Phân lập và xác định các đặc tính sinh học của vi khuẩn VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS gây bệnh hoại tử gan thận trên một số loài cá biển ở vùng biển hải phòng

VIỆN ĐẠI HỌC MĨ HÀ NỘI

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
............. ...................................

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CÁC ĐẠC TÍNH SINH HỌC CỦA VI

KHUÁN VIBRIO PARAHAEMOLYTICƯS GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN

THẬN TRÊN MỘT SĨ LỒI CÁ BIÉN Ở VÙNG BIÊN HẢI PHÒNG

Giáo viên hướng dẫn : TS. Phạm Thị Tâm

Sinh viên thực hiện : Đỗ Thị Vân Anh
Lóp: 11-02

Hà Nội-2015


LÒI CẢM ON
Trước hết, em xin chân thành câm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ thuộc Khoa
Công nghệ sinh học — Viện Đại học Mớ Hà Nội đã tạo điểu kiện thuận lợi nhất cho em

có thê thực tập và hoàn thành đề tài này.

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS. Phạm Thị Tâm
Giáng viên Khoa Công nghệ Sinh học, Viện Đại Học Mõ' Hà Nội, người đã trực tiếp tận

tình hướng dan và dìu dắt em trong suốt quá trình em thực tập và hồn thành đề tài.

Em khơng thê quên gửi lời biết ơn sâu sac tới gia đình, những người thân, các anh
chị khóa trước, bạn bè đã ln bên em, tận tình giúp đỡ, cơ vũ động viên trong suốt

thời gian em thực tập và hoàn thiện đề tài.
Trong q trình thực tập khơng tránh khói được những sai sót, kính mong các

thầy cơ giáo, các anh chị và các bạn đóng góp ý kiến đẻ em tiếp thu và hoàn thiện.

Em xin chân thành cám ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2014.

Sinh viên

Đỗ Thị Vân Anh


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Brain Heart Infusion Broth

BHI Broth

Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose

TCBS

Lubria - Bertani

LB

Kligler Iron Agar

KIA

Đường kính

D

Resistant

R

Intermediate

I

Susceptible

s

Giờ

H

Deoxyribonucleotide Acid

DNA

Base pair

„ .

Th 1111’ v'iAn Vipn

Polymerase Chain Reaction
Tế bào

BP. .
h no MỎ’ Híì Nơi
PCR
tb

1 u

•


MỞ ĐÀU
1. Lý do chọn đề tài
Việt Nam là một quốc gia ven biền nằm bên bờ Tây của Biển Đơng, có bờ biến

dài hơn 3.260 km trài dài từ Bắc tới Nam; tạo điều kiện thuận lợi cho sự hình thành và
phát triến kinh tế, đặc biệt là nghề nuôi trồng thủy hải sàn. Nuôi trồng thủy sàn là
ngành công nghiệp sán xuất thực phấm phát triển nhanh nhất trên thế giới, mang lại

những tiềm năng to lớn đe chúng ta dây mạnh chiến lược phát triên kinh tế biến.

Theo thống kê của Tông cục Thủy sàn (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn),
tống sân lượng thủy sàn nuôi trồng trong 8 tháng đầu năm 2014 ước đạt 543 nghìn tấn,

trong đó sàn lượng khai thác 244 nghìn tấn, sán lượng ni trồng 299 nghìn tấn, đưa
tống sản lượng thúy sản 8 tháng đầu năm xấp xì 4,0 triệu tấn, tăng 4,0%, trong đó sản

lượng khai thác 1,9 triệu tấn (tăng 4,9%), sàn lượng nuôi trồng 2,1% (tăng 3,1%). Tống
cục Thủy sàn cũng cho biết, giai đoạn 2011 - 2015 ngành thủy sán sẽ hướng tới sự phát

triển bền vững là một ngành xuất khấu hàng hóa lớn, có khá năng cạnh tranh cao và hội
nhập vừng chắc thế giới.

Hiện nay, đối tượng ni và mơ hình ni thúy sản ớ Việt Nam khá phong
phú.Trong đó, mơ hình nuôi cá lồng đang ngày càng khẳng định được vị trí cùa mình.
Đây là mơ hình được áp dụng cho nhiều lồi cá có giá trị kinh tế cao. Cá khi nuôi trong

lồng phái chịu rất nhiều yếu tố gây stress do phải thích nghi với mơi trường sống mới,

tập quán sinh sàn và kiếm ăn bị đảo lộn, sức đề kháng bị ánh hướng. Vì thế, cá ni
lồng thường mắc một số bệnh do vi khuẩn và virus gây ra. Đáng lưu ý nhất là bệnh

hoại từ gan thận trên cá biền do chúng vi khuầnVibrio parahaemolyticus gây ra, làm thiệt
hại khơng nhị đến người ni cá biến.

Bệnh hoại tử gan thận xuất hiện ở hầu hết các loài cá biển (cá mú, cá chèm, cá

giờ, cá hồng, cá bớp...), đặc biệt là cá ni lồng, xuất hiện ít ở cá nước ngọt. Khi vi
khuẩn Vibrio parahaemolyticus xâm nhập vào cơ thế cá biến, gây hoại tử lên các nội
quan của cá (đặc biệt là gan, thận), lở loét kýp biếu bì.

Gan và thận bị hoại tử. gan từ màu xám nâu chuyến thành màu vàng, làm cho cá

biền chết hàng loạt. Bệnh thường xày ra ờ các giai đoạn của cá, vì vậy tìm ra phương
pháp phịng và trị bệnh có thể hạn chế những ton that do dịch bệnh gây ra là hết sức

cần thiết.

Thực tế trong nuôi trồng thủy sán, người dân thường sứ dụng nhiều hóa chất và
kháng sinh để khống chế vi khuẩn này, song việc sử dụng kháng sinh có thồ gây hiện
tượng nhờn thuốc và không mang lại hiệu quả cao. Vi khuẩn này có khá năng tạo ra

màng bảo vệ (biofilm) trước thuốc diệt khuấn và kháng sinh. Chính vì thế, dịch bệnh

thường bùng phát trờ lại rất nhanh sau khi thuốc hết tác dụng. Mặt khác, dư lượng
kháng sinh trong sản phấm từ cá biển có thề gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng thịt cá

và sức khỏe cùa con người.
Đế giám thiểu việc sử dụng kháng sinh điều trị bệnh và đảm bảo chất lượng sán
phẩm từ cá biển, việc nghiên cứu ra một loại vắc-xin phòng bệnh là tương đối cần thiết.
Bước đầu tiên để tạo ra vắc-xin là phâi phân lập và sàng lọc được các chủng có tính đại

diện kháng nguyên để làm cơ sở cho việc tạo chúng có khá năng tạo kháng thế bão hộ.
Xuất phát từ thực trạng nêu trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Phân lập

và xác định các đặc tính sinh học của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh
hoại tủ’ gan thận trên một số loài cá biến ỏ’ vùng biến Hải Phòng” làm cơ sở ban
đầu hướng đen việc sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tứ gan thận ở cá biên trên quy

mô công nghiệp.

2. Mục tiêu nghiên cứu

2.1. Mục tiêu chung

Phân lập được các chủng vi khuấn Vibrio parahaemolyticus từ mẫu bệnh phẩm
trên một số loài cá biến (cá mú, cá hồng, cá bớp) bị bệnh hoại tứ gan thận ở vùng biên
Hải Phòng.
2.2. Mục tiêu cụ thể

- Phân lập được 6- 8 chúng vi khuấn Vibrio parahaemolyticus từ mầu bệnh phâm
trên một số loài cá biển (cá mú, cá hồng, cá bớp) bị bệnh hoại tử gan thận.


-Xác định các đặc tính sinh học điển hình của vi khuấn Vibrio parahaemolyticus:
đặc điếm hình thái, đặc điểm sinh hóa, khá năng gây bệnh, tính kháng kháng sinh.
3. Nội dung nghiên cúm

- Phân lập các chùng vi khuân Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận

trên một so loài cá biên (cá mú, cá hồng, cá bớp) từ các mầu bệnh phâm.
- Xác định được đặc tính sinh học của chùng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
gây bệnh phân lập được.

- Đánh giá mức độ kháng kháng sinh và đặc tính gây bệnh trên một số loài cá

biền cúa 6 8 chùng vi khuẩn đã chọn lọc được.
4. Ý nghĩa của đề tài

4.1. Ý nghĩa khoa học

- Kết quả xác định các đặc tính sinh học cũa các chùng vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận ở cá là cơ sở khoa học trong nghiên cứu

dịch tễ và xây dựng các giải pháp phòng trị bệnh.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn

- Là cơ sở khoa học nghiên cứu tạo chủng vi khuan Vibrio parahaemolyticus giám
độc lực đế sàn xuất vắc-xin bệnh hoại tử gan thận ở cá. vắc-xin là giải pháp hữu hiệu
trong việc hạn chế dịch bệnh làm tăng hiệu quả kinh tế trong sán xuất cá biên.


PHẦN I
TỐNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. lình hình ni trồng thủy hải sản trên thế giói và tại Việt Nam
1.1.1. Trên thế giói
Ngành ni trồng thúy hài sản trên thế giới đã có từ rất lâu nhưng ngành ni

trồng thủy hài sàn theo hướng hiện đại thực sự ra đời từ những năm 1930, và chi thật

sự bùng nồ từ những năm 80 khi tôm giống sàn xuất ra với số lượng lớn cung cấp cho
người nuôi.

Hiện nay trên thế giới ngành ni trồng thủy sản rất phát triển, có thổ kể đến các
nước đứng đầu về sản lượng nuôi trồng thủy sàn theo thứ tự gồm: Trung Quốc, Ấn Độ,

Việt Nam, Thái Lan, Indonesia, Bangladesh, Chile. Nhật Bàn, Na Uy và Philippines.
Tuy nhiên, ngành nuôi trồng thủy hái sàn đang bị gây trở ngại bới nạn dịch bệnh lây

lan khắp nơi. Các dịch bệnh thường xảy ra đối với thũy hài sản là bệnh đốm trắng,
bệnh đầu vàng, bệnh CÒỈ,.L ở .tơm ni, bệnh xuất huyết do viruSj bệnh índivirus... ở

cá, bệnh do nhóm Vibrio sp., nấm...gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành nuôi trồng

thùy hãi sản.[27]
Một trong những tác nhân gây bệnh đáng quan tâm hiện nay đó là bệnh do nhóm
vi khuẩn Vibriosp. Gây ra cho động vật thủy hài sán (tơm, cá). Chúng có thế gây bệnh

qua tất các giai đoạn của động vật thùy sản và được xem là nguồn gốc gây thiệt hại
nghiêm trọng trôn giống thúy hải sàn. Nhiều trường hợp nhiễm bệnh đã được phát hiện

ở Australia, Àn Độ, Indonesia, Philippines, Đài Loan, Thái Lan trên nhiều loài thủy hải

sản khác nhau. Các sự giảm sút gần đây trong ngành nuôi trồng thủy hãi sàn ờ Việt

Nam, Án Độ, Bangladesh. Philippines và Trung Quốc chú yếu là do tác động cùa nhóm
vi khuẩn Vibriosp. [27]

Theo dự báo cùa Trung tâm Thuý sản Thế giới, đến năm 2020, các nước đang

phát triển sẽ chiếm tới 77% tồng tiêu thụ thuỷ sản toàn cầu và 79% tổng sản lượng thuỳ
sản thế giới. Như vậy là, từ năm 1997 đến năm 2020, tiêu thụ thuỹ sản ở các nước


đang phát triển sẽ tăng từ 62,7 triệu tấn lên 98,6 triệu tấn (57%), trong khi các nước

phát triền sẽ chi tăng 4%, từ 28,1 triệu tấn lên 29,2 triệu tấn. [27]
1.1.2. Tại Việt Nam
Việt Nam là một trong những quốc gia trên thế giới có nghề ni thúy sán phát

triển và cũng là nước có lịch sử ni trồng thúy hải sàn lâu đời. Nghề nuôi thủy sán
truyền thống bắt đau từ thập niên 1960, tuy nhiên trong vòng 10 năm nay, nghề ni

thủy sán có tốc độ phát triển rất nhanh chóng. Trong những năm qua, ngành thuy

sản ln khắng định là ngành kinh tế mũi nhọn có những đóng góp quan trọng cho sự
phát triển kinh tế - xã hội nước nhà. Tạo công ăn việc làm cho hàng trăm ngàn lao
động, cung cấp thực phấm thúy sản cho đời sống người dân, và đang phẩn đẩu trở

thành ngành sán xuất hàng hóa lớn, sản phấm thủy sàn có sức cạnh tranh cao trên thị
trường đề tiếp tục phát triển nhanh, ổn định và bền vững. Thực phấm thuỷ hải sản còn
giữ vai trò an ninh lương thực quốc gia và góp phần xố đói giảm nghèo. Thực phẩm

thuỳ hâi sàn được đánh giá là nguồn cung cấp chính đạm dộng vật cho người dân Việt
Nam.[27]

Thư vịện Viện f)ại học Mở Hà Nội

1.1.3. Một sổ khó khăn trong ni trồng thủy hải sản
Vai trị cùa ni trong thủy sàn là rat to lớn trong việc cung cấp thực phấm, y học,

cơng nghiệp, nơng nghiệp hay giúp xố đói, giảm nghèo và phát triển kinh tế - xã hội

nói chung cùa nhiều quốc gia. Tuy nhiên, với sự thâm canh hố ngày càng cao độ, nghề
ni đang đối mặt với nhiều thách thức lớn như về ô nhiễm mơi trường, suy thối

nguồn lợi, dịch bệnh thúy sản, an toàn vệ sinh thực phẩm, phân cách và mâu thuẫn xã
hội...

Các mơ hình chiến lược sẽ được phát triến trong thời gian tới có thể gồm: Ni
thâm canh với hệ thống hồn chinh; ni tuần hồn, ni kết hợp và nuôi lồng biên

khơi. Nhằm phát triển bền vững nghề nuôi thúy sản, hiện nay, nhiều tố chức đã nô lực

rất lớn trong việc phát triển các phương thức - qui tắc quản lý tổng hợp đối với nghề
nuôi thủy sản và đã bước đau đã được ứng dụng ở nhiều nơi như: nuôi sạch, thực hành

quàn lý tốt hơn, và ni có trách nhiệm.
1.2. Lịch sủ’ phát hiện bệnh do vi khuẩn Vibrio


1.2.1. Trên thế giói
Nhóm vi khuẩn Vibrio được xác định là tác nhân gây bệnh phố biến ở các loài cá

biền trên thế giới. Theo Peggy and Ruth (2009), tỳ lệ cá chết khi nhiễm Vibrio có

thề trên 50% trong một đợt dịch, cá có dấu hiệu hơn mê, màu sắc cơ thế biến đồi và
xuất hiện vùng hoại tứ. Khi cá bệnh nặng nội quan có the xuất huyết hoặc bên
trong chứa đầy dịch lóng [29].

Vibrio anguillarum là lồi vi khuần đầu tiên thuộc giống Vibriođược phát hiện

gây bệnh trên cá và nó đã được phân lập từ cá chình ni ở Địa Trung Hải bời

Cancstrini vào năm 1883. Và những năm tiếp sau đó, người ta cho rang các tác nhân
gây bệnh Vibriosis chính lồi vi khuấn này là nguyên nhân.
Tuy nhiên, sự quan tâm ngày càng nhiều đối nghề nuôi cá trên thế giới đã giúp

cho vấn đề dịch bệnh được hiếu một cách rõ ràng hơn đối với mỗi vùng nuôi, từng hệ
thống nuôi và vai trị cùa mỗi lồi vi khuẩn trong sự bùng nổ cùa dịch bệnh. Chẳng

hạn, V. alginolyticusăược xác định là tác nhân thứ cấp tham gia gây bệnh đối với cá

tráp (Sparus aurata) ni ớ Israel khi lồi cá nàỵ bị thương tổn (Colorni và cộng sự.
1981). Trong khi đó, V.vulnificus là tác nhân gây bệnh cho cá chình ớ Nhật bàn được

thông báo bời Muroga và cộng sự năm 1979 và Bioscas vào năm 1991. Cùng với
Vibrio anguillarum, v.ordalii (Schiewe et al. 1981) và v.salmonicida (Egidius et al.

1986) đã xuất hiện và là những tác nhân gây bệnh rất nguy hiêm cho cá hồi ni ở Thái

Bình Dương và Đại Tây Dương.
Qua quá trình tồn tại và phát triền, các giống lồi Vibrio gây bệnh đã có sự biến

đơi cấu trúc gen khác so với ban đầu, việc này đã dẫn den hiện tượng kháng thuốc, có

tác hại nghiêm trọng đối với sự phát triển của nghề nuôi thuỷ sán nói chung và ni cá

biền nói riêng [27].
V. parahaemolyticus được Fujino phát hiện lần đầu tiên vào mùa hè năm 1951 tại

vùng ven biển Nhật Bán sau các vụ ngộ độc do ăn cá, hàu...Người ta đã xác định đuợc
21 lồi thuộc giống Vibrio, trong đó có 4 lồi thuộc tác nhân gây bệnh cho người

gồm: V. cholera, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. a/ginoỉyticus[28].


V. cholera phân bố rộng khắp với số lượng lớn lan lới cả chân Mỹ, gây bệnh dịch
tà cho inột số vùng châu Á, Ấn Độ và Đông Nam Á. Chúng từng gây đại dịch do lây

truyền qua tiếp xúc, nước, sữa, thực phẩm và côn trùng.
V. parahaemolyticus là vi sinh vật biến, tồn tại tự nhiên trong nước biến, thường

gặp ở các loại hâi sàn loại nhuyễn thề và giáp sát trong nước biến.
Năm 2001, Vibrio alginolyticus được xác định là tác nhân gây bệnh trên cá blip

có dấu hiệu lờ loét tại Đài Loan (Rajan et al 2001). Đến năm 2006 Vibrio vulnificus
được xác định chính là nguyên nhân gây bệnh trên cá bóp. Tuy nhiên, chưa có nghiên

cứu chính thức nào về cá bớp bị lở loét nuôi ờ Đong Bằng Sông Cửu Long. Trong bài
báo này, chúng tơi trình bày kết q phân lập, đặc điếm sinh lý, sinh hóa của vi

khuẩn và xác định độ nhạy của một số loại kháng sinh đối với vi khuấn phân
lập được nhằm cung cấp thông tin cho việc phịng trị bệnh hiệu quả [29],
Ngồi ra. những người dân sống ven sơng và vùng dun hài tại Canada thường
có thú đào vớt nghêu sị. Tuy nhiên ít người ý thức rằng các loại thủy sàn này đôi khi
là mối đe dọa về sức khoe. Cũng như bất cứ lọài thủy sàn nào khác, sị ốc cùng có thể

bị nhiễm bởi các loại vi khuẩn như E. coli spp, Salmonella spp, Vibrio vulniculus,
Vibrio parahaemolyticus và các loại virus như virus Norwalk( Norovirus) và virus

bệnh viêm gan A.

Bệnh viêm ruột do V. parahaemolyticus là bệnh truyền nhiễm cấp tính lây theo

đường ăn uống. Vi khuẩn V. parahaemolyticus gây ra hai hội chứng lâm sàng khác biệt
nhau là tiêu chày kiểu tá nhẹ và tiêu chảy phân có nhiều máu, kèm theo đau bụng và
sốt, kiểu lỵ trực khuẩn. Thông thường bệnh nhẹ và ít nguy hiểm, song nếu phát hiện

chậm và khơng được điều trị kịp thời cũng có the gây tử vong.

Hiện nay, V. parahaemolyticus đã được xác nhận là nguyên nhân gây ra nhiều vụ
ngộ độc thức ăn do ăn cá biên và hái sản. Trong khoảng 50 năm qua, người ta đã

nghiên cửu nhiều về loại vi khuẩn này. Các nhà khoa học lo ngại do biến đối khí hậu,

nhiệt độ tăng lên dẫn đến sự tăng vọt bất ngờ và đột ngột cùa V. parahaemolyticus -

loại vi khuân một thời có vè như chi gây nhiễm khuẩn nhẹ. Dịch tề học cùa vi khuẩn đã


thay đôi và những týp huyết thanh mới phát hiện đã được thừa nhận là nguyên nhân
của sự thay đồi này.

1.2.2. Tại Việt Nam

Hiện nay, đối tượng nuôi và mô hình ni thúy sản ờ Việt Nam khá phong phú.
Đặc biệt những năm gần đây, người dân chú ý đến khá năng nuôi cá mú, đặc biệt là cá
mú chấm nâu (Epinephelus coioides) là lồi được ni phố biến ở các tinh Phú Yên,

Khánh Hòa, Vũng Tàu, Quáng Ninh, Hài Phòng do đặc điếm lớn nhanh, thịt thơm ngon
và nguồn giống cung cấp cho người nuôi ôn định. Mặc dù nghề nuôi cá mú đã mang lại

hiệu quả kinh tế cao cho người nuôi cá biến nhưng rũi ro do dịch bệnh xảy ra cũng gây
ành hưởng không nhỏ đến nghề ni cá mú. Có nhiều ngun nhân gây thiệt hại cho

nghề ni cá mú, trong đó có ngun nhân bệnh do .V|i khuẩn Ỵịbrio sp. gây chết cá
nuôi. Cá mú bị bệnh do vi khuấn Vibrio sp. gây ra thường có các biếu hiện khác nhau

như: Hiện tượng mắt lồi và mù mắt hay hiện tượng lở loét, xuất huyết cơ thể. Ngồi ra.

vi khuẩn Vibrio sp. cịn gây bênh phổ biến trên một số loài cá khác như cá hồng, cá

giị, cá chèm, cá bớp...Trong đó, hiện tượng lở loét, xuất huyết cơ the ờ cá là chủ yếu

với các biếu hiện da cá sẫm màu, xuất hiện các đốm đỏ trên thân và tại các đốm đó này

bắt đầu lờ loét dần dần và lan rộng ra xung quanh. Cùng với đó là sự xuất huyết miệng,
vây, hậu môn và đuôi cá. Cá thường bơi gần mặt nước, sát bờ ao hay lưới lồng nuôi.
Khi giãi phẫu nội tạng có the nhìn thấy gan cá có màu nhợt nhạt hay có chất dịch trong

xoang bụng ở một số trường hợp cá bị bệnh nặng.
V. parahaemolyticus có thê gây ra viêm đường tiêu hóa, nhiễm trùng vết thương

và nhiễm trùng huyết ớ người. Nhiễm trùng huyết là mối đe dọa nghiêm trọng vì sinh

vật gây bệnh lây lan nhanh hoặc các độc tố của chúng sinh ra có thế tồn tại lâu dài và
lưu thông trong máu. Tác nhân vi khuẩn Vibrio gây xuất huyết cơ thế, xuất hiện các vết
lở loét ở thân, cuống đuôi và vây thối rữa ở cá mú giống và cá mú thịt là do vi


khuẩn Vibrio parahaemơlyticus, v.alginolyticus (Lcong tak Seng,1994; Somkiat

Kanchanakhan, 1996; Nguyễn Thị Thanh Thùy et al„ 2009)128]; gây hội chứng đường
ruột ở cá mú là do vi khuân Vibrio alginolyticus và V. carchariae (Lee và cs, 1995; Yii

và cs, 1997)[28]; gây triệu chứng mắt lồi và mù mắt ở cá mú là do nhóm vi
khuan Vibrio gây ra, chúng phá hùy cấu trúc đặc trưng của mắt, làm khả năng bất mồi

cùa cá kém đi, tìr đó làm cá yếu dần và chết (Sindermann, 1970; Richardol, 1972;
Lom, 1970)128],
Bệnh lở loét được ghi nhận đã xuất hiện và làm chết cá vào mùa hè năm 2008 -

2009 ớ một số cơ sở nuôi cá mú tại Sông cầu, thuộc tinh Phú Yên và Cam Ranh thuộc

tỉnh Khánh Hòa. Trong năm 2010 và đầu nãm 2011, bệnh cũng xuất hiện nhiều ở các
vùng nuôi cá mú trong ao và trong lồng nối trên biến thuộc các tỉnh Phú Yên, Khánh
Hòa và Vũng Tàu. Bệnh xuất hiện nhiều vào mùa hè và nhất là vào lúc giao mùa, gây tì

lệ chết cao.

1.3. Tổng quan về bệnh hoại tử gan thận ỏ’ cá biền
Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus có thể kí sinh trên rất nhiều lồi cá biển có giá

trị kinh tế phân bố ờ các vùng biến khác như các loài cá ờ vùng biền ấm như cá chêm
(Lates calcarifer), cá hong (Lutjanus spp.), cá giò (Rachycentron canadum), cá mú

(Epinephelus spp.). Bệnh do vi khuấn V. parahaemolyticus gây ra được báo cáo đã gây

thiệt hại kinh tế cho nghề nuôi cá biến ở nhiều nước trên thế giới 1,3, 12, 18.
Bệnh do vi khuấn V. parahaemolyticus gây ra đặc trưng bởi sự xuất hiện các đốm

đỏ, xuất huyết (bên ngoài hoặc nội quan bên trong). Vay cá bị tróc, rụng, tạo nên các

vết loét ngày càng lan rộng và sâu. Vây cá có thê bị mòn cụt, xơ xác. Giải phẫu mẫu cá
bệnh cho thấy hiện tượng xuất huyết nội tạng (đặc biệt là gan và thận) và xuất huyết

trong cơ của cá. Cá bị bệnh có the chết hàng loạt khi bị cấp tính, hoặc chết rái rác khi ở

thề thứ cấp tính.
Đặc điếm bệnh hoại tử ở cá mú chấm cam với các triệu chứng ban đầu là cá

thường bơi gần mặt nước hoặc bơi sát vào lưới, da cá sầm màu, xuất hiện các đốm đó
trên thân. Sau đó, các đốm này tạo thành vết loét rộng ra xung quanh, kèm theo biếu

hiện xuất huyết ở vây, miệng, hậu môn, đuôi. Giãi phẫu nội quan thường thấy gan nhợt
nhạt, thận đen bầm, đơi khi tích dịch trong xoang bụng ớ một số trường hợp bệnh nặng.

Bệnh hoại tử gan thận xảy ra ở khắp mọi nơi có nghề ni động vật thủy săn nước
lợ và nước mặn. Bệnh lây lan rất nhanh, nếu khơng phát hiện kịp thời có khả năng gây

chết rất cao. Bệnh thường xuất hiện vào mùa nóng và dầu mùa mưa, khi môi trường

thay đổi đột ngột, làm cá dồ bị sốc. Hơn nữa, vi khuẩn tổng số trong nước có xu hướng
tăng khi nhiệt độ tăng. Đây là điều kiện tốt cho vi khuẩn xâm nhập gây bệnh và đặc
biệt gây chết nhiều đối với cá giống mới thả ni. Vi khuẩn V. parahaemolyticus có
ánh hưởng nghiêm trọng đen nghề nuôi thủy sản cùa hơn 14 mrớc và gây bệnh trên
khống 48 lồi cá biến.

Bệnh do vi khuan V. parahaemolyticus gây ra được chấn đoán dựa vào những dấu

hiệu bệnh lý đặc trưng như đã mô tá ờ trên. Nuôi cấy phân lập Vibrio trên môi trường
chọn lọc và phân tích đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 4. Ngồi ra, nhận biết V.

parahaemolyticus bang các phương pháp sinh học phân tư như phân tích trình tự gen
16S ribosomal DNA (rDNA) 11 hoặc các gen độc tố đặc trưng 5.

Để điều trị được bệnh hoại tứ gan thận ờ cá biển, một số nghiên cứu đã đề xuất

biện pháp trị bệnh Vibriosis cho cá biến bàng cách cho ăn, tắm hoặc tiêm kháng sinh.
Biện pháp trộn kháng sinh vào thức ăn

như trộn tetracyline 75-100 mg/kg cá,

streptomycine 50-75 mg/kg cá, oxolinic acid 10 mg/kg cá và cho ăn liên tục trong 7

đến 10 ngày cũng cải thiện được tình trạng nhiễm bệnh do vi khuan Vibrio 3. Nhìn
chung, kháng sinh là phương pháp chọn lựa đầu tiên dùng trị bệnh do vi khuẩn. Mặc dù
kháng sinh dã đem lại hiệu quá điều trị nhất định trong một số trường hợp. nhưng việc
lạm dựng kháng sinh đã tạo ra các chúng vi khuân kháng thuốc gây khó khăn cho quá

trình điều trị. Nghiên cứu của Shyne và cộng sự (2008) về khà năng nhạy cảm với
kháng sinh cùa vi khuấn V. parahaemolyticus phân lập từ cá mú bệnh. Kết quá cho

thấy hầu hết các chúng đều kháng lại sulphadiazine và amoxicillin, 87% kháng lại
gentamycine, 89% kháng lại kanamycine và oxytetracycline 22.Ngoài ra, tồn dư kháng

sinh trong sản phấm thủy sán cịn ánh hưởng đến an tồn vệ sinh thực phâm và mơi
trường. Vì vậy, việc sử dụng kháng sinh để trị bệnh cho vật nuôi thúy sản vẫn không


nên khuyến khích và cần cân nhắc thận trọng trong từng trường hợp. Chính vì những

mặt trái do sử dụng kháng sinh, việc phịng bệnh cho cá ni vẫn ln được chú ý

trong suốt q trình ni. Phương pháp phịng bệnh tông hợp thường được các trại nuôi
áp dụng như sát trùng bể. ao và dụng cụ trước mồi đợt sán xuất, xứ lý nguồn nước
trước khi đưa vào sử dụng. Thà cá ni với mật độ thích hợp, tránh làm cá bị ton

thương trong quá trình vận chuyến, tam định kỳ đế phòng các loại bệnh ký sinh trùng
và chú ý chất lượng thức ăn. Tuy nhiên, đây chi là những biện pháp phịng bệnh đơn

giản với mục đích giảm thiêu nguy cơ nhiễm bệnh, những thiệt hại do bệnh vẫn đang
tiếp tục diễn ra và gây ảnh hường lớn cho nghề nuôi cá biên. Hiện nay, giãi pháp nâng

cao sức đề kháng cho vật nuôi bàng cách sứ dụng các chất gây kích thích miễn dịch
và vắc-xin phịng bệnh là phương pháp phòng bệnh chù động mang lại hiệu quả cao,
đã và đang được tập trung nghiên cứu ở nhiều nước trên thế giới. Song, để chế tạo ra
các loại vắc-xin đặc hiệu hay chọn lựa được các hoạt chất kích thích miễn dịch đem lại

hiệu quả báo hộ cao cho vật nuôi vẫn là một thừ thách không nhỏ đối với khoa học

hiện nay.
1.4. Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
1.4.1. Đặc điếm vi khuan Vibrio parahaemoỉyticus
1.4.1.1. Dặc điểm hình thái và cấu tạo của vi khuấn Vibrio parahaemoỉyticus

Dưới kính hiển vi quang học, Vibrio parahaemolyticus là phẩy khuấn gram âm,
có tiên mao ờ một đầu và có khá năng di động, không sinh bào tứ [28].


Hình 1.1: Tế bào vi khuấn Vibrio parahaemolyticus

quan sát dưới kính hiến vi điện tử.
VỊ trí phân loại:
Giới.’ Vi khuân

Ngành.’ Proteobacteria
Lớp.’ Gamma Proteobacteria
Bộ.’ Vibrionales

Họ.’ Vibrìonaceae
Chi.’ Vibrio

Lồi.’ Vibrio parahaemolyticus
Khuấn lạc cúa vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus trên mơi trường TCBS có màu
xanh đậm,dạng trịn đều và bóng với kích thước từ 2- 3 mm [28].

Hình 1.2: Hình thái khuấn lạc vi khuấn Vibrio parahaemolyticus


Chúng có thời gian thế hệ 8-9 phút [9], thường sống ở các cứa sông và ven biên
của hầu hết các vùng ven biển trên thế giới. Người ta cũng đã phân lập được chúng
trong cát, bùn và nước biên cũng như hài sàn [22].

Vi khuấn Vibrio parahaemolyticus có khà năng hình thành màng bao sinh học

(biofilm), sự hình thành các màng bao sinh học bắt đau khi vi khuấn bám trên bề mặt

vật chũ. Sau đó, vi khuân tiết ra các chất hình thành nên một lớp "keo" giúp cho chúng
gắn chặt vào bề mặt vật chù. Khi đã hình thành các màng bao sinh học chắc chắn trên

dạ dày tôm, các vi khuân bắt đầu nhân lên, màng bao là họp chat exopolysaccharides sẽ

hình thành có tác dụng báo vệ vi khuẩn với tác dụng cùa các loại kháng sinh, chất khứ
trùng, các chất chiết xuất từ thào dược và các phương pháp điều trị khác, trong khi các

hoạt động trao đổi chất ở tế bào của chúng vẫn diễn ra bình thường.
I.4.I.2. Đặc điểm sinh học

Sự phân bố cúa Vibrio parahaemolyticus có mối liên quan chặt chẽ với nhiệt độ

nước. Ớ những vùng nước có nhiệt độ trên 15°c, chúng có mặt quanh năm trong nước,
chất lắng cặn và có mật độ tăng cùng với sự tăng lên của nhiệt độ nước 7, 15. Ngoài ra,

pH của mơi trường cũng có ánh hưởng đến hoạt động cúa vi khuân này. Nghiên cứu
cho thấy các chủng V. parahaemolyticus thí nghiệm đều phát triển được trên mơi

trường NB (Nutrient Broth) với pH biến thiên từ 6,0 - 9,0. Tuy nhiên, ở pH 9,0 vi
khuẩn không tiết ra hemolysin trong khi ở các pH khác đều có hiện tượng này. Hơn

nữa, khả năng vận động bang tiên mao cùa vi khuân bị ức che trong môi trường kiềm
nhưng không bị ảnh hướng ở mơi trường trung tính và axit. Kct q nghiên cứu này

cho thấy pH cùa mơi trường có ảnh hường đến quá trình trao đồi chất và khá năng vận

động cúa V. parahaemolyticus 16. Khi ở độ mặn thích hợp và pH 8,0, vi khn V.
parahaemolyticus có khà năng di động bằng tiên mao với vận tốc 60 pm/s7.
1.4.1.3. Đặc tính sinh hóa

Đặc điểm sinh hóa là một chỉ tiêu rất quan trọng đê phân lập một loài vi khuân cụ
the. Đặc diem sinh hóa dựa trên khả năng sử dụng một số hợp chất, khả năng tiết


enzyme để thủy phân các chất có trong mơi trường cùa vi khuấn. V. paraheamolyticus

khi được nuôi trong môi trường tồng hợp hoặc bán tống hợp sẽ sử dụng các hợp chất

có sẵn đế phục vụ cho nhu cầu sinh trường và phát triển. Người ta đã xác định được
một số đặc tính sinh hóa của V. parahaemolyticus gồm: phản ứng dương tính với

oxidase và catalase, khả năng sừ dụng lysin, ornithin, arginine, khá năng lên men

đường glucose, có khá năng di động, dung huyết dạng p, sống được trong phạm vi

muối từ 3-8%, không mọc ờ môi trường không có muối (0%) hoặc muối q cao

(10%), kỵ khí tùy tiện và ưa môi trường kiềm mặn [29],
Bảng 1.1: Các phản ứng sinh hóa của vi khuấn Vibrio parahaemolyticus
Các phàn ứng sinh hóa

Vibrio parahaemolyticus

Di động

+

Sinh catalaza

+

Sinh oxidaza

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

Phản ứng lên men yếm khí

+

Phản ứng lên men hiếu khí

+

Sinh beta — galactosidaza
Agrinine

Lysine
Omithin
Sử dụng Citrate

Sinh H2S

Sinh ureaza

+


Sinh tryptophane
Sinh indole

+

Phàn ứng Voges - Proskauer

+

Sinh Gelatinaza

+

Sử dụng đường Glucose

+

Manitol

+

Inositol
Sorbotol
Rhamnose

Sucrose

Melibiose

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội
Amygdalin

+

Arabinose
Ghi chú: (+) dương tính, (-) âm tính

1.4.2.
I.4.2.I.

Gen độc tố và CO’ chế gây bệnh của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

Gen độc tố

Vi khuân Vibrio gây bệnh cho vật chù thông qua các loại độc to (toxin), đây là các

hoạt chất sinh học có băn chất protein hoặc không phái protein do vi khuẩn tiết ra nhằm
gây độc cho tế bào vật chù. Quá trình gây bệnh của chúng diễn ra theo trình tự bám dính,

xâm nhập vào tế bào vật chù và tiết ra các độc tố phá vờ màng tế bào và gây độc cho tế
bào vật chù. V. parahaemolyticus vào tế bào vật chủ thông qua phân tử gắn kết đa trị


(Multivalent Adhesion Molecule - MAM) chứa 6 hoặc 7 vùng gắn kết 7. Hoạt tính dung

huyết, phân giái protein, lipid, phospholipid, cytotoxin, yếu tố gây bám dính, ngưng kết

đều liên quan tới khá năng gây bệnh của nhiều loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio và được
quy định bới các gen độc tố đặc trưng 25.

Cũng như các loài vi khuân khác thuộc giong Vibrio, vi khuân V.
parahaemolyticus cũng tồn tại rất nhiều chúng mang các yếu tố gây độc khác nhau.

Hemolysin là ngoại độc tố, chuyến các dạng ion liên kết với protein như hemolysin,
transferrin, lactoferrin thành dạng tự do.Trong nhiều trường hợp, phạm vi tấn công của
hemolysin không dừng ở các tế bào hồng cầu mà còn mở rộng đến các tế bào biểu mô.
tế bào thần kinh và các tế bào nhân đa hình làm tăng cường độc tố và gây phá húy các

mô. Kct quá của sự phân giải này là giái phóng bcta-hemolysin (phân húy hồn tồn
hemoglobin) và alpha-hemolysin (phân hủy khơng hồn tồn hemoglobin). Chủng vi

khuan V. parahemolyticus trên môi trường thạch máu Wagatsumar đã săn xuất ra betahcmoglobin.

Ngày nay, người ta đã phát hiện có 4 nhóm protein độc tố gây ra hiện tượng dung

huyết ờ vi khuan Vibrio bao gồm TDH (Thermostable direct haemolysin), Hly A (El
Tor haemolysin), TLH (Thermolabile haemolysin) và TRH (Thermostable direct

related

haemolysin)[18].Trong

đó,

TDH,

TLH

và

TRH

thường

gặp

ở

v.parahaemolyticus trong khi Hly A thường gặp ờ V. cholerá25.
Vi khuấn V. parahaemolyticus có ba gen độc to hemolysin bao gồm tdh và trhmã

hóa các hemolysin ben nhiệt TDH, TRH và tlh mã hóa hemolysin khơng bền nhiệt
TLH. Cả hai gen tdh và trh đều nằm trên operon độc tố Vp-toxRS, được điều hịa bởi

gen toxR có trình tự bào ton cao trong loài 19.
Protein TDH và TRH được mã hóa bời gen tdh và trh tương ứng được coi là yếu
tố độc tính quan trọng trong q trình gây bệnh cùa V. parahaemolyticus20, 14. Gen

tdh, trh lần lượt có kích thước 250bp và 251 bp. Giữa các chủng v.parahaemolyticus
có các đoạn gen độc tố khác nhau. Hầu như tất cã các mẫu lâm sàng có tdh hoặc trh.


hoặc cà hai, trong khi gần như tất cả các mẫu từ mơi trường khơng có hoặc có tỉ lệ thấp
1-5% 120].

Các chủng V. parahaemolyticus có chứa các đoạn gen tdh và trh mã hóa các

protein độc tố TDH và TRHcùng nằm trong operon độc tố V. parahaemolyticustoxRS
(Vp-toxRS), được điều hòa bời gen toxR. Gen toxR là gen điều hòa kiếm sốt sự biếu

hiện cùa các gen mã hóa cho các nhân tố độc lực ngoại bào quan trọng và các gen liên
quan đến các độc tố khác. Gen toxR có kích thước 368 bp là gen điều hịa cho operon

Vp-toxRS26, tồn tại ở tất cá các chủng V. parahaemolyticus. Gen toxR là gen điều hịa
kiểm sốt sự biểu hiện cùa nhiều gen mã hóa cúa nhiều lồi trong chi Vibrio, có trình tự
bào tồn đặc trưng cho lồi nên có thế được sử dụng làm gen đích để xây dựng phương

pháp phát hiện nhanh V. parahaemolyticus trong mẫu thúy sản bang kỹ thuật PCR. Gcn

tlh có kích thước 451 bp mã hóa một hemolysin khơng bền nhiệt TLD có trình tự amino
acid bão thú trong họ Vibrionaceae, nên có tiềm năng làm vắc-xin điều trị bệnh thủy sàn

và marker chân đoán bệnh do Vibrio.
Hầu hết các nghiên cứu về độc tố và cơ chế gây độc của Vibrio, nhất là V.

parahaemolyticus đã được nghiên cứu tương đối sâu. chù yếu là nghiên cứu các chùng
phân lập từ người. Kết quả đạt được mang lại nhiều ý nghĩa quan trọng trong y học,

giúp chân đoán và điều trị bệnh do vi khuấn này gây ra. Tuy nhiên, số lượng công trình
nghiên cứu cơ bản về các loại vi khuấn gây bệnh cho đối tượng thúy sản vần còn hạn

chế. Việc tìm hiểu đặc điếm, cơ chế gây độc và tác hại của chúng trên đối tượng nuôi là
rất cần thiết nhàm tìm ra các giãi phííp hạn chế thiệt hại do vi khuẩn gây ra cho đối

tượng thúy sản.
1.4.2.2. Cơ chế gây bệnh

Vi khuấn này có khá năng hình thành màng bao sinh học là hợp chất
exopolysaccharides. Sự hình thành các màng bao sinh học bắt đầu khi vi khuẩn bám
trên bề mặt vật chú. Sau đó, vi khuân tiết ra các chat hình thành nên một lớp "keo" giúp

cho chúng gan chặt vào bề mặt vật chủ. Các vi khn bắt đầu nhân lên, màng bao sẽ

hình thành có tác dụng báo vệ vi khuấn với tác dụng của các loại kháng sinh, chất khừ


trùng, các chất chiết xuất từ thào dược và các phương pháp điều trị khác, trong khi các

hoạt động trao đổi chất ờ tế bào cùa chúng vẫn diễn ra bình thường.
Khi vi khuân V. parahaemolyticus xâm nhập vào cơ thê cá biên, vi khuấn lấy ion

Fe++ từ tế bào hồng cầu hình thành enzyme protease phục vụ cho quá trình tồng hợp
protein của chúng.

1.5. Các phưoiig pháp kiếm tra sự có mặt của Vibrio parahaemolyticus
Có nhiều phương pháp được sử dụng đế phát hiện V. parahaemolyticus như dựa

vào quan sát hình thái dưới kính hiến vi điện tử, các đặc tính sinh hóa và các kỹ thuật

sinh học phân từ như PCR, RAPD...

Các lồi V. parahaemolyticus khi ni cấy trên môi trường chọn lọc Thiosulfate
Citrate Bile Salt Sucrose (TCBS) có màu xanh lá cây hoặc màu xanh đậm trên thạch.

Ngồi ra, V. parahaemolyticus cịn phát triền trên mơi trường chọn lọc khác là
CHROMagar™Vibrio cho thấy các khuẩn lạc có màu tía hoặc màu tím.

Kỹ thuật PCR được sử dụng để phát hiện V. parahaemolyticus trong các mẫu
nước hoặc trên các loài cá biền. Phương pháp này thực hiện nhanh, dễ dàng và đáng tin
cậy.
1.6. Triệu chứng của cá khi mắc bệnh do vi khuẩn Vibrio paraheamoỉyticus

Cá biếng ăn, hoạt động bơi bị rối loạn. Cơ thề có màu đen đặc biệt ở vùng lưng và
trên các vết thương tồn; da, vây có thể sưng lên và bị lờ loét. Cơ nổi hạch, mang nhợt

nhạt, mắt cá lồi đục.

Lớp cơ dưới da có nhiều sắc tố melanin màu đen và thề hiện dấu hiệu hoại tứ, có

hiện tượng lở loét cùa lớp biêu bì. Lá lách, gan, thận bị hoại tử, vết hoại từ này lan
nhanh, hố lóng và lá lách sẽ có màu đị anh đào, rồi mất dần hình dạng ban đầu cùa

nó, gan chuyển từ màu xám nâu thành màu vàng. Các cơ quan bên trong khoang bụng
xuất hiện mạch máu nối rõ lên. Tim cá bị bệnh xuất hiện các vết nâu đen.

1.7. Đặc điểm hệ miễn dịch ờ cá xưong

Miễn dịch học ở cá được được chia thành hai loại:
1.7.1. Miễn dịch tự nhiên

Miễn dịch tự nhiên (hay còn gọi là miễn dịch không đặc hiệu) là khả năng tự bào

vệ sẵn có cùa cá the ngay từ khi mới sinh, khơng địi hịi phải có sự tiếp xúc trước với
tác nhân gây bệnh và mang tính di truyền giống nhau giữa các cá thể cùng lồi. Vai trị
cùa hệ miễn dịch tự nhiên được coi như là tuyến phòng thú đau tiên bão vệ cơ the

chống lại các vật lạ xâm nhập và nó có ý nghĩa vơ cùng quan trọng cho giai đoạn đầu
đời, khi mà hệ miền dịch thích nghi chưa được hồn thiện. Nhiều nghiên cứu về các

khía cạnh khác nhau của hệ miền dịch không đặc hiệu ở cá xương đã được tống quan
bởi các tác giã Chistiakov (2007) 6,Van (2008) 24. Hầu hết các nghiên cứu đều mô tả
về thành phần cấu thành và chức năng của chúng trong cơ chế tạo đáp ứng miễn dịch

tự nhiên ở cá. Ba thành phần chính tạo nên hệ miền dịch tự nhiên ở cá bao gồm hàng

rào vật lý, hàng rào dịch thế và hàng rào tế bào không đặc hiệu.
1.7.2. Miễn dịch đặc hiệu

Miễn dịch đặc hiệu hay còn gọi là miễn dịch mắc phải (miễn dịch thích nghi) là

đáp ứng miền dịch chi có thể thấy ở động vật có xương sống và có vai trị quan trọng

trong việc bảo vệ cơ thể chống lại sự tái nhiễm bệnh. Đặc điềm quan trọng của cơ chế
đáp ứng miền dịch này là tính đặc hiệu, tính đa dạng và tính nhớ, nhờ đó mà khi gặp
lại cùng loại kháng nguyên, cơ thề sẽ hình thành nên đáp ứng miền dịch thứ cấp đặc

trưng với thời gian phàn ứng nhanh và cường độ mãnh liệt hơn. Cho đến nay, các

nghiên cứu tương đối đầy đũ các khía cạnh liên quan đáp ứng miền dịch đặc hiệu ờ cá

chỉ mới tập trung trên các đổi tượng quen thuộc như cá hồi, cá da trơn và cá chép.
Những yếu tố cơ bàn của hệ miền dịch mắc phải là các thụ quan tế bào lympho T,
lympho B, các phân tứ kháng thế (Immuno globulin- Ig) 23. Tuyến ức, thận và lách là
ba cơ quan lympho lớn nhất ở cá xương. Thận cùa cá, ngoài chức năng tạo máu còn là

nơi chứa các te bào lympho B sinh kháng thế.


Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội


PHẦN II
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN củư
Đối tưọng nghiên cún

2.1.

Đối tượng nghiên cứu: mẫu cá mắc bệnh hoại tứ gan thận được thu thập từ vùng

biến Hải Phòng.
2.2.

Vât liệu

2.2.1.

2.2.1.1.

Thiết bị và dụng cụ phịng thí nghiệm
Thiết bị

Bảng 2.1. Thiết bị chính dùng trong nghiên cứu
Tên thiết bị

Hãng sản xuất

Tú cấy vô trùng viện V ện 1 Sanyo ,(NBậb>' Há NỘI
Tú lạnh

Nuaire (Mỹ)

Nồi hấp vô trùng

Nhật

Cân điện tư

Adam

Máy lắc Gyromax 737R

Amerex Instrument (Đức)

Máy vortex

Mimishaker. IKA (Đức)

Máy khuấy từ

Rotolab, OSI

Lò vi sóng

Moulinex

Máy li tâm

Mictocentriguge- Sorvall (Mỹ)


2.2.I.2. Dụng cụ

- Dụng cụ thu mẫu: bông thấm cồn, túi PE đã tiệt trùng, bộ giải phẫu đã tiệt
trùng.

- Dụng cụ đê làm phân tích và nghiên cứu vi khuân: ống nghiệm, đĩa petri, đầu

côn. ống eppendorf, que cấy, đèn cồn, dụng cụ dùng đế nhuộm gram, xylen, kính
hiền vi.
2.2.2.

Mơi trưịmg và hóa chất

2.2.2.I. Mơi trường
•Mơi trường TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Salts):
Peptone

10g

Cao nấm men

5g

Natri citrat

10g

Natri thiosulfat

10g

Viện Đại học Mở Hà Nệi
Natri clorid

10 g

Natri cholat

3g

Feric citrat

1 g

Saccharose

20 g

Dung dịch xanh thymol 1%

4 ml

Dung dịch xanh bromothymol 0,2%

20 ml

Agar

15 g

Nước cất vừa đù

1000ml