoạt tính sinh học được phân lập từ bọt biên.......... 142
Bảng 5.3. Một họp chất hoạt tính sinh học được phân lập từ lồi khác........ 143
Bảng 5.4. Bảng thu mẫu thực vật nghiên cứu.................................................. 145
Bảng 5.5. Một số CO' sở dữ liệu hữu ích cũng như các URL giúp tiến
hành loại trừ lặp lại (dereplication)................................ 149
Bảng 6.1. Thành phần môi trường lên men CO' bản đê lên men sản
xuất penicilin.................................................................. 160

9


Bảng 6.2. Các họp chất thiên nhiên phân lập tù' vi sinh vật sử dụng
phương pháp sắc ký ngược dòng...................................... 165
Bảng 6.3. Các họp chất thiên nhiên phân lập từ vi sinh vật sử dụng
phương pháp trao đổi ion..................................................169

Bảng 6.4. Các họp chất thiên nhiên phân lập từ vi sinh vật sử dụng
phương pháp nhựa hấp phự...............................................170
Bảng 7.1. Các kỹ thuật chiết xuất polysaccharide........................................... 185

10


Danh mục hình
Bộ dụng cụ Soxhlet............................................................................. 33
Chiết bằng cách đun hồi lưu.............................................................. 34
Chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước...................................... 35
Chiết long siêu tới hạn (SFE).............................................................40
Chiết lỏng điều áp............................................................................... 43
Hình ảnh trên bản mỏng TLC điển hình và cách xác định
giá trị Rf............................................................................. 52
Hình 3.2. Lựa chọn giữa dung mơi rửa giải nhanh (trái) và dung môi
làm mất vết tạp chất (phải)............................................... 56
Hình 3.3. So sánh giữa dung mơi phân tách rõ (bên trái) và dung môi
rửa giải nhanh (bên phải) cho sản phẩm mong muốn....... 57
Hình 3.4. Các khả năng có the xảy ra trên bản mỏng TLC................................ 57
Hìqh 3.5. Kỹ thuật sắc ký 2 chiều....................................................................... 58
Hình 3.6. Kỹ thuật SKLM điều chế.................................................................... 59
Hình 3.7. Bộ sắc ký cột [BioMedia Việt Nam].................................................. 60
Hình 3.9. Nhồi cột ướt [BioMedia Việt Nam]................................................... 63
Hình 3.10. Nhồi cột khơ (BioMedia Việt Nam)................................................ 64
Hình 3.11. Bộ sắc ký cột nhanh (BioMedia Việt Nam)......................................70
Hình 3.12. Đường biểu diễn mối liên hệ giữa trọng lượng phân tử của
bộ mẫu chuẩn................................................................................... 98
Hình 3.13. Sử dụng gel Sephardex G-l 5 để loại muối NaCl ra khỏi
hemoglobin.......................................................................99

Hình 3.13. Kỹ thuật kết nối.............................................................................. 104
Hình 3.14. Mồ hình thiết bị GC-MS............................................................... 106
Hình 3.15. So’ đồ hệ thống của thiết bị LC-MS (giao diện ion hố
phun mù electron)......................................................... 1 11
Hình 3.16. Hệ thống LC-NMR điển hình........................................................ 1 13
Hình 3.17. Hệ thống CE-MS điển hình.......................................................... . 1 16
Hình 3.18. Kết nối đa kỹ thuật................... ............................. ....................... . 1 17
Hình 4.1. Quy trình chung phân lập và chiết tách các họp chất từ thực vật... 120
Hình 4.2. Quy trình chung tạo dịch chiết CHCh khơng chứa tannin............ 125
Hình 4.3. Quy trình chung chiết tách saponin thơ từ thực vật....................... 126
Hình 4.4. Quy trình chung chiết tách alkaloid từ thực vật............................. 128
Hình 5.1. Quy trình chung để phân đoạn dịch chiết có nguồn gốc từ
sinh vật biên..................................................................................... 148
Hình 5.2. Sơ đồ chiết tách phân đoạn cải tiến của Kupchan.......................... 150
Hình 6.1. Quá trình phân lập amphotericin B sử dụng phương pháp
trao đơi ion...................................................................... 166
Hình 6.2. Phân lập các ustilagìnoidin thu được tử nấm kí sinh trên
cơn trùng (Metarhizium anisoplìae}.............................. 168
Hình 2.1.
Hình 2.2.
Hình 2.3.
Hình 2.4.
Hình 2.5.
Hình 3.1.

11


Hình 7.1. Cấu trúc hóa học của các sản phẩm thiên nhiên thuộc ngành

Nam đảm có hoạt tính dược lý....................................... 177
Hình 7.2. Một số hợp chất hoạt tính sinh học terpenoid được phân lập
từ nam............................................................................. 178
Hình 7.3. Câu trúc của các ganoderic acid khác nhau và dẫn xuất được
phân lập từ G. Lucidwn.................................................. 181

12


Chương 1
Mỏ’ đầu
1.1. Các họp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học

7.7. 7. Lịch sử phát triển - Khái niệm
Theo dòng chảy của sự phát triển con người, cây cỏ trong tự nhiên đã
được tìm hiểu và sừ dụng đế điều trị bệnh tật. Thời kỳ đầu con người chỉ
biết sử dụng cây cỏ với mục đích bố sung dinh dưỡng. Tuy nhiên, sau khi
phát hiện được các đặc tính chữa bệnh, các cây thuốc này đã được sừ dụng
rộng rãi trong cộng đồng và bắt đầu được thương mại hóa.
Người Ai Cập cổ đại đã chứng minh rau mùi và cây thầu dầu rất có ích
trong việc ứng dụng làm thuốc, mỹ phẩm và bảo quản thông qua hàng nghìn
bài thc. Hơn 2000 cây thuốc, cây dược liệu từ tự nhiên đã được định danh
và miêu tả chi tiết bởi người Do Thái và Trung Quốc... Cho đến nay nhiều
cây thuốc vẫn được sử dụng. Qua tìm hiếu, nghiên cứu các học giá như
Hippocrates, Theophastus, Celsus, Dioscorides... đã mơ tả và đưa ra hàng
nghìn phương pháp chữa bệnh sử dụng cây thuốc tự nhiên. Galen đã đê lại
các tài liệu về hơn 130 loại cây thuốc và dược liệu khác nhau trong thế kỷ
thứ 2 và ngày nay chúng vẫn đang tiếp tục được bổ sung (bảng 1.1).
Bảng 1.1. Lịch sử phát triến của các hợp chất thiên nhiên

Giai đoạn
•

Loại
♦ hình

Mơ tả

3000 năm trước Ayurveda - Hệ thống y Giới thiệu tính chất dược
học Hindu có nguồn liệu của thực vật và các sản
Công nguyên
gốc từ Án Độ).
phẩm từ thiên nhiên khác.
Y học cổ truyền Trung
Quốc
1550 năm trước Ebers Papyrus (một Trình bày một số lượng lớn
Cơng ngun
trong những tài liệu y các loại thuốc thô từ các

13


học cổ xưa nhất thế nguồn tự nhiên (ví dụ: hạt
thầu dầu và kẹo cao su).
giới)

460-377 năm Hippocrates
trước
Công
nguyên

370-287 năm
trước
Công
nguyên

Theophrastus

Mô tả một số lồi thực vật
và động vật có nguồn gốc
dược liệu.

Mơ tả một số thực vật và
động vật có thể là nguồn
dược liệu.

23-79 năm sau Pliny the Elder
công nguyên

Mô tả một số lồi động,
thực vật có nguồn gốc từ
dược liệư.

60-80 năm sau Dioscorides
công nguyên

Tác giả của "De Materia
Medỉca'\ mô tả hon 600
cây thuốc

131-200
sau
nguyên

năm
công

Thế kỷ thứ 15

Galen

Thực hành các loại thảo
dược (Galenicals) và làm
cho chúng phổ biến ở
phương Tây.

Krauterbnch

Trình bày thơng tin và hình
ảnh của các cây thuốc

(thảo dược)

Cách sử dụng cây thuốc của loài người thời xưa đã cho ta thấy lịch sử
phát triển của các hợp chất có hoạt tính sinh học. Tại thời điếm đó, con
người khơng có khái niệm về các hợp chất có hoạt tính sinh học, tuy nhiên
đã biết sử dụng chúng vào nhiều mục đích khác nhau.

Thơng thường, các hợp chất có hoạt tính sinh học trong sinh vật là các
hoạt chất thứ cấp. Trong cơ thế sống, từ các vi khuẩn đơn bào cho tới các

lồi thực vật có hàng triệu tế bào, có chứa nhiều loại hợp chât khác nhau
cần thiết cho sự sống của chúng. Những hợp chất này tham gia vào quá
trình trao đổi chất và giúp cho quá trình đó vận hành một cách trơn tru. Tất
cả các họ-p chất có thê chia ra thành 2 nhóm lớn:

14


- Thứ nhất là các hợp chất sơ cấp. đây là các chất hóa học có nhiệm
vụ cung cấp dưỡng chất cho q trình lớn lẻn và phát triển, ví dụ như
carbohydrate, amino acid, protein và lipid.
- Thứ hai là ờầc hợp chất thứ cấp, đây là nhóm các hợp chất có tác
dụng tăng cường khả năng sinh tồn của sinh vật và giúp sinh vật vượt qua
những trở ngại thơng thường. Nói một cách khác, các họp chất thứ cấp là
những hợp chất được sinh ra sau khi phát triển, khơng có đóng góp gì trong
q trình phát triển (mặc dù chúng có tác dụng trong việc giúp duy trì sinh
tồn). Các hợp chất này được sinh ra với một số lượng hạn chế trong sinh
vật, chúng có cấu trúc khơng phố biến và hình thành bằng việc kết hợp các
nhóm chất có cấu trúc liên quan. Q trình sản sinh các hợp chất thứ cấp
trong các loài sinh vật đa phần trải qua nhiều giai đoạn khác nhau cũng
như bắt nguồn từ nhu cầu, từ chính bản thân lồi đó. Ví dụ: các lồi hoa
tống hợp nên chất thơm để thu hút côn trùng phục vụ cho quá trình thụ
phấn và nở hoa của chúng, đồng thời sản sinh các độc tố đế gây bệnh hay
kích thích các loài thú ăn cỏ nhằm tiêu diệt sự phát triền của loài thực vật
khác. Trong số các họp chất thứ cấp, một số chất có tác dụng lên hệ thống
sinh học nên được gọi là các chất có hoạt tính sinh học. Do đó, một định
nghĩa đơn giản của các họp chất có hoạt tính sinh học đó là: các họp chất
thứ cấp có khả năng kích thích tạo ra các hiệu ứng dược học và độc tô
trong cơ thê con người và động vật.

1.1.2. Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học từ nguồn (lược liệu
phong phú của Việt Nam
Việt Nam có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng do có
khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng và ấm, đây chính là nguồn ngun liệu tự
nhiên rất phù hợp để làm dược liệu. Theo các nghiên cứu đã cơng bơ, ở
Việt Nam hiện có khoảng trên 20.000 lồi thực vật, trong đó có hơn 13.000
lồi thực vật hạt kín, 69 lồi hạt trần, 1 lồi quyết lá thơng, 53 lồi thơng
đất, 2 lồi có tháp bút, 691 loài dương xỉ và khoảng 368 vi khuẩn lam, 481
loài rêu, 2.200 loài nấm và 2.176 loài tảo. Có khoảng 22 lồi thú; 828 lồi
chim; 258 lồi bị sát, lựỡng cư và khoảng 5.500 lồi cơn trùng đối với
động vật. Trong hệ thực vật ở Việt Nam, nguồn tài nguyên có tinh dầu
chiếm khoảng 6,3%, bao gồm 657 loài thuộc 357 chi và 114 họ. Từ các kết
quả điều tra về công dụng làm thuốc của các lồi sinh vật ở Việt Nam đã
cho thấy có khoảng 3.948 loài thực vật và nấm lớn; 52 loài tảo biền, 408

15


lồi động vật và 75 loại khống vật trong đó các lồi cây thuốc có khả năng
khai thác là 206 lồi, số cầy thuốc có khả năng đe dọa cần bảo vệ là 136
loài, 152 động vật làm thuốc đã ghi trong sách đở ở Việt Nam.

Ớ Việt Nam, mỗi năm y học cố truyền, công nghiệp dược và xuất khấu
đã tiêu thụ khoảng từ 30 - 50 ngàn tấn các loại dược liệu. Riêng từ nguồn
dược liệu từ tự nhiên đã chiếm khoảng trên 20.000 tấn/năm.
Trong thực tế, đã có nhiều lồi cây thuốc được dùng để chiết tách các
hợp chất có hoạt tính sinh học làm thuốc dien hình như hợp chất taxol từ
cây Thơng đỏ (Taxus wallỉchianà)\ curcuminoid từ củ Nghệ (Curcuma
longaỴ' rutin từ cây Hoa hòe (Shophorajapomcdy, vinblanstin và vincristin
từ cây Dừa cạn (Catharantìnis roseusỴ, berberin từ cây Vàng đắng

(Cosccinỉum fenestratumy, artemisinin từ cây Thanh cao hoa vàng
(Artemisia annuaỴ beta carotene và lycopene từ Gâc (Momordỉca
cochinchinensisỴ, D-strophanthin từ hạt quả sừng dê (Strophantus
dỉvaricatusỴ, menthol và tinh dầu từ Bạc hà (Menth arvensisỴ) rotundine từ
nhiều loại cây Bình vơi (Sep hania spp.Ỵ, papain từ cây Đu đủ (Carỉca
papayaỴ, diosgenin từ cây Củ mài (Dỉoscorea deltoỉdeà) và cây Râu hùm
(Tacca chantrierĩỴ, morantin từ cây Mướp đắng (Momordỉca charantiaỴ,
andrographolide từ cây Xuyên tâm liên (Andrographis paniculataỴ
shikimic acid từ hoa Hôi (Illicium verum);... Hàng năm, tổng sản lượng
dược liệu được ước tính khoảng từ 3.000 - 5.000 tấn. Đặc biệt chú ý là cây
Thanh cao hoa vàng (gần 500 tấn/năm), cây Kim tiền thảo (gần 300
tấn/năm) và cây Quế (>300 tấn/năm),... Bên cạnh đó, diện tích trồng một
sơ loại cây dược liệu truyền thống cũng mở rộng, phát triển và được quy
hoạch thành các vùng dược liệu trọng điếm giúp tăng chất lượng và số
lượng cây dược liệu.

Người Việt Nam có truyền thống sử dụng dược liệu để phịng và chữa
bệnh hàng ngàn năm nay, nhờ có điều kiện tự nhiên, khí hậu và thổ nhưỡng
thuận lợi nơn nguồn dược liệu Việt Nam khá phong phú, đa dạng và có
nhiêu tiềm năng tự nhiên cho sự phát triển của nhiều loài dược liệu đặc
hữu khác nhau ở từng địa phương.
Theo Tố chức Y tế Thế giới (WHO), có tới 80% dân số thế giới hưởng
ứng việc chăm sóc sức khỏe ban đầu bằng y học cổ truyền, hầu hết số này
hiện dang sử dụng thuốc có nguồn gốc từ thảo dược thiên nhiên. Xu hướng
dùng dược liệu tự nhiên ngày càng được ưa chuộng do độ an toàn cao và

16


đó là nguồn tài nguyên tái tạo được. Thị trường thuốc từ thảo mộc cho tới

nay với hơn 3.000 sản phẩm, chiếm 10% toàn bộ thị trường dược phẩm và
gan 1/3 thị trường thuốc. Trong những năm gần đây, việc sử dụng các loại
dược liệu thảo mộc ngày càng được người tiêu dùng ưa chuộng.
Các hoạt chất tự nhiên trong dược liệu được sử dụng vào 5 nhóm sản
phâm sau:
1) Thuốc biệt dược: là dạng sản phàm chửa các hoại chất tỉnh khiết
phân lập được tù' các cây thuốc dùng trong điều trị nhiều bệnh lý khác nhau.

2) Thuốc cổ truyền: gồm các dịch chiết cô đặc chứa các hoạt chất tù’
toàn phân của cây, hay từng bộ phận của cây dùng cho việc chăm sóc sức
khỏe.
3) Thực phấm chức năng: là các thực phẩm chứa nhũng hoạt chất hô
sung có nguồn gốc tự nhiên giúp phịng ngừa và điều trị bệnh.
4) Mỹ phẩm, dược dụng: là mỹ phẩm trong thành phần có chứa các
hoạt chát chiết đặc hiệu tù’ dược liệu.

5) Dược liệu thô: là nguyên liệu thô chứa các hoạt chất - một dạng
sản phâm có tiềm năng giá trị cao.
Trong cả 5 nhóm sản phẩm dược liệu trên đều đã bao hàm giá trị các
họp chất có hoạt tính sinh học. Tùy theo mỗi loại sản phấm sẽ có những
cách thức sử dụng và mức độ yêu câu về thành phần, hàm lượng cùa hoạt
chât khác nhau. Do vậy. quan trọng nhất vẫn là các phương pháp tách chiết
các họp chất có hoạt tính sinh học đề sử dụng vào các loại sản phẩm phù
họp với thực tiễn mà vẫn giữ được nguyên hoạt tính.

1.2. Tách chiết các họp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học
Dựa trên số lượng lớn các họp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học
trong các ngn ngun liệu tự nhiên đa dạng như các loài thực vật, động
vật, nâm, vi sinh vật trên cạn và dưới biên, cho thấy sự cân thiết phải xây
dựng các kỹ thuật tách chiết phù hợp đê thu được các hợp chất thiên nhiên

có hoạt tính sinh học trên nhàm phục vụ cuộc sống con người.

1,2,1, Mục tiêu cùa việc tách chiết các hợp chất thiên nhiên
Hai vân đề cần được xác định khi bat đau tách chiết các hợp chất thiên
nhiên cỏ hoạt tính sinh học chính là: 1. Chúng ta đang co gang chiết tách
những hợp chat nào? 2. Tại sao chúng ta cỏ gang tách chiết chúng? Từ
iQ DẠI HỌC CÒNG NGHIỆP TP.HCM

THƯVIỆN


việc giải đáp 2 vấn đề này ta xác định được mục tiêu của việc tách chiêt
các họp chât thiên nhiên.

Một số mục tiêu cúa việc tách chiết các họp chất thiên nhiên:

a. Xác định thành phần hóa học cua một lồi mói: Lồi mới này chưa
được các nhà khoa học nghiên cứu về thành phần hóa học. Đe khảo sát
thành phần hóa học cần phải chiết tách, phân lập các họp chất đạt độ tinh
khiết > 95%, sử dụng các phương pháp phổ để xác định cấu trúc, tiến hành
thử nghiệm các hoạt tính sinh học của các họp chât đó;
b. Đoi với các họp chat đã biết cấu trúc hóa học: tiên hành thử
nghiệm thêm các hoạt tính sinh học, tinh sạch đề tạò thành chất chuẩn sử
dụng cho kiểm nghiệm phân tích, nếu có kết quả tốt, hiệu quả cao có thể
xem xét thể tống họp hóa học họp chất đó để có số lượng nhiều hơn;

c. Các họp chất đã biết hoạt tính sinh học: cần nghiên cứu con đường
sinh tông họp và xem chat này được sàn sinh ra từ bộ phận nào của sinh
vật;
d. Khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện sinh thái tói sự khác biệt của

những họp chất thử cấp được san sinh ra từ cùng một nguồn tự nhiên. Ví
dụ: xác định hàm lượng của những họp chất có trong 2 loài thực vật cùng
họ (family), cùng chi (genus), cùng lồi (species) ở nhũng điều kiện khí
hậu, đất đai tho nhường khác nhau.
1.2.2. Các kỹ thuật tách chiết

Đe tìm hiểu về sự chiết tách chọn lọc từ các nguồn nguyên liệu tự
nhiên, trải qua thực tiễn hàng trăm năm rất nhiều kỹ thuật tách chiết đã
được áp dụng cho các đối tượng mẫu cụ the. Tuy nhiên, nguyên tắc của tât
cả các kỹ thuật trên đều dựa trên một nguyên lý chung, đó là tiến hành
nghiên cứu chuyên sâu trên các trạng thái phù họp của mẫu từ nguyên liệu
thô ban đầu.
Các mục tiêu chung của các kỹ thuật trên bao gồm:

a. Xử lí nguyên liệu ở trạng thái ban đầu;

b. l ăng cường độ chọn lọc của phương pháp;
c. Cải thiện chất lượng của phương pháp bang cách tăng cường tập
trung vào phân tích những yếu tố cần thiết đế xác định hợp chất và phân lập;

d. Cải tiến các kỹ thuật phân tích cho phù hợp hơn;
18


e. Đưa ra một phương án hiệu quả, có thê áp dụng nhiêu mà không
bị phụ thuộc vào sự khác nhau của các loại mẫu nguyên liệu.
ỉ. 2.2. ỉ. Các kỹ thuật tách chiết truyền thông

Các họp chat thiển nhiên có hoạt tính sinh học trong dược liệu có thê
được chiết ra bang rất nhiều kỹ thuật khác nhau. Người ta vẫn sử dụng 3

kỹ thuật chính đe tách chiết: 1) chiết soxhlet; 2) ngâm chiết; 3) chưng cất.
Đa phan các kỹ thuật này dựa trên khả năng chiết của từng loại dung môi
khác nhau, dưới sự tác động thêm bởi các yếu tố nhiệt độ hay các kỹ thuật
bô sung khác.
Việc lựa chọn hệ dung môi phù hợp ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất
của các thuật tách chiết. Rất nhiều hệ dung môi khác nhau đã được áp dụng
đê tách chiết các họp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học. Trong q
trình chọn cần chú ý đến độ phân cực của các chất cần tách. Ngoài ra, các
yếu tố như ái lực phân tử, môi trường, khả năng kết họp dung môi, hiệu
quá kinh tê cũng cần được quan tâm chú ý.
ỉ. 2.2.2. Các kỹ thuật tách chiết hiện đại

Thách thức lớn đối với kỹ thuật tách chiết truyền thống đó là thời gian
lâu, yêu cầu dung mơi đắt tiền, có độ tinh sạch cao, bay hơi dung môi
nhiều, khả năng phân tách chọn lọc thấp và dễ gây phân hủy đối với các
chất nhạy nhiệt. Các hạn chế này đã được khắc phục bằng các sử dụng các
kỹ thuật tách chiết mới. Một số kỹ thuật mới đã được áp dụng nhiều hiện
nay như là: 1) chiết siêu âm, 2) chiết sử dụng enzyme, 3) chiết sử dụng vi
sóng, 4) chiết sử dụng xung điện trường, 5) chiết lỏng siêu tới hạn, 6) chiết
long điều áp (pressurized liquid extraction). Trong đó, một số phương pháp
đã đáp ứng được chỉ tiêu của cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ đưa ra
như sử dụng các dung môi an tồn, tiết kiệm năng lượng, có thê tái sử
dụng, giảm các tạp chất, đạt hiệu quả kinh tế cao, khơng gây ơ nhiễm và
an tồn với người sử dụng.
1.3. Phân lập các họp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học

Dịch chiết thô của các mẫu nghiên cứu thường chứa các họp chất có
độ phân cực khác nhau với cấu trúc từ đơn giản đến phức tạp. Do vậy, việc
phân lập các hợp chất này cần sử dụng nhiều kỹ thuật tách chiết kết hợp
với nhau.

19


Các dịch chiết thô trước hết phải được phân bố thành các phân đoạn cụ
thế khác nhau nhàm thu được các phân đoạn có chứa các hợp chất gần
giống nhau về độ phân cực hoặc các phân tử có kích cỡ tương tự nhau.
Các kỹ thuật sắc ký đe phân lập các hợp chất thiên nhiên với đa dạng
cấu trúc có the chia ra 2 loại cổ điển và hiện đại.
ỉ) Kỹ thuật SCIC ký cô điên gôm:

- sác ký lóp mỏng (TLC - Thin layer chromatography);
- Sắc ký lớp mỏng điều chế (PTLC - Preparative thin layer
chromatography);

- Sac ký cột (CC - Column chromatography);
- Sac ký nhanh (FC - Flash chromatography).
2) Kỹ thuật sac ký’ hiện đại gồm:
- Săc ký lớp móng hiệu năng cao (HPTLC);

- Sắc ký nhanh đa chức năng (Multiflash chromatography)
- Sac ký lỏng chân không (VLC- Vacuum liquid chromatography);
- Chiết pha ran (SPE- Solid phase extraction);
- sác ký nhó giọt ngược dịng (DCCC - Droplet counter-current
chromatography);
- Sắc ký long hiệu năng cao (HPLC-High perfomance liquid
chromatography);

- Các kỹ thuật ghép nối thiết bị như HPLC-PDA; sắc ký lỏng ghép
khối phổ (LC-MS); sắc ký long ghép phổ cộng hưởng từ hạt nhân (LCNMR); sắc ký lỏng ghép phổ khối và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (LCMS-NMR...)

Khối lượng các hợp chat thu được trong quá trình phân lập và làm sạch
rất quan trọng trong nghiên cứu các sản phấm tự nhiên. Đánh giá khả năng
thu hồi trong q trình phân lập có the được thực hiện dựa vào các kỹ thuật
phân tích đa dạng, ví dụ như sử dụng chất chuẩn. Trong phương pháp phân
lạp dựa trên CO' sở xét nghiệm sinh học, các hoạt chất được theo dõi bang
phân tích sinh học ỏ' từng giai đoạn và đánh giá khối lượng hoạt chất
thường được tiến hành bằng phương pháp phân tích pha lỗng.

20


Hàm lượng các hợp chất thiên nhiên trong nguyên liệu thấp hay khả
năng thu hồi các hợp chất thấp là một trong những khó khăn hay gặp phái
trong phân lập các hợp chất thiên nhiên. Ví dụ, 15 tan lá dừa cạn khô (Vinca
rosea) chỉ thu được khoảng 30 g vincristine. Tương tự như vậy, từ khoảng
27,3 tấn vở của 6.000 cây thơng đỏ (Taxiis hrevifolia) mới thu được khống
1,9 kg taxol. Khó khăn về nguồn cung cấp Taxol đã được, viện ung bướu
Quốc gia Hoa Kỳ đề xuất một số giải pháp như:

- Tìm nguồn cung cấp taxol khả quan hơn nhự các loài khác cùa chi
Taxus hoặc cải thiện điều kiện trồng trọt, chọn giống;
- Bán tống hợp taxol từ tiền chất có hàm lượng lớn;

- Tổng hợp tồn phần taxol;
- Ni cấy mơ tạo sản phẩm taxol hoặc các chất giống nó.
Mặc dù taxol đã tong họp được tồn phần tuy nhiên phương pháp này
lại khơng hiệu quả về mặt kinh tế. Cho nên cách khả thi nhất là bán tơng
hợp taxol.

1.4. Thủ’ nghiệm hoạt tính sinh học của các họp chất thiên nhiên

1.4.1. Khái niệm
•
Các phân tích hố học, sinh học hoặc vật lý rất cần thiết trong việc xác
định các hợp chất tù' một dịch chiết. Ngày nay, việc nghiên cứu sản phâm
tự nhiên tập trung nhiều hơn vào việc phân lập các họp chất theo định
hướng hoạt tính sinh học hơn là cố gang phân lập tất cả các họp chất có
trong dịch chiết. Vì vậy, các thử nghiệm hoạt tính sinh học thích họp nên
được kết hợp đồng thời với các quá trình chiết tách và phân lập (sơ đồ 1.1).
Thử nghiệm các họp chất có hoạt tính sinh học là phương pháp chính
đê phát hiện các nguồn thuốc mới, dược liệu mới có nguồn gốc từ tự nhiên.
Do đó, thử nghiệm các hoạt tính sinh học cỏ thê được định nghĩa là các
thư nghiệm được sử dụng đê phát hiện các hoạt tính sinh học cùa một phan
dịch chiết, hoặc cua một chat nhận được từ một sinh vạt sống hoặc dược .
tông họp cần thiết cho sự phát triên một thuốc mới.

21


Dược liệu đã xử lý

So’ đồ 1.1. Qui trình kỹ thuật phân lập và thử nghiệm hoạt tính sinh học
của các hợp chất thiên nhiên.

22


1.4.2. Phân loại thử nghiệm hoạt tính sinh học

ỉ. 4.2. ỉ. Thử nghiệm ỉn vitro

Các kỹ thuật này dựa sử dụng dựa trên sự nuôi cấy tế bào của một hệ
sinh học để nghiên cứu tác dụng của hợp chất dưới điều kiện tiêu chuân
không giống như của môi trường sống. Sự nuôi cấy tế bào tồn tại do sử
dụng dinh dưỡng trong mơi trường. Ví dụ, sử dụng các tế bào gôc, nuôi
cấy tế bào và các vi khuẩn...
Ư’u điểm: nhanh, cần lượng mẫu nhỏ, có thế thực hiện các thử nghiệm
lặp lại.
Nhược điểm: hoạt tính có thể bị mất trong thử nghiệm ỉn vivo do một
cơ ché khác với cơ chế được thử nghiệm - chất chuyển hóa có thê có hoạt
tính hơn là các chất có ban đầu trong dịch chiết hoặc phân đoạn.
1.4.2.2. Thử nghiệm ỉn vivo
Các kỹ thuật này sử dụng trên một động vật sống được cho phép sử dụng
cho mục đích thử nghiệm. Các kỹ thuật này có mục đích nghiên cứu tác
dụng sinh học hoặc sự đáp ứng của họp chất trong một hệ sống, ví dụ: chuột,
thở, mèo, chó,... thường được sử dụng trong các thử nghiệm dược lý.
Ưìi điểm: các kết quả thích họp nhất với điều kiện lâm sàng, các tác
dụng phụ thường được thế hiện.

Nhược điếm: giá thành cao, thiếu chỉ định cho cơ chế tác dụng của hoạt
chất, khó sử dụng trong phân lập theo định hướng hoạt tính sinh học, cần
các thiết kế cấn thận và phân tích xử lý số liệu phù họp các kêt quả.

1.4.2.3. Thử nghiệm lâm sàng
Các thử nghiệm trên động vật (in vivo) và thử nghiệm lâm sàng cơ bản
đế nghiên cứu hiệu quả và độc tính của các họp chất thiên nhiên đã dược
chứng tỏ là có hoạt tính sinh học bằng các thử nghiệm sàng lọc in vitro.

Thử nghiệm lâm sàng là các nghiên cứu y sinh hoặc hành vi trên con
người được thiết kế để trả lời các câu hỏi cụ thế và sự can thiệp y sinh hoặc
hành vi (các vaccine, thuốc, điều trị, thực phẩm chức năng mới hoặc các

phương pháp điều trị mới) tạo ra các dữ liệu về an toàn và hiệu lực.
1.4.3. Một số nguyên tắc cơ bản trong tìm kiếm, sàng lọc các chất có
hoạt tính sình học
Trong thời gian qua, kỹ thuật thử hoạt tính sinh học là lĩnh vực được
phát triển mạnh mẽ, đặc biệt về mức độ tự động hóa và số lượng mẫu được

23


thử theo một đon vị thời gian {Automated and high-throughput screening
HTS). Do sự hiếu biết sâu rộng của con người về các quá trình sinh học
của một số căn bệnh, cùng với việc có được nhiều thụ thể, enzyme, gene
và hệ tế bào nên kỹ thuật thử hoạt tính sinh học đã có những thay đổi cơ
bản, đã hạn che bớt việc sử dụng động vật'thí nghiệm hoặc các cơ quan
nội tạng cùa chúng cho các phép thử hoạt tính sinh học.

Nhờ có các kỹ thuật thử hoạt tính mới mà nhiều chất dã biết và có lượng
lớn trong tự nhiên đã được phát hiện là có hoạt tính, thậm chí hoạt tính một
cách chọn lọc đối với một số enzyme và thụ thể {receptor). Gần đây, các
họp chất dược phát hiện với phổ hoạt tính mới rộng bao gồm các flavonoid
và triterpenoid. Các flavonoid có hoạt tính ức chế rất nhiều loại enzyme, có
hoạt tính sinh estrogen cao, chống đột biên và ung thư. Một sô flavonoid
đang dược nghiên cứu lâm sàng.
Y nghĩa ứng dụng của họp chất sẽ được nâng cao nếu cơ chế tác dụng
cùa nó cùng với các enzyme liên quan đến hoạt chất này được làm sáng tỏ.
Ví dụ: paclitaxel từ Taxus brevifolia và camptothecin từ Camptotheca
acuminata. Hai họp chất này được phân lập nhờ q trình sàng lọc theo
hướng hoạt tính kháng tế bào ung thư biểu mô (KB). Taxol đã được bán
trên thị trường, còn camptothecin đang được thử lâm sàng tại Trung Quôc.
Cơ che tác dụng cúa hai hoạt chất này thuộc loại độc nhất hiện nay.

Camptothecin ức che enzyme topoisomerase I và taxol kích thích q trình
polymer hóa tubulin.

Phương pháp thử hoạt tính sinh học sử dụng các hệ thống sinh học đê
phát hiện các hoạt tính (kháng khuan - antibacterial, kháng nâm antifungal, chống ung thư - anti cancer, kháng HIV- antì-HIV, chống tiêu
dường - antidiabetic...) của các dịch chiết thô, các phân đoạn sac ký, hỗn
họp các chất hay các họp chất sạch. Các phép thử sinh học bao gồm sử
dụng hệ thống ìn vivo (thử nghiệm lâm sàng hay trên động vật), hệ thong
ex vivo (trên các mô tế bào tách biệt hay các cơ quan sống) hoặc hệ thống
in vitro (trong ông nghiệm - các tế bào nuôi cây).
Các nghiên cứu in vivo liên quan nhiều hơn đen các điều kiện lâm sàng
nên cung cấp dược nhiều số liệu về độc tính trong cùng thời điểm. Nhược
điểm cúa các nghiên cứu này là chi phí cao, thời gian dài, cân khôi lượng
chất thử lớn, thiết kế phức tạp. cần có bệnh nhân và khó chọn phương pháp
xác định hoạt tính. Các phép thừ in vitro cần ít thời gian, khối lượng mẫu
24


thử nhỏ, nhưng các kết quả có khi khơng liên quan đến các điều kiện lâm
sàng.
Xu hướng nghiên cứu hiện nay đang ưu tiên từ hệ thống thử nghiệm ỉn
vivo chuyên sang in vitro. Ngày nay, phép thử sinh học rất mạnh, siêu nhạy
thậm chí có the chỉ cần sử dụng khối lượng chất thử rất nhỏ khoảng vài
picogram (pg). Phần lớn các phép thử (sử dụng đĩa 96 hoặc 384 giếng)
được tiến hành tự động hoặc bán tự động.

Những diem cơ bản khi tiến hành các thử nghiệm các sản phẩm tự
nhiên:

a. Các mẫu hoà tan hoặc các chất lơ lửng trong các dung môi khác

nhau của dịch chiết ban đầu phải đuực lọc hoặc ly tâm đê loại bở
bất kỳ chất khơng hịa tan nào;
b. Các mẫu acid hóa hoặc base hố phải được điều chỉnh lại với độ
pH như ban đầu của dịch chiết đe ngăn ngừa chúng gây trở ngại
cho phép thử nghiệm sinh học;
c. Các chất đối chứng dương tính và âm tính nên được kết họp trong
bất kỳ thử nghiệm sinh học nào;
d. Điều kiện lý tưởng nhất là phép thử nghiệm tối thiểu bán định
lượng, hoặc các mẫu phải được khảo sát trong một loạt các nồng
độ pha loãng khác nhau để xác định phần lớn các họp chất đích;

e. Các phép thử phải đủ độ nhạy để phát hiện các thành phần hoạt
tính ở nồng độ thấp.

ỉ.4.4. Các xu hưởng chính trong nghiên cứu, tìm kiếm các hợp chất mới
có hoạt tính sinh học
Ngày nay, các xu hướng chính trong nghiên cứu, tìm kiếm các họp chất
mới có hoạt tính sinh học nguồn gốc tự nhiên tập trung chủ yêu vào các
lĩnh vực bao gồm:
- Nghiên cứu đánh giá hoạt tính liên quan đến ung thư;

- Nghiên cứu đánh giá hoạt tính liên quan đến bệnh nhiễm trùng;
- Các hợp chất có hoạt tính trong miễn dịch;

- Các chât có liên quan đến tim mạch;
- Các chât có liên quan đến hệ thần kinh.

25