Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm từ rừng quốc gia cúc phương (ninh bình) sinh tổng hợp acetyl(xylan) esterase và bước đầu tinh sạch enzyme này

Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mờ Hà Nội
LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn PGS. TS Lê Mai Hương đã cho em cơ hội được làm
việc và học tập tại phịng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học các Hợp chất thiên

nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Viêt Nam

Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Đồ Hữu Nghị đã tận tình chỉ

bão, dạy dồ, hướng dần em đê em có thê hồn thành tốt khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn các cán bộ nhân viên của phịng đã u q, tận tình

giúp đờ em, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình thực tập tại phòng Sinh
học thực nghiệm.
Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô trong khoa Công nghệ sinh học - Viện

Đại học Mờ Hà Nội đã tận tình giảng dạy và giúp đỡ em trong thời gian học tập tại

trường.

Cuối cùng em kính chúc q thầy cơ. cùng các cơ chú. anh chị trong phịng Sinh
học thực nghiệm luôn dồi dào sức khõe, đạt được nhiều thành công hơn nữa trong sự

nghiệp nghiên cứu khoa học và truyền đạt tri thức cho thế hệ sinh viên trẻ.

Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2015

Sinh viên thực hiện

Hà Thị Như Quỳnh

Hà Thị Như Quỳnh

CNSH 11.04


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mờ Hà Nội
MỤC LỤC

MỚ ĐÀU............................................................................................................................. 1

CHƯƠNG I: TÔNG QUAN............................................................................................... 3
1.1

Giới thiệu về nấm đảm (Basidiomycota) và nấm túi (Ascomycota)...................3

1.1.1

Nấm đám (Basidiomycota)............................................................................. 3

1.1.2

Nấm túi (Ascomycota)................................................................................... 4

' 1.2 Cấu trúc và đặc điếm của xylan và pectin và các enzyme carbohydrate esterase
thúy phân xylan................................................................................................................ 6

1.2.1

Cấu trúc và đặc điếm của xylan...................................................................... 6

1.2.2

Cấu trúc và đặc điểm của pectin.................................................................... 8

1.2.3

Các enzyiĩ|^hịy^t^^^,^y|b^J^;...N.ộ|.......................... 9

CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.......................................... 14

2.1

Nguyên liệu...........................................................................................................14

2.1.1

Chúng nấm..................................................................................................... 14

2.1.2

Các loại môi trường....................................................................................... 14

2.1.3

Máy móc, thiết bị, dụng cụ thí nghiệm....................................................... 15

2.1.4

Hóa chất......................................................................................................... 15

2.2

Phương pháp........................................................................................................ 16

2.2.1

2.2.2S

Phân lập nấm.................................................................................................. 16
àng lọc chung nấm có khả năng sinh enzyme acetyl(xylan) esterase...... 16

2.2.3

Môi trường sàng lọc, cảm ứng sinh tống hợp enzyme............................... 17

2.2.4

Nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho sinh tống hợp enzyme............... 17

Hà Thị Như Quỳnh

CNSH 11.04


Viện Đại học Mờ Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

2.2.5

Động học lên men sinh tống hợp enzyme.................................................... 18

2.2.6

Phương pháp xác định hoạt tính enzyme..................................................... 18

2.2.7

Tách chiết và tinh sạch enzyme....................................................................18

CHƯƠNG III: KẾT QUÀ VÀ THÀO LUẬN................................................................ 20

3.1

Kết quả phân lập................................................................................................... 20

3.2

Kết quả sàng lọc và lựa chọn chủng nấm sinh enzyme cao.............................. 20

3.3

Cơ chất và điều kiện thích hợp lên men sinh tổng hợp enzyme bời nấm

Alternaria sp. SP66....................................................................................................... 23

3.3.1

Cơ chất cảm ứng sinh tổng hợp acetyl(xylan) esterase............................... 23

3.3.2

Điều kiện pH, nhiệt độ thích hợp cho lên men sinh tơng hợp enzyme bời

chủng nám Alternaria sp. SP66................................................................................. 25

3.4

Ket quả (bước đau) tinh sạch acetyl(xylan) esterase.........................................27

KÉT LUẬN VÀ KiĩihNGHện..V.iệxi..Đại.họ.c.Mo:.Hà..N.ộj..................... 29
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................ 31

Hà Thị Như Quỳnh

CNSH 11.04


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mờ Hà Nội
DANH MỤC CHŨ VIẾT TẢT
CS: Cộng sự
VSV: Vi sinh vật

Mw: Trọng lượng phân tứ (molecular weight)

km: Hằng số xúc tác(michaelis constant)
pì: Điểm đắng điện(Isoelectrics point)

Vnrax:Vận tốc phán ứng cực đại (maximal Velocity)

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

Hà Thị Như Quỳnh

CNSH 11.04


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mờ Hà Nội

DANH MỤC BẢNG
Bàng 1: Đặc tính một số acetyl(xylan) esterase từ nguồn vi sinh vật (bao gồm các

enzyme tái tổ hợp)............................................................................................... 13
Báng 2: Hoạt tính sinh acetyl(xylan) esterase (AE) cùa các chúng nấm nghiên cứu ..21

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

Hà Thị Như Quỳnh

CNSH 11.04

Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mờ Hà Nội

DANH MỤC HÌNH
Hình 1 : Các dạng q thể của nấm túi Ascomycota........................................................ 5
Hình 2: cấu trúc của xylan và các enzym thủy phân xylan............................................. 7
Hình 3: Các phần acetyl hóa và feruloyl trong cấu trúc pectin......................................... 9
Hình 4: Chủng nấm SP66 phân lập từ rừng quốc gia Cúc Phương (Ninh Bình) phát

triển trên mơi trường thạch..................................................................................22

Hình 5: Trình tự nucleotide của chủng nấm SP66.......................................................... 23
Hình 6: Bước đau tinh sạch protein biếu hiện hoạt tính acetyl(xylan) esterase từ mơi
trường ni cấy nấm Alternaria sp. SP66 bằng sắc kí trao đoi anion DEAE

Sepharose............................................................................................................. 27

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

Hà Thị Như Quỳnh

CNSH 11.04


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mờ Hà Nội

DANH MỤC BIÊU ĐỊ

Biểu đồ 1: Hoạt tính sinh acetyl(xylan) esterase cùa chủng nấm Altemaria sp. SP66
trên các điều kiện môi trường bô sung cơ chất khác nhau................................ 24

Biếu đồ 2: Hoạt tính sinh acetyl(xylan) esterase của chủng Alternaria sp. SP66 trên
mơi trường ni cấy lịng cơ chất rơm ờ các giá trị nhiệt độ khác nhau.......... 25

Biêu đồ 3: Hoạt tính sinh acetyl(xylan) esterase cùa chùng Alternaría sp. SP66 trên
mơi trường ni cấy lóng cơ chất rơm ở các giá trị pH khác nhau.................. 26

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

Hà Thị Như Quỳnh

CNSH 11.04


MỎ ĐẦU
Đặt vấn đề

Hiện nay trên trái đất, mỗi năm thực vật sàn sinh ra một lượng sinh khối khống lồ
ước tính đạt tới bốn mươi tỹ tấn. Tất cà mọi hoạt động của con người cũng như các loài

động vật đều cần đến thực vật. Chúng là nguồn lương thực để nuôi sống con người và

động vật đồng thời là nguồn cung cấp nguyên, nhiên vật liệu cho các ngành cơng
nghiệp. Đe thay đổi tính chất cùa vật liệu đầu vào cho phù hợp với sản phấm mong đợi

người ta phái tìm cách thay đổi cấu trúccúa thành tế bào thực vật. Tuy nhiên thành tế
bào thực vật lại có cấu tạo khá vừng chắc bởi cellulose, hemicellulose và lignin cho
nên đế phá húy một phần hoặc toàn bộ chúng thì người ta thường sử dụng các phương

pháp hóa - lý như xử lý ờ nhiệt độ cao, áp suất cao, các hóa chất mạnh như axit mạnh

hay kiềm mạnh. Do đó chi phí để sàn xuất các sàn phấm như giấy thường cao và nhất
là gây ảnh hướng nghiêm trọng đến mơi trường sinh thái. Chính vì vậy mà yêu cầu đặt

ra là phải thay thế bàng các phương pháp an tồn hơn đối với mơi trường. Và giái pháp

cho vấn đề này là các loậi enzym thủy phân các pởlyrher sinh học kê trên.
Nhưng để phân giài hiệu quả polymer bền này, ngoài các enzyme phân giải mạch

chính, cần có các enzyme thúy phân các liên kết ester thuộc nhóm carbohydrateesterase
(CE) như: acetyl(xylan) esterase; cinnamoyl esterase; feruloyl esterase; carboxyl
esterase;

S-formylglutathione

hydrolase;

N-acetylglucosamine

6-phosphate

deacetylase; N-acetylglucosamine 6-phosphate deacetylase...Trong đó tham gia vào
q trình chuyến hóa lignocellulose chủ yếu có /2-coumaryl/feruloyl esterase và

acetyl(xylan) esterase, hoạt động trên các mạch nhánh của cấu trúc polysaccharide

thành tế bào đê phân cat liên kết cầu nối giữa các chuồi xylan và giữa xylan với lignin;
chúng đóng một vai trị quan trọng trong giai đoạn đầu q trình phân hủy

lignocellulose (Williamson & cs., 1998, Wong 2006). Theo cơ sở dữ liệu CAZy

(; Cantarelá cs., 2009), carbohydrate esterase là những enzyme
xúc tác đề-acetyl hóa tại liên kết O- hay N- cùa saccharide ở vị trí thế, ở đây là các

ester hay amid, trong đó các đơn vị đường đóng vai trò là một alcohol hay amin.

Hà Thị Như Quỳnh

CNSH 11.04
1


Một trong những enzyme đang được quan tâm hiện nay là enzyme acetyl(xylan)
esterase bời vai trò của chúng trong các ứng dụng như công nghệ sản xuất giấy và bột
giấy, dệt may, trong công nghệ sàn xuất thức ăn chăn nuôi,...

Tuy được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống, nhưng các ứng dụng thực

tiễn cùa những enzyme mới có hạn che do thiếu thơng tin về đặc tính xúc tác, điều kiện

tối ưu sinh tông hợp enzyme và khi sử dụng ở quy mô lớn. Thông qua đề tài nghiên
cứu: "Phăn lập và tuyển chọn các chứng nấm từ rừng quốc gia Cúc Phương (Ninh
Bình) sinh tống họp acetyl(xylan) esterase và bước đầu tinh sạch enzyme này" chúng

tôi hy vọng có the bước đau tuyền chọn được các chủng nấm có khá năng sinh tổng
hợp enzyme acetyl(xylan) esterase, được biết là có vai trị liên quan đến chuyển hóa
xylan, là cơng cụ quan trọng trong nghiên cửu cơ che và cấu trúc thành tế bào thực vật

và có thề bước đầu thu nhận enzyme.

Mục tiêu đề tài
•

Phân lập. định tên (bằng phương.pháp, hình thái và sinh học phân tư) một số

chùng (nấm đàm, nấm túi) ớ rừng quốc gia Cúc Phương.

•

Đánh giá và tuyền chọn các chúng có khả năng sinh tống hợp enzyme
acety](xylan)esterase.

•

Bước đầu tinh sạch protein enzyme có hoạt tính acetyl(xylan) esterase từ (một)

chủng nam phân lập.

Hà Thị Như Quỳnh

CNSH 11.04
2


CHƯƠNG I: TÓNG QUAN

l.l Giới thiệu về nấm đâm (Basidiomycota) và nấm túi (Ascomycota)

1.1.1 Nấm đảm (Basidiomycota)
• Đặc điểm

Nấm đám (Basidiomycota) là lớp nấm khá lớn, một số ít hoại sinh, nhiều lồi có

thể ăn được và đa số kí sinh thực vật. Lớp nấm này rất phổ biến, chúng gồm nấm ăn,
nấm cò giầy, được đặc trưng bới cấu tạo đảm và bào lử đảm. Ờ nấm đám khuẩn ti cũng
có vách ngăn và bào tử khơng di động. Khuẩn ti của nấm đám khi sinh ra phồng lên rất

đặc trưng, được gọi là các u nối, chúng đóng vai trò đặc biệt trong di truyền hạch nhân.
Hầu hết nấm đàm sống ờ trên cạn.

Hệ sợi nấm rất phát triền,, sợi nấm có ch ngăn ngang chưa hồn chinh. Sinh
-A- ,.A ./u
Y4en_yiewmMc Mợ HaNftL
__
sàn vơ tính băng đính bào tử, sinh sản hữu tính băng bào từ đám hình thành ngồi đăm.

Q trình sinh sàn hữu tính diễn ra như sau: Các bào tử đàm, về hình thái giống nhau,
nhưng về mặt sinh lý có khác nhau, nảy mầm cho ra 2 loại sợi nấm sơ cấp khác tính

(gọi là sợi âm và sợi dương). Mỗi tế bào của sợi mang một nhân đơn bội. Khi các tế
bào ớ đau 2 sợi gặp nhau sẽ kết hợp thành tế bào 2 nhân và phát triển thành sợi thứ cấp

có đời sống kéo dài. Đến một lúc nào đó thì tế bào ờ đầu sợi mọc ra một ống nhở
hướng về phía gốc của tế bào. hai nhân phân chia thành 4, đong thời xuất hiện 2 vách

ngăn, tách thành 3 tế bào: tế bào đinh chứa 2 nhân, tế bào ống và tế bào chân ở gốc đều
chứa một nhân (2 tế bào này về sau sẽ hợp nhau lại thành một tế bào có 2 nhân). Tế

bào đinh sẽ phát triền thành đâm: 2 nhân kết hợp với nhau rồi phân chia liên tiếp 2 lần,

lần đầu giản nhiễm, đổ cho 4 nhân. Te bào phình lo ra, phía trên mọc ra 4 u nhỏ, mồi

nhân con sẽ chui vào 1 u và biến thành 1 bào tử đâm mọc bên ngồi đám.

• Phân loại
Dựa vào đặc điếm cùa nấm đám, một số tác giã chia lóp nấm này thành 3 phân lớp

Hà Thị Như Quỳnh

CNSH 11.04
3


Phân lớp nấm đảm đớn bào (đám khơng có vách ngăn) có thố quả hay đơi khi

khơng có, phần lớn hoại sinh, chi có 1 số ít kí sinh trên cây trồng. Phân lớp gồm nhiều
bộ, họ khác nhau, bao gồm chủ yếu các loài nấm lớn. VD: nấm hương, nấm độc
Phân lớp nấm đảm đa bào: Với vách ngăn ngang hoặc dọc. Trên mồi tế bào của

đảm có 1 cuống nhỏ với bào tử đảm ờ đầu. VD: mộc nhĩ
Phân lớp nấm đám có bào tử động: Gồm các nấm đám khơng có thể quả, đảm đa
bào có vách ngăn ngang. VD: nấm than
1.1.2Nấm túi (Ascomycota)

•

Đặc điểm

Nấm túi (Ascomycota) là ngành rộng nhất trong giới nấm,ước tính có khoảng hơn

32.000 lồi thuộc 3.400 chi đã được mơ tã (Kirk & cs., 2001), nếu kể cá dạng chưa

hoàn chinh gồm tới hơn 50% tổng số loài nấm. Chúng xuất hiện ở hầu hết các vùng có

khí hậu khác nhau và phát triền''phổ biến trong đất; tròng vùng nước mặn hay nước
ngọt, hoại sinh trên xác bã động vật và kí sinh trên động vật và thực vật. Hệ sợi nấm rất

phát triên, sợi nấm có vách ngăn ngang chưa hồn chinh (mang lồ có gờ ờ mép). Đặc
tính quan trọng đề phân biệt Ascomycota với các nhóm nấm khác là nang (ascus) chứa
các bào tử sinh sán. Sinh sân vô tính bang hình thức đính bào tử (conidia), bào từ ở

trong một cái bọc gọi là cuống bào tử đính (conidiophore). Trong một số loài, sinh sản
với bào tứ phấn (pycniospore), bào từ vách mòng (oidida) hay bào tử vách dày

(chlamydospore) (Wu & Kimbrough & cs., 1992; Raju & cs., 1992).

Song song với quá trình hình thành túi, các sợi nấm ở xung quanh phát sinh ra nhiều
sợi đơn bội chằng chịt lẫn nhau, quấn quanh các sợi sinh túi và túi tạo thành quả

thề.Quã thể gồm có các túi xen kẽ với những sợi bên bất thụ hợp thành bào tầng, và lớp
mô giả (các sợi nấm kết bện với nhau) làm nhiệm vụ báo vệ. Có 3 dạng quả thế: quá

thề kín, quà thể mở lồ, và quả thề hình đĩa.

Hà Thị Như Quỳnh

CNSH 11.04
4


Hình 1: Các dạng quả thề cùa nấm túi Ascomycota.
1,2-

•

Các quả thể hình cầu kín; 3,4-Các q thể mở lồ; 5,6-Q thể hình đĩa

Phân loại

Các tiêu chí chính để phân chia Ascomycotacó nhiều cách như:

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

Loại và cấu trúc nang
Loại quả thể

Thể trung tâm cúa quá thể
Giai đoạn sinh túi và đính bào tử cùa nấm.

Ainsworth’s (1973) đã chia Ascomycota thành 6 phân lớp: Hemiascomycota,
Loculoascomycota, Plectomycota, Laboulbcniomycota, Discomycota. Và có thẻ chia

thành 2 phân lớp:
Phân lớp nấm túi trán (Hemiascomycetidae):

Gồm những nấm túi chưa có thể quá và sợi sinh túi. Bộ đại diện là

Endomycetales với họ điên hình là Saccharomyces(nấm men) : với hơn 20 lồi, có cấu
tạo đơn bào hình trứng hay bầu dục, sinh sản sinh dưỡng bang cách nấy chồi, sinh sản

Hà Thị Như Quỳnh

CNSH 11.04
5


hữu tính tạo thành bào tử túi, thường là 4 bào tử, ít khi 8bào tử. Ngồi ra phân lớp này
cịn có một số nấm kí sinh gây bệnh cây nhưng không phổ biến.

Phân lởp nam túi thật (Euascomycetidae):

Gồm những nấm túi có quà thê, chia làm 3 nhóm: nhóm có q thể kín; nhóm
có quả thế mớ lồ đinh và nhóm có q thế hở, hình đĩa. Trong hệ thống phân loại hiện

tại phân lớp nấm túi thật thường phân chia thành các nhóm phù hợp với dạng quá thể
và túi.
Nhóm nấm túi có q thể kín: gồm 3 bộ là Eurotiales, Onygenales và
Microascales. Trong đó thường gặp nhất là bộ Eurotialcs (Bộ nấm cúc) với họ đại diện
tiêu biểu là Eurotiaceae: họ gồm những loài nấm mốc thường hoại sinh trên các loại

sàn phẩm dinh dưỡng khác nhau hay trên đất. Sợi nấm có vách ngăn ngang chưa hồn
chinh, phân nhánh nhiều. Sinh sản vơ tính bằng đính bào tứ. Nhiều lồi của 2 giống
Penicillium và Aspergilluscó ý nghĩa trong thực tiễn cuộc sống.

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

Nhóm nấm túi có the quà mở lỗ ớ đỉnh: gồm có 5 bộ. Trong đó đại diện điên
hình nhất là bộ Erysiphales(nấm phấn trắng): bao gồm những nấm ngoại ký sinh, sợi

nấm lan trên bề mặt mô bệnh tạo thành một lớp phấn trang nên gọi là nấm phấn trắng.
Nhóm nấm túi có thể quả dạng dĩa: túi bào tử hình thành trên đầu sợi sinh túi;
trong chu trình sống của nấm ln có sự kế tiếp các giai đoạn nhân. Giai đoạn đơn bội

chiếm cả thời gian sinh dưỡng và sinh sàn vơ tính. Giai đoạn hai nhân rất ngắn chì có
trên các sợi sinh túi. Giai đoạn lưỡng bội thề hiện ở nhân (2n) trong túi lúc cịn non sau

khi có kết hợp nhân.
1.2. Cấu trúc và đặc điểm của xylan và pectin và các enzyme carbohydrate

esterase thủy phân xylan

1.2.1 Cấu trúc và đặc điểm của xylan

Xylan là một trong những thành phần cơ bàn cùa hemicellulose, nó là một
polysaccharide hồn tạp có chứa các nhóm phụ là các goc acetyl, 4-O-methyl-D-

Hà Thị Như Quỳnh

CNSH 11.04
6


glucuronosyl và a-arabinofuranosyl liên kết với bộ khung được tạo bởi các gốc

xylopyranose. Bộ khung này được liên kết với nhau theo kiểu p-1,4-glycozit. Lignin
liên kết với xylan bang liên ket ester bang các gốc cùa axit 4-O-methyl-D-glucuronic
(Puls,J„ 1997;Bissoon, s. & cs„ 2012)

Xylan chiếm khoảng 30% vật liệu cúa thành tế bào cùa thực vật sống lâu năm,
từ 15-30% đối với gồ cứng và 7-10% đối với gồ mềm. Với các cây gồ mềm, các nhóm
phụ cùa xylan chú yếu là axil 4-O-mcthyl glucuronic và arabinose. Chúng liên kết với

bộ khung xylan bàng liên kết a-l,3-glycozit. Hiểm khi thấy các nhóm acetyl trong
xylan của gỗ mềm. Tỹ lệ arabinose so với xylose thường là 0,6 (Dervilly, G. & cs.,

2011)
a4OM»OclA

Hình 2: cấu trúc cùa xylan và các enzym thùy phân xylan

Ac: nhóm Acetyl; a-Araf: a-arabinofuranose; 0t-4-O-Me-GlcA: a-4-Omethylglucuronic acid.
(Sunna A, Antranikian G, 1997)

Hà Thị Như Quỳnh

CNSH 11.04
7


1.2.2 Cấu trúc và đặc điếm của pectin
Pectin là một polysaccharide tồn tại phổ biến trong thực vật, là thành phần tham

gia xây dựng cấu trúc thành tế bào thực vật. Pectin được phân tách và mô tà lần đầu

tiên bới Braconnot-vào nãm 1825. Pectin bao gồm các đơn vị mắt xích axit a-D-

galacturonic. Trong đó một số gốc axit có chứa nhóm the methoxyl (-OCH3). Các đơn
vị này nối với nhau nhờ liên ket 1,4-glucosidc. Mỗi đơn vị mắt xích chứa một nhóm

cacboxyl ở vị trí c6. Trong tự nhiên, pectin không tồn tại độc lập mà thường đi kèm

polysaachride khác, khi thủy phân tạo ra L-arabinose và £>-galactose. Chiều dài của

chuồi axit polygalacturonic có thế biến đổi từ vài đơn vị đến hàng trăm đơn vị

galacturonic. Một phân tứ pectin có phân tứ lượng từ 50.000 đến 150.000 đvC, tùy

thuộc nguồn gốc thực vật (Whisler & Bemiller,1997). Các nhóm axit này tồn tại ở
trạng thái tự do hoặc dưới dạng liên kết ester (metyl ester). Trong pectin tự nhiên

thường có khoảng % số nhóm axit bị metyl hóa. Trong thực vật, có thể chia pectin

thành hai dạng là protopectin khơng hịa tan, tồn tại chủ yếu ở thành tế bào,các lớp gian
bào. dưới dạng kết hợp với polysaccharide araban, dạng pectin hòa tan. tồn tại chu yếu
ở dịch tế bào. Pectin như một loại keo gán chặt các tế bào thực vật với nhau, vì thế
người ta gọi chúng là chất ciment trong cấu trúc tế bào thực vât.

Trong cây lanh, rơm rạ có khoảng 0,5-2% pectin. Trong gồ, hàm lượng pectin

dao động trong khoảng 0,5-1% (Hồ Sĩ Tráng,2006). Pectin có nhiều trong tầng phát
sinh của gồ, lớp liên kết các tế bào. Trong thời kì sinh trường pectin ở các lớp này liên

tục biến đổi. Có lẽ pectin đám bảo độ bền và độ dèo của cây non. Sau đó, chất pectin
chuyến hóa và hàm lượng cùa chúng giám đi.

Hà Thị Như Quỳnh

CNSH 11.04
8


h3co

Hình 3: Các phần acetyl hóa và feruloyl trong cấu trúc pectin.
(A) Mạch chính được hình thành từ gốc khác của axit galacturonic và rhamnose, (B)

các phần còn lại của liên kết d-(l,4) của axit galacturonic, (C) nhóm 2-O/3-O-acetyl,

(D) nhóm C-6-methyl, (E) chuỗi liên kết d-(l-5)arabinan, (F) nhóm O-2-dif'eruloyl, (G)
nhóm O-2-feruloyl được gắn với arabinose, (H) nhóm O-6-feruloyl được gắn với

galactose. Theo Mathew & Abraham (2004).
1.2.3 Các enzym carbohydrate esterase thủy phân xylan
Phân huỷ sinh học xylan là sự kết hợp hoạt động cùa nhiều loại cn/.ym trong đó
endo-p-l,4-xylanase (p-l,4-D-xylanxylanohydrolase) thực hiện nhiệm vụ phân cắt

mạch chính xylan bang việc thúy phân ngẫu nhiên khung xylan tạo ra các
oligosaccharide. Sau đó exo-P-l,4-D-xylosidase (P-l,4-D-xylan xylohydrolase) thủy

Hà Thị Như Quỳnh

CNSH 11.04
9


phân các oligosaccharide thành các monomer. Các nhóm bên có mặt trong xylan được

giãi

phóng bời

a-L-arabinofuranosidase,

a-D-glucuronidase,

galactosidase

và

acetyl(xylan) esterase.
Để thúy phân hồn tồn xylan tự nhiên cần có các esterase để loại bỏ liên kết

cúa các axit acetic và axit phenolic với xylose. Esterase phá vờ liên kết cúa xylose với
axit acetic (acetyl(xylan) esterase, các gốc chuồi bên arabinose với axit ferulic (feruloyl
esterase) và gốc chuỗi bên arabinose với axit p-coumaric (p-coumaroyl esterase)). Phân

cắt các nhóm acetyl, feruloyl và p-coumaroyl từ xylan thì thuận lợi cho sự loại bỏ
lignin. Chúng có the góp phần làm hòa tan lignin bời sự phân cắt các liên ket ester giữa

lignin và hemicellulose. Neu sử dụng cùng với xylanase và các enzym phân húy xylan
khác trong tẩy trắng bột giấy, các esterase có thề phá vỡ và làm lóng lẻo một phần cấu
trúc của thành tế bào.
Các enzyme cacbohydrate esterase liên quan đến chuyên hóa xylan là công cụ

quan trọng trong nglpi^.cự^y chế:

cấu trj^jhi^jebap thrrc vật. ứng dụng của

các enzyme này là trong công nghiệp sàn xuất giấy và bột giấy. Khi sử dụng phối hợp

xúc tác cùa xylan và các enzyme thủy phân xylan khác trong sản xuất bột giấy và tẩy

trắng giấy, các esterase (feruloyl esterase, acetyl(xylan) esterase) có thề phá vỡ 1 phần

cấu trúc và loại bỏ một phần thành tế bào thực vật. Do đó, phức hợp lignin -

cacbohydrate có thể trờ nên dề bị tấn công bởi hoạt độ xúc tác cùa enzyme và sự hịa

tan sản phẩm chuyển hóa tốt hơn. Việc tăng hiệu quá chiết xuất lignin dẫn đến giảm
được sứ dụng chlorin ở các bước tây trang tiếp theo và tăng độ trang sáng của bột giấy

và giấy (Christov, L.P & Prior, B.A, 1993). Dịch nuôi cấy một số chúng Aspergillus có

hoạt tính feruloyl esterase và acetyl(xylan) esterase đã được sử dụng trong xử lý bột
giấy khác nhau (Viikari, L. R., Poutanen & cs., 1990). Các esterase cũng là nguồn ứng

dụng tiềm năng trong tổng hợp các đồng phân carbohydrat. Ví dụ như acetyl (xylan)
esterase được sử dụng đế thu một số đồng phân acetyl xylan mới với các đặc tính hữu
ích.Một phần trong các ứng dụng này là xử lý gel pectin. Các ứng dụng thực tiền của
những enzyme mới có hạn chế do thiếu thơng tin về đặc tính xúc tác, điều kiện tối ưu

Hà Thị Như Quỳnh

CNSH 11.04
10


sinh tổng hợp enzyme và khi sử dụng ở quy mô lớn. Việc phát triến ứng dụng công

nghệ sinh học phân tử, hiểu nhiều hơn về cơ chế sinh tồng hợp và sử dụng các cơ chất

(cảm úng) thích hợp góp phần giảm giá thành sản xuất enzyme.
• Enzyme feruloyl esterase
Feruloyl esterase xúc tác thủy phân liên ket ester giữa arabinose và axit ferulic.

Feruloyl esterase có thế được chia thành enzyme 1 tiểu đơn vị nhỏ, hoặc 2 đơn vị lớn,

và enzyme 1 đơn vị cơ bàn dựa trên khối lượng phân tử. Dựa trên tính đặc hiệu cơ chất

và khâ năng giãi phóng các cầu noi diferuloyl, các esterase này có thê được phân chia

thành bốn nhóm là A.B.C.D (Crepin & cs.,2004). Benoit & cs., 2008 đã đưa ra cách
phân loại khác của ferulic acid esterase dựa trên trình tự amino acid tương đồng và

hoạt động cùa chúng đối với methyl ferulate, methyl sinapate, và methyl caffeate. Hau

hết các feruloyl esterase là enzyme ngoại bào và phân cắt liên kết ester trong xylan và
các oligosaccharide có dần xuất từ xylan, sau khi phân cắt tạo thành các axit ferulic, do

đó axil ferulic tăng lên. Ferulic/ coumaric axit esterase thuộc họ carbohydrate esterase
1 (CE).Hiện nay, chl lỉiHt sẩ^c^slể&Prẳị' ảtìiỳc feib?vìí^âiủ^ềli từ nguồn vi khuẩn
hoặc nấm (vd: Clostridium sp., Pseudomonas sp., Aspergiluss sp., Fusarium sp.,... )

(Wong,2006; Benoit & cs., 2008).
• Enzyme acetyl(xylan) esterase
Cùng với vi khuân xylanolytic và enzyme cellulolytic, acetyl(xylan)esterase là

enzyme quan trọng tác động đến khả năng chuyển hóa các dưỡng chất cần thiết của

thành tế bào thực vật bang cách thủy phân liên ket ester giữa acetyl và xylose trong
xylan. Quá trình dcacetyl này làm các đơn vị xylopyranosyl cùa mạch chính xylan dề

bị phân hủy hơn bới endo-|3-l,4-xylanases. Các acetyl(xylan) esterase đóng vai trị
quan trọng trong thủy phân xylan. ví dụ như các nhóm acetyl nhánh có thế làm ãnh

hướng cách tiếp cận cùa các enzym phân cắt mạch chính bời trờ ngại về khơng gian và
sự bài tiết của enzyme,vì vậy hoạt động của enzyme endoxylanase sẽ phân cắt các
nhóm acetyl nhánh này, giúp enzyme phân cắt mạch chính được dễ dàng hơn (Javier &
cs., 2007). Enzym này sẽ loại bỏ các nhóm ớ-acetyl ở các vị trí 2/3 trên p-D

Hà Thị Như Quỳnh

CNSH 11.04
11


xylopyranosyl cùa acetyl xylan. Acetyl(xylan) esterase đóng vai trị quan trọng trong

thủy phân xylan.
Acetyl(xylan) esterase là một hydrolase xúc tác giãi phóng nhóm acetyl từ
polymer sinh học như pectin và xylan của lignocellulose (Biely, 2012).Cùng với hệ

enzyme thúy phân cellulose và xylan, acetyl(xylan) esterase được biết là có vai trị
quan trọng cho khâ năng đồng hóa các vật liệu thành tế bào thực vật. Enzyme này từ

một số nấm Ascomycota đã được miêu tà, bao gồm Trichoderma reesỉ (Sundberg &

Poutanen,

1991), Aspergillus awamori (Sundberg & cs.,

1990), Aspergillus

>ứger(Linden & cs., 1994), Penicillium purpurogenum (Gordillo & cs., 2006),

1999) và Chrysosporium lucknowense

Fusarium oxysporum (Christakopoulos,
(Pouvreaua & cs., 2011).

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

Hà Thị Như Quỳnh

CNSH 11.04
12


Báng 1: Đặc tính một số acetyl(xylan) esterase từ nguồn vi sinh vật (bao gồm các
enzyme tái tồ hợp) (theo tống quan bởi Kulkarni Sayali& cs„ 2013)

STT

V
__
v max

pH

Nhiệt

Mw

km(p

Các nguồn

Loại

tối

độ

(kDa)

M)

(pM/min/mg)

vsv

enzyme

ưu

tối

pl

ưu
(°C)

Bacillus
1

pumilis

8.0

55

40

1540

360

4.8

-

45

31

-

-

6.4

Bacillus

2

subtilis

Aspergillus

3

awamori

Acetyl(xy)

Chủng vi

an) esterase

>ạfU>iọ

: Mở íà-NỘ i

-

khuẩn ưa

4

nhiệt Strain

7.0

80

195

-

-

-

7.5

84

106

-

-

-

JW/SLYS485
Chùng vi

khuấn ưa
5

nhiệt Strain

JW/SLYS485

Hà Thị Như Quỳnh

CNSH 11.04
13


CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1
2.1.1

Nguyên liệu

Chủng nấm
Quá thề nấm tươi được thu lượm từ vườn Quốc gia Cúc Phương - Ninh Bình và

một số chủng nấm được chọn [ọc từ bộ chúng giống lưu giữ tại phòng thí nghiệm Sinh
học thực nghiệm - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên.

2.1.2

Các loại môi trường

Môi trường phân lập và tuyên chọn
Môi trường malt-agar:

Malt

20g/l

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội
Agar

18g/l

Nước

11

Khử trùng ở 121°c/latm trong 30 phút.
Môi trường nuôi và giữ các chủng nấm
Môi trường thạch-khoai tây:

Nước chiết khoai tây

200g/l

Glucose

20g/l

Pepton

5g/l

Agar

20g/l

Nước

11

CNSH 11.04

Hà Thị Như Quỳnh
14


pH

6-6,5

Khử trùng ở 121°c/latm trong 30 phút
Môi trường lên men lòng

MgSO47H2O

0,5g/l

KH2PO4

l,5g/l

Chiết nấm men

2g/l

Dịch vi lượng (vết) lml/1

2.1.3

Nước

11

Cơ chất phù hợp

2%

Máy móc, thiết bị, dụng cụ thí nghiệm

Tủ cấy vi sinh-Box laminar (Đức), bê ốn nhiệt -Memmert (Dửc). tu ấm co2

(Daewoo-Hàn Quốc), cân điện từ AL300 (Thụy Sỹ), nồi khừ trùng Lequenx (Pháp), tú

lạnh Sanyo (Nhật Bản), máy li tâm Sigma (Mỹ), máy lắc ngang (Đức), máy đo OD
ELISA Bio-Rad (Pháp)
Các dụng cụ cấy vi sinh: bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, pipet, ống

eppcndorf, que cấy, đèn cồn....(Việt Nam, Trung Quốc, Pháp,...)

2.1.4

Hóa chất

Arabinoxylan, xylan từ gỗ, mùn gỗ, bã ngơ, rơm, dầu olive, triglyceride
Các hóa chat đa lượng, vi lượng sử dụng trong q trình thực hiện đề tài có

nguồn gốc xuất xứ từ Trung Quốc, Việt Nam, Đức,...

Hà Thị Như Quỳnh

CNSH 11.04
15


2.2 Phuong pháp
2.2.1 Phân lập nấm

Từ các mẫu nấm thu thập được, chúng tôi đã phân lập trên môi trường thạch
malt trên đĩa peptri có bố sung các loại kháng sinh (nystatin40 g/1 và chloramhenical,

penicillin, streptomycin, benomy 50 g/L), ú ớ nhiệt độ khoảng 23°c, sau khoáng thời
thời gian 24-72 giờ hệ sợi bat đầu mọc. Tách lấy hệ sợi nam sang ống nghiệm thạch

nghiêng (môi trường thạch - khoai tây), tiếp tục nuôi cấy trong khoảng 12-15 ngày, khi

hệ sợi màu trắng bao phủ hết bề mặt môi trường thì có thề sử dụng cho các thí nghiệm

tiếp theo.
• Phân loại bằng phương pháp hình thái:
Các chùng nấm lựa chọn được cấy trên đĩa thạch khoai tây hoặc Czapek-Dox. Quan

sát các đặc điếm hình thái, màu sắc, bào tử, thế bình giá sinh bào tứ,... và định danh

chúng bằng các khóa phân loại hiện đang được sử dụng theo các tài liệu (Booth c,

1971,DomschK.Hqfp$pvjện yịện £)ại họC Mở Ị-Ịà Nội
• Phăn loại bằng phương pháp sinh học phân tử:

Việc định tên theo hình thái mới chi xác định được chi của chủng vsv, vì vậy
chúng tơi tiếp tục tiến hành định tên theo phương pháp sinh học phân từ để làm rõ loài
đang nghiên cứu. Việc phân loại bằng phương pháp sinh học phân tứ này được thực

hiện tại Bảo tàng Thiên nhiên-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.2 Sàng lọc chủng nấm có khả năng sinh enzyme acetyl(xylan) esterase
• Sàng lọc trên mơi trường ran:
Các chùng nấm lựa chọn được đánh giá khả năng sinh enzyme esterase trên mơi

trường ni cay bề mặt trong bình Erlenmeyer 100 ml có cơ chat giàu lignocellulose

(rơm. mùn gồ, bã ngơ) (Liers & cs., 2006). Mỗi bình mơi trường được cấy với 3
khoanh thạch (0 lem) từ môi trường ni cấy đã có sự phát triên cùa các sợi nấm và ủ

ở 22-25°C trong 25 ngày. Sau mồi 3-5 ngày, dịch chiết thô từ môi trường nuôi cấy bề

Hà Thị Như Quỳnh

CNSH 11.04
16


mặt được lấy đổ đánh giá hoạt tính acetyl(xylan) esterase cũng như pH môi trường

(mỗi thực nghiệm được lặp lại 3 lần). Hoạt tính cao nhất trong suốt q trình nuôi cấy
dược so sánh giữa các chúng nấm với nhau để lựa chọn được chùng sinh hoạt tính

enzyme cao.

2.2.3 Mơi trường sàng lọc, cảm ứng sinh tống họp enzyme

Môi trường lên men cơ bảmgồm các thành phần cần thiết cho sự phát triển cùa
nấm (MgSO4 0,5 g/1; KH2PO4 1,5 g/1; Cao nấm men 2,0 g/1; dịch vi lượng lml/l).Cơ
chất bố sung: các cơ chất cảm ứng giàu lignocellulose (rơm rạ, bã ngô,mùn gỗ). Chia
đều lượng V=100 mL môi trường lên men cơ bàn cho mỗi bình các bình tam giác

Erlenmeyer-1 00ml.

Ngồi ra, một số mơi trường khác được sử dụng để so sánh khả năng phát triển
và sinh tống hợp enzyme như môi trường cà chua, khoai tây, đậu tương.

,

Khá năng sinh tông hợp enzyme của nâm được đánh giá trên môi trường lên

; .L Thự vien yien Đại hoc Mờ Hà Noi

-s „

4

men dịch thê khác nhau. Nam được nuôi cây trong 27 ngày, sau môi 3 ngày dịch
enzyme được thu nhận đế xác định hoạt tính enzyme tương ứng.

2.2.4 Nghiên cứu các điều kiện thích họp cho sinh tổng họp enzyme
• Anh hưởng của nguồn cacbon giàu lignocellulose:

Các chủng nấm có khá năng sinh enzymeacetyl(xylan) esterase được ni cấy
trên các môi trườngdịch thê khác nhau bao gồm MgSO4, KHịPO4, cao nấm men và các

nguyên tố vi lượng dạng vết ( mục 2.1.2). Sau đó, 500 ml mơi trường dịch thề đã chuẩn

bị ở trên được cho vào các bình tam giác Erlenmeyer-lOOml bố sung 2% (w/v) nguồn
cacbon là các CƯ chất cám ứng giàu lignocellulose và ester: rơm, bã ngơ, mùn gồ,

triglyceride và dầu olive. Các bình được ni cấy lắc 200 vịng/phút tại 25°c và sau 3,
6, 9, 12,15, 18, 21, 24 và 27 ngày thì xác định hoạt tính. Sau khi xác định được cơ chất

cảm ứng sinh enzyme phù hợp nam được nuôi cấy trên quy mô lớn hơn với 500

Hà Thị Như Quỳnh

CNSH 11.04
17


ml/bình tam giác Erlcnmeyer-lOOOml hoặc 2L trên thiết bị lên menAmAr-2,5 L
(Mumbai, Án Độ).

• Anh hưởng cứa pH và nhiệt độ đến sinh tơng họp enzyme:

Sau khi tìm ra mơi trường ni cấy thích hợp cho từng chúng nấm, chúng tơi lấy
mơi trường đó làm mơi trường ni cấy các chủng nấm tại các điều kiện nhiệt độ (23,
30, 35, 40 và 45°C) và pH (5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7,8) khác nhau trong khoảng thời gian 3
tuần. Dịch enzyme thô từ các mẫu lên men ớ nhiệt độ và pH khác nhau được thu nhận
rồi sau đó mang đi ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút và dùng để xác định hoạt tính

acetyl(xylan) esterase bằng phương pháp đo quang, từ đó tìm ra khoảng nhiệt độ và pH
thích hợp nhất cho sự phất triền của nấm.

2.2.5 Động học lên men sinh tổng hợp enzyme
Để sinh tổng hợp enzyme ở lượng lớn, một cơ chất cảm ứng phù hợp nhất ờ trên
được lựa chọn làm môi trường lên men dịch thế. Nấm phát triền trên môi trường thạch-

khoai tây được cấy ẹhuyển sang mơi trường lên men lịng -với-mật độ khống 106-?108

bào tử/ml dưới điều kiện lắc liên tục 200 vòng/phúl. Nấm được phát triển ờ 25°c trong
khoảng thời gian phù hợp để sinh tổng hợp enzyme tối đa. Dịch nuôi cấy được sừ dụng

để tách chiết và tinh sạch enzyme.
2.2.6 Phưomg pháp xác định hoạt tính enzyme
Hoạt tính acetyl(xylan) esterase được xác định bằng phương pháp đo quang ở

À=405nm dựa trên sự tạo thành p-nitrophenol từ p-nitrophenil acetate. Nồng độ cuối

cùa cơ chất là ImM trong đệm phosphate (lOOmM). Phân ứng được xáy ra ờ 37°c trên

phiến vi lượng 96 giếng trong thời gian thích họp.
2.2.7 Tách chiết và tinh sạch enzyme
Dịch lên men từ môi trường nuôi cấy nấm được lọc sơ bộ,ly tâm loại cặn lang

6.000-10.000v/ph trong 5-10ph. Sau khi ly tâm, dịch enzyme được lọc bàng hệ thống
siêu lọc 10 kDa cut-off (Stirred Ultrafdtration Cell, Millipore, Bedford, USA). Dịch

enzym được tinh sạch bàng phương pháp sắc ký trao đổi anion DEAE Sepharose.

Hà Thị Như Quỳnh

CNSH 11.04

18