TIỂU LUẬN:SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR ĐỂ CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO ( Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis) ppt

1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LỚP DH06SH




BÁO CÁO TIỂU LUẬN
CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC VÀ GIA CẦM BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ
ĐỀ TÀI
SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR ĐỂ
CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO
( Mycobacterium tuberculosis,
Mycobacterium bovis)

Giáo viên hướng dẫn: PGS. TS. NGUYỄN NGỌC HẢI
Sinh viên thực hiện: NGÔ THỊ TÚ TRINH
MSSV: 06126169






Tháng 10/200
2


I. ĐẶT VẤN ĐỀ


Lao là tình trạng nhiễm vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis, thường gặp nhất
ở phổi nhưng cũng có thể ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương (lao màng não),
hệ bạch huyết, hệ tuần hoàn (lao kê), hệ niệu dục, xương và khớp.
Hiện nay lao là bệnh nhiễm khuẩn chính và thường gặp nhất, ảnh hưởng đến 2
tỉ người tức 1/3 dân số, với 9 triệu ca mới mỗi năm, gây 2 triệu ng
ười tử vong, hầu
hết ở các nước đang phát triển.
Hầu hết (90%) các trường hợp nhiễm khuẩn lao là tiềm ẩn không triệu chứng.
10% những người này trong cuộc đời họ sẽ tiến triển thành bệnh lao có triệu
chứng, và nếu không điều trị, nó sẽ giết 50% số nạn nhân. Lao là một trong 3 bệnh
truyền nhiễm gây tử vong cao nhất trên thế giới: HIV/AIDS giết 3 triệu người m
ỗi
năm, lao giết 2 triệu, và sốt rét giết 1 triệu.
Sự sao lãng trong các chương trình kiểm soát lao, sự bùng phát của đại dịch
HIV/AIDS và việc di dân đã khiến lao trỗi dậy. Các chủng lao kháng đa thuốc
(MDR, multiple drug resistant) đang tăng. Năm 1993, Tổ chức Y tế Thế giới tuyên
bố tình trạng khẩn cấp toàn cầu đối với lao.
Do đó, việc phát hiện và điều trị kịp thời đối vớ
i bệnh lao rất quan trọng. Hiện
nay, vi khuẩn lao được phát hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau như xét
nghiệm đờm (nhuộm
 Ziehl-Neelsen), xét nghiệm hình ảnh (X-quang), phản ứng
tuberculin hay soi phế quản. Tuy nhiên, những phương pháp này vẫn tồn tại một số
mặt hạn chế của nó như tốn nhiều thời gian để chẩn đoán, cho kết quả có độ chính
xác không cao,… Ngày nay, với sự phát triển của các kỹ thuật sinh học phân tử sẽ
giúp cho quá trình chẩn đoán vi khuẩn lao nhanh chóng và hiệu quả hơn. Trong
phạm vi bài tiểu luận này, tôi xin đề cập

đến việc chẩn đoán vi khuẩn lao
(Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis) bằng kỹ thuật PCR.
3

II. TỔNG QUAN


1. Bệnh lao
1.1. Vi khuẩn lao
1.1.1. Mycobacterium tuberculosis

Hình 1: Mycobacterium tuberculosis

Phân loại
Giới: Bacteria
Ngành: Actinobacteria
Bộ: Actinomycetales
Phân bộ: Corynebacterineae
Họ: Mycobacteriaceae
Giống: Mycobacterium
Loài: M. tuberculosis
Mycobacterium tuberculosis (MTB), tác nhân gây bệnh lao, là vi khuẩn
hiếu khí. Vi khuẩn này phân chia mỗi 16 đến 20 giờ, rất chậm so với thời gian
phân chia tính bằng phút của các vi khuẩn khác (trong số các vi khuẩn phân
chia nhanh nhất là một chủng E. coli, có thể phân chia mỗi 20 phút). MTB
không được phân loại Gram dương hay Gram âm vì chúng không có đặc tính
hoá học này, mặc dù thành tế bào có chứa peptidoglycan. Trên mẫu nhuộm
Gram, nó nhuộ
m Gram dương rất yếu hoặc là không biểu hiện gì cả. Trực
khuẩn lao có hình dạng giống que nhỏ, có thể chịu đựng được chất sát khuẩn

4

yếu và sống sót trong trạng thái khô trong nhiều tuần nhưng trong điều kiện tự
nhiên, chỉ có thể phát triển trong sinh vật ký chủ.
Trực khuẩn lao được xác định dưới kính hiển vi bằng đặc tính nhuộm
của nó: nó vẫn giữ màu nhuộm sau khi bị xử lý với dung dịch acid, vì vậy nó
được phân loại là "trực khuẩn kháng acid" (acid-fast bacillus, viết tắt là AFB).
Với kỹ thuật nhuộm thông thường nhất là nhuộm Ziehl-Neelsen, AFB có màu
đỏ t
ươi nổi bật trên nền xanh. Trực khuẩn kháng acid cũng có thể được xem
bằng kính hiển vi huỳnh quang và phép nhuộm auramine-rhodamine.
Phức hợp M. tuberculosis gồm 3 loài Mycobacterium khác có khả năng
gây lao: M. bovis, M. africanum và M. microti. Hai loài đầu rất hiếm gây bệnh
và loài thứ 3 không gây bệnh ở người.
1.1.2. Mycobacterium bovis

Hình 2: Mycobacterium bovis
Phân loại
Giới: Bacteria
Ngành: Actinobacteria
Bộ: Actinomycetales
Phân bộ: Corynebacterineae
Họ: Mycobacteriaceae
Giống: Mycobacterium
Loài: M. bovis
Mycobacterium bovis là nguyên nhân chủ yếu gây bệnh lao phổi ở gia
súc, nhưng cũng có thể gây bệnh cho những loài khác kể cả con người. Ở
người, M.bovis có thể gây ra chủng lao ảnh hưởng đến phổi, hạch bạch huyết
5


và các bộ phận khác của cơ thể. Vi khuẩn này phân chia rất chậm, từ 16 đến 20
giờ, là vi khuẩn hiếu khí. Nó có liên hệ với M. tuberculosis.
1.2. Sức đề kháng của vi khuẩn
Vi khuẩn có sức đề kháng mạnh nhất là chỗ thiếu ánh sáng và được làm
khô. Trong phân gia súc, đờm, chỗ tối thì vi khuẩn có thể sống hàng tháng.
Ánh sáng mặt trời có khả năng làm mất độc lực vi khuẩn sau 8 giờ.
1.3. Phương thức lây truy
ền
Các loài động vật máu nóng, máu lạnh, gia súc, thú rừng, người đều có
thể mắc bệnh. Có thể xếp thứ tự cảm nhiễm như sau: người, bò, gà, heo, chó,
mèo, trâu. Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể theo các con đường sau:
9 Đường hô hấp: phổ biến nhất là ở bò và người, mầm bệnh từ cơ thể bị
bệnh bài xuất ra ngoài qua đường hô hấp hay qua phân, mầm bệnh có
trong không khí, gia sú khỏe hít vào sẽ mắc bệnh.
9
Đường tiêu hóa: thông thường qua bú sữa, thức ăn, nước uống có mầm
bệnh.
9 Ngoài ra còn có thể lây lan qua núm nhau, đường sinh dục, đường phối
giống.
1.4. Triệu chứng
9 Nhóm lao phổi: ho khan, sau to hơn có âm ran, về sau ho ướt ho
có đờm, vật ốm, đờm lúc đầu loãng sau đặc dần có thể có mủ
máu. Thời gian sau là rối loạn hô hấp, thở hắt nhiều, niêm mạc
mũi có thể xuất huyết, phổi có âm ran ướ
t.
9 Nhóm lao hạch: hạch sưng cứng, bề mặt hạch không trơn, hạch
cứng lồi lõm, không di động được, các hạch dưới hàm, vai, hạch
vú, hạch trước vai đều bị sưng.
9 Nhóm lao vú: chủ yếu ở bò sữa năng suất cao, vú sưng, núm vú
bi biến dạng, nạch vú sưng to gồ ghề, sản lượng sữa giảm.

9 Nhóm lao đường tiêu hóa: ít gặp, thường gặp ở các ổ lao
ở ruột
có thể ở gan, gia súc tiêu chảy, gầy dần, rối loạn tiêu hóa, niêm
mạc đường tiêu hóa bị phá hủy, hạch màng treo ruột bị thoái hóa
dạng bã đậu.
6

1.5. Bệnh tích
Có thể nghi ngờ bệnh khi có bệnh tích casein hóa hoặc calci hóa.
Các hạt lao chủ yếu có ở phổi, màng treo ruột và hạch lamba, xương hay
khớp.
Các bệnh tích lúc đầu gồm các hạt nhỏ có casein hoặc calci hóa trong
hạch lamba vùng hầu, ngực và đôi khi ở hạch màng treo ruột về sau
chúng gồm rất nhiều hạt to, cứng, màu trắng xám ở khu vực màng phổi
và màng bụng (hạt có màu xám), kích thước hạt thay đổi từ đầu đ
inh
ghim tới hạt phỉ. Trong thể lao hạt kê, các hạt lao có rất nhiều ở phổi,
gan lách và các cơ quan khác, chúng thường có màu xám vàng.
(a) (b) (c)
(d) (e) (f)
(g) (h)
Hình 3: Test dị ứng bằng Tuberculin (a) ; Hạt lao phổi giống như ngọc
trai trên màng phổi trong xoang ngực (b) ; Hạt lao màu vàng trắng trên
gan (c) ; Hạt lao trên gan (d) ; Các hạch phổi to lên rõ và có các hạt màu
vàng trắng ngà (e) ; Thoái hóa dạng bả đậu ở hạch màng treo ruột (f) ;
7

Tế bào khổng lồ trong u hạt hạch phổi và tế bào kháng axit trong bào
tương (g) ; khuẩn lạc Mycobacterium bovis nuôi cấy 8 tuần ở 37
o

C trong
môi trường Herold (h).
2. Chẩn đoán vi khuẩn lao bằng phương pháp PCR ( Polymerase Chain
Reaction)
2.1. Phương pháp PCR
2.1.1. Định nghĩa
Phương pháp PCR là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao các
đoạn DNA mà không qua tạo dòng. Phương pháp này được K.Mullis đưa ra
năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988. Phương pháp PCR được thực hiện
hoàn toàn trong các eppendoff và trong thời gian ngắn ta có thể thu nhận rất
nhiều bản sao DNA. Kỹ thuật PCR có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh v
ực:
chẩn đoán, xét nghiệm các tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới tính của
phôi, giải mã di truyền, tạo giống mới với các đột biến định hướng, nghiên cứu
sự tiến hoá của sinh vật ở mức độ phân tử,….
2.1.2. Nguyên lý
Phản ứng chuỗi sử dụng enzyme polymerase hay còn gọi là PCR là một
phản ứng tổng hợp sợi DNA đơn dựa vào một sợi DNA đơn khác làm khuôn và
một
đoạn oligonucleotide làm mồi. Sợi DNA đơn được tổng hợp nên có trình
tự bổ trợ với sợi khuôn.
Các oligonucleotide dùng làm mồi cho enzyme DNA polymerase và sợi
biến tính của phân đoạn DNA lớn được dùng làm sợi khuôn. Kết quả là tổng
hợp các sợi DNA mới bổ trợ cho các sợi khuôn bố mẹ. Những sợi mới này có
đầu 5’ (chính là đầu 5’của mồi oligonucleotide), trong khi đó đầu 3’ thì chưa
xác định được độ dài.
Quá trình tổng hợ
p định hướng theo oligonucleotide của các sợi DNA
con có thể được nhắc lại nếu sợi kép mới được biến tính (bằng nhiệt) và mồi bổ
sung được phép gắn vào sợi khuôn (nhờ hạ xuống nhiệt độ thích hợp). Các

bước này bao gồm: a) biến tính, b) gắn mồi, c) kéo dài mồi tạo ra một chu kỳ
trong phương pháp khuếch đại PCR.
8

Sau mỗi chu kỳ sợi DNA mới tổng hợp có thể làm khuôn trong chu kỳ
tiếp theo.
Một sợi trong sợi mới được tổng hợp từ chu kỳ 2 trở đi có đầu 5’ và 3’
được xác định tại vị trí gắn mồi oligonucleotide. Sau n chu kỳ, sự khuếch đại
các phân đoạn tuân theo quy luật sau: 1) chỉ có 1x bản sợi khuôn ban đầu (sợi
kép 2 –dna-), PCR không bao giờ tái tạo được sợi dài như sợi khuôn, trừ
trườ
ng hợp hai mồi nằm ở tận cùng hai đầu sợi khuôn. 2) Có n sợi đơn mỗi loại
(-dna và dna-) với độ dài không xác định, trong đó n là số chu kỳ. Những phân
đoạn có độ dài không xác định này có một đầu được giới hạn bởi mồi PCR còn
đầu kia không xác định. 3) Có [2
n
– (n+1)] bản sao sợi đơn mỗi loại (dna xuôi
và ngược) có độ dài xác định giữa hai mồi PCR.
2.1.3. Tối ưu hóa PCR
Các yếu tố quyết định sự thành công của PCR có thể chia thành bốn
nhóm chính, đó là: khuôn (độ tinh sạch và nồng độ), mồi thiết kế (tính đặc
hiệu, cấu trúc và nồng độ), các thành phần khác (đệm, MgCl
2,
phụ gia,
polymerase, dNTP), các chế độ phản ứng (nhiệt độ và thời gian).
2.1.3.1. Khuôn DNA
PCR là một công cụ cực kỳ mạnh để khuếch đại DNA bởi vậy cần
rất ít khuôn DNA. Nhưng để giảm khả năng tạo lỗi của Taq DNA
polymerase, có thể sử dụng nồng độ DNA cao hơn, mặc dù quá nhiều
khuôn có thể tăng hàm lượng thể lẫn tạp và giảm hiệu suất.

Thườ
ng hàm lượng khuôn DNA trong khoảng 0.01-1 ng đối với
plasmid hoặc DNA phage và 0.1-1 µg đối với DNA nhân bào, cho một phản
ứng tổng thể tích 50 µl. Hàm lượng khuôn DNA cao hơn thường tăng hiệu
suất thu hồi sản phẩm PCR không đặc hiệu, nhưng nếu độ tin cậy tổng hợp
là tới hạn, nên dùng hàm lượng khuôn DNA tối đa cho phép cùng với số
chu kỳ PCR giới hạn để tăng tỷ lệ sản phẩm PCR đặc hiệu.
2.1.3.2.
Mồi
9

Mồi là một phân đoạn nucleotide ngắn bổ trợ cho vùng DNA cần
được khuếch đại trong PCR. Mồi có thể đặc hiệu hoặc chung (universal) với
trình tự nucleotide đặc trưng. Mồi chung bổ trợ cho nhiều trình tự
nucleotide là một bộ phân tử DNA đặc trưng nào đó. Do đó, chúng có thể
liên kết rộng rãi với nhiều loại khuôn DNA.
Mồi là một trong các yếu tố quan trọng nhất quyết định sự thành
công củ
a PCR. Việc thiết kế mồi đặc hiệu và sử dụng nồng độ thích hợp sẽ
dẫn đến PCR có sản phẩm hay không. Tính bổ trợ hoàn chỉnh của 18nt hoặc
hơn là lý tưởng.
2.1.3.4. dNTP
Nồng độ mỗi loại dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) trong hỗn hợp
phản ứng thường là 200 µM. Một điều quan trọng là nồng độ mỗi loại
dNTP phải như nhau. Chỉ cần một dNTP nào đó chênh v
ề nồng độ có thể
gia tăng mức độ gắn nhầm nucleotide vào sản phẩm PCR, dẫn đến kết quả
trình tự có lỗi và sản phẩm biểu hiện có thể là một thể đột biến.
Nồng độ nucleotide cần không quá 50µM mỗi lọai, tuy nhiên sản
phẩm dài có thể cần nhiều hơn. Khi độ tin cậy tối đa của quy trình PCR là

tới hạn, nồng độ dNTP cuối cùng phải là 10-50 µM, do
độ tin cậy tổng hợp
DNA là tối đa trong dãy nồng độ này. Ngoài ra, nồng độ MgCl
2
phải được
chọn nghiêm ngặt, bắt đầu từ 1 mM và tăng lên 0.1mM mỗi bước, cho tới
khi thu được hiệu suất có đủ sản phẩm PCR. Nồng độ dNTP có thể được sử
dụng tới 1.5 mM. Do dNTP bắt kẹp các ion Mg
2+
, nên [Mg
2+
] sử dụng có
thể cần được thay đổi. Tuy nhiên thừa dNTP có thể tăng tỷ lệ lỗi và có khả
năng ức chế Taq pol. Bởi vậy giảm dNTP (10-50 µM) có thể cũng giảm tỷ
lệ lỗi. Phân đoạn PCR kích thước lớn hơn cần nhiều dNTP hơn.
2.1.3.5. Polymerase
Có thể sử dụng Taq DNA polymerase, Tli, Pfu trong phản ứng PCR.
Taq pol có một tỷ lệ lỗ
i cao hơn Tli hoặc Pfu. Tuy nhiên Taq pol lại ít phức
10

tạp hơn các polymerase khác và ít khi thất bại. Người ta có thể sử dụng Taq
pol cùng với các enzyme khác để tăng độ tin cậy của phản ứng.
Thường 1-1.5 unit Taq DNA polymerase được sử dụng trong một
hỗn hợp phản ứng 50 µl. Hàm lượng Taq pol cao hơn có thể tổng hợp nhiều
sản phẩm PCR không đặc hiệu. Tuy nhiên, nếu các chất ức chế có mặt trong
hỗn hợp phản ứng (ví dụ
khuôn DNA sử dụng không được tinh sạch cao),
hàm lượng Taq pol (2-3 unit) cao hơn có thể là cần thiết để thu hiệu suất sản
phẩm khuếch đại cao hơn.

2.1.3.6. Nồng độ Mg
2+

Nồng độ Mg
2+
ảnh hưởng tới bắt cặp mồi, T
m
của sợi khuôn, sản
phẩm và liên kết mồi-khuôn, tính đặc hiệu sản phẩm, hoạt tính enzyme và
tính chính xác. [Mg
2+
] ảnh hưởng tới sự bắt cặp oligo với khuôn DNA bằng
cách bền hóa với khuôn-mồi. Vì vậy nó cũng tăng sự bắt cặp không đặc
hiệu và tổng hợp các sản phẩm PCR không mong muốn (cho nhiều băng
trên gel). EDTA kẹp càng cua Mg
2+
có thể thay đổi [Mg
2+
].
Do ion Mg
2+
taọ ra các phức hợp với dNTP, mồi và khuôn DNA,
nồng độ tối thích của MgCl
2
được lựa chọn cho từng thí nghiệm. Quá ít ion
Mg
2+
cho hiệu suất thu nhận sản phẩm PCR thấp và quá nhiều ion tăng hiệu
suất thu các sản phẩm không đặc hiệu và tăng gắn nhầm. [Mg2+] thấp hơn
được mong muốn khi độ tin cậy tổng hợp DNA là tới hạn.

Taq pol cần các ion Mg
2+
tự do. Do các thành phần như dNTP, mồi
khuôn, tất cả đều tạo càng cua và thu giữ cation, trong đó dNTP có nồng độ
cao nhất, do đó [Mg
2+
] ít nhất phải là 0.5-2.5 mM cao hơn nồng độ của
dNTP.
2.1.3.7. Phụ gia
Phụ gia là những chất được bổ sung vào PCR nhằm thu các sản
phẩm PCR mong muốn nhiều hơn. Phụ gia thường dùng cho các phân đoạn
11

PCR rất dài, giàu GC hoặc dễ hình thành cấu trúc bậc hai. Các phụ gia
glycerol, formamide, NMP có tác dụng hạ thấp nhiệt độ bắt cặp vài độ và
giảm biến tính, trong khi đó DMSO giảm hình thành cấu trúc bậc hai.
2.1.3.8. Đệm PCR
Thường các kit thương mại đều cung cấp đệm đã pha sẵn. Nhưng
người ta có thể sử dụng nồng độ đệm PCR tự pha chế cao hơn để nâng cao
hiệu suất. Đệm bao gồm các thành phần: 16.6 mM ammonium sulfate, 67.7
mM Tris-HCl, pH 8.9, 10 mM
β-mercaptoethanol, 170 µg/ml BSA, 1.5-3
mM MgCl
2
.
Đệm PCR trong kit thường chứa các thành phần: 10-50 mM Tris-
HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl
2
hoặc cao hơn, 100 µg/ml gelatin
hoặc BSA, và/hoặc 0.05-0.1% chất tẩy rửa không ion như Tween-20 hoặc

Nonidet P-40 hoặc Triton X-100.
Nồng độ muối KCl hoặc NaCl cao hơn 50 mM sẽ ức chế Taq pol,
nhưng lại cần thiết để tạo điều kiện dễ dàng bắt cặp mồi.
Một số enzyme không cần bổ sung protein, một số khác lại phụ
thuộc vào nó. Một số enzyme hoạt động tốt hơn v
ới sự có mặt của chất tẩy
rửa, có lẽ do nó ngăn cản xu hướng tự nhiên của enzyme liên kết với nhau.
2.1.4. Chu trình nhiệt
2.1.4.1. Biến tính
Thường biến tính 0.5-2 phút ở 94-95
o
C là đủ, do sản phẩm PCR được
tổng hợp ở chu kỳ khuếch đại thứ nhất ngắn hơn đáng kể so với khuôn DNA
ban đầu và được biến tính hoàn toàn dưới các điều kiện này. Nếu DNA khuếch
đại có hàm lượng GC rất cao, thời gian biến tính có thể được tăng lên 3-4 phút.
2.1.4.2. Gắn mồi
12

Thường nhiệt độ bắt cặp tối thích thấp hơn 5
o
C so với nhiệt độ nóng
chảy của sợi kép mồi-khuôn DNA. Thời gian gắn mồi kéo dài 0.5-2 phút là đủ.
Tuy nhiên, nếu sản phẩm PCR không đặc hiệu thu được ngoài sản phẩm mong
đợi, nhiệt độ bắt cặp phải được tối ưu bằng cách tăng từng bước 1-2
o
C.
2.1.4.3. Kéo dài
Thường bước kéo dài mồi (tổng hợp) được thực hiện ở 70-75
o
C. Tốc độ

tổng hợp DNA bằng Taq DNA polymerase đạt cao nhất ở nhiệt độ này. Thời
gian tổng hợp phân đoạn PCR dài 2 kb được đề xuất là 1 phút. Khi khuếch đại
các phân đoạn PCR dài hơn, thời gian tổng hợp được tăng lên 1 phút cho mỗi
kb.
2.2. Chẩn đoán vi khuẩn lao bằng PCR
2.2.1. Chẩn đoán nhanh Mycobacterium tuberculosis bằng PCR
Với tác động ngày càng tăng của bệnh lao và sự xuấ
t hiện của các chủng
Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc, phương pháp chẩn đoán nhanh bệnh
lao phổi có một ý nghĩa quan trọng đối với sức khỏe cộng đồng. Ở các nước
phát triển, tác động cao hơn của bệnh lao không chỉ liên quan đến bệnh AIDS
và tình trạng vô gia cư mà còn liên quan đến tuổi của dân số. Mặc dù phổi là cơ
quan chịu ảnh hưởng trực tiếp, các dạng bệnh do bị nhiễm phải hay các b
ệnh
ngoài phổi là thường xuyên, được phát hiện đến khoảng 77% ở các bệnh nhân
bị nhiễm HIV và 24% ở các bệnh nhân không nhiễm HIV.
Sự có mặt của vi khuẩn lao trong máu đã được biết đến hơn 50 năm; tuy
nhiên, người ta chỉ mới nhận thấy sự xảy ra thường xuyên cho đến khi có đại
dịch AIDS. Ở thập kỷ trước, nuôi cấy trên môi trường máu đã trở thành công
cụ có ích cho việc phát hiện M. tuberculosis và nh
ững vi khuẩn lao khác ở các
bệnh nhân bị nhiễm HIV, đặc biệt ở những bệnh nhân có hàm lượng tế bào
CD4 thấp. Mặc dù những kinh nghiệm từ những bệnh nhân AIDS, thông tin về
lợi ích chẩn đoán của nuôi cấy trong môi trường máu ở những bệnh nhân
không bị nhiễm HIV còn giới hạn và vẫn không được khuyến khích.
13

PCR là một kỹ thuật sử dụng rộng rãi để chẩn đoán nhiều bệnh nhiễm
khuẩn, bao gồm bệnh lao. Trong nghiên cứu này, người ta áp dụng kỹ thuật
PCR để phát hiện DNA của M. tuberculosis ở những mẫu máu của bệnh nhân

với một phổ rộng bệnh nhân nhiễm lao, gồm cả bệnh nhân không bị nhiễm HIV
cũng như bị nhiễm HIV.
Phương pháp thực hiện
Lấy mẫu máu ở vùng ngoại biên cho vào tube có chứa sẵn dung dịch
chống đông tụ EDTA và phân tích mẫu. Toàn bộ mẫu trong tube được trải trên
dung dịch Ficol-Hypaque và ly tâm 400 vòng trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.
Phần kết tủa được rửa 2 lần với muối phosphate-buffered (10 mM phosphate
buffer [pH 7.2], 150 mM NaCl). Tế bào, 10
6
, được ly tâm 9000 vòng trong 15
phút, và được ủ trong 100 µl buffer phân giải (50 mM Tris-HCl [pH 8], 50 mM
KCl, 2.5 mM MgCl
2
, 0.45% Tween 20, 0.45% Nonidet P-40) có chứa 100 µg
enzyme proteinase K trên mỗi ml ở 56
o
C trong 3h và sau đó nâng nhiệt độ biến
tính ở 95
o
C trong 10 phút.
Tất cả các mẫu được phân tích với 1 cặp primer (PCO4-GH20) khuếch
đại 1 vùng của gene β-globin, với sự biến đổi như sau: các phản ứng PCR được
thực hiện với thể tích cuối là 25 µl chứa 1.5 mM MgCl
2
và 12.5 µl dung dịch
dung giải mẫu. Tiến trình này cho phép sự định lượng toàn bộ DNA tế bào và
sự có mặt của tác nhân ức chế của Taq polymerase.
Sự khuếch đại được tiến hành như đã được mô tả, sử dụng kỹ thuật khởi
động nóng ( hot start technique). Phản ứng phát hiện 1 vùng 123-bp từ trình tự
chèn IS 6110 là phức hợp chuyên biệt của M. tuberculosis. PCR được thực hiện

trong 1 chu kỳ nhiệt DNA ( Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Conn). Phản ứ
ng
khuếch đại được thực hiện với thể tích 25 µl chứa 10 mM Tris-HCl (pH 8.3),
50 mM KCl, 1.5 mM MgCl
2
, 0.01% gelatin, 0.2 mM mỗi deoxynucleoside
triphosphate, primers (1mM mỗi loại), và 100000 PBMC.
Sau khi hỗn hợp phản ứng đạt 82
o
C, 0.625 unit Taq pol được thêm vào.
Sau đó mẫu được biến tính ở 94
o
C trong khoảng 5 phút, và thực hiện 30 chu kỳ
khuếch đại với quy trình như sau: biến tính ở 94
o
C trong 2 phút, bắt cặp ở
14

68
o
C trong 2 phút, và kéo dài với mồi ở 72
o
C trong 2 phút. Thời gian kéo dài
được tăng thêm 5s với mỗi chu kỳ tiếp theo.
Sau khi khuếch đại, 10µl hỗn hợp phản ứng được điện di trong ethidium
bromide- có chứa 2% gel agarose và quan sát bằng tia UV. DNA được chuyển
qua màng nylon bằng alkaline blotting. Lai phân tử được thực hiện trong 53
SSPE (0.75 M NaCl, 50 mM sodium phosphate [pH 7.7], 5 mM EDTA)- dung
dịch 13 Denhardt’s- 1% sodium dodecyl sulfate (SDS)–10% dextran sulfate ở
55

o
C để qua đêm với mẫu dò đánh dấu
32
P. Sự bắt cặp đặc hiệu của mẫu dò
khoảng 108 cpm/mg, xấp xỉ 107 cpm được sử dụng trong phản ứng lai. Sau đó,
màng lai được rửa trong 2x SSPE- 0.1 % SDS ở 55
o
C và được đưa vào máy ….
Có chứa các màng hình khuếch đại trong khoảng 2 đến 24 h ở -70
o
C.
Mẫu dương tính được nhìn thấy trong kỹ thuật phóng xạ tự ghi. Trong
tất cả các trường hợp, kết quả đạt được từ các mẫu nhân bản là giống nhau
hoàn toàn.
15



2.2.2. Xác định đặc hiệu loài của Mycobacterium bovis bằng PCR
Kỹ thuật RAPD được sử dụng trong xác định đoạn đặc hiệu loài của
Mycobacterium bovis. Một đọan DNA có kích thước khoảng 500 bp được
khuếch đại từ bộ gene của 15 dòng M. bovis, bao gồm cả M. bovis BCG
Pasteur, nhưng không có mặt trong 26 vi khuẩn lao khác và 20 dòng khác của
Mycobacterium tuberculosis. Khi đoạn DNA được sử dụng như là một mẫu dò
trong phương pháp Southern blot, một vài band có hoạt tính phóng xạ thu
ộc về
16

M. tuberculosis và M. bovis được quan sát. Tuy nhiên, đoạn DNA này lai đặc
hiệu với đoạn EcoRI 2900bp trên bộ gene của M. bovis, nhưng lại không lai

với DNA nhiễm sắc thể của M. avium. Dựa trên tỷ lệ trình tự nucleotide của
đoạn 500 bp, hai primer oligonucleotide được thiết kế và tiến hành phản ứng
PCR. Sử dụng mẫu DNA vi khuẩn lao đã tinh sạch, chỉ có M. bovis và M.
bovis BCG cho ra band khuếch đai duy nhất. Phản ứng PCR này có thể phát
hiện được 10 fg DNA M. bovis đã tinh sạch. Thí nghi
ệm này cũng được sử
dụng trong xác định trực khuẩn trực tiếp từ mẫu sinh vật không qua nuôi cấy,
ví dụ như sữa.
Phương pháp thực hiện
Các dòng vi khuẩn lao được sử dụng cho ở bảng 1 được cho tăng trưởng
trên môi trường Sauton loặc Lowensttein- Jensen, thu hoạch và bảo quản ở 4
o
C.
Các dòng M. bovis được phân lập từ các con thú bị nhiễm. Các dòng M.
tuberculosis phân lập được lấy từ phòng thí nghiệm vi sinh, bệnh viện San Juan
de Dios. Tất cả các dòng được phân loại bằng các thử nghiệm sinh hóa và vi
sinh theo tiêu chuẩn.
17


Ly trích DNA nhiễm sắc thể: Đối với tinh sạch DNA quy mô nhỏ, một
vòng tròn trên khuẩn lạc trưởng thành được tổng hợp lại trong TE ( 10 mM
Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA) và được rửa 3 lần với cùng loại buffer. Vi khuẩn
được ủ khoảng 1h ở 37
o
C với sự có mặt của lysozyme (2 mg/ml). Vách tế bào
được phá vỡ bằng cách từ từ tăng nhiệt độ lên 60
o
C và thêm vào SDS và
proteinase K (Bethesda Research Laboratory) đến nồng độ cuối 1% (w/v) và

250 µg/ml. Sau 1.5h, DNA được ly trích với phenol/ chloroform và kết tủa với
0.6 V 2-propanol. Phần lắng được rửa với 70% (v/v) ethanol và được tăng sinh
lại trong 30-50 µl nước cất; 10 µl mẫu được sử dụng trong kỹ thuật RAPD,
hoặc trong phản ứng PCR đặc hiệu.
18

Các primer được sử dụng trong kỹ thuật RAPD được liệt kê trong bảng
2. Các trình tự oligonucleotide được thiết kế theo hàm lượng GC của bộ gene vi
khuẩn lao, và sử dụng chương trình Oligo version 4.0 ( National Biosciences).
Các primer được tổng hợp bởi phương pháp phosphite triester pha rắn theo
Pharmacia LKB Gene Assembler Special.
19

Khuếch đại bằng kỹ thuật RAPD: Thực hiện phản ứng với 50 µl có chứa
10µl DNA, 1x buffer phản ứng ( Gene amp kit, Perkin Elmer Cetus), 2.5 đơn vị
Taq pol, 0.2 mM mỗi deoxynucleoside triphosphate, và 75 pmol mỗi primer.
Phản ứng được thực hiện theo chu kỳ nhiệt DNA Perkin Elmer. Phản ứng được
thực hiện trong 30 chu kỳ khuếch đại với bước biến tính ở 94
o
C trong 1 phút,
bắt cặp trong 30s ở nhiệt độ nóng chảy (T
m
, bảng 2) của primer, và bước kéo
dài 1 phút ở 72
o
C.
Phân tích sản phẩm RAPD: 5µl mẫu từ thử nghiệm RAPD được phân
tích bởi điện di trên gel với 1% (w/v) gel agarose. DNA được quan sát bằng
cách nhuộm với ethidium bromide ( 0.5 µg/ml; Sigma) và gel được chiếu qua
tia UV. Các sản phẩm khuếch đại được đưa lên màng gắn mẫu dò Z-probe

(Bio- Rad) để lai phân tích. Đoạn đặc hiệu được khuếch đại bằng kỹ thuật
RAPD, dài xấp xỉ 500bp, được tinh sạch từ gel agarose sử dụng bộ Geneclean
kit (Bio 101). Đoạn khu
ếch đại (10 ng) được đánh dấu với Rediprine kit (
Amersham) sử dụng [α-32P] dCTP ( Amersham).
Màng Z-probe có chứa sản phẩm RAPD từ các dòng mycobacteria khác
nhau được lai với probe đã đánh dấu ( 1x10
6
cpm/ml) ở 42
o
C ủ qua đêm trong
dung dịch chứa 50% ( v/v) formamide, 0.12 M Na
2
HPO
4
, pH 7.2, 0.25 M
NaCl, và 7% (w/v) SDS. Sau khi lai, màng được rửa khoảng 15 phút trong 2x
SSC ( SSC: 0.15 M NaCl, 0.015 M sodium citrate)/ 0.1% SDS ở 42
o
C; 30 phút
trong 1x SSC/0.1%SDS ở 65
o
C, và được để dưới tia X-Omat Kodak ở -70
o
C
qua đêm.
Đối với phương pháp lai Southern, 5 µg DNA của M. tuberculosis,
M.bovis và M. avium được phân cắt hoàn toàn nhờ EcoRI. Quá trình lai được
thực hiện như đã mô tả ở trên.
Tạo dòng và giải trình tự đoạn chuyên biệt. Đoạn DNA đã tinh sạch

được dòng hóa vào plasmid pCR 1000 ( Invitrogene) và giải trình tự nucleotide
của clone pLD1 được thực hiện bằng cách sử dụng T7 và M13 theo hướng
primer với Sequenase kit từ USB ( Sanger et al., 1977).
20

Khuếch đại bằng PCR. Dựa trên tỷ lệ trình tự nucleotide của đoạn 500bp
đặc hiệu, 1 cặp mồi được thiết kế cho việc sử dụng PCR đặc hiệu ( bảng 2).
Điều kiện phản ứng được thực hiện tối đa trong 30 chu kỳ, với chu kỳ nhiệt
như sau: bước biến tính ở 94
o
C trong vòng 1 phút, bước bắt cặp ở 68
o
C trong 1
phút, bước tổng hợp ở 72
o
C trong 1 phút.

21


22


III. KẾT LUẬN
Kỹ thuật PCR, với những ưu điểm của nó, đang ngày càng được sử dụng
rộng rãi trong chẩn đoán và xét nghiệm các bệnh trên người cũng như là trên
gia súc gia cầm. Việc chẩn đoán sớm vi khuẩn lao sẽ giúp đưa ra hướng điều trị
thích hợp nhằm tránh tình trạng uống thuốc không đúng bệnh, như vậy rất dễ
tạo ra các ch
ủng vi khuẩn kháng thuốc. Hy vọng trong tương lai không xa

người ta có thể ngăn chặn được sự lây lan của vi khuẩn lao trên người cũng như
trên gia súc gia cầm.
23


TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Ngọc Hải, 2007. Công nghệ sinh học trong thú y. NXB Nông nghiệp.
2. Quyền Đình Thi, Nông Văn Hải, 2008. Công nghệ sinh học- Tập II, Những kỹ
thuật PCR và ứng dụng trong phân tích DNA. NXB Khoa học tự nhiên và công
nghệ.
3. www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=228836

4. www.scielo.br/pdf/bjm/v40n2/v40n2a04.pdf

5. .v n/Site/vi‐VN/64/109/13847/Default.aspx
6. www.anova.com.vn/ /article.asp?











