TIỂU LUẬN môn hóa SINH THỰC PHẨM đề tài các kỹ THUẬT hóa SINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP. HCM
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

TIỂU LUẬN
MƠN: HĨA SINH THỰC PHẨM
Đề tài:

CÁC KỸ THUẬT HĨA SINH

HỌC VIÊN: Cao Hồ Kim Ngân
Mã học viên: 2070083
GVHD: TS. Võ Đình Lệ Tâm

Tháng 12 /2020

6

0


TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP. HCM
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

TIỂU LUẬN
MƠN: HĨA SINH THỰC PHẨM
Đề tài:

CÁC KỸ THUẬT HĨA SINH

Tháng 12 /2020

6

0


MỤC LỤC
DANH MỤC HÌNH ẢNH..............................................................................................i
CHƯƠNG I: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HIGH
PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY – HPLC).....................................1
1.1. Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng.......................................................................1
1.2 Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao...................................................1
1.2.1 Pha động trong sắc ký lỏng............................................................................1
1.2.2 Bộ phận khử khí (degasser)............................................................................2
1.2.3 Bơm (pump)...................................................................................................2
1.2.4 Injector, Autosampler.....................................................................................2
1.2.5 Cột sắc ký.......................................................................................................2
1.2.6 Đầu dò (detector)............................................................................................3
1.2.7 Bộ xử lý dữ liệu..............................................................................................4
1.2.8 Dung môi thải.................................................................................................4
1.2.9 Dây nối...........................................................................................................4
1.2.10 Thiết kế gradients.........................................................................................4
1.3 Phân tích bằng HPLC...........................................................................................6
1.3.1 Phân tích định tính.........................................................................................6
1.3.2 Phân tích định lượng......................................................................................7
1.3.3 Phương pháp nội chuẩn..................................................................................7
1.4 Chuẩn bị mẫu.......................................................................................................7
1.4.1 Chiết lỏng - lỏng............................................................................................8
1.4.2 Chiết pha rắn..................................................................................................8
1.5 Ưu và nhược điểm của phương pháp....................................................................8
1.5.1 Ưu điểm.........................................................................................................9

1.5.2 Nhược điểm....................................................................................................9
1.6 Sự cố và xử lý.......................................................................................................9
1.6.1 Đường nền bị nhiễu........................................................................................9
1.6.2 Trôi đường nền cơ sở....................................................................................10
1.6.3 Hình dạng đỉnh kém.....................................................................................10
CHƯƠNG 2: POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)........................................11
2.1 Nguyên tắc của phương pháp PCR.....................................................................11
2.1.1 Giai đoạn biến tính.......................................................................................11
2.1.2 Giai đoạn lai ghép........................................................................................12
2.1.3 Giai đoạn kéo dài.........................................................................................12

6

0


2.2 Thành phần chủ yếu của phương pháp PCR.......................................................14
2.2.1 Đoạn mồi (primers)......................................................................................14
2.2.2 DNA polymerase (Taq polymerase).............................................................14
2.2.3 Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs)......................................................14
2.2.4 DNA đích từ mẫu.........................................................................................15
2.2.5 Dung dịch đệm.............................................................................................15
2.2.6 Magie clorua (MgCl2)..................................................................................15
2.3 Phát hiện và phân tích sản phẩm PCR................................................................15
2.4 Ưu và nhược điểm của phương pháp..................................................................15
2.4.1 Ưu điểm.......................................................................................................15
2.4.2 Nhược điểm..................................................................................................16
2.5 Sự cố và xử lý sự cố...........................................................................................16
2.5.1 Không khuếch đại DNA...............................................................................16
2.5.2 Sản phẩm không đặc hiệu.............................................................................17

CHƯƠNG 3: ENZYMEE-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)............17
3.1 Nguyên tắc chung của ELISA............................................................................17
3.2 Các loại ELISA..................................................................................................18
3.2.1 ELISA trực tiếp............................................................................................18
3.2.2 ELISA cạnh tranh.........................................................................................19
3.2.3 ELISA gián tiếp............................................................................................20
3.2.4 ELISA cạnh tranh gián tiếp..........................................................................21
3.2.5 Sandwish ELISA..........................................................................................22
3.4 Quy trình thực hiện kiểm tra mẫu bằng bộ kit ELISA........................................24
3.4.1 Chuẩn bị chất chuẩn.....................................................................................24
3.4.2 Chuẩn bị dung dịch rửa................................................................................24
3.4.3 Các bước phân tích.......................................................................................24
3.4.4 Giai đoạn đọc kết quả...................................................................................25
3.5 Ưu và nhược điểm của phương pháp ELISA......................................................26
3.5.1 Ưu điểm.......................................................................................................26
3.5.2 Nhược điểm..................................................................................................26
CHƯƠNG 4: PULSED FIELD GEL ELECTROPHORESIS (PFGE).........................26
4.1 Nguyên tắc..........................................................................................................26
4.2 Thiết bị và quy trình thực hiện............................................................................27
4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ chính xác của phương pháp.................................28
4.3.1 Thời gian xung (thời gian chuyển đổi, khoảng thời gian chuyển đổi)..........28

6

0


4.3.2 Cường độ trường..........................................................................................30
4.3.3 Định hướng lại góc.......................................................................................30
4.3.4 Nồng độ agarose trong gel............................................................................31

4.3.5 Thành phần và nhiệt độ của đệm điện di......................................................31
4.4 Ưu và nhược điểm của phương pháp..................................................................31
4.4.1 Ưu điểm.......................................................................................................31
4.4.2 Nhược điểm..................................................................................................31
CHƯƠNG 5: SẮC KÝ KHÍ (GC)...............................................................................32
5.1 Nguyên tắc của sắc ký khí..................................................................................32
5.2 Chọn điều kiện chạy sắc ký................................................................................34
5.2.1 Cột................................................................................................................ 34
5.2.2 Lựa chọn khí mang.......................................................................................34
5.2.3 Tối ưu hóa chương trình nhiệt độ lị cột.......................................................35
5.2.4 Tối ưu hóa loại đầu phun, nhiệt độ và thể tích tiêm......................................35
5.2.5 Lựa chọn pha tĩnh.........................................................................................36
5.2.6 Tối ưu hóa đầu dị và nhiệt độ đầu dò..........................................................36
5.3 Kỹ thuật chuẩn bị mẫu........................................................................................37
5.4 Ưu và nhược điểm của phương pháp..................................................................37
5.4.1 Ưu điểm.......................................................................................................37
5.4.2 Nhược điểm..................................................................................................38
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................39

6

0


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao.........................................................................3
Hình 1.2 Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC.........................................................................5
Hình 1.3 Sắc ký đồ của mẫu chạy đẳng dịng................................................................5
Hình 1.4 So sánh hai giản đồ của sự phân tách bằng chế độ đẳng dịng (trái) và
gradient (phải)................................................................................................................6

Hình 1.5 Quy trình chiết pha rắn....................................................................................8
Hình 2.1 Giai đoạn biến tính DNA mẫu.......................................................................12
Hình 2.2 Giai đoạn lai..................................................................................................12
Hình 2.3 Giai đoạn kéo dài..........................................................................................13
Hình 2.4 Sơ đồ tổng hợp các bước của phương pháp PCR..........................................14
Hình 3.1 Nguyên lý hoạt động của phương pháp ELISA.............................................18
Hình 3.2 ELISA trực tiếp để phát hiện kháng nguyên (a) và kháng thể (b)..................18
Hình 3.3 ELISA cạnh tranh để phát hiện kháng nguyên (a) và kháng thể (b)..............19
Hình 3.4 ELISA gián tiếp để phân tích kháng thể........................................................21
Hình 3.5 ELISA cạnh tranh gián tiếp để phát hiện kháng nguyên................................22
Hình 3.6 Sandwich ELISA để phát hiện kháng nguyên đặc hiệu.................................23
Hình 3.7 Máy rửa (a), đầu đọc kết quả (b) và máy in (c) được sử dụng trong quy trình
ELISA..........................................................................................................................25
Hình 4.1 Sơ đồ thể hiện cơ chế phân đoạn DNA trong quá trình điện di trên gel trường
xung.............................................................................................................................27
Hình 4.2 Giản đồ thể hiện hình dạng điện cực trong các dụng cụ thường dùng cho điện
di gel trường xung........................................................................................................28
Hình 4.3 Ví dụ về phân đoạn và xác định kích thước của DNA nhiễm sắc thể bằng điện
di trên gel trường xung với đoạn dốc thời gian xung...................................................29
Hình 5.1 Sơ đồ của hệ thống sắc ký khí.......................................................................33

i

6

0


CHƯƠNG I: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HIGH
PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY – HPLC)

1.1. Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng (Meyer, 2005)
Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn hoặc
chất lỏng và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn, lỏng - lỏng). Mẫu phân tích
được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất
phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất
phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hố của các chất khác nhau, nên khả
năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau, chúng di chuyển với
tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.
1.2 Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (Meyer, 2005)
1.2.1 Pha động trong sắc ký lỏng
Pha động hoặc chất rửa giải là dung mơi có độ tinh khiết cao hoặc hỗn hợp các
dung môi.
Các chất phụ gia như muối, axit, bazơ, thuốc thử, cũng có thể được hịa tan trong
pha động và phải tan hoàn toàn.
Chất rửa giải cần phải được lọc qua màng 0,45μm, để giữ lại các hạt mịn lớn hơn
0,5 µm trên màng. Nó khơng được can thiệp vào phương pháp phát hiện; ví dụ, nếu sử
dụng máy dị UV thì pha động cần phải trong suốt về mặt quang học ở bước sóng đã
chọn.
Nên mua dung mơi có chuyên dụng cho máy HPLC. Ngay cả nước, một thành
phần phổ biến của chất rửa giải, phải đạt cấp HPLC nếu phịng thí nghiệm khơng được
trang bị hệ thống lọc nước tạo ra nước siêu tinh khiết. Các chất phụ gia cũng phải
tương thích với máy dị.
Pha động có thể chia làm 2 loại:
- Pha động có độ phân cực cao: có thành phần chủ yếu là nước, tuy nhiên để
phân tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi để giảm độ phân cực. Pha động loại
này được dùng trong sắc ký pha ngược.
- Pha động có độ phân cực thấp: là các dung mơi ít phân cực như cyclopentan,
n-pentan, n-heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS2), CCl4, toluene…
Để tách một nhóm chất thơng thường pha động một thành phần đôi khi không
đáp ứng được khả năng rửa giải, người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có

1

6

0


được dung mơi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích. Sự thay
đổi thành phần pha động đôi khi diễn ra theo thời gian, trường hợp này người ta gọi là
gradient pha động.
1.2.2 Bộ phận khử khí (degasser)
Bộ khử khí là một phần của thiết bị HPLC. Khử khí cho phép máy bơm và máy
dị hoạt động bình thường.
Ngồi ra, nó làm giảm nhiễu của đường cơ sở của sắc ký đồ, do đó khử khí là bắt
buộc trong phân tích vết. Nó có thể được thực hiện bằng cách sử dụng hệ thống chân
khơng dịng chảy có màng thấm khí hoặc bằng cách làm sạch bình chứa dung mơi
bằng heli.
1.2.3 Bơm (pump)
Q trình phân tách HPLC được thực hiện ở áp suất 50–300 bar (0,5–3 × 107 Pa).
Tốc độ dịng chảy thường nằm trong khoảng từ 0,5 đến 2 ml/phút (hoặc trong
khoảng 0,1 ml /phút nếu sử dụng cột có lỗ hẹp).
Máy bơm phải cung cấp dịng pha động chính xác ở bất kỳ tốc độ dịng nào mà
khơng có xung nhịp, bất kể độ nhớt của dung môi và áp suất ngược của cột.
1.2.4 Injector, Autosampler
Thể tích mẫu thường sử dụng để phân tích bằng HPLC là từ 10 đến 100 µl.
Mẫu có thể được bơm thủ cơng vào van tiêm hoặc sử dụng bộ lấy mẫu tự động.
Bộ lấy mẫu tự động là được sử dụng phổ biến trong hầu hết các thiết bị HPLC. Các
mẫu cần phân tích được cho vào các lọ nhỏ (có thể tích ví dụ 2 ml), đậy nắp và để vào
giá đựng mẫu. Giá đỡ làm mát có sẵn trên thị trường để khảo sát các mẫu không bền
nhiệt. Lượng mẫu tối thiểu cần thiết cho bộ lấy mẫu tự động là từ 10 µl (trong những

trường hợp tối ưu và nếu thể tích mẫu được bơm vào khơng cao hơn 1–3 µl) và 50 µl,
tùy thuộc vào cấu tạo và chi tiết lọ. Không có thiết bị lấy mẫu tự động nào có thể bơm
tồn bộ lượng chất lỏng có trong lọ; một phần của nó sẽ được để lại.
Tiêm mẫu thủ cơng cũng là một lựa chọn nếu khơng có đủ mẫu. Thay vì các lọ,
cũng có thể tiêm trực tiếp từ các đĩa giếng nếu sử dụng giá đỡ thích hợp.
1.2.5 Cột sắc ký
Cột là phần quan trọng nhất của máy sắc ký vì sự phân tách diễn ra ở đây. Nó là
một ống thép khơng gỉ có đường kính trong 2 – 4,6 mm và chiều dài 5–30 cm.

2

6

0


Cột được nhồi các hạt có cở đường kính 3, 4, 5, 10 µm. Chất nhồi trong cột
thường là silicagen hoặc silicagen có bọc hoặc gắn hóa học một màng mỏng chất hữu
cơ. Bên cạnh silicagen người ta còn dùng Al2O3, hạt polime xốp, hạt chất trao đổi ion.
Các cột vi mơ có đường kính trong nhỏ hơn 1 mm cũng có sẵn và chỉ nên được
sử dụng với các thiết bị HPLC vi mô được thiết kế đặc biệt. Cột được lắp đặt giữa van
kim phun và đầu báo.

Hình 1.1 Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao
Hầu hết các cột đều khơng có hướng dịng chảy định trước nhưng một khi cột đã
được sử dụng, dịng chảy khơng được đảo ngược.
Tiền cột là bộ phận được gắn giữa kim phun và cột để bảo vệ cột khỏi bụi bẩn
hoặc các chất gây tắc nghẽn. Tiền cột khá rẻ và được thay thế khi cần thiết.
Đối với nhiều sự phân tách, cần phải kiểm soát nhiệt độ cột hoặc làm việc ở nhiệt
độ cao. Do đó, lị cột là một phần tiêu chuẩn của nhiều thiết bị HPLC, nhưng chúng

cũng có thể được lắp đặt sau.
1.2.6 Đầu dị (detector)
Trong HPLC, mẫu được bơm vào một đầu của cột và các peak đã tách được rửa
giải ở đầu kia. Do nồng độ thấp và dải rửa giải hẹp nên cần một thiết bị có độ tinh vi
cao để phát hiện chúng.
Một số máy dị đo đặc tính phần lớn của chất rửa giải như chiết suất hoặc độ dẫn
điện. Tuy nhiên, hầu hết các máy dò được xây dựng để phát hiện các hợp chất có các
đặc tính nhất định. Một số đầu dị thơng dụng là UV/VIS, huỳnh quang, chỉ số khúc
xạ, độ dẫn điện, điện hóa, tán xạ ánh sáng bay hơi (đối với các hợp chất không bay
hơi) hoặc máy dò phân cực.
3

6

0


Ngồi ra, có thể ghép nối trực tuyến HPLC với phổ khối phổ MS hoặc phổ cộng
hưởng từ hạt nhân NMR. Máy dò biến đổi hiện tượng quan sát được thành tín hiệu
điện, thường là điện áp.
1.2.7 Bộ xử lý dữ liệu
Các tín hiệu của máy dị được trình bày trên màn hình hoặc giấy dưới dạng đồ thị
của cường độ so với thời gian. Những sắc ký đồ này cung cấp thơng tin định tính (có
các peak rửa giải không, chúng xuất hiện tại thời điểm nào?). Và cả thơng tin định
lượng (kích thước của các pic là bao nhiêu?).
Việc xác định và tính tốn kích thước pic cần thiết thường được thực hiện bằng
máy tính, nó cũng được sử dụng để điều khiển toàn bộ thiết bị HPLC.
1.2.8 Dung môi thải
Một nhược điểm của HPLC là đắt tiền và trong một số trường hợp phải sử dụng
các dung mơi độc hại hoặc có hại cho mơi trường. Cách tốt nhất để giữ cho khối lượng

dung dịch rửa giải mới và cả lượng dung môi thải ở mức thấp là sử dụng các cột có
đường kính bên trong nhỏ, ví dụ: 3, 2 hoặc 1 mm thay vì các cột 4,6 mm thường được
sử dụng.
1.2.9 Dây nối
Các bộ phận khác nhau của máy sắc ký được nối với các ống mao dẫn có đường
kính trong 0,25 hoặc 0,18 mm và các phụ kiện thích hợp. Chúng được làm từ thép
khơng gỉ hoặc nhựa chịu hóa chất. Khơng phải tất cả các vật liệu đều tương thích với
tất cả các pha động có thể có, và nhựa có giới hạn áp suất trên nhất định tùy thuộc vào
thành phần hóa học, độ dày thành và pha động được sử dụng.
1.2.10 Thiết kế gradients

4

6

0


Hình 1.2 Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC

Hình 1.2 cho thấy chỉ có một bình chứa dung mơi, do đó chế độ chạy này gọi là
sự phân tách đẳng dòng. Trong chế độ này, thành phần của pha động khơng đổi trong
tồn bộ thời gian của sắc ký đồ. Đỉnh càng muộn thì hình dạng của nó càng rộng và ít
cao hơn.

Hình 1.3 Sắc ký đồ của mẫu chạy đẳng dịng
Việc tách trong hình 1.3 được thực hiện bằng cách sử dụng chế độ chạy đẳng
dòng. Số lượng các hợp chất có thể được tách ra bị hạn chế.

5

6

0


Đối với các hỗn hợp phức tạp, cần phải làm việc ở chế độ được gọi là chế độ
gradient nơi thành phần của dung dịch rửa giải bị thay đổi trong q trình phân tách.
Điều này có thể được thực hiện bằng cách sử dụng hai (hoặc nhiều) máy bơm, một
máy bơm cho mọi dung môi được sử dụng và một bộ phận trộn, đây là thiết kế
gradient áp suất cao. Một giải pháp thay thế rẻ hơn là sử dụng một máy bơm duy nhất
và thay đổi các tỷ lệ cần thiết của các dung môi khác nhau bằng van chuyển mạch điều
khiển bằng máy tính, đây là thiết kế gradient áp suất thấp.
Với gradient, thời gian tách có thể kéo dài đến một giờ và có thể phân tích các
hỗn hợp rất phức tạp. Các hợp chất có thể có các đặc tính tương tự hoặc khác nhau
mạnh. Khơng có sự mở rộng đỉnh cao đáng chú ý theo thời gian.

Hình 1.4 So sánh hai giản đồ của sự phân tách bằng chế độ đẳng dòng (trái) và
gradient (phải)
Hạn chế của sự phân tách theo gradient là cần một thời gian để điều hòa trở lại,
tức là để đưa hệ thống phân tách về điều kiện ban đầu.
1.3 Phân tích bằng HPLC (Meyer, 2005)
1.3.1 Phân tích định tính
Một peak sắc ký đánh dấu sự có mặt của hợp chất rửa giải mà về nguyên tắc chưa
xác định được danh tính.
Để xác định các chất phân tích hồn tồn chưa biết, cần sử dụng các kỹ thuật
quang phổ, chủ yếu là khối phổ. Việc ghép nối máy HPLC với đầu dò như quang phổ
UV, MS và NMR cho phép làm sáng tỏ cấu trúc ngay lập tức.
Trong nhiều trường hợp, bản chất của các chất phân tích được biết đến và chúng
có thể được xác định bằng cách tiêm chất chuẩn. Sự đồng nhất chỉ được chứng minh

6

6

0


nếu chất chuẩn và hợp chất chưa biết có thời gian lưu giống hệt nhau trong nhiều hệ
thống phân tách, tốt nhất là có các ký tự khác nhau như pha bình thường và pha đảo
ngược hoặc pha đảo ngược và trao đổi ion.
1.3.2 Phân tích định lượng
Có thể sử dụng diện tích peak hoặc chiều cao peak để định lượng.
Mối quan hệ giữa lượng chất phân tích được bơm vào và kích thước peak chỉ có
thể được mơ tả bằng hệ số đáp ứng thực nghiệm, do đó cần phải thực hiện phân tách
hiệu chuẩn với lượng hoặc nồng độ đã biết của chất phân tích nếu cần định lượng.
Nếu peak của chất phân tích được phân giải tốt khỏi các peak lân cận thì có thể
sử dụng hợp chất chuẩn tinh khiết. Nếu không, tốt hơn là sử dụng chất đối chiếu hỗn
hợp với một lượng chất phân tích đã biết hoặc để hịa tan hợp chất đối chiếu trong hỗn
hợp nhân tạo. Cách tiếp cận này cho phép hiệu chuẩn trong các điều kiện thực tế.
Đường chuẩn theo thể tích có 5–8 điểm tham chiếu với nồng độ khác nhau, nồng
độ chất phân tích dự kiến của mẫu phải nằm ở giữa dải hiệu chuẩn.
1.3.3 Phương pháp nội chuẩn
Đối với nhiều phép phân tích định lượng, nên làm việc với chất nội chuẩn. Đây là
một hợp chất có độ tương đồng hóa học cao với các chất phân tích được quan tâm, ví
dụ như đồng phân. Do đó, nó sẽ hoạt động tương tự trong q trình chuẩn bị mẫu và
sắc ký.
Ban đầu, chất nội chuẩn được thêm vào cả mẫu thử và mẫu tham chiếu với lượng
giống hệt nhau. Từ tỷ lệ khối lượng hoặc nồng độ đã biết của chất nội chuẩn và chất
phân tích trong mẫu chuẩn, có thể tính được lượng "thực" của chất phân tích trong
mẫu bằng cách so sánh với tỷ lệ kích thước peak.

Sự mất mát của chất phân tích trong quá trình chuẩn bị mẫu hoặc các vấn đề về
tiêm mẫu có thể được bù đắp ở mức độ cao với phương pháp này.
1.4 Chuẩn bị mẫu (Meyer, 2005)
Nhiều chế phẩm thuốc chứa các chất phân tích ở nồng độ khá cao và ở dạng hỗn
hợp tương đối đơn giản.
Với các mẫu có nguồn gốc sinh học, tình hình hồn tồn khác. Máu, nước tiểu
hoặc các mơ đại diện cho một lượng lớn các hợp chất, nhiều trong số chúng ở nồng độ
rất thấp. Để tìm và thậm chí định lượng một chất phân tích nào đó khơng đơn giản
chút nào, và các bước chuẩn bị mẫu phức tạp là cần thiết để phân lập và cô đặc.
7

6

0


Hơn nữa, hầu hết các quy trình HPLC khơng cho phép tiêm trực tiếp dịch cơ thể
chưa được xử lý do có thể nhiễm bẩn hoặc tắc nghẽn cột nhanh chóng. Theo ngun
tắc chung, khi kết thúc q trình chuẩn bị mẫu, các chất phân tích quan tâm phải được
hịa tan trong pha động được sử dụng để tách HPLC, có thể có ngoại lệ nhưng theo yêu
cầu tối thiểu là dung dịch mẫu phải hòa tan dễ dàng trong pha động.
1.4.1 Chiết lỏng - lỏng
Chiết lỏng – lỏng là phương pháp tách hai chất lỏng khơng hịa tan vào nhau có
khả năng tách pha.
Cách thực hiện:
- Cho hỗn hợp mẫu vào phễu chiết (hoặc ống ly tâm, tùy theo lượng mẫu có
được)
- Lắc đều và để yên để hỗn hợp tách pha.
+ Làm bay hơi dung môi hữu cơ
+ Sử dụng nước để chiết lại thành pha nước (chất phân tích hịa tan chất vào

dung mơi hữu cơ), lắc dung dịch với đệm bazo sau đó sử dụng sắc ký pha đảo hoặc
trao đổi ion để tách.
- Hòa tan chất cần phân tích vào dung mơi pha động.
1.4.2 Chiết pha rắn

Hình 1.5 Quy trình chiết pha rắn
Bước 1: Chuẩn bị cột chiết (pha tĩnh là chất rắn, thường là silicagel, pha động là
hỗn hợp dung môi A)
Bước 2: Cho mẫu vào cột chiết.
Bước 3: Các chất trong mẫu được hấp phụ vào cột.
Bước 4: Rửa giải các tạp chất hoặc chất ảnh hưởng bằng dung môi B.
Bước 5: Rửa giải chất phân tích bằng dung mơi C.
8

6

0


1.5 Ưu và nhược điểm của phương pháp (Meyer, 2005)
1.5.1 Ưu điểm
- Độ nhạy cao
- Khả năng định lượng tốt, độ chính xác cao
- Có khả năng định lượng đồng thời các chất có độ phân cực gần nhau
- Lượng mẫu phân tích nhỏ.
1.5.2 Nhược điểm
- Thời gian làm sạch và ổn định cột sau các lần chạy lâu
- Thiết bị đắt tiền
- Hao tốn dung môi
- Cột dễ bị nghẹt nếu không xử lý mẫu kỹ.

1.6 Sự cố và xử lý (Meyer, 2005)
1.6.1 Đường nền bị nhiễu
Bộ phận của máy HPLC hoạt động kém
- Thay thế khóa của bơm. Làm sạch van một chiều của bơm hoặc thay thế
chúng.
- Kiểm tra tất cả các bộ phận xem có rị rỉ không.
- Thay đèn UV hoặc đèn huỳnh quang sau khoảng thời gian được ghi trong sách
hướng dẫn.
- Di chuyển thiết bị đến nơi không làm ảnh hưởng đến điện trường, gió lùa, dao
động nhiệt độ hoặc ánh nắng trực tiếp.
Pha động khơng được hịa trộn đều
- Đối với phân tách đẳng dòng, nên chuẩn bị dung dịch rửa giải trong một chai
duy nhất thay vì trộn các thành phần trong thiết bị.
- Ngay cả với phân tách gradient, đường nền bị nhiễu thấp hơn có thể được
quan sát nếu pha động ban đầu (chẳng hạn như 80% nước với phụ gia /20% dung môi
hữu cơ) được trộn sẵn trong bình chứa A.
- Bộ khử khí kém cũng ảnh hưởng. Trong một số trường hợp, ví dụ: với phát
hiện điện hóa, quy trình khử khí hai bước (helium cộng với chất khử khí màng) là cần
thiết.
Dung mơi và thuốc thử phải tương thích với đầu dị

9

6

0


- Để sử dụng với chất lượng tốt, không nên sử dụng thuốc thử có khả năng
tương thích hồn hảo với tia UV để phát hiện điện hóa và ngược lại.

- Trong nhiều trường hợp, không sử dụng hệ pha mà detector có thể làm phát
sinh các hiện tượng khơng mong muốn như các cực đại phụ hoặc cực đại âm (ví dụ,
nếu cần phát hiện tia cực tím ở 210 nm hoặc thấp hơn).
Hằng số thời gian của máy dò quá thấp
- Chọn hằng số thời gian cao hơn trong lần tiếp theo (nhưng hãy cẩn thận với
hằng số thời gian quá cao có thể dẫn đến các đỉnh bị cắt).
1.6.2 Trôi đường nền cơ sở
Trôi đường cơ sở rất phổ biến với sự phân tách gradient. Độ dốc của nó phụ
thuộc vào thành phần pha động và máy dị được sử dụng. Thuốc thử và dung mơi chất
lượng cao là yêu cầu bắt buộc, như đã đề cập ở trên. Một số nguyên tắc phát hiện như
phát hiện chỉ số khúc xạ khơng tương thích với gradient.
Có thể quan sát thấy hiện tượng trôi khi dao động nhiệt độ, với sự thay đổi thành
phần của các pha động đã trộn sẵn (bay hơi, khử khí heli quá mạnh), với việc bơm
khơng hồn tồn hoặc thời gian cân bằng cột quá ngắn khi dung dịch rửa giải bị thay
đổi.
1.6.3 Hình dạng đỉnh kém
Hình dạng đỉnh kém, đi mạnh hoặc thậm chí là các đỉnh kép cho thấy cột
khơng cịn phù hợp với mục đích sử dụng và phải được thay thế.
Việc nối đi cũng có thể xảy ra với thể tích cột phụ quá lớn trong hệ thống
HPLC chẳng hạn như ống mao dẫn có đường kính bên trong lớn, phụ kiện kém hoặc
kết nối kém giữa các bộ phận riêng lẻ của thiết bị hoặc thậm chí khóa roto bị mịn.
Đầu dị có thể tích bên trong q cao cũng có thể làm phát sinh hiện tượng kéo
đi. Các hình dạng đỉnh khơng đối xứng có đi hoặc khơng đối xứng khác có thể là
kết quả của thể tích mẫu quá cao hoặc nồng độ mẫu quá cao. Trong trường hợp này,
biện pháp khắc phục đơn giản là bơm một thể tích nhỏ hơn hoặc pha lỗng mẫu.
Trong nhiều trường hợp, hình dạng pic kém xuất phát từ nồng độ đệm quá thấp,
do làm việc với hệ thống khơng có bộ đệm mặc dù bộ đệm là cần thiết và do việc sử
dụng hệ thống pha không thuận lợi.

10

6

0


CHƯƠNG 2: POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
2.1 Nguyên tắc của phương pháp PCR (K. Kadri, 2019)
PCR là kỹ thuật tạo ra một lượng lớn chuỗi DNA từ một mẫu DNA ban đầu.
Khn mẫu DNA có thể là bộ gen hoặc DNA thu được bằng cách phiên mã
ngược từ RNA hoặc có thể là DNA ty thể.
Kỹ thuật này được chia thành ba giai đoạn: giai đoạn biến tính, giai đoạn lai ghép
với mồi và giai đoạn kéo dài. Sản phẩm của mỗi bước tổng hợp đóng vai trị là khn
mẫu cho các bước sau, do đó đạt được sự khuếch đại theo hàm mũ.
Phản ứng chuỗi polymerase được thực hiện trong một hỗn hợp phản ứng bao
gồm chiết xuất DNA (DNA khuôn mẫu), Taq polymerase, các đoạn mồi và bốn
deoxyribonucleoside triphosphat (dNTPs) dư thừa trong dung dịch đệm.
Các ống chứa hỗn hợp mẫu phải chịu các chu kỳ nhiệt độ lặp đi lặp lại vài chục
lần trong khối gia nhiệt của bộ tuần hồn nhiệt (thiết bị có vỏ bọc nơi các ống mẫu
được lắng đọng và trong đó nhiệt độ có thể thay đổi, rất nhanh và chính xác, từ 0 đến
100°C bởi hiệu ứng Peltier).
Thiết bị này cho phép lập trình khoảng thời gian và sự liên tiếp của các chu kỳ
của các bước nhiệt độ. Mỗi chu kỳ bao gồm ba khoảng thời gian vài chục giây. Quy
trình của PCR được chia thành ba giai đoạn như sau:
2.1.1 Giai đoạn biến tính
Đây là giai đoạn phân tách của hai sợi DNA, thu được bằng cách tăng nhiệt độ.
Thời kỳ đầu tiên thực hiện ở nhiệt độ 94°C, gọi là nhiệt độ biến tính. Ở nhiệt độ này,
DNA mẫu, đóng vai trị là chất nền trong q trình sao chép bị biến tính.

11

6

0


Hình 2.1 Giai đoạn biến tính DNA mẫu
Các liên kết hydro khơng thể duy trì ở nhiệt độ cao hơn 80°C do đó DNA sợi kép
bị tách thành 2 DNA sợi đơn (single-stranded DNA).
2.1.2 Giai đoạn lai ghép
Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ từ 40 đến 70°C, đây được gọi là nhiệt độ
lai mồi.
Giảm nhiệt độ cho phép các liên kết hydro mới được hình thành và do đó các sợi
đơn được bổ sung để lai hóa.

Hình 2.2 Giai đoạn lai
Các đoạn mồi, trình tự sợi đơn ngắn bổ sung cho các vùng bên hông DNA được
khuếch đại, sự lai ghép sẽ dễ dàng hơn so với DNA mẫu sợi dài. Nhiệt độ lai hố càng
cao thì sự lai hoá càng chọn lọc, càng đặc hiệu.
2.1.3 Giai đoạn kéo dài
Giai đoạn thứ ba được thực hiện ở nhiệt độ 72°C, gọi là nhiệt độ kéo dài. Đây là
giai đoạn tổng hợp các sợi bổ sung.
12

6

0


Ở 72°C, Taq polymerase liên kết với DNA sợi đơn đã được mồi và xúc tác sao

chép bằng cách sử dụng deoxyribonucleoside triphosphat có trong hỗn hợp phản ứng.
Do đó, các vùng của DNA khuôn mẫu ở cuối của mồi được tổng hợp một cách chọn
lọc.

Hình 2.3 Giai đoạn kéo dài
Trong chu kỳ tiếp theo, các đoạn được tổng hợp ở chu kỳ trước lần lượt là khuôn
mẫu và sau một vài chu kỳ, đoạn gen ưu thế tương ứng với trình tự DNA giữa các
vùng mà mồi lai với nhau.
Cần 20–40 chu kỳ để tổng hợp một lượng DNA có thể phân tích được (khoảng
0,1 μg). Theo lý thuyết, mỗi chu kỳ sẽ tăng gấp đôi số lượng DNA có trong chu kỳ
trước.
PCR có thể khuếch đại các trình tự DNA có kích thước nhỏ hơn 6 kilobase. Phản
ứng PCR cực kỳ nhanh chóng, chỉ kéo dài vài giờ (2–3 giờ đối với phản ứng PCR 30
chu kỳ).

13

6

0


Hình 2.4 Sơ đồ tổng hợp các bước của phương pháp PCR
2.2 Thành phần chủ yếu của phương pháp PCR (Dey P., 2018)
2.2.1 Đoạn mồi (primers)
Các đoạn mồi là những đoạn nhỏ của chuỗi DNA nhân tạo, đây là những đoạn bổ
sung ở đầu 3′ của mỗi sợi DNA đích.
Các đoạn mồi thường bao gồm 20–30 nucleotide.
Mồi là các DNA sợi đơn mà sự lai ghép trên các trình tự nằm bên cạnh trình tự
yêu cầu sẽ cho phép sao chép của nó một cách có chọn lọc.

2.2.2 DNA polymerase (Taq polymerase)
Taq polymerase là một loại enzyme DNA polymerase có tác dụng tổng hợp sợi
DNA mới. Nó kết hợp ở phần cuối của đoạn mồi và sau đó liên tiếp thêm các
nucleotide mới vào sợi DNA ở đầu 3′ bổ sung cho DNA đích.
Nhiệt độ cao (94°C) là cần thiết để tách DNA sợi kép. DNA polymerase thông
thường bị phá vỡ trong nhiệt độ này. Tuy nhiên, Taq polymerase có đặc điểm duy nhất
là hoạt động hiệu quả ở nhiệt độ cao hơn.
Taq DNA polymerase này được chiết xuất từ vi khuẩn Thermus aquaticus.
Những vi khuẩn này sống trong suối nước nóng và có thể tồn tại ở đó.
2.2.3 Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs)

14

6

0


Deoxynucleotide triphosphat (dNTP) là dATP, dCTP, dGTP và dTTP. Đây là
nguyên liệu cơ bản của các sợi DNA mới. Taq polymerase bắt các dNTP này từ dung
dịch làm việc và gắn chúng vào phần cuối của mồi để kéo dài chuỗi DNA.
2.2.4 DNA đích từ mẫu
DNA cần khuếch đại được chiết xuất từ mẫu.
2.2.5 Dung dịch đệm
Dung dịch đệm tạo mơi trường hóa học tối ưu cho phản ứng xảy ra.
2.2.6 Magie clorua (MgCl2)
Magie clorua hoạt động như một đồng yếu tố của enzym Taq polymerase.
2.3 Phát hiện và phân tích sản phẩm PCR (Dey P., 2018)
Sản phẩm của PCR bao gồm một hoặc nhiều đoạn DNA (trình tự hoặc các trình
tự quan tâm). Việc phát hiện và phân tích các sản phẩm có thể được thực hiện rất

nhanh chóng bằng điện di trên gel agarose (hoặc acrylamide).
DNA được phát hiện bằng cách nhuộm ethidium bromide. Do đó, các sản phẩm
có thể nhìn thấy ngay lập tức bằng cách chiếu tia cực tím (280–320 nm). Các sản phẩm
rất nhỏ thường có thể nhìn thấy rất gần với mặt trước di chuyển dưới dạng nhiều hoặc
ít dải khuếch tán. Chúng tương ứng với các chất dimer của mồi và đôi khi với chính
các mồi.
Tùy thuộc vào các điều kiện phản ứng, các đoạn DNA khơng đặc hiệu có thể
được khuếch đại ở mức độ lớn hơn hoặc nhỏ hơn, tạo thành các dải lưới hoặc “vết
bẩn”. Trên các hệ thống tự động, máy phân tích mảnh hiện được sử dụng. Thiết bị này
sử dụng nguyên tắc điện di mao quản. Phát hiện phân mảnh được thực hiện bởi một
diode laser. Điều này chỉ có thể thực hiện được nếu PCR được thực hiện với các mồi
kết hợp với fluorochromes.
2.4 Ưu và nhược điểm của phương pháp (Dey P., 2018)
2.4.1 Ưu điểm
- Cho kết quả xét nghiệm nhanh, thường không quá 5 giờ kể từ khi bắt đầu làm
xét nghiệm.
- Phát hiện được các tác nhân vi sinh vật gây bệnh mà phịng thí nghiệm lâm
sàng khơng có khả năng phát hiện với các xét nghiệm vi sinh hay miễn dịch truyền
thống.

15

6

0


- PCR cịn có thể cho ra kết quả định lượng chính xác số bản copies virus/1 ml
máu. Từ đó hỗ trợ rất đắc lực cho bác sĩ đánh giá được hiệu quả điều trị, cũng như tiên
lượng giai đoạn bệnh.

- Phát hiện các đột biến gen gây ung thư, gây các bệnh di truyền khác...nhằm có
biện pháp phịng ngừa bệnh.
- Xác định mối quan hệ huyết thống giữa những cá thể khác nhau.
2.4.2 Nhược điểm
- Ngoại nhiễm cao do khả năng nhân bản DNA mạnh.
- Sai sót của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp.
- Kết quả phụ thuộc rất lớn vào toàn bộ thao tác.
- Thiết bị đắt tiền.
2.5 Sự cố và xử lý sự cố (Dey P., 2018)
2.5.1 Khơng khuếch đại DNA
Các ngun nhân có thể là:
- Lượng khn mẫu DNA q ít: Nếu lượng khn mẫu DNA q ít thì có thể
khơng có sự khuếch đại đầy đủ. Số lượng mẫu DNA nên được tăng lên trong điều kiện
như vậy.
- Điều kiện phản ứng quá nghiêm ngặt: Nếu điều kiện phản ứng được duy trì rất
nghiêm ngặt, thì có thể khơng có bất kỳ sự khuếch đại nào của sản phẩm PCR.
- Thuốc thử không được thêm vào: Có thể khơng thêm một hoặc nhiều thuốc
thử vào hỗn hợp phản ứng. Toàn bộ phản ứng nên được thực hiện lại bằng cách thêm
cẩn thận các thuốc thử.
- Thuốc thử không ở nồng độ tối ưu hoặc hết hạn sử dụng: Thuốc thử phải được
làm mới và thay đổi một thuốc thử mới tại một thời điểm để tìm ra vấn đề của thuốc
thử nào.
- Nhiệt độ biến tính quá cao hoặc quá thấp: Trong điều kiện đó, thay đổi nhiệt
độ thấp hoặc cao 1°C tại một thời điểm.
- Nhiệt độ ủ mồi quá cao: Trong trường hợp này, hãy hạ nhiệt độ xuống 2°C
cùng một lúc.
- Hình thành mồi mới: Hai mồi có thể tự ủ hoặc ủ với nhau. Trong trường hợp
này, điện di trên gel cho thấy một sản phẩm nhỏ có ít hơn 100 cặp bazơ. Việc bổ sung

16

6

0


DMSO có thể giải quyết vấn đề này. Ngồi ra, chu kỳ nhiệt có thể giải quyết vấn đề
này.
- Số chu kỳ nhiệt dưới mức tối ưu: Số chu kỳ nhiệt dưới mức tối ưu có thể tạo
ra lượng sản phẩm PCR ít hơn. Trong điều kiện đó, tăng thêm 5–10 số chu kỳ nhiệt.
- Mồi bị lỗi: mồi có thể bị lỗi và do đó PCR có thể khơng hoạt động. Trong
trường hợp đó, hãy thiết kế lại mồi.
2.5.2 Sản phẩm khơng đặc hiệu
Sản phẩm khơng đặc hiệu có thể được hình thành trong PCR và trong trường hợp
này, nhiều dải có độ dài thay đổi được nhìn thấy trong điện di trên gel. Điều này có thể
là do:
- Quá ít nghiêm ngặt trong PCR: Điều kiện quá ít nghiêm ngặt tạo ra các sản
phẩm DNA không mong muốn trong PCR.
- Quá nhiều mẫu DNA: Quá nhiều mẫu DNA có thể tạo ra sản phẩm khơng
mong muốn trong PCR.
- Quá nhiều chu trình nhiệt: Trong trường hợp này, hãy giảm số chu trình nhiệt
xuống 5–10.
- Nồng độ magie quá cao: Điều chỉnh nồng độ và giảm nồng độ xuống thấp.
- Mồi bị lỗi: Thiết kế lại mồi.
- Bị ô nhiễm: Thay đổi nơi thực hiện PCR.
CHƯƠNG 3: ENZYMEE-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)
3.1 Nguyên tắc chung của ELISA (Sakamoto S. và cộng sự, 2017)
ELISA dựa trên khái niệm về phản ứng kháng nguyên - kháng thể, đại diện cho
sự tương tác hóa học giữa các kháng thể được tạo ra bởi tế bào B của bạch cầu và
kháng nguyên. Phản ứng miễn dịch cụ thể này đóng một vai trị quan trọng trong việc

bảo vệ cơ thể khỏi những kẻ xâm lược như mầm bệnh và độc tố.
Bằng cách khai thác phản ứng này, ELISA cho phép phân tích định lượng/định
tính có độ nhạy cao và chọn lọc đối với các kháng nguyên, bao gồm protein, peptit,
axit nucleic, hormone, thuốc diệt cỏ và các chất chuyển hóa thứ cấp của thực vật.
Để phát hiện các phân tử này, một kháng nguyên hoặc kháng thể được đánh dấu
bằng cách sử dụng các enzym, cái gọi là xét nghiệm miễn dịch enzym, trong đó
alkaline phosphatase (ALP), horseradish peroxidase (HRP), và β-galactosidase thường
được sử dụng.
17

6

0


Kháng nguyên trong pha lỏng được cố định trên pha rắn, chẳng hạn như tấm
microtiter tạo thành polystyrene cứng, polyvinyl clorua và polypropylene. Sau đó,
kháng nguyên được phép phản ứng với kháng thể cụ thể, kháng thể này được phát hiện
bởi kháng thể thứ cấp được đánh dấu enzym.

Hình 3.1 Nguyên lý hoạt động của phương pháp ELISA
Màu sắc được tạo bằng cách sử dụng chất nền sinh màu tương ứng với sự hiện
diện của kháng nguyên.
Các phản ứng enzym - cơ chất này thường được hồn thành trong vịng 30–60
phút và phản ứng dừng lại khi thêm dung dịch thích hợp, ví dụ, natri hydroxit, axit
clohydric, axit sulfuric, natri cacbonat và natri azit, đối với các phản ứng riêng lẻ. Cuối
cùng, các sản phẩm có màu hoặc huỳnh quang được phát hiện bằng cách sử dụng đầu
đọc tấm microtiter.

3.2 Các loại ELISA (Sakamoto S. và cộng sự, 2017)

3.2.1 ELISA trực tiếp
Năm 1971, Engvall và Perlmann và Van Weemen và Schuurs là những người đầu
tiên phát triển ELISA trực tiếp, là kiểu cơ sở cho các loại ELISA khác.

18

6

0


Hình 3.2 ELISA trực tiếp để phát hiện kháng nguyên (a) và kháng thể (b)
Ghi chú: (i) Gắn kháng nguyên/kháng thể vào pha rắn. (ii) Ủ với kháng
thể/kháng nguyên đánh dấu enzym. (iii) Rửa sạch kháng thể / kháng nguyên đánh dấu
enzym chưa liên kết ra ngoài. (iv) Tạo màu với chất nền.
Một kháng nguyên hoặc một kháng thể được cố định trên bề mặt của tấm
microtiter. Sau khi bề mặt bị chặn bằng các protein khác (ví dụ: albumin, gelatin,
casein, và sữa gầy) để tránh sự hấp phụ không đặc hiệu của các protein khác, kháng
thể hoặc kháng nguyên được đánh dấu enzym tương ứng được phép phản ứng với mục
tiêu cố định, tiếp theo là tạo màu với chất nền thích hợp. Với số lượng mục tiêu ngày
càng tăng, tín hiệu sẽ tăng lên.
ELISA trực tiếp thích hợp cho việc phân tích định tính các đại phân tử.
3.2.2 ELISA cạnh tranh
Năm 1973, Belanger phát triển ELISA cạnh tranh để phát hiện α-fetoprotein của
chuột, liên quan đến sự phát triển của ELISA gián tiếp và ELISA sandwich.
Điểm quan trọng của ELISA cạnh tranh là phản ứng cạnh tranh giữa mục tiêu
(kháng nguyên hoặc kháng thể) trong mẫu và mục tiêu được đánh dấu enzym (kháng
nguyên hoặc kháng thể) chống lại kháng thể hoặc kháng nguyên cố định tương ứng.

19

6

0