Nghiên cứu tách chiết và phân tích cấu trúc kháng sinh thu được từ chủng xạ khuẩn STREPTOMYCES SP KCTC 0041BP sau khi đã đột biến mất GEN MIII

VIỆN DẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

------ ỈOCg-*-SíXS8------

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
DÈ TÀI:
NGHIÊN CứU TÁCH CHlếT VÀ PHÂN TÍCH cấu TRÚC KHÁNG

SINH THU ĐUọC Từ CHÚNG Xạ KHUấN STREPTOMYCES SP. KCTC

0041BP SAU KHI ĐÃ ĐỘT BlếN MấT GEN GER Mill.

Giáo viên hưóng dẫn

:Th.s Nguyễn Thị Ngọc Anh

Sinh viên thục hiên

:Nguyễn Hoài Linh

Lớp

:ll-02


Viện dại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài em đã nhận được rất nhiều sự

quan tâm, giúp đờ của quý thầy cỏ, gia đình và hạn hè.
Với lòng biết ơn sâu sac nhát em xin gửi tới cô giáo - ThS. Nguyễn Thị Ngọc

Anh - người đã định hướng nghiên cứu, giúp đỡ và tạo mọi điểu kiện tốt nhất cho
em trong suốt quá trình thực tập và hồn thành đề tài nghiên cứu cùa mình.
Em xin chân thành cảm ơn TS. Tạ Thị Thu Thúy - Chủ nhiệm khoa Công Nghệ

Sinh Học - Viện Đại Học Mờ Hà Nội, cùng tồn thê các thay cơ giáo, anh chị kĩ

thuật viên các bạn sinh viên Phòng thí nghiệm Sinh học phân tứ đã ln bên cạnh

động viên, khích lệ, ủng hộ em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Bước đầu tìm hiếu, thực hiện đề tài với von kiến thức còn hạn che và nhiều bỡ
ngỡ. Mặc dù bân thân đã có nhiều cố gắng, nhưng khơng thế tránh khỏi những

thiều sót nên em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của q Thây - Cơ đê
bài khóa luận của ém được .dầy dụ

hqn.

Em xin chân thành cám ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2015
Sinh viên

Nguyễn Hồi Linh.

Nguyễn Hồi Linh

Lóp 11-02

Viện dại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

MỤC LỤC

LỜI CÁM ƠN................................................................................................................ i

MỤC LỤC.................................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC HÌNH............................................................................................ V
DANH MỤC CÁC BÁNG.......................................................................................... vi

MỚ ĐÂU....................................................................................................................... 1

PHÁN 1: TỎNG QUAN TÀI LIỆU.......................................................................... 4

1.1.

Tông quan vê kháng sinh................................................................................ 4

1.1.1.

Lịch sử về kháng sinh..................................................................................... 4

1.1.2.

Định nghĩa về kháng sinh............................................................................... 4

1.1.3.

Phân loại kháng sinh....................................................................................... 5

1.1.4.

Cơ chế tác dụng của kháng sinh..................................................................... 6

1.1.5.

Các nghiên cứu gần đây về kháng sinh.......................................................... 7

1.2.

Tổng quan về xạ khuấn Streptomyces............................................................ 9

1.2.1.

Vai

1.2.2.

Giới thiệu về xạ khuấn Streptomyces........................................................... 10

9

1.2.3.

Sự hình thành chất kháng sinh ớ xạ khuẩn................................................... 10

1.3.

Xạ khuẩn Streptomyces. sp K.CTC 0041BP................................................. 11

1.3.1.

Đặc điểm nuôi cấy......................................................................................... 11

1.3.2.

Đặc điếm sinh lý, sinh hóa............................................................................ 13

1.3.3.

Khá năng kháng khuân với một số vi sinh vật kiếm định............................ 13

1.3.4.

Phân loại......................................................................................................... 13

1.4.

Xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC0041 bp đã được đột biến GerMIII......13

1.5.

Tổng quan về kháng sinh dyhidrochalcomycin............................................ 14

1.5.1.

Cấu trúc cùa dyhidrochalcomycin................................................................. 15

1.5.2.

Vai trò và hoạt tính sinh học......................................................................... 15

1.5.3.

Các nghiên cứu về dihydrochalcomycin....................................................... 16

1.6.

Đại cương về gen gerMIII (2-O-methyltransferase).................................... 21

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cửu................................... 23

Nguyễn Hồi Linh

Lóp 11-02


Viện dại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

2.1.

Vật liệu hóa chất và thiết bị............................................................................. 23

2.1.1.

Vật liệu.......................................................................................................... 23

2.1.2.

Hóa chất......................................................................................................... 23

2.1.3.

Môi trường nuôi cấy......................................................................................24

2.1.4.

2.2.

Thiết bị.......................................................................................................... 25

Phương pháp nghiên cứu................................................................................. 25

2.2.1.

Phương pháp nuôi cấy chủng vi sinh vật..................................................... 25

2.2.2.

Phương pháp bảo quản giống....................................................................... 27

2.2.3.

Phương pháp tách chiết kháng sinh thô bằng dung mơi hữu cơ................. 27

2.2.4.

Phương pháp thư hoạt tính kháng sinh bằng khoanh giấy lọc.....................29

2.2.5.

Phương pháp sac ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC)...... 30

2.2.6.

Phương pháp Prep - TLC (Prepare TLC)..................................................... 31

2.2.7.

Phương pháp sắc ký lóng kết hợp khối phố (Liquid Chromatography

Mass).

2.2.8.

............................................................................................................. 33

Phương pháp ion h^tia 0iện ESI (Electrophox^si^ Spray ^jnization)......34

PHÀN 3: KÉT QUA VÀ THAO LUẠN................... .............................. 35
3.1.

Tách chiết kháng sinh thô bang dung môi hữu cơ.......................................... 35

3.2.

Thừ hoạt tính kháng sinh bang phương pháp khoanh giấy lọc...................... 36

3.3.

Tthừ hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp sắc ký lóp móng TLC............ 38

3.4.

Tinh sạch kháng sinh bàng Prep - TLC (Prcpare-TLC)................................ 40

3.5.

Ket quả phân tích kháng sinh bằng phương pháp sắc ký lóng kết hợp khối phố

(LC-Mass) và phương pháp ESI-Mass....................................................................... 41
3.6.

Quy trình tách và thu nhận kháng sinh thơ quy mơ phịngthí nghiệm........... 43

3.7.

Qui trình tinh sạch quy mơ phịng thí nghiệm................................................ 45

PHẦN 4: KÉT LUẬN VÀ DỀ XUẤT....................................................................... 46
4.1.

Kết Luận........................................................................................................... 46

4.2.

Đe Xuất............................................................................................................ 46

TÀI LIỆU THAM KHÁO.......................................................................................... 47

Nguyễn Hồi Linh

iii

Lóp 11-02


Viện dại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC CHŨ VIẾT TÁT

Chữ viết tắt

Chú thích

Amp

Ampicillin

Bp

Base paire

c

Carbon

CKS

Chat kháng sinh

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTPs

Deoxynucleotide triphosphates

RNA

Ribonucleic Acid

Gr+

Gram dương

Gr

Gram âm

Neo

Neomycin

vsv

Vi sinh vật

HPiiCviện Viện Đị

1 học High Perfomance Liquid
Chromatography

LB

Luria Bertani

TLC

Thin Layer Chromatography

LC-Mass

Liquid Chromatography Mass

PKS

Polyketidc Synthase

ESI-Mass

Electrophoresis Spray Ionization Mass

dvC

Đơn vị Cacbon

Nguyễn Hồi Linh

iv

Lóp 11-02


Viện dại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Khn lạc cua chùng Streptomyces sp. KCTC 004IBP trênmơi trường

ISP2............................................................................................................................. 12

Hình 1.2. Hình dạng KTKS và KTCC của chúng Streptomyces sp. KCTC 004IBP
phóng đại (x 4.500-15.000)........................................................................................ 13

Hình 1.3.Cấu trúc cùa Dihydrochalcomycin .............................................................15
Hình 1.4. Dự đốn con đường sinh tổng hợp gốc đường khứ và bước cuối hồn

thành cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin........................................................ 19
Hình 1.5. Nhóm gen sinh tổng hợp dihyrochalcomycin phân lập từpGERI-5

cosmid........................................................................................................................22
Hình 3.1. Phân pha chiết dịch kháng sinh........................................................... 35

Hình 3.2. Sản phấm kháng sinh của các chùng đã đột biến sau khi quay cô. 36
Hình 3.3. Ket q thử hoạt tính kháng sinh của các chủng Streptomyces sp.

KCTC 0041BP đã đột biến......................................................................................37

Hình 3.4. Kết q kíềni .tfa\:hặy TLC c&t chủng kỉreịttịìnyces sp. KCTC
0041BP(W) và các chúng đột biến M3-1-10(10), M3-8-I3(13)...................... 38
Hình 3.6. Kết quả thứ hoạt tính kháng sinh sau khi tinh sạch........................... 40
Hình 3.5. Kct quá thứ hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp TLC với chúng

xạ khuấn Streptơmyces sp. KCTC 0041BP ban đầu(W) và các chúng đột biến
M3-l-10(10), M3-8-13(13)..................................................................................... 39
Hình 3.7. Ket quả chạy TLC sau khi tách khói bột silicagel............................. 41
Hình 3.8A và hình 3.8B: Phân tích cấu trúc phân tứ Dihydrochalcomycin

bàng LC-Mass...........................................................................................................42
Hình 3.9A và hình 3.9B: Phân tích cấu trúc cùa dẫn xuất kháng sinh từ chùng

đột biến gen GerMIlI............................................................................................... 43

Hình 3.10. Sơ đồ quy trình thu nhận kháng sinh thơ...........................................44
Hình 3.11. Sơ đồ quy trình tinh sạch quy mơ phịng thí nghiệm...................... 45

Nguyễn Hồi Linh

Lóp 11-02


Viện dại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BANG
Bảng 1.1. Dự đoán chức năng cùa các gen ORFs trong nhóm gen sinh tống

hợp dihydrochalcomycin.......................................................................................... 17

Bảng 3.1. Ket quà thứ hoạt tính kháng sinh của chủng Streptomyces sp.
KCTC 004IBP ban đầu và các chúng đột biến M3-8-13, M3-1-10................37
Bàng 3.2. Kết quả thừ hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp TLC với chùng

đột biến M3-1-10, M3-8-13 và chủng wild type..................................................38

Thư viện Viện Đại học Mớ Hà Nội

Nguyễn Hoài Linh

vi

Lóp 11-02


Viện dại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
Bệnh nhiễm khuấn là một trong những nguyên nhân hàng đầu đe dọa đến sự

an toàn cùa con người. Những trận dại dịch không những cướp đi sinh mạng con
người mà thậm chí cịn dẫn đến sự diệt vong cùa một đế chế hùng mạng. Chính điều
đó đã thơi thúc các nhà khoa học trên thế giới phái tìm ra được một chất có khã
năng phịng chong và điều trị các bệnh nhiễm khuẩn.
Ngày nay với sự phát triển vượt bậc của cơng nghệ sinh học đã tìm ra rất nhiều

chất kháng sinh (CKS) phục vụ đời sống con người. Trong số hơn 10.000 CKS

được tìm ra thì có khống 2.000 chất do thực vật tạo ra. khoảng 8.000 chất là kháng
sinh do vi sinh vật tổng hợp. trong đó xạ khuẩn tồng hợp trên 80% 1111.

Tuy nhiên, do việc sử dụng các CKS không hợp lý đã làm xuất hiện hiện
tượng kháng kháng sinh, số lượng các vi khuẩn kháng với chất kháng sinh ngày

càng gia tăng. Vì vậy, đi kèm với các biện pháp sử dụng kháng sinh an tồn, hợp lý
thì việc nghiên cứu sàn xuất ra các chat kháng sinh mới có nhiều đặc tính ưu việt

thựcsựrấtcầnthiểpi^ viện

Viện Đại học Mở Hà Nội

Xạ khuấn Streptomyces sp. KCTC0041BP dang dược nghiên cứu ở nhiều
nước như Hàn Quốc, Việt Nam. Đây là chùng hoang dại sinh tồng hợp ra
Dihydrochalcomycin và đã được phân lập. xác định cấu trúc hóa học bời nhóm

nghiên cứu tại Hàn Quốc 119].

Kháng sinh Dihydrochalcomycin (C35H58O14) là kháng sinh thuộc nhóm

Macrolide 16C, được sứ dụng trong điều trị nhiễm trùng đường hô hấp. Kháng sinh
Dihydrochalcomycin được tách chiết từ chũng xạ khuân Streptomycessp. KCTC

004IBP. có tác dụng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn Gr' (Gram âm) và Gr+ (Gram

dương) bang cách liên kết vào tiểu phần 50S cùa ribosome, ngăn càn quá trình sinh

tống hợp protein của vi khuấn. Nhiều nhà khoa học đã và dang quan tâm nghiên
cứu về loại kháng sinh này bới nhiều ưu điếm vượt trội cùa nó như ít độc, dung nạp

lốt, thái trừ nhanh, có hoạt tính kháng khuẩn rất mạnh và đặc biệt chưa xuất hiện

hiện tượng kháng thuốc.

Nguyễn Hồi Linh

1

Lóp 11-02


Viện dại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

Các nhóm nghiên cứu trên thế giới xác định tồn bộ nhóm gen cùa xạ khuấn

này. Tồn bộ nhóm gen tham gia sinh tống hợp có chuỗi trình tự là 75.5kb và có
khoảng 23 ORF chứa thơng tin di truyền và mã hóa của các gen tham gia con đường

tơng hợpDihydrochalcomycin: gerữ, gerMl, gerN, gerR. gerPl, gerP2, gerG. gerE.

gcrD, gerF, gerM2, gerP3, gerH, gerK 1. gerM3, gerĩ 1, gerK, gerS 1, gerS2, ggerS4. gerS5, gerỴ, gerT2, gerK2. Hiện nay, đã có một so gen được nghiên cứu

chứng minh chức năng cùa chúng là: gé/Tl, gerT2, gcrKl, gerF, gerR. ge/'M2,
gerMl [1], [4], [5], [13].

Trong 31

gen tham gia vào quá trình sinh tống hợp kháng sinh

Dihydrochalcomycin, gen gerMIII có chức năng mã hóa tồng hợp enzyme 2- O-

mcthyltransferasc.Enzyme2-O-methyltransfcrasc (GcrMIll) cùng với 3-0methyltransferase (GerMII) sẽ xúc tác phán ứng methyl hóa nhóm -OH tại vị trí c2,
c3 tạo gốc đường D-mycinose.

Gen gerMIII đã có khóa luận tốt nghiệp “Nghiên cứu tạo đột hiến gen mã hóa
cho enzyme 2 - O-me^l^^fepa^a(gen GerM.3. bhang phương pháp tiếp hợp trên

xẹt khuân Streptonryces sp. KCTC0041BP'' - Ngô Văn Luân (2013). Sau khi đã đột
biến gen gerMlII và đã được chứng minh bang sàng lọc trên mồi trường có bố sung
kháng sinh Apramycin và Neomycin tạo chúng đột biến có trao đồi chéo đơn và

chúng có trao đối chéo kép. Tuy nhiên mới bước đầu sàng lọc chùng đột biến có

trao dối kép làm mat gen ger Mil. Đố chứng minh đột biến mat gen ger MII và làm

rõ hơn chức nâng cùa gen ger MIL năm 2014 khóa luận toi nghiệp “Bước đầu

nghiên cứu tách chiết và kiếm tra sán phàm kháng sinh cùa chúng xạ khuẩn đột
hiến gen ger Mil từ chùng Streptomyces sp. KCTC 004IBP han đầu” - Nguyền Thị

Hà (2014).
Tuy nhiên mới bước đầu tách chiết và phân tích một lượng nhó sán phàm

kháng sinh từ chững xạ khuấn đột biến.Vì vậy nhóm nghiên cứu thực hiện đề tài :

“Nghiên cứu tách chiếtvà phân tích cấu trúc kháng sinh thu được từ chủng xạ
khuẩn Steptomyces sp. KCTC0041BP sau khi dã dột biến mất gen ger Mill”.
Mục tiêu đề tài:

Nguyễn Hồi Linh

2

Lóp 11-02


Viện dại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

-

Tách chiết và thứ hoạt tính kháng sinh thơ cũa chủng xạ khuân Streptomyces

sp. KCTC 004IBP đã đột biến mất gen gcrMIII

-

Phân tích cấu trúc kháng sinh thu được từ chúng xạ khuấn Streptomyces sp.

KCTC004IBP.
Nội dung thực hiện:
-

Tách kháng sinh thô bằng phương pháp quay cơ chân khơng.

-

Xác định hoạt tính kháng sinh bang phương pháp khoanh giấy lọc.

-

Xác định hoạt tính kháng sinh bàng phương pháp chạy sắc ký bản móng TLC.

-

Nghiên cứu tách và tinh sạch kháng sinh bang Prep-TLC(Preparative-TLC).

-

Phân tích kháng sinh bằng phương pháp sắc ký lỏng kết hợp phối khổ ( LC-

Mass) và phương pháp ESI-Mass.

-

Xây dựng quy trình tinh sạch kháng sinh thơ trong phịng thí nghiệm.

Thư viện Viện Đại học Mớ Hà Nội

Nguyễn Hồi Linh

3

Lóp 11-02


Viện dại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

PHÀN 1: TÔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.

Tổng quan về kháng sinh.

1.1.1. Lịch sử về kháng sinh.

Năm 1928, nhà sinh vật học người Anh Alexander Fleming trong khi nghiên
cứu tụ cầu ông nhận thấy xung quanh khuẩn lạc mốc xanh nhiễm vào hộp petri ni

tụ cầu tạo thành vịng vơ khuẩn.Hiện tượng kì lạ này đã được Fleming nghiên cứu.
phân lập thuần khiết và xác định được mốc xanh đó là Penicillium notation - một

chúng tạo penicillin.

Năm 1938. Fleming nhận được thư cùa hai nhà khoa học từ trường Đại học
Oxford là Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey, với lời đề nghị được hợp tác
với ông đế tiếp tục thực hiện công trình nghiên cứu về penicillin và họ đã thứ

nghiệm thành cơng penicillin trên chuột vào 1940.
Năm 1941, nhóm đã chọn đưực loại nấm Penicillium ưu việt nhất là chúng
Penicillum chrysogenium, chế ra loại penicillin có hoạt tính cao hơn cả triệu lần
Mợ Hà Nội

penicillin do

Năm 1945, Fleming được giải thướng Nobel về y học cùng với Ernst Boris
Chain và Howard Walter Florey.
Một số kháng sinh khác : sulfornamid được Gerhard Domard (Đức) tìm ra vào

năm 1932 và streptomycin được Selman Waksman và Albert Schat tìm ra vào năm
1934. Sau này dặc biệt ớ hai thập kỹ cuối của thế kỷ XX, cơng nghệ sinh học và hóa

dược phát triển mạnh, người ta đã tìm ra được rất nhiều loại kháng sinh mới. Ngày
nay con người biết được khoáng 8000 chất kháng sinh khác nhau có nguồn gốc từ

nấm mốc, xạ khuẩn và vi khuẩn, 100 loại được dùng trong Y khoa và Thú y.
1.1.2. Định nghĩa về kháng sinh.

Thời kì vàng son cúa kháng sinh bắt đầu từ khi sản xuat penicillin để dùng

trong lâm sàng (1941). Khi đó người ta đã định nghĩa

Kháng sinh là những sàn

phẩm trao đối chất tự nhiên được các vi sinh vật tiết ra (vi khuẩn, vi nấm), có tác
dụng ức chế sự phát triến hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật khác", theo
Waksmanl942.

Nguyễn Hồi Linh

4

Lóp 11-02


Viện dại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

Tuy nhiên, với sự phát triển của khoa học. người ta có thể tống họp. bán tổng

hợp các kháng sinh tự nhiên (chloramphenicol); tống hợp nhân tạo các chat có tính
kháng sinh: sulfamid. quinolon hay chiết xuất từ vi sinh vật những chất diệt được tế
bào ung thư (actinomycin). Vì the định nghĩa kháng sinh đã được thay đối: “Kháng

sinh là tát củ các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tống hợp với nong độ rất

thấp có khả năng đặc hiệu kìm hãm sự phát triên hoặc tiêu diệt đổi với các vi sinh
vật gây bệnh, đồng thời không có tác dụng hoặc tác dụng yếu lên con người, động
vật và thực vật hằng con đường cung cấp chung”[3].

Đe biếu thị độ lớn giá trị hoạt tính sinh học của kháng sinh trong 1 ml dung
dịch (đơn vị/ml) hay 1 mg chế phấm (đơn vị/mg), thường dùng đơn vị kháng sinh.

Đơn vị kháng sinh là lượng kháng sinh tối thiếu hồ tan trong một thế tích mơi

trường xác định, có tác dụng ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật kiếm định trong thời
gian xác định[3]. Đơn vị kháng sinh quốc tế là UI, ví dụ 1 UI penicillin = 0,6 pg,

còn 1 UI streptomycin = 1,0 pg (Hopwood, 2007).

1.1.3. Viện Đại học Mớ Hà Nội
Việc phân loại nhằm khái quát một cách có hệ thống danh mục các CK.S do
việc tìm ra các CKS ngày càng nhiều. Nhờ đó tiết kiệm thời gian khi nghiên cứu các

CKS mới về cấu trúc hoá học, cơ chế tác dụng và khá năng ứng dụng trong cơng tác
chữa bệnh.

Có thè phân loại kháng sinh dựa trên nhiêu phương diện như phô tác dụng, cơ
chế tác dụng, nguồn gốc, con đường sinh tồng hợp hay cấu trúc hóa học. Tuy nhiên,
phân loại theo cấu trúc hóa học là phương pháp khoa học nhất, đưa ra một cái nhìn

tống quát nhất đối với các nhóm kháng sinh.
Theo cấu trúc hóa học, kháng sinh được phân thành 9 nhóm chính [3]:

- Nhóm 1: Các kháng sinh cacbonhydrate
- Nhóm 2: Các lactonemacrolide

- Nhóm 3: Các kháng sinh quinolone và dần xuất
- Nhóm 4: Các kháng sinh peptide và amino acid

- Nhóm 5: Các kháng sinh dị vịng chứa nitơ

Nguyễn Hồi Linh

5

Lóp 11-02


Viện dại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

- Nhóm 6: Các kháng sinh dị vịng chứa oxy

- Nhóm 7: Các kháng sinh mạch vịng no
- Nhóm 8: Các kháng sinh chứa nhân thơm

- Nhóm 9: Các kháng sinh mạch thăng

1.1.4. Cơ chế tác dụng của kháng sinh.
Các kháng sinh tác dụng cơ bản qua việc ức chế các phàn ứng tống hợp rất

khác nhau cùa tế bào vi sinh vật gây bệnh. Chúng liên kết vào các vị trí chính xác
hay các phân từ đích cùa tế bào vi sinh vật mà tạo ra các phản ứng trao đối chất làm

ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh.
Các đích tác dụng đặc trưng cho từng nhóm kháng sinh, tuy nhiên trong nhiều

trường hợp người ta vần chưa biết được chính xác het. Có 6 mức tác dụng khác

nhau đối với tế bào vi khuẩn hoặc nấm: tác dụng lên thành tế bào, tác dụng lên

màng nguyên sinh chất, tác dụng lên quá trình tống hợp DNA, tác dụng lên quá
trình tổng hợp protein, tác dụng lên sự trao đối chất hô hấp và cuối cùng là tác dụng

KnSự.rao1.1.4.1. ức che quá trình tồng hợp thành tế bào của vi khuẩn.
Các P-Lactam ngăn càn sự tông hợp các mucopeptide, làm rôi loạn q trình

nhân lên của vi khuẩn. Khi có mặt kháng sinh, vi khuấn có thế vẫn tiếp tục nhân lên
với vách khơng hồn chinh hoặc khơng có vách nhưng chúng dễ bị tiêu diệt bởi

thực bào, nhân tố lý hóa học.
Xycloserin tác động bằng cách ngăn cán tập hợp các tetra và pentapeptide do

ức chế enzym tồng hợp D-alanin.

Bacitracin: thay đơi tính thẩm thấu chọn lọc cúa màng ngun tương của vi khuẩn.
1.1.4.2. ức chế chức năng của màng tế bào.

Thay đồi chức năng năng lượng, ánh hường sự hô hấp tế bào: gramicidin,
sideromycin.

Kháng sinh gan lên màng tế bào chat làm thay đổi cân bằng thấm thấu cùa

màng tế bào như kháng sinh polypeptide: polymycin, colistin và kháng sinh chống
nam nistatin.

Nguyễn Hồi Linh

6

Lóp 11-02


Viện dại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

1.1.4.3.

ưc chê q trình sinh tơng hợp protein.

Nhóm aminoglycoside gan với receptor trên tiếu phần 30S của ribosome, ngăn

cản phức hợp khởi đầu hoạt động bình thường, can thiệp tiếp cận tRNA làm cho
q trình dịch mã khơng chính xác.

Nhóm chloramphenicol gắn với tiếu phần 50S cùa ribosome ức chế enzyme
peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide mới
thành lập.

Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phần 50S cũa ribosome làm
ngăn cán sự thành lập phức hợp đầu tiên đế tống hợp chuồi polypeptide.

1.1.4.4.

ức chế quá trình tong hợp nucleic acid.

Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn càn q trình sao mã
tạo thành mRNA (RNA thơng tin).

Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho hai mạch

đơn của DNA không thế duỗi xoắn làm ngăn cản q trình nhân đơi cùa DNA.
Nhóm sulfanyde^^ai^ti^icj giống PẠBẠ(paminọbenzoni^ acid) có tác dụng

cạnh tranh PABA và ngăn cán q trình tống hợp nucleic acid.
Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác có q trình tạo nhân purine
làm ức chế quá trình tạo nucleic acid.

1.1.4.5.

ức chế quá trình trao đôi chat folate.

Folic acid là cơ sở cho sự tơng hợp methionine, purine và pyrimidine, từ đó
tơng hợp nên protein và các acid nucleic của vi khuân. Sulfamid và trimethoprim có

cấu trúc hố học tương tựp-aminobenzoic acid (PABA) và folic acid. Khi sứ dụng,
sulfamid đối kháng cạnh tranh với PABA một tiền chất đề tống hợp folic acid, sẽ
gây thiếu purine, nucleic acid. Trimethoprim ức chế dihydrofolate reductase ngăn
quá trình chun hóa dihydrofolate thành tetrahydrofolate (dạng hoạt động cúa folic

acid), làm cho sự hoạt động cùa tế bào bị rối loạn.
1.1.5. Các nghiên cứu gần đây về kháng sinh.

Những năm 1940 - 1959 được coi là thời kỳ hoàng kim cứa việc nghiên cứu CKS
với hàng loạt CKS mới liên tiếp được phát hiện như : gramixidin. tiroxidin do Rene

Nguyễn Hồi Linh

7

Lóp 11-02


Viện dại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

Jules Dobos phát hiện năm 1939, streptomycin do Waksman phát hiện nãm 1941,

erythromycin do Gurre phát hiện năm 1952...Cùng với việc phát hiện ra các CK.S mới,
công nghệ lên men sàn xuất CKS cũng ra đời và dần được hoàn thiện [21 ].

Ngay từ những năm 1950. CKS đã được nghiên cứu sứ dụng trong việc phịng
chống bệnh, kích thích sự tăng trưởng của động vật nuôi và cây trồng. CKS thu hút
được sự quan tâm cùa các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau trên the giới.
Tốc độ tìm kiếm các CKS trong thời gian gần đây vần diễn ra nhanh chóng,

nhiều trung tâm nghiên cứu khoa học về y học, dược phẩm và nông nghiệp lại nhiều
nước trên the giới vẫn liên tục phát triển được hàng loạt các CKS mới có giá trị ứng
dụng trong thực tiền.

Năm 1999 một chất kháng sinh mới khác được phát hiện có tác dụng ngăn
chặn hiện tượng cholesterol, tăng sức đề kháng đối với các chất độc của chuột,
ngoài ra kháng sinh này cịn có hoạt tính chống nấm gây bệnh mạnh. Đó là kháng
sinh loposomal HA - 92, được tách từ xạ khuẩn Streptomyces CDRLL - 312.

Năm 2003, nhiều ng^c ựêp thế.giợi ^ẫn tiệp tục phát, hi^n được hàng loạt các
CKS mới. Tại Nhật Bán, chất kháng sinh mới là yatakemycin đã được tách chiết từ
xạ khuấn Streptơmycessp. TP - A0356 bằng phương pháp sắc ký cột. CKS này có
khả năng kìm hãm sự phát triển cùa nam Aspergillus fumigalus và Candida
albicans. Ngồi ra chất này cịn có khá năng chống lại các tế bào ung thư [5].

Năm 2007, tại Hàn Quốc dã phân lập được loài xạ khuân Streptomyces sp.
C684 sinh CKS laidlomycin, chat này có thế tiêu diệt cà những tụ cầu đã kháng

methicillin và các cầu khuấn kháng vancomycin [28].
Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại cùng sự hồ trợ cúa

nhiều ngành khoa học khác đã giúp cho việc tìm kiếm và ứng dụng CKS đạt được
những thành tựu rực rỡ. Đe sàn xuất CKS con người khơng chi tìm kiếm những
chúng vi sinh vật sinh CKS từ tự nhiên mà còn cái tạo chúng bằng nhiều phương

pháp như dùng kỹ thuật di truyền và công nghệ gcn, gây dột biến định hướng, chọn
dòng gene sinh tồng hợp, tạo và dung hợp tế bào trần đế tạo ra các chủng có hoạt

Nguyễn Hồi Linh

8

Lóp 11-02


Viện dại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

tính kháng sinh cao. đồng thời nhằm mục đích tìm kiếm các loại kháng sinh mới và

quý trong thời gian ngan [10], [26]

1.2.

Tong quan về xạ khuân Streptomyces.

1.2.1. Vai trò của xạ khuân trong tự nhiên .

Xạ khuấn (Actinobacteria) thuộc chúng vi khuấn thật (Eubacteria) phân bố rất
rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có trong đất. nước, rác, phân chuồng, bùn. thậm chí

cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nam mốc khơng phát triền được.
Theo Waskman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 - 2.400.000 mầm xạ
khuẩn, chiếm 9-45% tổng số vsv [22].

Sự phân bố cùa xạ khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào độ pH mơi trường, chúng
có nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu 6,8 - 7,5. Xạ khuẩn
có rất ít trong lớp đất kiềm hoặc axit và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm, số

lượng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm.
Trong quá trình trao đồi chất, xạ khuẩn cịn có thể sinh ra các chất hữu cơ như
các loại vitamin nhóm B (Bl,

B^2j)^n\0k^ acid hựụ cơ như acid lactic,

acid acetic; acid amin như acid glutamic, metionin. tryptophan, lizin.
Một trong những đặc tính quan trọng nhất của xạ khuấn là khá năng hình
thành chat kháng sinh. 60 - 70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh

chất kháng sinh. Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế

giới thì có tới 80% là do xạ khn sinh ra [3], Trong sơ dó có trên 15% có nguồn
gốc từ các loại xạ khuẩn hiếm như Micromonospora Actinomadura, Actìnoplanes,
Streptoverticillium, Streptosporangium.... Điều đáng chú ý là các xạ khuân hiếm đã

cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị đang dùng trong y học như gentamixin,
tobramixin, vancomixin, rosamixi.

Ngoài ra, xạ khuẩn tham gia tích cực vào các q trình chuyển hố nhiều hợp

chất trong đất, nước. Dùng đe sàn xuất nhiều enzym như proteaza amylaza,

xenluloza...một số axit amin và axit hữu cơ.
Một số xạ khuẩn có thề gây bệnh cho người, động vật. Các bệnh này được gọi

tên chung là Actinomycosis [11].

Nguyễn Hồi Linh

9

Lóp 11-02


Viện dại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

1.2.2. Giới thiệu về xạ khuẩn Streptomyces.
Chi Streptomyces là một giống xạ khuẩn bậc cao được Wakman và Hcnrici đặt

tên năm 1943 [27].

Đường kính sợi xạ khuẩn khống 1 - 10 ụ 111, khuấn lạc thường khơng lớn và
có đường kính khoáng 1 - 5 mm. Khuấn lạc chắc, dạng da mọc đâm sâu vào cơ chất,

Bề mặt khuẩn lạc thường được phú bới khuẩn ti khí sinh dạng nhung, dày hơn cơ
chất, đơi khi có tính kỵ nước.
Xạ khuấn chi Streptomyces sinh sàn vơ tính bàng bào từ. Trên đầu sợi khí sinh

hình thành cuống sinh bào tứ và chuồi bào tứ. Cuống sinh bào tứ có những hình

dạng khác nhau tùy lồi: thang, lượn sóng, xoắn, có móc, vịng ... Bào tư được hình
thành trên cuống sinh bào tứ bang hai phương pháp phân đoạn và cat khúc. Bào tứ

xạ khuấn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với đường kính khoảng 1,5 pm.
Màng bào tử có thể nhẵn, gai, khối u, nếp nhăn...tùy thuộc vào loài xạ khuẩn và môi

trường nuôi cấy. Thường trên môi trường có nguồn đạm vơ cơ và glucoza, các bào

(ứbiêuhiện ếe d^^^^Viện Đại h?c Mở Hà Nội
Màu sac cúa khuẩn lạc và hệ sợi khí sinh cũng rất khác nhau tìiy theo nhóm
Streptomyces, màu sắc này cũng có thế biến đối khi ni cấy trên mơi trường khác
nhau. Vì vậy mà ủy ban Quốc te về phân loại xạ khuẩn ISP đã nêu ra các môi

trường chuấn và phương pháp chung đề phân loại nhóm vsv này.
Các lồi xạ khn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn Gr (+),

hiếu khí, dị dường các chat hữu cơ. Nhiệt độ tối ưu thường là 25-30°C, pH tối ưu

6,5 - 8,0. Một số lồi có thế phát triền ờ nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn (xạ khuẩn

ưa nhiệt và ưa lạnh). Chi xạ khuấn này có khá năng tạo thành số lượng lớn các CKS
ức chế vi khuẩn, nấm sợi, các tế bào ung thư, virus và nguyên sinh động vật [23]
1.2.3. Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn.

Một trong những đặc điềm quan trọng nhất cùa xạ khuẩn là khả năng hình

thành CKS. Trong số 8000 CKS hiện biết trên thế giới có trên 80% là có nguồn gốc
từ xạ khuẩn [3].

Nguyễn Hồi Linh

10

Lóp 11-02


Viện dại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

Một trong những tính chất cùa các CKS có nguồn gốc từ vsv nói chung và từ xạ

khuân nói riêng là có tác dụng chọn lọc. Mỗi CKS chi có tác dụng với một nhóm vsv

nhất định. Hầu hết CKS có nguồn gốc xạ khuẩn đều có phổ khángkhuẩn rộng. Khá

năng kháng khuẩn của các CKS là một đặc diêm quan trọng đơ phân loại xạ khn.
Có nhiều quan điềm khác nhau về khá năng hình thành CKS. Một số tác già

cho rằng sự hình thành CKS là do cơ chế giúp cho vsv tồn tại trong môi trường tự
nhiên, số khác cho rằng, sự hình thành CKS là do sự cạnh tranh trong môi trường

dinh dường. Hau hết các tác giá cho rằng kháng sinh là sán phâm chuyến hóa thứ
cấp được hình thành vào cuối pha tích lũy thừa, đầu pha cân bang cùa chu kỳ sinh
trường [14].

Mặc dù CKS có cấu trúc khác nhau và vsv sinh ra chúng cũng đa dạng,

nhưng quá trình sinh tổng hợp chúng chi theo một số con đường nhất định.
- CKS được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp, thơng qua một chuỗi
phản ứng enzym.

CKS được hình thành từ hai hoặc ba chất chuyển hóạ sơ cấp khác nhau.

-

- CKS được hình thành bang con đường polyme hóa các chất chuyến hóa sơ
cấp, sau đó tiếp tục biến đơi qua các phân ứng enzym khác.

Nhiều chủng xạ khuân có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều CKS có
cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau. Quá trình sinh tong hợp CKS phụ

thuộc vào cơ chế điều khiển đa gcnc, ngoài các gcnc chịu trách nhiệm tống hợp

CKS, cịn có cả các gene chịu trách nhiệm tồng hợp các tiền chat, enzym và
cofactor.

1.3.

Xạ khuẩn Streptomyces. sp KCTC 0041BP.

1.3.1. Dặc diem nuôi cấy.

Năm 1996. chung Streptomyces.spKCTC 0041BP có khà năng tạo CKS

Dihydrochalcomycin được Kim và cs phân lập tại Hàn Quốc. Đặc điểm nối bật cùa

xạ khuân là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và khơng có vách ngàn (chì trừ
cuống bào tử khi hình thành bào tử). Hệ sợi mánh, đường kính thay đối trong

khoảng 0,2 - 2 pm.

Nguyễn Hồi Linh

11

Lóp 11-02


Viện dại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

Xạ khuấn Streptomyces sp.KCTC 0041BP sinh sân vơ tính bằng bào tứ. Trên
đầu sợi khí sinh hình thành cuống bào tử và chuồi bào tử. Cuống sinh bào tử có hình

thắng hoặc lượn sóng (Rf - Rectiflexibiles). Bào tứ được hình thành trên cuống sinh
bào tử bang hai phương pháp phân đoạn và cắt khúc. Bào tử có hình bẩudục, hình
lăng trụ. hình cầu với đường kính khống 1,5 pm. Bề mặt bào tử trơn nhẵn Sm

(Smooth). Màng bào tư có nếp nhăn trên môi trường ISP2.

Khuẩn lạc thường không lớn, có đường kính khoảng 1 - 5 mm. Khuẩn lạc ran
chác, mọc đâm sâu vào cơ chất. Be mật khuẩn lạc thường dược bao phú bời khuẩn ti

khí sinh dạng nhung, dày (Hình 1). Nó có khá năng phát triển tốt trên môi trường
ISP1. ISP2, ISP4. Gause 2 và R2YE, đặc biệt là mơi trường ISP2 và R2YE.

Mớ Hà Nội

Hình 1.1. Khuân lục cùa chúng Streptomyces sp. KCTC 004IBP trên
môi trường ISP2.

Nguyễn Hồi Linh

17.

LĨP 11-02


Viện dại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

Hình 1.2. Hình dạng KTKS và KTCC cùa chúng Streptomyces sp. KCTC 004 IBP

phóng đại (X 4.500-15.000).

1.3.2. Dặc diem sinh lý, sinh hóa.
Chúng Streptomyces sp. KCTC 004IBP có thê sinh trường trong dài nhiệt độ
25 - 32 °C, thích hợp nhất ở 28 - 30 °C và hồn tồn khơng phát triển được ở 37 °C

hoặc cao hơn.

Chúng phát triển tốt ở khoáng pH = 6 -ỉ- 9. Ở pH< 6 hoặc pH > 9 thì chúng
phát triền kém hoặc khơng phát triền. Chúng Streptomyces sp. KCTC 0041BP hình

thành sac to melanin trên môi trường thạch tyrosine (ISP-7).

1.3.3. Khá năng kháng khuẩn với một số vi sinh vật kiếm định.
Xạ khuẩn Streptomyces sp.KCTC 004IBP sinh kháng sinh có khá năng ức chế
vi khuẩn Gr (+) và vi khuẩn Gr (-). Tuy nhiên, kháng sinh này có khá năng ức chế

cao hơn đối với vi khuẩn Gr (+). Điều này được giài thích bời vi khuẩn Gr (-) có lớp

thành te bào dày và nhiều lớp hơn so với vi khuẩn Gr (+), vì vậy chúng ít chịu ành

hưởng bời kháng sinh hon^ Tropg; e^ic vi khu^n Gr+ đựợc nghiêỉỊ cứu, khà năng ức
chế vi sinh vật của xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC 004IBP lên vi khuẩn Bacillus
cereus là lớn nhất (D = 21.33 mm), tiếp theo là vi khuan Bacillus subtilis (D =
19,50 mm) 11 ].

1.3.4. Phân loại.
Khi dối chiếu với các khóa phân loại khác nhau, chúng Streptomycessp.K.CTC

004IBP rất giong với lồi Streptomyces bikiniensis. Theo khóa phân loại cứa
Waksman năm 1961, lồi này thuộc nhóm cuống sinh bào từ thắng, khơng phân

nhánh; trong mơi trường đạm đều có sắc tố màu nâu sẫm tới màu đen. melanin

dương tính; khuấn ty khí sinh từ màu trắng lới màu xám.
1.4.

Xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC0041 bp đã được đột biến GerMIII.

Gen GerMIII thuộc nhóm gen tham gia vào con đường sinh tổng hợp kháng

sinh Dihydrochalcomycin từ chủng xạ khuân Streptomyces sp. KCTC 004IBP dã

được đãng bàn quyền trên gen bank với mã số AY 118081.

Nguyễn Hồi Linh

13

Lóp 11-02


Viện dại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

Trong 31 gen tham gia vào con đường sinh tổng hợp. gen GerMIII được dự

đốn với chức năng là mã hóa, tông hợp enzyme 2-O-methyltransferase. Enzyme 2O-methyltransferase (GerMIII) cùng với 3-O-methyltransferase (GerMIII) sẽ xúc

tác phản ứng methyl hóa nhóm -OH tại vị trí C2, C3 tạo gốc đường D-mycinosc.
Theo kết quà nghiên cứu, hoạt tính và chức năng của gen GerMIII đã được

chứng minh bàng phương pháp đột biến gen (tiếp hợp gen) đế tạo chủng xạ khuấn

đột biến khơng có chứa gen GerMlII.

Tiếp tục phân tích đánh giá sàn phâm trung gian từ chùng xạ khuấn đột biến
gen GerMIlI, tách chiết và tinh sạch hợp chất có hoạt tính sinh học mới.

1.5.

Tổng quan về kháng sinh dyhidrochalcomycin.

Macrolide là kháng sinh dược sừ dụng đế chống nhiều vi khuẩn là cầu khuân

Gr+ hiếu khí và kị khí, tác dụng tốt với vi khuẩn nội bào (Mycoplasma. Rickettsia,
Chlamydia), điều trị nhiễm trùng gây ra bời Haemophilus influenzae, nhiễm trùng

đường hô hap và nhiễm trùng mô mềm ... Kháng sinh macrolide là sán phẩm tự
phổ kháng kỊtụẩn rộng hơn so với

nhiên chiết xuất lự x^khuẩn

kháng sinh penicillin, có khá năng tham sâu vào O mù nên là một chọn lựa tốt cho

phòng ngừa nhiễm khuấn hơ hấp, có tác dụng hiệp lực với polypeptide, sulfamid.

Nhóm macrolide có độc tính rất thấp, thường chi sốt, nôn mửa, dị ứng da.

Kháng sinh macrolide cấu tạo gồm một vịng lactone lớn (có từ 12-16 ngun
tử C) gan với các phân từ đường bằng các liên kết glycosidic. Dựa vào so nguyên tứ
c trong vòng lactone, kháng sinh macrolide được chia thành 3 nhóm: macrolide

12C, 14C và 16C. Trong đó, kháng sinh nhóm macrolide 16C có vai tròquan trọng
nhất với nhiều ưu điếm vượt trội hơn so với macrolide 12C và 14C vì kháng sinh

nhóm này chưa xuất hiện hiện tượng kháng thuốc cúa vi khuấn [22].
Có nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rang kháng sinh thuộc nhóm macrolide có khả

năng ức chế cạnh tranh trung tâm hoạt động cúa enzyme petidyltransferase của tế
bào vi khuẩn như carbomycin, spiramycin, chalcomycin....nhưng duy nhất chí có

kháng sinh macrolide 16C có thề liên kết trực tiếp với trung tâm hoạt động cúa

enzyme peptyltransfcrase và từ dó bât hoạt q trình tơng hợp protein của vi khn.

Nguyễn Hồi Linh

14

Lóp 11-02


Viện dại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

Với nhiều ưu điếm như vậy kháng sinh nhóm macrolide 16C là nhóm kháng
sinh đang được nồ lực nghiên cứu bời rất nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới với

mục tiêu chính là: tạo ra các kháng sinh khơng bị ảnh hướng bời cơ chế kháng thuốc
của vi khuân và từ đó nghiên cứu và phát triên nhóm kháng sinh polyketidc

synthase (PKS) thế hệ mới.
1.5.1. Cấu trúc cùa dyhidrochalcomycin.
Dihydrochalcomycin có cơng thức phân tử là (C35H58O14), tan trong Aceton,

Benzen, Chloroform, Ethylacetat, Methanol, không tan trong nước và n - Hexan
(Kimvàcs, 1996).

Dihydrochalcomycin thuộc nhóm kháng sinh macrolide 16C, là sán phẩm trao
đơi chât bậc 2 của chúng xạ khuân Streptomyces sp. KCTC 004IBP. được tách chiết
lần đầu tiên và xác định cấu trúc năm 1996.

Mycinose

Dihydrochalcomycin

Hình 1.3. Cấu trúc cùa Dihydrochalcomycin 119].
về cấu trúc, kháng sinh dihydrochalcomycin cấu tạo gồm 3 thành phần chính:
Trung tâm là macrocylic lacton, phẩn trung tâm được gắn với 2 gốc đường khứ là

D-mycinose và D-chalcose lần lượt tại vị trí C20 và C5 thơng qua cầu nối Oglycosydic. Hai gốc đường này tham gia tạo tính tan và tính gắn với đích tác dụng
thuốc có vai trị vơ cùng quan trọng trong việc thê hiện hoạt tính sinh học trong các

chất chứa nó và trong kháng sinh này (Ta Thi Thu Thuy và cs, 2008) [ 14|.
1.5.2. Vai trị và hoạt tính sinh học.

Neuvễn Hồi Linh

lí

LĨP 11-02


Viện dại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

Qua nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng, kháng sinh dihydrochalcomycin đã biêu
hiện hoạt tính kháng khuẩn rất mạnh có thế ức chế và tiêu diệt cá vi khuấn Gr' và

Gr+. Đã phân lập thành công chung xạ khuan Streptomyces sp. KCTC 004IBP tạo
ra chat kháng sinh này, đồng thời cấu trúc hóa học cùa kháng sinh này cũng được

xác định bời nhóm nghiên cứu tại Hàn Quốc, kháng sinh này được xác định là chất
dần xuất của kháng sinh chalcomycin đã được xác định trước đó bởi nhóm nghiên
cứu khác [15],[20], Mặc dù toàn bộ cơ chế tác dụng cúa dihydrochalcomycin chưa

được nghiên cứu hoàn toàn đầy đú nhưng một số nghiên cứu đã khẳng định hoạt
tính sinh học cũa dihydrochalcomycin hồn tồn tương tự như hoạt tính cùa kháng

sinh chalcomycin và mycinamycin [18].

Nghiên cứu về cấu trúc tinh the phóng xạ đê xác định cơ chế hoạt động cúa
kháng sinh, nhóm của Hansen đã chứng minh được cấu trác nhân macrocyclic

lactone cúa kháng sinh này hình thành phức hệ và gắn với tiểu phần lớn cúa
ribosome vi khuẩn tại điếm tách chuồi polypeptide ra khói tâm hoạt động cùa

enzyme peptidyltransferase. Tìr đó kháng sinh này có hoạt tính ức chế sinh tống hợp

Viên Đại học Mớ Hà Nội

1.5.3. Các nghiên cứu về dihydrochalconiycin.

1.5.3.1. Lập thư viện gen và giải trình tự nhóm gen sinh tơng hợp
dyhidrochalcomycin.

Qua thời gian nghiên cứu cấu trúc dihydrochalcomycin, kháng sinh này dược
xác định cấu trúc bằng phương pháp phô cộng hường từ hạt nhân (NMR - Nuclear
Magnetic Resonance) và được phân loại thuộc nhóm kháng sinh PKS loại I. Nhóm

nghiên cứu đã tách và lập được thư viện gen, tách được nhóm gen tham gia vào con
đường sinh tổng hợp dihydrochalcomycin từ chủng xạ khuẩn Streptomyces
sp.KCTC 004IBP. Tồn bộ nhóm gen tham gia sinh tống hợp có chuồi trình tự là
75,5kb đã được xác định trong đó có chứa 23 ORFs chứa thơng tin di truyền, mã

hóa cho các gen tham gia con đường sinh tồng hợp dihydrochalcomycin. Đồng thời
các gen này cũng được dự đốn cấu trúc (Báng 1.1). Trình lự các gen này đã được

đăng bàn quyền trên GenBank với mã số AY118081 [II].

Nguyễn Hồi Linh

16

Lóp 11-02


Viện dại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

Băng 1.1. Dự đoán chức năng của các gen ORFs trong nhóm gen sinh tổng họp
dihydrochalcomycin.
Tên

Số amino acid

Gerl
Gcr2
Ger3
Gcr4
GerA
GerB
GcrMI
GerN
GerR
GcrPI

GerPlI
GerG
GerD
GerE
GcrF
GerMII
GerPll
GerH
GerK
GerMII
GerTI
GerR
GcrSl

608
684
331
308
334
381
271
485
823
401
407
274
323
295
196
255

420
73
326
403
418
280
439

GerS2
GerS3
GerS4
GerS5
GerY
GerTll
GerK2
Ger29

1976
3734
1618
1357
404
425
248
580

Dự dốn chức năng trong nhóm gen sinh tồng hợp

Transferase protein
Hypothetical protein

Hypothetical protein
Conserved hypothetical protein
Oxidoreductase
3,4-dehydratase like protein
O-mcthyltransferase
NDP-4,6- dideoxyhexose 3,4-enoyl reductase
Beta glucosidase
Cytochrome P450 hydroxylase
Cytochrome P450 hydroxylase
Type 11 thioesterase
dTDP-glucose 4.6- dehydratase
Alpha-D-glucose - 1-phosphate thymidyltransferase
NDP-hcxose 3-cpimcrase
3 - O-inethyltransferase
Th . Q^hroi^j^p 1 Ị1ỌC ỊỷỊơ 1 [à \ội
Ferredoxin
dTDP-hexose 4-ketoreductase
2 - O-methyltransferase
Glycosyltransferase
rRNA methyltransferase
PKS[LM(KSQ.AT.ACP)M 1 (KS.AT.KR.ACP),
M2(KS,AT,DH.KR.ACP)1
PKS [M3(KS.AT.DH,KR.ACP)]
PKS[M4(KS,AT, KR*. ACP). M5(KS, AT. DH. ER. KR. CP1
PKS [M6(KS.AT.KR.ACP)J
PKS (M7(KS,AT.ACP), TEI]
NDP - hexose-3,4-isomerase
Glycosyltransferase
Post-PKS reductase
Putative transcriptional regulator

1.5.3.2. Tách và dự đốn chức năng nhóm gen tham gia sinh tổng hợp đường Dchalcose và D-mycinose.
Các gen tham gia sinh tống hợp đường khứ D-chalcose và D-mycinose đã

được xác định và giãi trình tự lừ pGERI-5 cosmid. So sánh độ tưong đồng về trình
Nguyễn Hồi Linh

17

Lóp 11-02


Viện dại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

tự các chuồi amino acid cùa các gen trong cosmid với trình tự amino acid cũa các

gcn đã biết trên ngân hàng gen thế giới GcnBank. Các gcn tham gia sinh tổng hợp 2
gốc đường khứ này đã được dự đoán cấu trúc, từ đó dự đốn được con đường sinh
tống hợp gốc đường này.
Trong con đường sinh tổng hợp, dTDP-4-keto-6-deoxyglucose là gốc đường
trung gian cho quá trình tong hợp cả 2 gốc đường chalcose và mycinose, được tồng

hợp từ glucose-1-phosphate với hoạt tính xúc tác của các enzyme GerD có chức
năng là dTDP-glucose synthase và GerE có chức năng là dTDP-glucose 4,6-

dehydartase.

Quá trình sinh tống hợp đường D-chalcose bẳt đầu từ gốc đường trung gian 4kcto-6-deoxyglucosc với hoạt tính xúc tác của các enzyme 3,4-isomcrase (GcrY) đô

tạo đồng phân, tiếp theo là phàn ứng loại nhóm OH bới 3,4-dehydratase (GerB) và

phàn ứng khứ của enzyme 3,4-enoylreductase (GerN) để tạo ra 3-keto-4.6dideoxygluco.se. Sán phẩm
enzyme 3-ketoreduc^ev

tại vị trí 3-keto sẽđược chuyển thành 3'-OH

nhờ

dTDP-^,6-(^ideoxy glucose. T'ếp đó’ gốc

đường này được chuyến đến nối với nhân macrolide tại vị trí c5 nhờ hoạt tính xúc
tác cùa chalcosylglycosyltransferase (GerTII) và cuối cùng methyl hóa nhóm -OH
tại vị trí Ọí nhờ hoạt động cùa enzyme O-methyltransferase (GerMI) tạo gốc đường

D-chalcose.

Gốc đường D-mycinose đã được nghiên cứu trong cấu trúc kháng sinh tylosin
vì vậy con đường sinh tông hợp đã được chứng minh trong các nghiên cứu vê kháng
sinh này [2]. Phân ứng sinh tồng hợp được bắt đầu từ dTDP-4-keto-6-deoxyglucose

đế tạo thành dTDP-D-allose với xúc tác cúa hai enzyme 3-epimerase (GerF) và 4-

ketoreductase (GerKI). Tiếp theo là phán ứng gán gốc đường allose vào nhân
macrolacton tại vị trí C2|) nhờ hoạt tính xúc tác cúa glycosyltransferase (GerTI).Cuối

cùng hai enzyme 2-0-methyltransferase (GerMIII) và 3-0-methyltransferase
(GerMlI) xúc tác phàn ứng methyl hóa nhóm OH tại vị trí c2, Cj tạo gốc dường Đ-

mycinose.

Nguyễn Hồi Linh

18

Lóp 11-02