Nghiên cứu sàng lọc và thu nhận aptamer đặc hiệu kháng sinh neomycin

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan các kết quả trong luận văn là do em thực hiện dưới sự
hướng dẫn của PGS.TS. Lê Quang Huan, TS Lã Thị Huyền. Các số liệu và kết
quà trong luận văn chưa được công bố ờ bất kỳ cơng trình nào khác.

Ký tên

Đồn Thị Mai

Thư viện Viện Đại học Mờ Hà Nội


LỜI CẢM ON
Trong quá trình làm thực tập sinh tại phịng Cơng nghệ Té hào Động vật _
Viện Cơng nghệ Sinh học _ Viện Hàn lãm Khoa học và Công nghệ Việt Nam em đã
được giao đề tài: "Nghiên cứu sàng lọc và thu nhận aptamer dặc hiệu kháng sinh

neomycin ”
Lời đầu tiên em xin giá lời cám ơn sâu sac tới PGS.TS. Lê Quang Huấn,

TS. Lã Thị Huyền đã tạo điều kiện, nhiệt tình giúp đỡ em giúp em được tiếp xúc,
thêm hiếu biết và hồn thành cơng việc trong thời gian qua.
Em xin cám ơn Ths. Lê Thị Hạnh, Ths. Lê Thị Minh Phúc, Ths. Đặng Thị

Minh Lụa đã hướng dẫn, chi báo tận tình, ln theo sát và tạo điều kiện tốt cho em

trong snot quá trình em học tập và nghiên cứu.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các cán bộ phịng Cơng nghệ Te bào

Động vật đã nhiệt tình chi háo em giúp em hồn thành tot cơng việc được giao.

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội
Cuối cùng em xin gửi lời cảm tới gia đình và bạn bè đã động viên giúp em
hồn thành tot cơng việc.

Hà Nội, ngày 19 tháng 5 năm 20 ì 5


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN..........................................................................................................
LỜI CÁM ƠN............................................................................................................... ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỪ VIẾT TẦT................................................ vi
DANH MỤC CÁC HÌNH........................................................................................ viii
DANH MỤC CÁC BÁNG........................................ Error! Bookmark not defined.

MỞ ĐÀU......................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỎNG QUAN VÈ TÀI LIỆU............................................................... 3

1.1.

Tổng quan về kháng sinh Neomycin............................................................ 3

1.1.1.

Giới thiệu về kháng sinh Neomycin........................................................ 3

1.1.2.

Kháng sinh trong chặn nụôi.............. . V......A.,.........................................6

1.1.3.

Dư lượng kháng sinh trong các mẫu thực phàm................................... 7

1.1.4.

Các thông tin về hàm lượng kháng sinh an toàn trong thực phẩm...... 9

1.1.5.

Các phương pháp xác định dư lượng kháng sinh hiện nay...................10

1.2.

Thư viện Viện Đại học Mớ Hà Nội

Tổng quan về aptamer.................................................................................12

1.2.1.

Giới thiệu ve aptamer........................................................................... 12

1.2.2.

Phương pháp SELEX (Systematic Evolution of ligands by Exponential

enrichment) sàng lọc aptamer............................................................................ 14

1.2.3.

Tình hình nghiên cừu aptamer trong và ngồi nước............................ 15

CHƯƠNG 2: VẶT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cúu............................. 19

2.1

Vật liệu........................................................................................................... 19

2.1.1.

Sinh phẩm............................................................................................... 19
iii


2.1.2.

Hóa chất:................................................................................................ 19

2.1.3.

Thiết bị và máy móc............................................................................... 19

2.1.4.

Mơi trường và dung dịch nuôi cấy.........................................................19

2.2

. Phương pháp nghiên cứu............................................................................ 20

2.2.1.

Phương pháp PCR................................................................................ 20

2.2.2.

Phương pháp SELEX sàng lọc aptamer................................................ 23

2.2.3.

Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR................................................27

2.2.4.

Phương pháp điện di trên gel agarose.................................................. 27

2.2.5.

Phán ứng gan gen vào vector tách dòng...............................................28

2.2.6.

Phương pháp biến nạp plasmid vào tế bào E. coli DH5a................... 30

2.2.7.

Phương pháp tách DNA từ vi khuân E. coli chủng DH5a................... 31

2.2.8.

Phương pháp ELISA.................................................

2.2.9.

Phương pháp giải trình tự nucleic acid tự động.................................. 35

Thư viện Viện Đại học Mờ Hà Nội
33

CHƯƠNG 3: KẾT QUÁ THựC NGHIỆM.............................................................. 36

3.1.

Kết quá sàng lọc aptamer liên kết kháng sinh Neomycin.......................... 36

3.1.1.

Ket quả tạo thư viện...............................................................................36

3.1.2.

Kết quả sàng lọc aptamer liên kết với kháng sinh Neomycin.............. 37

3.2.

Kết quả tách dòng aptamer liên kết với kháng sinh Neomycin.................. 43

3.2.1.

Nhân bản trình tự aptamer ssDNA liên kết kháng sinh Neomycin...... 43

3.2.2.

Phán ứng gắn sàn phẩm PCR vào vector tách dòng............................ 44

3.2.3.

Kết quá biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuan E. coli...........45

3.2.4.

Kết quà tách plasmid từ vi khuẩn ecoli.................................................47
iv


3.3.

Kết quà xác định khả năng liên kết giữa kháng sinh Neomycin và aptamer .48

3.4.

Xác định trình tự aptamer đặc hiệu kháng sinh Neomycin......................... 51

KẾT LUẬN................................................................................................................. 53
KIẾN NGHỊ................................................................................................................ 54

TÀI LIỆU THAM KHAO.......................................................................................... 55

Thư viện Viện Đại học Mớ Hà Nội

V


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
ATTP

An toàn thực phẩm

Bb

Cặp base

BSA

Bovine Serum Albumin

DMSO

Dimethyl sulphat

DNA

Axit deoxyribonucleic

DNase

Enzym DNase

EDTA

Axit ethyenediaminetetraacetic

E. coli
IPTG

Vi khuân Escherichia coll

Thi

Isopropyl P-D-1 -thiogalactopyranosidc

Kb

Kilo base

KN-KT

Kháng nguyên- kháng thê

LB

Môi trường luria Berlani

MPBS

Milk Phosphate buffer saline

PCR

Phàn ứng chuỗi trùng hợp

RT-PCR

Phàn ứng chuỗi trùng hợp thời gian thực

RNase

Enzym RNase

RNA

Axit ribonucleic

ssDNA

DNA sợi đơn

vi


dsDNA

DNA sợi đôi

SDS

Natri dodeyl sulphat

TAE

Tris acetate EDTA

Taq polymerase

Enzym polymerase chịu nhiệt

TMB

Tetramethylbenzidine

TPBS

Tween Phosphate buffer saline

x-gal

5 - Bromo - Clorua 3 - indodyl -0 - D galactoside

Thư viện Viện Đại học Mờ Hà Nội

vii


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Sơ đồ cơ chế tác động cùa các kháng sinh Neomycin................................5

Hình 1.2: cấu trúc aptamer liên kết với kháng sinh Neomycin................................ 12
Hình 1.3: Các ứng dụng cùa nucleic acid aptamer.................................................... 13

Hình 1.4: Quy trình sàng lọc SELEX......................................................................... 14
Hình 2.1: Ba giai đoạn của 1 chu kì trong phàn ứng PCR........................................ 21
Hình 2.2: Sàn phẩm của phàn ứng PCR tăng theo cấp số nhân................................ 22
Hình 2.3: Sơ đồ cấu tạo cùa vector tách dịng pCR2.1 _TOPO................................29
Hình 3.1: Kết quá của phán ứng PCR làm giàu thư viện..........................................36

Hình 3.2: Quá trình cắt dsDNA sử dụng enzym À exonuclease.............................. 37
Hình 3.3: Kết q PCR với khn là ssDNA sau vòng sàng lọc I với cặp mồi
ApF2/ApR2-Ph...................................................................
... . „ „1.
Till! viện Viên Đạihọc Mở Hà Nội
Hình 3.4: Kêt quá PCR sau vịng III và vịng IV...........................

39

41

Hình 3.5: Kết q PCR sau vịng VI.......................................................................... 41

Hình 3.6: Kết quả PCR vịng VII............................................................................... 42
Hình 3.7: Quy trình tách dịng aptamer ssDNA liên kết đặc hiệu kháng sinh
Neomycin.................................................................................................................... 43
Hình 3.8: Kết quá PCR sau vịng loại trừ.................................................................. 44
Hình 3.9: Kết q biến nạp vector tái tổ hợp vào vikhuẩn E. coli chúng DH5a..... 45
Hình 3.10: Kết quà PCR từ khuẩn lạc........................................................................ 47
Hình 3.11: Kết quả tách plasmid từ vi khuẩn E. coli............................................... 47

Hình 3.12: Hình thế hiện nồng độ cùa ssDNA khi tiến hành PCR với mồi
ApFi/ApRi-Biotin hóa................................................................................................ 49
Hình 3.13: Kết quả ELISA giữa aptamer ssDNA với kháng sinh Neomycin..........50

Hình 3.14: Biểu đồ thế hiện khả năng gắn kết của các aptamer đặc hiệu Neomycin
............. .......................................................................... ...............
......50
vĩiĩ


Hình 3.15: Ket quả xác định trình tự nucleotide của dịng chứa aptamer số 6 có khá
năng gắn kết với Neomycine......................................................................................51
Hình 3.16: cấu trúc khơng gian cúa aptamer (dịng số 6) có khả năng gắn kết với
Neomycin.................................................................................................................... 52

Thư viện Viện Đại học Mờ Hà Nội

ix


DANH MỤC CÁC BẢNG
Băng 1.1: Dư lưọng tối đa kháng sinh neomycin trong thực phẩm.................... 9

Bảng 2.1: Thành phan của phán ứng PCR làm giàu thư viện................................... 23
Bàng 2.2: Chu kỳ nhiệt cùa phàn ứng PCR làm giàu thư viện.................................. 23
Bâng 2.3: Thành phần cúa phản ứng tạo sợi đơn DNA........................................... 24
Bàng 2.4: Thành phần cúa phàn ứng gắn gen vào vector tách dòng........................29
Bàng 3.1: Nồng độ ssDNA sau vòng sàng lọc 1........................................................ 38
Băng 3.2: Tóm tắt điều kiện nghiêm ngặt tăng dan cho mồi vòngsàng lọc............. 40

Báng 3.3: Thành phan của phíin ứng gan gcn vào vector tách dịng PCR 2.1........44
Bâng 3.4: Các thành phần cũa phàn ứng PCR từ khuẩn lạc...................................... 46
Bâng 3.5: Chu kỳ nhiệt của phán ứng PCR từ khuấn lạc.......................................... 46

Thư viện Viện Đại học Mớ Hà Nội

Bảng 3.6: Nồng độ của ssDNA khi tiến hẩnh PCR với mồi ApF2 -Biotin/ApR2....48

X


MỞ ĐẦU
Việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi là một vấn đề nổi cộm không chi ở

Việt Nam mà là cùa cả thế giới. “Khoảng 5% kháng sinh được sữ dụng ở Việt Nam
là dùng trong nông nghiệp, đê kích thích tăng trường hoặc điêu trị bệnh”. Tình trạng

tồn dư kháng sinh trong thực phẩm đang ờ mức báo động.

Việc sử dụng kháng sinh bừa bãi tiềm ấn nguy cơ ánh hướng tới sức khóe.

Người tiêu thụ kháng sinh gián tiếp hăng ngày sỗ lùm tăng khá năng xuất hiện các
loại vi khuẩn kháng thuốc phát triển trong cơ the. Khi một người bị nhiễm bệnh mà

trong cơ the có sẵn một lượng kháng sinh rồi thì việc điều trị sẽ không hiệu quà

hoặc nhiễm phái các vi khuân kháng lại hầu hết các loại kháng sinh thì việc điều trị
sẽ rất tốn kém và vất vả, có nguy cơ dẫn tới tứ vong.
Những năm gần đây mức sống cùa người dân tăng cao nhất là ở các thành

phố lớn nên nhu cầu sứ dụng sữa có chất lượng ngày càng tăng. Đẻ đáp ứng nhu cầu

đó, ngành chăn ni bị sữa ngày càng phát triển nhưng do kỳ thuật chăn ni, cơng
lác phịng trị bệnh cịn hạn chế nêh bệnh trên đàn bò sữa thường xáy ra, đặc biệt

bệnh viêm vú là nỗi lo cùa nhà chăn nuôi. Bệnh làm giám sán lượng sữa. rút ngắn

chu kỳ sàn xuất sữa, thời gian điều trị kéo dài, chi phí điều trị cao, làm gia tăng ti lệ

bò loại thài và ành hường tới thu nhập cùa nhà chăn nuôi. Khi điều trị bệnh viêm vú
bị, người chăn ni đã sử dụng một số hỗn hợp kháng sinh bơm vào bầu vú bị.
Những hỗn họp dó thường có kháng sinh neomycin. Chúng được sứ dụng trong thú

y với mục đích phòng và điều trị dưới dạng tiêm trong hồn hợp. Vì vậy các sán
phấm sừa có nguy cơ chứa lượng kháng sinh neomycin và ành hường tới sức khóe

cứa người tiêu thụ sữa.

Hiện nay có rất nhiều phương pháp dế xác định hàm lượng kháng sinh

neomycin trong sữa ví dụ như: Phương pháp vi sinh vật. phương pháp sắc ký lóp
mịng, phương pháp sắc ký lịng hiệu năng cao, phương pháp sác ký lỏng ghép khối

phố, phương pháp ELISA, phương pháp cám biến sinh học.
Aptamer được phát hiện từ năm 1990 bởi hai phịng thí nghiệm dộc lập của

Ellington và Szostak năm 1990. Tuerk và Gold năm 1990. Aptamer là
1


oligonucleotit (ADN hoặc ARN) hay các phân từ peptide có khá năng liên kết chặt
chẽ với một phân tử đích cụ thể nhờ sự tương tác cấu trúc không gian 3 chiều. Phồ
đích của aptamer rất đa dạng từ mức độ ion tới phân tử, tế bào. Aptamer được ứng

dụng trong nhiều lình vực và có ưu điểm hơn so với kháng thể. Do đó, việc sàng lọc

thu nhận các aptamer đặc hiệu kháng sinh ứng dụng trong việc tạo các biosensor

phát hiện kháng sinh trong sữa cũng như trong các thực phấm có nhiều tiềm năng.

Trong khn kho khóa luận tốt nghiệp, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Nghiên cứu sàng lọc và thu nhận aptamer đặc hiệu kháng sinh Neomycin”.

Mục tiêu cúa đề tài:
J Xây dựng được phương pháp sàng lọc các aptamer có khả năng liên kết
với kháng sinh neomycin từ thư viện aptamer

J Tách dòng và chọn lọc dược từ 1 tới 2 aptamer có khâ năng liên kết đặc
hiệu với kháng sinh neomycin.

Nội dung nghiên cứu;

.___

.

.

Thữ viẹn Viện Đại học Mớ Hà Nội

Sàng lọc aptamer đặc hiệu với kháng sinh neomycin từ thư viện ssDNA.

J Tách dịng và xác định trình tự các aptamer sau sàng lọc.

Nghiên cứu. lựa chọn aptamer đặc hiệu với kháng sinh Neomycin.

2


CHƯƠNG 1: TỐNG QUAN VÈ TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về kháng sinh Neomycin

1.1. ỉ. Giới thiệu về kháng sinh Neomycin
Kháng sinh Neomycin thuộc nhóm Aminosid - là nhóm kháng sinh được thu
nhận từ loài Streptomyces và một số được bán tống hợp. Do cấu trúc hóa học đều

mang đường và có chức amin nên có tên Aminosid. Kháng sinh nhóm Aminosid

gồm

nhiều

loại

thuốc

như

sau:

Streptomycin,

Neomycin,

Kanamycin,

Gcntamycin...Trong đó kháng sinh neomycin được phân lập vào năm 1949.

♦ Sự hấp thu
Neomycin khơng hoặc rất ít hấp thu ờ đường tiêu hoá. Khi tiêm bắp

neomycin hấp thu nhanh, đạt nồng độ cao trong huyết tương sau 1-2 giờ. Thuốc

được hấp thu 100%. Thời gian bán thái của Neomycin khống 24 giờ. Neomycin
lích luỹ ờ vó thận có thể kéo dài 60-100 giờ. Nhất là khi thận bị viêm hay tiêm nhắc

lại.

Thư viện Viện Đại học Mớ Hà Nội
♦ Phân bố
Neomycin gắn dề dàng với protein - huyết thanh vào dịch não tuỷ. Khi viêm

màng não, nó tham vào nhiều hơn. Neu tiêm đồng thời vào não và tĩnh mạch thuốc
sẽ đạt hàm lượng hữu hiệu chữa bệnh trong 11-18 giờ liền. Khi bị bệnh ờ phổi, vì
nồng độ Neomycin trong phoi luôn thấp hơn MIC (minimal inhibitated
concentration) cúa nhiều chúng vi khuấn gây viêm phối, phế quán. Do vậy, với

bệnh đường hô hấp nên dùng theo phương pháp khí dung, nhó mũi hay tiêm tĩnh

mạch. Thuốc khuếch tán tốt qua nhau thai, dịch cồ trướng, dịch phe mạc, dịch ngồi
tim ít vào mờ, xương.

♦ Thái trừ

Neu tiêm. Neomycin thái qua nước tiểu dưới dạng ngun chưa chuyến hố
cịn hoạt tính. Thuốc ln có nồng độ cao trong nước tiều, thải nhanh trong 24 giờ

đâu từ 80-90% qua câu thận. Rât ít qua mật. Nêu suy thận sẽ làm thay đơi sự thái
trừ của Neomycin, khi đó thời gian bán thải của thuốc sẽ tăng lên gấp 20-30 lần so
3


với bình thường. Neu uống, gần như khơng được hấp thu qua đường tiêu hoá (chi

khoáng 10%).
Neomycin gây hiện tượng tích luỹ thuốc ờ cầu thận. Tại các quản cầu thận,
nồng độ Neomycin lớn gấp 2 - 3 lần so với tuỳ thận và gấp 20 - 30 lần nồng độ cao

nhất trong huyết thanh. Do thuốc gắn chặt vào các te bào trên quán cầu thận, nên
gây hiện tượng tích luỹ nhiều tuần sau khi ngưng thuốc.

♦ Phản ứng có hại:
Hai phán ứng có hại nồi tiếng là gây độc cho tai và gây độc cho thận.

Neomycin gây độc cho tai nhiều hơn các thuốc khác, mặc dù chưa bao giờ có mối

liên quan rõ ràng giữa nong độ Neomycin huyết thanh và tiến triến cùa nhiễm độc ờ
tai. Mặc dù người ta cho ràng độc tính đối với tai cùa Neomycin chủ yếu là ờ ốc tai.
Nhiễm độc tai diễn ra sau khi sứ dụng kéo dài và không the hồi phục.
Nhiễm độc thận là một phân ứng có hại khác. Neomycin được hấp thu bời
hiện tượng thấm bào và thuốc tập trung trong các lysosome. Vì khơng có cơ chế đào
. . ‘ wrvien vMWniQcMoaNai' ■ '. 7.
thải phức hợp Neomycin-lysosom nội bào, tẽ bào trương lên và vỡ ra. Nông độ

thuốc tàng cao trong thời gian dài làm nặng thêm độc tính thận của Neomycin. Gây

độc với thận vì thãi trừ chủ yếu qua thận nên dễ gây kích ứng, nặng hơn có thế gây

hoại tứ ống thận cấp.

♦ Sự hấp thụ
Phố kháng khuẩn rộng dùng chù yếu để chống khuẩn hiếu khí gram (-) [1].

Thường dùng dưới dạng thuốc bôi dế diều trị nhiễm khuẩn da - niêm mạc trong
bóng, vết thương, vết loét và các bệnh ngoài da bội nhiễm [2). Neomycin chi được
dùng dường uống trong điều trị bệnh não gan vì dộc tính q cao khi dùng ngồi

đường tiêu hóa hoặc rửa tại chồ.
♦ Tính kháng thuốc
Neomycin khơng có tác dụng đối với liên cầu khuẩn, và đa số chùng vi

khuẩn đường ruột Enterococcus kháng thuốc.

4


♦ Cơ chế tác độnj

Hình 1.1: So' đồ CO' chế tác động của các kháng sinh neomycin
Nhóm Aminosid ức chế sự tổng nảy ịhílỄirbểiĩấ vi khuẳn bằng cách gắn vào
protein tiếp nhận trên đơn vị 30S của ribosome làm đọc sai thơng tin cúa ARN, làm

hình thành các protein khơng có hoạt tính, ngồi ra cịn làm tách các protein ớ trạng
thái polymer thành monomer.
Giai đoạn 1: Thuốc gắn vào protein là thụ thế chuyên biệt ở trên tiếu đơn vị

30S cùa ribosome vi khuấn.
Giai đoạn 2: Thuốc phong tỏa hoạt động của phức hợp đầu tiên "initiation

complex" cùa quá trình thành lập chuồi peptide (ARNm + íbrmylmethiomine +

ARNt).

Giai đoạn 3: Thông tin mRNA bị đọc sai ở vùng nhận diện (recognition
region) cúa ribosome, kết quá là một acid amin không phù hợp được đưa vào chuỗi

peptide, tạo một protein khơng có chức năng.

5


Giai đoạn 4: Sự gắn cúa thuốc làm vỡ các polysome thành các monosome
khơng có khá năng tồng hợp protein, các tác động này xảy ra ít nhiều có tính đồng

thời và kết quà là tế bào vi khuấn bị giết.
1.1.2. Kháng sinh trong chăn nuôi

Do vật nuôi cũng bị vi sinh vật tan công, gây bệnh dịch chết hàng loạt. Vì

vậy, các kháng sinh cũng được dùng đế chữa bệnh. Tuy nhiên việc chữa bệnh cho
động vật bàng các kháng sinh dùng cho người dẫn tới việc tạo ra nhanh chóng các

chúng kháng thuốc, do đó việc dùng cùng loại kháng sinh đế chữa bệnh cho cả

người và động vật phải hết sức hạn chế và được các quy định luật pháp điều tiết.

Kháng sinh còn được dùng như chất kích thích tăng trọng gia súc gia cầm,

giám chi phí thức ăn. kích thích tăng sán lượng trứng gà vịt 11].

♦ Tình hình sử dụng kháng sinh trên thế giới

Mỹ là một trong những nước sử dụng kháng sinh nhiều nhất thế giới, hàng
năm khoảng 2730 tấn kháng sinh được dùng trong chăn nuôi, xấp xi 80% gia cầm,

.v^w yien yjei) DaiTipcTviQHa_N0f

70% lợn; 70% bò sữa và 60% bò thịt ớ Mỹ được ni dưỡng băng thức ăn có bơ
sung kháng sinh. Vào năm 1999, có khống 9273 tấn kháng sinh được sữ dụng
(theo số liệu thống kê của viện thú y Mỹ) và đặc biệt khoảng 1270 tan kháng sinh

được sử dụng với mục đích kích thích sinh trường.
Trong năm 1997 tồng lượng kháng sinh sử dụng dùng ờ các nước châu Âu là
10.500 tấn trong dó 33% trong điều trị thú y và 15% như chất bổ sung trong thức ăn

chăn ni.
♦ Tình hình sừ dụng kháng sinh ỡ Việt Nam

Kết quá điều tra cùa Lã Văn Kính và ctv (1996) trên 75% số mẫu thịt và
66,7% số mẫu gan (gà nuôi theo phương thức công nghiệp) cho thay đều có tồn dư
kháng sinh với mức tồn dư từ 3,67-122 ppm tùy theo chúng loại, cao hơn hàng chục

đến hàng nghìn lần so với tiêu chuẩn Quốc tế.
Khoa Chăn nuôi Thú y Đại học Nông Lâm thành phố Ho Chí Minh xét
nghiệm các mẫu thịt được lấy trực tiếp tại các chợ cho thấy có 26 loại kháng sinh
6

được phát hiện. Trong đó loại được sứ dụng nhiều nhất chloramphenicol (chiếm

15,35%), tylosin (15%), colistin (13,24)... Trong đó, chloramphenicol là kháng sinh
hiện đã bị cấm sứ dụng. Trong 149 mầu thịt gà dược kiếm tra. phân tích có đến

44,96% số mẫu có dư kháng sinh vượt quá mức quy định cho phép từ 2,5 đến 1.100

lần so với tiêu chuẩn ngành. Trong đó, loại kháng sinh chloramphenicol chiếm tỳ lệ
cao nhất đến 87,5%.
1.1.3. Dư lượng kháng sinh trong các mầu thực phẩm

Dư lượng kháng sinh là tình trạng kháng sinh tồn tại trong các mầu thực
phẩm như thịt, cá, trứng, sữa... còn ờ dạng nguyên chất hay đã bị chuyển hóa mà

việc sừ dụng những loại thực phẩm này có thê gây ra những tác hại khơng ngờ tới

người tiêu dùng.
4 Nguyên nhân gây tồn dư kháng sinh:

s Có thể nhiễm lẫn vào thức ăn do tiếp xúc với mơi trường có chứa kháng
sinh. Có thể tồn dư do lỗi kỹ thuật sử dụng thường xuyên kháng sinh trong chăn

nuôi gia súc như:

Thư viện Viện Đại học Mớ Hà Nội

+ Kháng sinh cho vào thức ăn với mục đích kích thích tăng trọng cho gia

súc.

+

Kháng sinh cho vào nước uống đế phòng bệnh trong mùa dịch bệnh.

+

Kháng sinh cho vào nước uống dế chừa bệnh gia súc.

+

Kháng sinh cho thêm vào thức ăn cho gia súc để báo quàn súc sân lâu hư.

+ Kháng sinh tiêm vào súc vật hoặc cho súc vật uống trước khi giết thịt với

mục đích kéo dài thời gian, tránh hư hóng thịt tươi.
+

Sừ dụng kháng sinh ngồi danh mục cho phép.

J Có thế cho thắng vào thực phẩm với mục đích ức chế, tiêu diệt vi sinh vật
dô báo quán thực phâm. Do vận chuyên sàn phàm đi xa, cho kháng sinh vào thực

phẩm để bâo quăn.

7


J Không tuân thù theo đúng quy định về thời gian ngưng thuốc cũng như

liều lượng kháng sinh vì sự chuyển hóa kháng sinh trong mỗi cơ thể phụ thuộc vào

nhiều yếu tố như: giống, lồi, ti, tình trạng sức khòe...
Tất cà những nguyên nhân trên làm cho sàn phấm chăn ni tồn dư kháng

sinh, có ảnh hướng khơng tốt đối với người tiêu thụ.
♦

Ảnh hưởng của dư lượng kháng sinh đối vói sức khỏe con người:

Vì mục tiêu tăng năng suất trong chăn nuôi, trước đây người ta sữ dụng

kháng sinh như là chất kích thích tăng trọng, giảm tiêu hao thức ăn, tăng lợi nhuận.

Điều dó đã gây ra hậu quà rất xấu cho con người mà ngày nay người ta đã nhận ra
được. Đế góp phần nâng cao nhận thức và trách nhiệm cho các nhà chăn nuôi đối
với cuộc sống của nhân loại, sau đây là các tác hại cúa việc sử dụng kháng sinh

trong thức ăn chăn nuôi:

V Ảnh hưởng ngay lập tức sau khi tiêu thụ sán phấm:

-

Phán ứng quá mẫn đối Ỷới ọgười nhạy câm kháng sinh

-

Gây dị ứng sau khi tiêu thụ thực phấm tồn dư kháng sinh

V

Ánh hưởng muộn hơn khi tiêu thụ thực phẩm tồn dư kháng sinh:

-

Tạo ra thể vi sinh vật kháng thuốc

-

Gây khó khăn cho cơng tác diều trị nhiễm khuẩn

-

Gây tốn kém về mặt kinh tế

V Làm giảm sự đáp ứng miễn dịch cùa cơ the, tạo ra con giống yếu ớt:
-

Không sống được khi không có kháng sinh
Một số kháng sinh có thể gây ung thư cho người tiêu thụ

Vậy ngoài đường uổng, thuốc kháng sinh còn thâm nhập vào cơ thế chúng ta
qua đường ton dư trong thực phẩm: thịt, trứng, sữa của các động vật chăn nuôi.

8


1.1.4. Các thông tin về hàm lượng kháng sinh an toàn trong thục phẩm

Hiện nay trên thế giới, ủy ban Châu Âu. Mỹ và các nước phát triển khác đã

ban hành các quyết định, quy định giới hạn cho phép thuốc, hóa chất dùng trong thú

y bao gồm cà thuốc kháng sinh được dùng trong sán phẩm động vật (chang hạn
Quyết định số 2377/90 EC), theo đó các sán phẩm có nguồn gốc động vật phái được

kiểm sốt dư lượng và tuân thú các quy trình cụ thể (chăng hạn Chi thị số 96/23
EC).

ủy ban Tiêu chuẩn về Thực phẩm Quốc te (Codex) đã đưa ra các quy định

giới hạn tối đa dư lượng (Maximum Residue Limit, MRL) cũa kháng sinh
Neomycin trong thực phẩm. Tức là lượng kháng sinh cao nhất được phép tồn dư

trong thực phấm mà không ánh hường đến sức khỏe con người và vật nuôi khi sứ
dụng sản phàm đó làm thức ăn.

Giá trị MRL được xác định bởi 3 ycu tố:
(1) Lượng toi thiểu có tác dụng trên động vật thí nghiệm hay điều trị gây ra
hiệu quâ được cônĩta'iện

Viện Đại học Mơ Hà Nội

(2) Độ an toàn trong khoảng 1% hay thấp hơn, nếu được chấp nhận trong y

học hoặc độ an toàn cao hơn 1 % nếu có bất cứ bang chứng nào cho thay có nguy cơ

giống như các thí nghiệm trên những hợp chất tương tự.
(3) Các yếu tố để cân bang các tỳ lệ trong các mô ở một khấu phần ăn trung

bình.

Ờ nước ta, ngày 19/12/2007, Bộ Y Tế ban hành quy định giới hạn tối đa ô

nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm kèm Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT.

trong đó có giới hạn tối đa dư lượng kháng sinh neomycin trong thực phấm như sau:

Báng 1.1: Dư lượng tối đa kháng sinh Neomycin trong thực phấm

Neomycin

Thịt

Gan

Trứng

Sữa

MRL (pg/kg)

500

500

500

1500

9

1.1.5. Các phương pháp xác dinh dư lượng kháng sinh hiện nay

'C Phưong pháp ELISA: Phương pháp này hiện được sử dụng rộng rãi

trong nhiều lĩnh vực như y học, nơng nghiệp, đặc biệt trong quy trình kiềm tra an
tồn chất lượng cùa các sản phẩm thực phấm, Thị trường tiềm năng hiện nay cùa

phương pháp này là lĩnh vực kiếm soát dư lượng trong thủy sản, thực phấm, bệnh

nhiệt đới. EL1SA có rất nhiều dạng, đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc
hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thế được gan với một

enzyme. Phương pháp ELISA có ưu diem nhanh, thao tác đơn giàn, dề thực hiện,

khơng địi hịi thiết bị đắt tiền, khơng cần nhân viên chun mơn cao, chi phí kiêm

mẫu thấp do có the kiểm đồng thời số lượng mầu lớn. Tuy nhiên nhược điểm do đây
là sinh phấm nên I số hóa chat cần phái báo quán lạnh và có hạn sừ dụng nhất định,

độ chính xác khơng cao bằng các phương pháp hóa lý.
■

S Phương pháp sử dụng enzyme và vi sinh vật

Gần đây, ớ Việt Nam phương pháp hai đĩa mới "NTPT - New Two Plate
Test" đã được lối ưu và chuẩn hóa đế phát hiện kháng sinh trong tôm (Phạm Kim
Đăng, 2010). Tuy nhiên, các phương pháp này thường có nhược diếm là phố phát
hiện hẹp, có thể gây dương tính giã do các chất gây ức chế vi sinh vật như
lysozyme, không thè xác định cụ thê từng loại kháng sinh trong nhóm và độ chính

xác là khơng ồn định. Hiện nay. đa số các phương pháp này được sứ dụng như là
những phương pháp sàng lọc trước khi sử dụng những phương pháp phân tích đặc
hiệu hay sắc ký đế giảm thiểu chi phí.

J Phương pháp sắc ký lóp mỏng (Thin Layer Chromatography, TLC)
Sắc ký lớp mỏng là một kỳ thuật sắc ký được dùng để tách các chất trong
hỗn hợp. Phương pháp sắc ký lớp mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng các chất

hấp phụ, thường là silica gel, aluminium oxide hoặc cellulose được phu trên một

mặt phang chất trơ. Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hịa tan trong
một dung mơi thích hợp và được hút lên bán sắc ký bời mao dẫn. Các mẫu được áp

dụng chú yêu là dược phấm và một số loại thực phẩm như sữa, mật ong. thịt, cá...

10


Phương pháp này chủ yếu có vai trị định tính, thư tinh khiết và đôi khi đế
bán định lượng hoạt chất của thuốc, khó xác định được chính xác hàm lượng kháng
sinh tồn dư trong mẫu.
■

/ Phưong pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-Performance Liquid

Chromatography, HPLC)

Phương pháp sac ký long hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967 - 1968.
HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lóng và pha tĩnh

chứa trong cột là chat ran dã dược phân chia dưới dạng tiếu phân hoặc một chất
lỏng phú lên một chất mang ran, hay một chất mang đã được biến đối bằng liên kết
hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Phương pháp này ngày càng được sứ dụng rộng

rãi và phố biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khá năng định lượng tốt, thích hợp
lách các hợp chất khó bay hơi hoặc dề phân húy nhiệt.
Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp

chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực
thực phẩm, dược phâhiị môi trưèmgừ)

Đại học Mở I là Nội

Ưu điếm chính cúa hệ thống HPLC là thời gian chạy nhanh hơn nhiều so với

các phương pháp sắc ký khác nhưng nhược điếm là đắt tiền nên khó áp dụng trên
quy mơ lớn.

■

/

Phương

pháp

sắc

ký

lịng

ghép

khối

phổ

(liquid

chromatographytandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS)
Sac ký lõng ghép khối phố là một thiết bị lý tường cho các phịng thí nghiệm.

LC/MS là phương pháp được dùng trong phân tích vết và các hợp chất cần nhận

danh chính xác vì trong những điều kiện vận hành nhất định ngồi thời gian lưu đặc
trưng, hóa chất cịn được nhận danh bằng khối phố của nó. Trong sắc ký lỏng ghép

khối phố, hồn hợp chất phân tích sau khi lách ra khỏi cột sẽ đi qua một đường

truyền đen đau dò khối phố. Cột sac ký lòng cho phép tách chất cần quan tâm, khối
phổ cho phép tách ion cần quan tâm và cho biết phân tử lượng cùa chất phân tích.

Một hệ thong LC/MS/MS sẽ phân mánh ion mẹ thành các ion con và tách các ion
11


con đế định danh và định lượng. Phương pháp này cho kết q chính xác nhưng

cũng cần có các trang thiết bị đắt tiền cũng như cán bộ được đào tạo chuyên sâu cà
về chuyên môn lần kỹ năng sừ dụng thiết bị.
1.2. Tổng quan về aptamer
1.2.1. Giới thiệu về aptamer

Aptamer (thuật ngữ bắt đầu từ tiếng Latin aptus - phù hợp. tiếng Hy Lạp

meros - phan) có bán chất là acid oligonucleic hoặc các phân tứ peptid có khá năng
liên kết chặt chẽ và đặc hiệu với một phân tứ đích cụ thế. Aptamer được phát hiện
từ năm 1990 bới 2 phịng thí nghiệm độc lập Ellington & Szostak, 1990 và Tuck &

Gold, 1990 [8,15],

Hình 1.2: cấu trúc aptamer liên kết vói kháng sinh neomycin

Aptamer được tạo ra theo con đường nhân tạo. Aptamer dược sàng lọc băng

phương pháp SELEX _ Systematic Evolution of Ligands bj' exponential
enrichment. Quá trình sàng lọc bắt đầu với thư viện oligonucleotide lớn ngẫu nhiên.
Các chuỗi oligonucleotide được ủ với phân tử đích và qua nhiều vòng sàng lọc đế

lựa chọn những phân tứ đích có ái lực cao với phân tử đích. Sau đó, sứ dụng PCR
đế khuếch đại aptamer mong muốn. Được tống hợp từ những năm 1990 tới nay,
aptamer đã được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực: chẩn đoán các mối nguy, cám biến
12


sinh học, điều trị ung thư, y dược, thực phấm... Phố đích cúa aptamer rất đa dạng từ

các ion, các phân tứ, các chất, tế bào [15], Aptamer cịn có khá năng phát hiện ra

các chat độc hoặc các chất khơng có hoạt tính miễn dịch. Một so aptamer đã được
nghiên cứu có hang so phân ly trong phạm vi nanomol hay picolmol. Trong một số

trường hợp vai trò như đầu dị nhận biết phân tứ. aptamer có ái lực liên kết thậm chí
vượt qua các kháng thể đơn dịng. Các kít thương phẩm của aptamer đã được

thương mại hóa đề nhận biết các phân tử: EGFR, INSR, ErbB2, EphA2, IGF_1R,

HGFR...và một số thuốc đã được thương mại hóa. Hơn the, aptamer đang được kỳ
vọng là hướng nghiên cứu da lĩnh vực, những căn bệnh nan y như HIV, ung thư...

Hình 1.3: Các ứng dụng của nucleic acid aptamer

Ưu điếm cùa aptamer so với kháng thế:
J Aptamer có kích thước phân tứ nhó hơn kháng thể và khơng sinh đáp ứng

miễn dịch khi sử dụng in vivo.

13


J Aptamer có khà năng nhận biết và gắn kết đặc hiệu với phân tử đích tương

đương hoặc hơn các kháng thể.

J Vấn đề tạo aptamer đơn gián, nhanh và hiệu quá vượt trội so với việc tạo
kháng thể đơn dịng hoặc các kháng thể tái tố hợp.

J Aptamer có các độ bền với các tác nhân như hóa, lý, môi trường cao hơn
kháng thê.

1.2.2. Phương pháp SELEX (Systematic Evolution of ligands by Exponential

enrichment) sàng lọc aptamer

Phương pháp SELEX là phương pháp sử dụng một nhóm các kỹ thuật sinh
học phân tử đe tống hợp in vitro oligonucleotide có khá năng liên kết với phối tử,

mục tiêu phối tử. Trong quá trình sàng lọc aptamer theo một qua trình SELEX gồm

nhiều vịng sàng lọc với 3 q trình chọn lọc những trình tự oligonucleotide gắn với
phân từ đích từ thư viện oligonucleotide ngẫu nhiên, thu nhận và khuếch đại những
aptamer có khâ năng liên kết đặc hiệu với phân tư đích [8,15].

Thư viện Viện Đại học Mớ Hà Nội

Hình 1.4: Quy trình sàng lọc SELEX
Quy trình SELEX sàng lọc aptamer bat đau từ một thư viện oligonucleotide

ngẫu nhiên. Thư viện này gồm ssDNA có độ đa dạng cao. Mỗi ssDNA có một vùng
14


trung tâm là các trình tự ngẫu nhiên có n nucleotide từ 20 tới 80 nucleotide được
gắn với 2 đầu là trình tự cố định. Trình tự này khoảng 18 tới 21 nucleotide. Kích
thước của vùng ngẫu nhiên gồm n nucleotide quyết định sự phức tạp của thư viện.

Việc lựa chọn số lượng nucleotide thích hợp trong vùng ngẫu nhiên giúp tăng khà
năng sàng lọc được những phân tứ aptamer có ái lực cao, bền vững với phân từ

đích. Trong các thí nghiệm đã được tiến hành về aptamer, sử dụng phương pháp

SELEX chọn lọc trong thư viện ban đàu có 109 tới IO14, 1015 phân từ [6].

Q trình sàng lọc, thư viện được ú với những phân tử đích trong đệm. Sau
dó sử dụng những kỳ thuật khác nhau đê tách các phức hợp aptamer_đích ra khỏi
những phân từ khơng gắn kết đặc hiệu. Những trình tự gắn kết đặc hiệu đã được thu

sau giai đoạn phân tách được giãi hấp và khuếch đại để cung cap thư viện cho vịng
sàng lọc sau [71. Q trình sàng lọc và khuếch đại này được diễn ra cho tới khi sàng
lọc được aptamer có ái lực cao nhất đối với phân từ đích và sẽ được chuyển sang
giai đoạn tách dịng và giải trình tự [6, 8, 15].
1.2.3. Tình hình nghiên cứu aptamer trong và ngoài nước

Aptamer là các phân tử đa chức năng có ứng dụng to lớn trong nhiều lĩnh

vực. Tiến bộ gần đây trong việc lựa chọn và phát triến aptamer có khả năng gắn với
các mục tiêu đế phân phối thuốc, chân đoán và trị liệu, phát hiện nguy cơ. phát hiện

độc tố, điều trị bệnh và điều hịa biếu hiện gen. Aptamer cùng có thế giúp phát hiện

sớm bệnh ung thư. Aptamer có ưu điếm hơn với các kháng thể và cung cấp các
công cụ hứa hẹn trong các ứng dụng khác nhau.
J Trong lĩnh vực chế tạo cảm biến sinh học: Aptamer được sứ dụng đe
phát hiện kháng sinh tồn dư trong sán phẩm như streptomycin, obramycin,

neomycin, phát hiện độc tố nấm ờ nồng độ nano gram: mycotoxin [4], ochretoxin A

và đã xây dựng thành kít thương phâm, fumonisin Bl. nephrotoxin [4,5], những
phát hiện cùa aflatoxin trong các mẫu sữa, việc phát hiện E. coli 0157: H7 trong

các mẫu thực phẩm hoặc việc sứ dụng của một tế bào dựa trên kỹ thuật cám biến

sinh học để phát hiện so lượng khác nhau cùa các mầm bệnh và các chất độc. Ngồi

ra. aptamer cịn được sư dụng để phát hiện các kim loại nặng có trong nước uống

15