Chương 2: KỸ THUẬT PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT docx

Chương 2:

KỸ THUẬT PHÒNG THÍ NGHIỆM
NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO
THỰC VẬT
Ni cấy mơ (tissue
culture) là một nhánh của sinh
học, trong đó, mơ hay tế bào
được ni cấy nhân tạo trong
một mơi trường có kiểm sốt.

Nhân giống
in vitro th
ự
c
v
ậ
t
hay vi nhân giống thực vật
(micropropagation) là phương
thức nuôi cấy tế bào, cơ quan
thực vật trong ống nghiệm, bình
ni cấy, ở điều kiện vô trùng,
nhằm mục đích nhân nhanh
giống, mang lại hiệu quả kinh tế
cao.

KHÁI NIỆM

Gồm 05 điểm nổi bật:

- Nhân nhanh các giống cây: hệ số nhân giống cao.

- Cây giống sau khi nuôi cấy có sự đồng nhất về mặt
di truyền.

- Loại sạch bệnh cây, đảm bảo các cây giống khỏe
mạnh, có sức tăng trưởng nhanh.

- Chủ động nguồn giống cây trồng cho sản xuất.

- Trẻ hóa vật liệu giống.
ƯU ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP
VI NHÂN GIỐNG THỰC VẬT
Gồm 03 điểm nổi bật:

- Hạn chế về chủng loại sản phẩm.

- Chi phí sản xuất cao: Vi nhân giống đòi hỏi
nhiều lao động kỹ thuật thành thạo.

- Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: đặc
biệt là các biến dị di truyền.
NHƯỢC ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP
VI NHÂN GIỐNG THỰC VẬT
Các yếu tố đảm bảo sự thành công trong nuôi
cấy mô thực vật là gì?

2.1 Bảo đảm điều kiện vô trùng

2.2 Chọn đúng môi trường và chuẩn bị

môi trường đúng cách

2.3 Chọn mô cấy thích hợp, xử lý mô
cấy thích hợp trước và sau khi cấy

2.1 BẢO ĐẢM ĐIỀU KIỆN VÔ TRÙNG
Ý NGHĨA CỦA VÔ TRÙNG TRONG VI
NHÂN GIỐNG THỰC VẬT

Môi trường nuôi cấy mô thực vật có chứa
đường, muối khoáng và vitamin, là môi trường thích
hợp cho các loài nấm, vi khuẩn phát triển.

Tốc độ phân chia tế bào của nấm và vi khuẩn lớn
hơn rất nhiều so với tế bào thực vật. Nếu môi trường
nuôi cấy bị nhiễm vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau
vài ngày đến một tuần, toàn bộ bề mặt môi trường nuôi
cấy và mẫu cấy sẽ phủ đầy nấm, khuẩn, thí nghiệm
chắc chắn phải loại bỏ.
Để đảm bảo điều kiện vô trùng trong
quá trình nuôi cấy, đòi hỏi chúng ta
phải thực hiện các yêu cầu:
- Vô trùng mô cấy.
- Vô trùng dụng cụ thủy tinh, môi trường và
nút đậy.
- Trong thao tác nuôi cấy cần tránh làm rơi
nấm, khuẩn lên bề mặt môi trường.
VÔ TRÙNG MÔ CẤY
Mô cấy có thể là các bộ phận khác nhau của
thực vật, tùy theo sự tiếp xúc với môi trường bên ngoài

mà các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn, nấm.

Phương pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến hiện
nay là dùng các chất hóa học có hoạt tính diệt nấm,
diệt khuẩn. Hiệu lực diệt nấm, diệt khuẩn của các chất
này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả
năng xâm nhập trên bề mặt mô cấy.
Tác nhân vô trùng Nồng độ (%)Thời gian xử lý (phút) Hiệu quả

Hypochlorite canxi 9 – 10 5 – 30 Rất tốt
Hypochlorite natri 2 5 – 30 Rất tốt
Hydroperoxid (H
2
O
2
) 10 – 12 5 – 15 Tốt
Nước Brom 1 – 2 2 – 10 Rất tốt
HgCl
2
0,1 – 1 2 – 10 Trung bình
Chất kháng sinh 4 – 50 (mg/l) 30 – 60 Khá tốt
Nồng độ và thời gian sử dụng một số chất diệt
nấm, diệt khuẩn có thể dùng để xử lý mô cấy:
Lưu ý:
Trong quá trình xử lý mô cấy phải ngập hoàn
toàn trong dung dịch diệt nấm, khuẩn.

Với các bộ phận có bám nhiều cát, bụi trước khi
xử lý cần rửa sạch bằng xà phòng và nước máy.

Sau khi xử lý xong, mô cấy được rửa sạch nhiều
lần bằng nước cất vô trùng và loại bỏ những phần bị
hoại tử trước khi đặt mô cấy lên môi trường.
Quy trình khử trùng mẫu thực sinh:
Mẫu thực sinh
Rửa kĩ bằng xà phòng và nước máy
Cho vào bình tam giác
Ngâm trong cồn 70
0
C (khoảng 30 giây)
Rửa bằng nước cất vô trùng 3 lần
Tiếp tục ngâm trong dung dịch diệt khuẩn (khoảng 15 - 20 phút) với 05 giọt Tween 80
Rửa bằng nước cất vô trùng 3 lần
Cắt bỏ những phần mô bị tác nhân vô trùng làm hoại tử (trắng)
Đặt lên môi trường nuôi cấy
VÔ TRÙNG DỤNG CỤ THỦY TINH,
MÔI TRƯỜNG VÀ NÚT ĐẬY
Dụng cụ thủy tinh, môi
trường và nút đậy của chai lọ
hay dụng cụ thủy tinh được vô
trùng bằng cách hấp khử trùng ở
nhiệt độ 121
0
C, áp suất 1atm
trong thời gian 15 – 20 phút.
o
C
o
F Tác động đến vi sinh vật
121 250 Nhiệt hơi nước tiêu diệt hoàn toàn vi sinh vật và bào tử (15 – 20 phút)

116 240 Nhiệt hơi nước tiêu diệt hoàn toàn vi sinh vật và bào tử (30 – 40 phút)
110 230 Nhiệt hơi nước tiêu diệt hoàn toàn vi sinh vật và bào tử (60 – 80 phút)
100 212
Nhiệt độ sôi của nước có khả năng tiêu diệt tế bào dinh dưỡng nhưng
không tiêu diệt được bào tử
82 – 93 179 – 200
Tiêu diệt hoàn toàn tế bào đang phát triển vi khuẩn, nấm men, nấm mốc
62 – 82 151 – 180 Các vi sinh vật ưa nhiệt vẫn phát triển được
60 – 77 140 – 171
Pasteur hóa, tiêu diệt phần lớn vi sinh vật gây bệnh trong sữa, nước quả,
trừ bào tử của chúng
16 – 38 61 – 100 Các loài nấm men, nấm sợi, vi khuẩn phát triển mạnh
10 – 16 50 – 61 Các loài ưa lạnh phát triển mạnh
0 32 Các loài vi sinh vật ngừng phát triển
– 18 0 Vi khuẩn ở trạng thái chết
– 251 – 420 Rất nhiều loài vi sinh vật không bò chết trong hydrogen lỏng
Buồng cấy: là buồng có diện tích nhỏ, có hai
lớp cửa. Buồng cấy cần lát gạch tráng men, tường sơn
có thể lau rửa được. Trước mỗi lần sử dụng, buồng cấy
cần được xử lý vơ trùng sơ bộ.

Các dụng cụ mang vào buồng cấy đều cần phải
được khử trùng: áo chồng, mũ, khẩu trang, dao kéo,
kẹp, giấy bọc, bông, ống nghiệm, v.v

Tủ cấy: là loại tủ có thiết bò thổi không khí vô
trùng vào vị trí thao tác cấy.
KỸ THUẬT CẤY VƠ TRÙNG
KỸ THUẬT CẤY VÔ TRÙNG
• Vô trùng dụng cụ trong nuôi cấy

• Rữa tay bằng xà phòng và nước trước khi cấy
• Lau cồn mặt bàn tủ cấy vô trùng
• Dùng ngọn lửa đèn cồn để vô trùng pince, dao cấy,
kéo,
• Tránh quơ tay ngang qua các dụng cụ vô trùng trong
tủ cấy.
• Đậy các dụng cụ và môi trường vô trùng sau mỗi thao
tác
• Hạn chế nói chuyện trong phòng cấy.
2.2 CHỌN ĐÚNG MÔI TRƯỜNG VÀ
CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG ĐÚNG CÁCH
Thành phần của môi trường nuôi cấy thay đổi
tùy theo loài thực vật, loại tế bào, mô và cơ quan nuôi
cấy.

Đối với cùng một loại mô, cơ quan nhưng mục
đích nuôi cấy không giống nhau, môi trường sử dụng
cũng khác nhau.

Môi trường nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạn
sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy.
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật có
hàng trăm loại môi trường khác nhau. Tuy nhiên
có thể chia chúng thành 3 nhóm:
- Môi trường nghèo dinh dưỡng: điển
hình là môi trường Knop, môi trường Knudson C;
- Môi trường trung bình: điển hình là môi
trường môi trường White; môi trườnng B5 của

Gamborg;
- Môi trường giàu dinh dưỡng: điển hình
là môi trường Murashige – Skoog (môi trường
MS).
PHÂN LOẠI MƠI TRƯỜNG NI CẤY
Các thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy:
• Khoáng đa lượng và vi lượng.

• Nguồn cacbon.

• Các vitamin.

• Chất kích thích sinh trưởng.

• Các chất bổ sung, các amino acid và các chất
làm thay đổi trạng thái môi trường,…
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
KHỐNG ĐA LƯỢNG
Nguồn nitơ
: gồm các dạng: amon, nitrat và
amino acid (canxi nitrat, kali nitrat, natri nitrat hay
amon nitrat (NH
4
NO
3
), amon sulphat).

Nguồn phospho:
thường dùng nhất là NaH
2

PO
4

.7H
2
O và KH
2
PO
4
. Nồng độ phospho trong môi
trường biến thiên từ 0,15 đến 4,00mM, thường
dùng khoảng 1,00mM.

Nguồn kali:
kali nitrat, kali chlorua, kali
phosphat. Nồng độ K
+
trong môi trường biến thiên
từ 2 đến 25 mM, trung bình khoảng 10mM.
KHỐNG ĐA LƯỢNG
Nguồn canxi:
muối canxi nitrat, canxi
chlorua. Nồng độ Ca2
+
trong môi trường từ 1,0 đến
3,5mM, trung bình là 2,0mM.

Nguồn magiê:
magiê sunphat, với nồng độ
trong môi trường khoảng 0,5 – 3,0mM.

Nguồn sắt:
Những môi trường cổ điển dùng
sắt ở dạng chlorua sắt FeCl
2
sulphat sắt, citrat sắt
Fe(C
4
H
4
O
6
). Hiện nay hầu hết các phòng thí
nghiệm đều dùng sắt ở dạng chelat kết hợp với
Na
2
-ethylen diamintetraacetat (EDTA).
KHỐNG VI LƯỢNG
Tên vi lượng Dạng sử dụng Nồng độ (µm)

Mangan (Mn) MnSO
4
.4H
2
O 15 – 100
Bo (B) H
3
BO
3
6 – 100

Kẽm (Zn) ZnSO
4
.7H
2
O 15 – 30
Đồng (Cu) CuSO
4
.5H
2
O 0,04 – 0,08
Molypden (Mo) (NH
4
)
6
Mo
7
O
24
.4H
2
O 0,007 – 1,0
NaMoO
4
.2H
2
O
Coban (Co) CoCl
2
.6H
2

O 0,1 – 0,4
Iốt (I) KI 2,5 – 20,0

Hai dạng đường thường sử dụng nhất là
saccharose và glucose.

Tùy theo mục đích nuôi cấy, loại mẫu cấy và
giai đoạn sinh trưởng của mẫu cấy, nồng độ saccharose
biến đổi từ 1-6% (w/v), thông dụng nhất là 2%, tương
ứng với 58,4mM.
NGUỒN CACBON – ĐƯỜNG