Sàng lọc, tuyển chọn và nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy thích hợp của chủng nấm sợi có khả năng sinh tổng hợp LACCSE với tiềm năng ứng dụng loại màu thuốc nhuộm

SVTH: Nguyen Hồi Thu

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HẢ NỘI
KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đê tài:

Thư viện
Viện
Đại
học Mở Hà Nội
•
■
•

SÀNG LỌC, TUYÊN CHỌN VÀ NGHIÊN cứu MỘT SỐ ĐIÈU KIỆN NI
CÁY THÍCH HỢP CỦA CHỦNG NÁM SỢI CĨ KHÁ NĂNG SINH TÓNG HỢP
LACCSE VỚI TIÈM NÀNG ỨNG DỤNG LOẠI MÀU THUÓC NHUỘM

Người hướng dẫn:TS. Đinh Thị Thu Hằng
Sinh viên thực /ỉ/ện.-Nguyền Hồi Thu

Lớp: 11-04

Hà Nội - 2015

Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Nguyen Hồi Thu

Lời Cảm ơn !

Trước hết, tơi xin bày tó sự biết ơn chân thành và sâu sac tới PGS.TS. Đặng

Thị Cấm Hà, TS. Dinh Thị Thu Hang đã tận tình chi bảo, quan tâm hướng dan và
dìu dắt tơi trong suốt q trình học tập, nghiên cứu và hồn thành luận văn, giúp
tơi có thêm nhiều kiên thức và kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu khoa học.
Tôi cũng xin giá lời cảm ơn tớiKS. Trần Thị Thu Hiển, Th.s Đào Thị Ngọc

Ánh, Th.s Ngô Thị Huyền Trang, KS. Nguyễn Hái Vân, KS. Hoàng Thị Nhung, CN.
Nguyễn Văn Huynh và các anh chị trong phịng Cơng nghệ sinh học tái tạo môi

trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cồng nghệ Việt Nam
đã quan tâm, giúp đỡ và dạy bảo tận tình cho tơi trong q trình làm khóa luận tot

nghiệp.
Tơi cũng xin bày tò lòng biết an đối với thầy cộ trong Khoa Công Nghệ Sinh

Học- Viện Đại học Mớ Hà Nội đã tận tình dạy dỗ và tạo mọi điều kiện cho tơi hồn
thành khóa học và thực hiện khóa luận này.
Bên cạnh đó, tơi xin cảm on bo mẹ và những người thân yêu nhát đã tạo điều

kiện động viên giúp đỡ tôi cà về vật chát và tinh than đê tơi có thê hồn thành khóa
luận này.

Hà Nội, ngày 22 tháng 05 năm 2015

Nguyễn Hồi Thu

Khóa luận tốt nghiệp


SVTH: Nguyen Hoài Thu
MỤC LỤC

LỜI CẢM ON
MỤC LỰC

DANH MỤC CÁC CHỦ VIÉT TẤT
DANH MỤC CÁC BÁNG
DANH MỤC CÁC HÌNH

MỞ ĐÀU....................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TÔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................. 3
ENZYME LACCASE............................................................................3

1.1

1.1.1

Giới thiệu về laccase............................................................................... 3

1.1.2

Cấu trúc phân tử của laccase...................................................................3

1.1.3

Cơ chế xúc tác cùa laccase.....................................................................5

114
^kThii.vien.Vien Đai hoc Mở Hà Nội
_
1.1.4 Tính chât hóa sinh cua enzyme laccase................................................ 7
1.1.5

Sự phân bố và khã năng sinh laccase của một số vsv........................8

1.1.6

ưng dụng cùa laccase............................................................................ 10

TÓNG QUAN VÊ NẤM SỢI............................................................. 11

1.2

1.2.1

Nấm sợi...................................................................................................11

1.2.2

Khả năng sinh laccase cùa nấm sợi...................................................... 11

1.3

THUỐC NHUỘM................................................................................ 11

1.3.1

Khái niệm thuốc nhuộm........................................................................ 11

1.3.2

Ô nhiễm nước thái dệt nhuộm và tác hại ô nhiễm của nó................... 14

1.3.2.1

Ơ nhiễm nước thài dệt nhuộm do thuốc nhuộm.................................14

1.3.2.2

Tác hại của ô nhiễm............................................................................15

1.3.3

Khá năng xử lý thuốc nhuộm bằng phương pháp sinh học................. 16

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN củu....................... 18
Khóa luận tốt nghiệp


SVTH: Nguyền Hồi Thu

2.1

VẬT LIỆU............................................................................................. 18

2.1.1

Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 18

2.1.2

Hóa chất và mơi trường ni cấy.......................................................... 18

2.1.3

Thiết bị, máy móc.................................................................................. 19

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚƯ...................................................... 20

2.2
2.2.1

Sàng lọc các chùng nấm có khả năng sinh laccase.............................. 20

2.2.2

Phương pháp xác định hoạt tính laccase............................................. 20

2.2.3

Định danh chúng nấm........................................................................... 21

2.2.3.1 Phân loại theo phương pháp truyền thống.......................................... 21

2.2.3.2

Phân loại bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự vùng ITS

(1TS1 -5.8S-ITS2).......................................................................................... 21
Nghiên cứu chọn lọc mơi trường và điều kiện ni cấy thích hợp lên

2.2.4

khả năng sinh laccase cùa chùng nấm đại diện.................................................24
2.2.4.1

Ảnh hưộng^^i

2.2.4.2

Ảnhhưởng của pH môi trường nuôi cấy........................................... 24

2.2.4.3

Anh hướng cúa chất cảm ứng............................................................ 24

2.2.4.4

Anh hưởng cứa nồng độ chất câmứng C11SO4...................................24

2.2.4.5

Ảnh hưởng của nguồn carbon............................................................ 25

2.2.4.6

.........................24

Ânh hường cùa nguồn nitơ vô cơ.......................................................25

2.2.5

Dánh giá khâ năng loại màu của dịch enzyme thô cùa chúng nấm được

chọn

25

CHƯƠNG 3. KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................... 27
SÀNG LỌC CÁC CHỦNG NÁM CÓ KHẢ NĂNG SINH LACCASE

3.1
27

3.2
3.2.1

PHÂN LOẠI CHỦNG FAXS1.......................................................... 28

Phân loại theo phương pháp truyền thống............................................ 28

Khóa luận tốt nghiệp


SVTH: Nguyền Hoài Thu

3.2.2

Phân loại bàng phương pháp xác định và so sánh trình tự vùng ITS

(ITS1 -5.8 s - ITS2).......................................................................................... 29

CHỌN LỌC MÔI TRUÔNG VÀ ĐIÊU KIỆN NUÔI CÁY.......... 31

3.3
3.3.1

Ảnh hưởng cùa môi trường nuôi cấy lên khá năng sinh laccase.........31

3.3.2

Ảnh hưởng cùa pH lên khà năng sinh laccase..................................... 33

3.3.3

Anh hưởng của chất căm ứng lên khả năng sinh laccase.................... 34

3.3.4

Anh hường cùa nồng độ chất cám ứng CuSO4lên khá năng sinh

laccase. 35

3.3.5

Anh hưởng cùa nguồn carbon lên khả năng sinh laccase.................... 37

3.3.6

Anh hưởng của nguôn nitơ vô cơ lên khá nâng sinh laccase..............38

3.4
KHẢ NĂNG LOẠI MÀU CỦA DỊCH ENZYME THÔ TỪ CHỦNG
NÁM MYROTHECIVM SP. FAXS1................................................................... 39
3.4.1

Khà năng loại màu nhóm anthraquinone của dịch enzyme thơ từ chủng

Myrothecium sp. FAXS1 khi có mặt các chất gắn kết..................................... 40

3.4.2

Khả tUn
Myrothecium sp. FAXS1 khi có mặt các chất gắn kết..................................... 41
3.4.3

Khà năng loại màu thương mại của dịch enzyme thơ từ chúng

Myrothecium sp. FAXS1 khi có mặt các chất gan kết..................................... 43

PHÀN 4. KÉT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ................................................................46
4.1

Kết luận......................................................................................................... 46

4.2

Kiến nghị....................................................................................................... 46

TÀI LIỆU THAM KHÁO........................................................................................ 48

Khóa luận tốt nghiệp


SVTH: Nguyen Hoài Thu

DANH MỤC CÁC CHỦ VIẾT TẤT

ABTS

2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid

Ace

Acetosyringone

bp

Base pair

CLS

Dimaren Black CLS

DDT

Dichloro - Trichloroethane Diphenyl

DNA

Deoxyribonucleic acid

Dig

Đồng tác giả

HCH

Hexachlorocyclohexane

HOBT

Hydroxybenzotriazole

ITS

Internal transcribed spacer

Lac

Laccase

LF-2B

Everzol Red

LiP

Lignin peroxidase
h?c Mở Hà Nội

MnP
NY1

Acid red 299

NY5

Acid red 266

NY7

Acid blue 281

PCR

Polymerase Chain Reaction

RBBR

Remazol brilliant blue R

Si

Sinapic acid

Syr

Syringaldehyde

TNT

Trinitrotoluen

VIO

Violuric acid

vsv

Vi sinh vật

Khóa luận tốt nghiệp


SVTH: Nguyen Hoài Thu
DANH MỤC CÁC BANG
Báng 1.1. Một so vi sinh vật có khá năng sinh laccase............................................. 9
Băng 1.2. Một số loại thuốc nhuộm đại diện............................................................. 14

Báng
Báng
Bàng
Báng
Bảng

Báng

2.1. Danh sách các màu sứ dụng trong nghiên cứu.......................................... 18
2.2. Thành phần môi trường nuôi cấy............................................................... 19
2.3. Thành phần phân ứng xác định hoạt tính laccase..................................... 20
2.4. Thành phần phản ứng.................................................................................23
2.5. Chu trình nhiệt............................................................................................ 23
2.6. Thành phần các chất trong phàn ứng loại màu........................................ 26

Báng 3.1. Hình thái khuấn lạc của 6 chủng nấm trên môi trường PDA chứa guaiacol
.... ........................................
27
Báng 3.2. Hoạt tính laccase của 6 chúng nam sau 8 ngày......................................... 28

Thư viện Viện Đại học Mơ Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp


SVTH: Nguyen Hồi Thu
DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc khơng gian 3 chiều cùa laccase.................................................... 4
Hình 1.2. Trung tâm hoạt động của laccase............................................................... 5
Hình 1.3. Cơ chế xúc tác của laccase.......................................................................... 6
Hình 1.4. Cơ chế xúc tác của laccase trong cơng nghiệp............................................ 7
Hình 1.5. Màu Orange II (nhóm màu azo) bị phân hủy dưới tác dụng cúa
hydrogenase................................................................................................................. 17
Hình 3.1 .Hình thái cùa chúng FAXSI dưới hiển vi quang học với độ phóng đại 400
lần................................................................................................................................ 29

Hình 3.2. Điện di đồ sán phẩm PCR trình tự vùng ITS cùa chủng nấm FAXS1.... 30
Hình 3.3. Cây phát sinh chúng loại cùa chúng nam sợi FASX1...............................31
Hình 3.4. Ảnh hưởng của mơi trường ni cấy lên khả năng sinh laccase của chúng
Myrothecium sp. FAXS1............................................................................................ 32
Hình 3.5. Anh hưởng của pH lên hoạt tính laccase chủng Myrothecium sp. FAXS133
Hình 3.6. Ảnh hường của một số chất cảm ứng lên hoạt tính laccase cúa chủng
Myrothecium sp. EAXS1 ............................... .........
34
Hình 3.7. Ảnh hưởng cua nồrig độ GuSCXt lênììồầt tỉẤhlẩdcàse^cÌiủng Myrothecium
sp. FAXSI..............?............. .....................................................................
36
Hình 3.8. Ảnh hướng cùa nguồn carbon lên hoạt tính laccase chùng Myrothecium
sp. FAXS1..........................
37
Hình 3.9. Ánh hướng của nguồn nitơ lên hoạt tính laccase chúng Myrothecium sp.
FAXS1............. ................. .................. ................ ..............7............................. 38
Hình 3.10. Khá năng loại màu thuốc nhuộm NY5 (A); RBBR (B) cùa dịch enzyme
thô từ chúng Myrothecium sp. FAXS1 khi có mặt các chất gan kết......................... 40
Hình 3.11. Sự thay đối màu NY5 bởi laccase thơ từ chùng Myrothecium sp. FAXS1
khi có mặt các chất gắn kết......................................................................................... 41
Hình 3.12. Sự thay đơi màu RBBR bời laccase thơ từ chúng Myrothecium sp.
FAXS1 khi có mặt các chất gắn kết........................................................................... 41
Hình 3.13. Khá năng loại màu thuốc nhuộm NY 1 (A), NY7 (B) cùa dịch enzyme
thô từ chúng Myrothecium sp. FAXS1 khi có mặt các chất gắn kết......................... 42
Hình 3.14. Sự thay dối màu NY 1 bởi laccase thơ từ chúng Myrothecium sp. FAXS1
khi có mặt các chất gắn kết......................................................................................... 43
Hình 3.15. Sự thay đổi màu NY7 bởi lacase thơ từ chùng Myrothecium sp. FAXS1
khi có mặt các chất gắn kết......................................................................................... 43
Hình 3.16. Khà năng loại màu CLS (A) và LF-2B (B) cùa dịch enzyme thô từ
chúng Myrothecium sp. FAXS1 khi có mặt các chất gan kết.................................... 44

Khóa luận tốt nghiệp


SVTH: Nguyen Hồi Thu
Hình 3.17. Sự thay đối
FAXS1 khi có mặt các
Hình 3.18. Sự thay đối
FAXS1 khi có mặt các

màu CLS bởi dịch enzyme thô từ chủng Myrothecium sp.
chất gắn kết........................................................................... 44
màu LF-2B bởi dịch enzyme thô từ chùng Myrothecium sp.
chất gắn kết........................................................................... 45

Thư viện Viện Đại học Mơ Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp


SVTH: Nguyen Hồi Thu

MĨ ĐÀU

Ngày nay, ơ nhiễm mơi trường, đặc biệt ô nhiễm môi trường nước ngày càng
tăng và trờ nên nghiêm trọng. Ơ nhiễm mơi trường do tác động của thiên tai và các
hoạt động của con người (sàn xuất công nghiệp, nông nghiệp, sinh hoạt, vui chơi

V.V.). Trong đó, nước thải từ hoạt động cơng nghiệp có ánh hướng nhiều nhất đến
mơi trường nước do tính đa dạng và phức tạp. Một trong những ô nhiễm do sản xuất

công nghiệp gây ra dược quan tâm hiện nay là ô nhiễm thuốc nhuộm.
Việt Nam là một trong những nước có tình trạng ơ nhiễm mơi trường bời

thuốc nhuộm đang trớ nên báo động,do đó cần phái thực hiện nghiêm ngặt các tiêu
chuẩn đối với việc thải chất thải vào môi trường. Các phương pháp xử lý đang được

áp dụng phố biến hiện nay như hấp phụ. keo tụ-tạo bơng kết hợp lọc, oxy hố hố
học, phương pháp điện hố v.v. thường khơng đạt hiệu q cao. Bên cạnh đó. loại
màu và phân hủy thuốc nhuốm bạng con đư^ng sinh học đang được quan tâm vì

vừa mang lại hiệu quá kinh tế và đặc biệt rất thân thiện với mơi trường. Trong đó,
việc sừ dụng các enzyme ngoại bào do các vi sinh vật sinh ra để xừ lý, loại bỏ các

chất ơ nhiễm là một lựa chọncó tiềm năng ứng dung cao.
Các enzyme ngoại bào như laccase, maganese peroxidase (MnP), lignin

peroxidase (LiP) từ lâu đã được sứ dụng để xừ lý ơ nhiễm mơi trường. Trong đó,
laccase là enzyme được nghiên cứu và sừ dụng nhiều nhất. Laccase xuất hiện nhiều

ở các loại thực vật bậc cao và nấm, hoạt động ở dái pH tối thích rộng và có khá
năng chịu nhiệt cao. Chúng có khả năng phân húy phenol và các dẫn xuất cùa
phenol. Ngoài ra, laccase còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như khứ độc và
loại màu thuốc nhuộm do các ngành công nghiệp dệt nhuộm thái ra. xử lý nước thài,

trong công nghiệp giây và thực phàm, mỹ phâm v.v.

Hiện nay, các nghiên cứu trên thế giới về laccase, chủ yếu tập trung vào các
chúng nấm đám vì chúng có khá năng sinh tơng hợp enzyme ngoại bào cao. Các

nghiên cứu tìm kiếm và khai thác enzyme ngoại bào thuộc nhóm oxidoreductase và
Khóa luận tốt nghiệp

Trang I


SVTH: Nguyền Hoài Thu

peroxidase từ nam đàm dã đạt những bướe tiến rất lớn. Đã có tới gần 100 loại
enzyme laccase đã được xác định với trọng lượng phân tứ khác nhau với các tính

chất khác nhau. Những năm gần đây, việc sãn xuất enzyme ngoại bào nói chung và
laccase nói riêng từ nam sợi đã và đang được các nhà khoa học trên thế giới quan

tâm. Tuy nhiên laccase từ nấm sợi được tìm thấy chưa nhiều. Do dó đề tài ' Sàng

lọc, tuyến chọn và nghiên cứu một số diều kiện ni cấy thích hợp của chủng
nấm sợi có khả năng sinh tống hợp laccase với tiềm năng úng dụng trong loại

màu thuốc nhuộm" đã được tiến hành với một số nội dung như sau:

-

Sàng lọc các chúng nam có khả năng sinh tong hợp laccase từ bộ sưu tập

nấm đã được phân lập tÙTÌrng Quốc gia Xuân Sơntinh Phú Thọ và tĩnh Bình

Định:

-

Phân loại chung nấm lựa chọn bang phương pháp truyền thống và so sánh
trình tự vùng ITS (ITS 1 - 5,8 s - ITS2);

-

Đánh giá ánh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng

hợp laccase cuti'chung tíạĩ diệíl;

-

Đánh giá khá năng loại màu thuốc nhuộm của chúng đại diện;

Khóa luận tốt nghiệp

Trang 2


SVTH: Nguyền Hồi Thu

CHNG 1. TƠNG QUAN TÀI LIỆU

1.1

ENZYME LACCASE
1.1.1 Giói thiệu về laccase

Laccase (p- benzenedoil: oxygen oxidoreductase, E.c. 1.10.3.2) thuộc nhóm

enzyme oxy hóa khừ. Trong phân tử có chứa 4 nguyên từ đồng có khá năng oxy hóa

cơ chất sử dụng phân tứ oxy làm chất nhận điện tứ.
Khác với phan lớn các enzyme khác, laccase có phố cơ chat rất đa dạng, bao

gồm diphenol, polyphenol, các dần xuất phenol, diamine, amine thơm,
benzenethiol, PCB (polychlorinated biphenyl), dioxin và cả các hợp chất vô cơ như

iot. Các laccase được tách chiết từ các nguồn khác nhau rất khác nhau về mức độ

glycosyl hóa, khối lượng phân tứ và tính chất động học[29].

1.1.2 Cấu trục phân tử của laccase

Tnu Viện Vĩẹn Đậĩ học Mớ Hà Nội

Một lồi vi sinh vật có the có nhiều dạng isozyme của laccase, các dạng
enzyme này khác nhau về trình tự acid amin và một số tính chất về động học xúc

tác. Nấm có thề tạo ra nhiều dạng isozyme laccase khác nhau cà về mức độ glycosyl
hóa và cà thành phần các gốc carbonhydrate. Nam Trametes versicolor có 5 dạng
isozyme và chúng chỉ khác nhau về thành phan carbohydrate, thành phần

carbohydrate cúa chúng thay đổi từ 10 - 45% so với khối lượng cùa thành phần
protein. Phân tư laccase thường là monomeric protein, chi một số là oligomeric
protein, có khối lượng phân tử dao động trong khoảng 60 - 90 kD. Phần lớn laccase

cùa nam có ban chất là glycoprotein với hàm lượng carbohydrate chiếm khoảng 10

- 25% [28]. Ngồi ra cịn có nhiều loại enzyme giống laccase (laccase-like) [1].

Tuy vậy, tất cá các laccase đều giống nhau về cấu trúc trung tâm xúc tác với

4 nguyên từ đồng. Những nguyên tư đồng này được chia thành 3 nhóm: loại 1 (Tl),
loại 2 (T2), loại 3 (T3), chúng khác nhau về tính chất hấp thụ ánh sáng và thế điện

tư. Các nguyên tư đồng TI và T2 có tính chat hấp thụ điện tứ và tạo thành phổ điện
Khóa luận tốt nghiệp

Trang 3


SVTH: Nguyen Hoài Thu
tứ mạnh, trong khi cặp nguyên tứ đong T3 không tạo phô điện từ hấp thụ điện tử và

có thể được hoạt hóa khi liên kết với anion mạnh (Hình 1.1).

Hình l.l.cấu trúc khơng gian 3 chiều của laccase

Phân tử laccase thông thường bao gồm 3 tiểu phần (vùng) chính A. B, c có
khối lượng tương đối bằng nhau, cà ba phần đều có vai trị trong q trình xúc tác

của laccase. Vị trí liên kết với cơ chất nam ờ khe giữa vùng B và vùng c. trung tâm
một nguyên tứ đồng nằm ờ vùng c và trung tâm ba nguyên từ đồng nằm ờ bề mặt

chung cúa vùng A và vùng c.
Trung tâm đồng một nguyên tứ chi chứa một nguyên từ đồng TI. liên kết với
một đoạn peptit có hai gốc histidin và một gốc cystein. Liên kết giữa nguyên tử

đồng TI với nguyên tứ lưu huỳnh cua cystein là liên kết đồng hóa trị ben và hấp thụ
ánh sáng ớ bước sóng 600 nm. tạo cho laccase có màu xanh nước biền đặc trưng.

Trung tâm dồng ba nguyên tứ có nguyên tư dong T2 và cặp nguyên từ dong T3.
Nguyên tứ đồng T2 liên kết với hai gốc histidin bào thú trong khi các nguyên tử

đồng T3 thì tạo liên kết với 6 gốc histidin bảo thu(Hình 1.2) [29],

Khóa luận tốt nghiệp

T rang 4


SVTH: Nguyen Hồi Thu

Hình 1.2.Trung tâm hoạt động của laccase
1.1.3 Cơ chế xúc tác của laccase

Laccase là enzyme oxy hóa khử có khả năng oxy hóa diphenol và các hợp
chất có liên quan, sứ dụng oxy phân tử làm chất nhận điên tứ. Khác với phần lớn
, 1™;
, . .hợp cua
. các
,
các
loại enzyme khác, laccase có phơ đặc hiệu cơ chat khá rộng. Sự phù

cơ chất đối với laccase quyết định bời hai nhân tố chính. Thứ nhất là sự phù hợp
giữa cơ chất và nguyên tử đồng T1. thứ hai là sự phụ thuộc vào sự chênh lệch giữa

the oxy-hóa khứ giữa cơ chất và enzyme. Các đại lượng này phụ thuộc cấu trúc hóa
học của cơ chất. The oxy hóa khừ cùa laccase dao động trong khoảng 0,4 đen 0,8 V

[8]. Cơ chất khứ bị mất một điện từ nhờ xúc tác bởi laccase thường tạo thành một
gốc tự do, gốc tự do không bền này tiếp tục bị oxy hóa nhờ xúc tác bởi chính
laccase đó hoặc tiếp tục các phàn ứng không cần xúc tác enzyme nhờ hydrate hóa,

phân ly hoặc polymer hóa.

Trung tâm nguyên tứ dồng một nguyên từ (Tl) là nơi diễn ra phàn ứng oxy
hóa cơ chất. Cơ chất chuyển một điện tử cho nguyên tử đồng TI. biến nguyên từ

đồng TI (Cu2+) trờ thành dạng Cu+, hình thành phân tử laccase có cả 4 nguyên tử
đồng đều ớ trạng thái khử (Cu+). Một chu kỳ xúc tác liên quan đến sự vận chuyển
đồng thời 4 điện tư từ nguyên từ đồng TI sang cụm nguyên tư đồng T2/T3 qua cầu

Khóa luận tốt nghiệp

Trang 5


SVTH: Nguyen Hoài Thu
tripeptit bào thú His-Cys-His. Phân tứ oxy sau đó oxy hóa laccase dạng khử. tạo

thành hợp chất trung gian peroxy, và cuối cùng bị khứ thành nước (Hình 1.3).

Hình 1.3.CO' chế xúc tác Clia laccase
Trong cơng nghệ tổng hợp các hợp chất hay trong các công nghệ khác, cơ
chế xúc tác có thể Àý ra ttìếó một trong Cắc .cờ chế ’ờ hình lứ, Cơ chế đơn giản

nhất có thể xây ra khi các cơ chất bị oxy hóa trực tiếp bời trung tâm hoạt động cũa
enzyme. Tuy nhiên, các phan tứ cơ chất thường có cấu tạo phức tạp hoặc có the khử

q lớn. Vì vậy, chúng không thế tiếp cận được trung tâm phán ứng cùa phân tử
laccase. Trong trường hợp này cần một hợp chất hóa học trung gian gọi là mediator

(chất gắn kết) (Hình 1.4). Hợp chất hóa học này có thế tiếp xúc với trung tâm phán

ứng cùa laccase và bị laccase oxy hóa thành dạng gốc tự do[41 ]. Sau đó chất trung
gian ờ dạng sạng oxy hoá nhận một điện tứ cùa cơ chất và trớ thành chất khử, tiếp

tục tham gia vào chu kỳ xúc tác. Ngược lại, laccase sau khi cho chất trung gian một
điện tử thì trở thành dạng khứ và bị oxy hoá thành dạng oxy hoá và tiếp tục tham

gia vào chu kỳ xúc tác tiếp theo.
Các chất gan kết thường được sư dụng cho laccase là: 3-hydroxyanthranillic

acid (HAA), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenz.thiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS), 1hydroxybcnzo-trialzone (HOBT). N-hydroxyphtaimide (HP1), violuric acid (ViO)

Khóa luận tốt nghiệp

Trang 6


SVTH: Nguyen Hoài Thu

v.v. |41 ]. Sự tham gia của chat gắn kết làm cho laccase có khá năng tham gia xúc
tác với nhiều chất hoai, tức là làm tăng tính khơng đặc hiệu cơ chất.
Các chất ức chế của laccase thường là các ion nhó như: azide, cyanide,

fluoride. Các ion này liên kết vào trung tâm đồng và càn trờ các dòng điện tứ đi đến

các nguyên tứ này. Các chất ức che khác là EDTA, tropolone, kojic acid và

coumaric acid, nhưng chúng chi có tác dụng ức chế ờ nồng độ cao hơn. Các hợp

chất chứa sulfhydryl như L-cystein, dithiothreitol và thioglycolic acid cũng được

coi là chất ức che enzyme laccase.

Hình 1.4.CƠ chế xúc tác của laccase trong cơng nghiệp

1.1.4 Tính chất hóa sinh của enzyme laccase

Hoạt tính xúc tác của enzyme được đặc trưng bời hằng số Michaelis-Menten
(Ã",,,). Hang số này cùa laccase dao dộng trong một khoảng giới hạn khá rộng từ 2-

500 pM phụ thuộc vào nguồn gốc của enzyme và cơ chất. Giá trị K,„ thấp nhất với
cơ chất là syringaldazine (một dạng dimer cũa hai phàn tứ 2,6- dimethoxyphenol

liên kết với nhau bang cầu noi azide). Ái lực đối với oxy ít phụ thuộc vào enzyme

và chi dao động trong khoáng 20-50 pM.
Laccase hoạt động tối thích trong khoảng pH 4-6 đối với các cơ chất

phenolic. Khi tăng pH sang vùng trung tính hoặc vùng kiềm thì hoạt tính cùa

Khóa luận tốt nghiệp

Trang 7


SVTH; Nguyền Hoài Thu
laccase bị giâm, nguyên nhân do anion nhỏ là ion hydroxide đã ức chc laccase. Mặt

khác, tăng pH cịn làm giảm the oxy hóa khử của cơ chat phenolic, do đó cơ chat
phenolic dề bị oxy hóa bởi laccase hơn. Do vậy, hoạt tính cùa laccase ở các pH khác

nhau là kết quá của hai tác dụng đối lập cúa pH là sự tâng chênh lệch thế oxy hóa

khứ laccase- cơ chất và tác dụng ức chế trung tâm đồng ba nguyên tứ cùa ion
hydrocide. Đối với các cơ chất khơng phải phenolic như ATBS thì phân ứng oxy
hóa khơng liên quan đen sự vận chuyển ion và do đó pH tối thích nằm trong khoảng

2-3. Ngược lại, tính bền cùa laccase cao nhất trong khống pH kiềm từ 8-9.

Nhiệt độ ben cúa laccase dao động đáng kể, phụ thuộc vào nguồn gốc của vi
sinh vật. Nhìn chung, laccase bền ở 30-50°C và nhanh chóng mất hoạt tính ở nhiệt

độ trên 60°C. Laccase bền nhiệt nhất được phân lập chú yếu từ các lồi thuộc
Prokaryote, ví dụ như: thời gian bán hùy của laccase ở Streptomyces lavendulae là

100 phút ở 70°C và của protein CotA từ loài Bacillus subtilis là 112 phút ờ 80°C.

Thời gian bán hũy cùa laccase có nguồn gốc nấm thường dưới 60 phút ở 70°C và
dưới 10 phút ớ 80nC [8; 29; 30; 44],

Thư viện Viện Đại học Mơ Hà Nội
1.1.5 Sự phân bố và khả năng sinh laccase của một so vsv

Laccase là enzyme rất phô biên trong tự nhiên, chúng được tìm thây ở thực

vật, nấm. một số vi khuấn và côn trùng. Laccase được phát hiện lần đầu tiên ở cây
Ruhs vemicifera . Việc nghiên cứu laccase trên dối tượng thực vật và nam đám rất

phố biến. Laccase còn được phát hiện trong các loài nấm thuộc các lớp Ascomyces,
Deuteromyces, Basidoinyces và các lồi nam có khã năng phân húy lignocellulose

như Agaricus basidomyces, Botrytis cinerea, Chaetomium thmophilum, Coprius,
cinereus, Neurospora crassa, Phlebia radiatre, Pleurotus otreatus, Pycnoporus

cinnabarius, Trametes versicolor. Tuy nhiên các nghiên cứu về laccase trên các đối
tượng xạ khuấn, vi khuấn và nam sợi không nhiều. Một số loại vsv có khá năng

sinh enzyme laccase được trình bày ở bảng 1.1 [19; 20; 32; 40].

Khóa luận tốt nghiệp

Trang 8


SVTH: Nguyen Hoài Thu
Báng 1.1. Một số vi sinh vật có khả năng sinh laccase

Nấm đảm

Phanerochaete chrysosporium
Pycnoporus cinnabarinus

Rhizotonia solani

Trametes villosa
Trametes versicolor

Pleurotus ostreatus

Lentinula edodes

Agaricus bisporus
Botrytis cinerea

Nấm sợi

Melanocarpus albomyces

Fusarium oxysporum
Aspergillus nidulans

Trichoderma harzianum
Aspergillus niger

Thư viện Viện Đ
Pholiota spp.
Peniophora spp.

Mauginiella sp.

Xạ khuấn

Streptomyces lavendulae
Streptomyces psammoticus
Streptomyces viridosporus
Streptomyces coelicolor

Vi khuân

Bacillus lichen iform is
Bacillus halodurans
Thermus thermophilus

Escherichia coll

Bacillus subtilis

Khóa luận tốt nghiệp

Trang 9


SVTH; Nguyền Hoài Thu
1.1.6 ủng dụng cứa laccase
Phương pháp oxy hóa sinh học nhờ enzyme được xem là phương pháp khá
thi có thế thay thế các phương pháp oxy hóa hóa học do chúng rất thân thiện với

mơi trường, có tính đặc hiệu và hiệu suất cao. Laccase là một trong các enzyme oxy
hóa được ứng dụng khá phố biến trong các ngành cơng nghiệp do chúng có phố cơ

chất rộng và sứ dụng chất nhận điện tử cuối cùng là oxy phân từ chứ không cần các
chất nhận điện tứ đắt tiền khác như NAD(P)+. Laccase được ứng dụng trong các
lĩnh vực sau :

-

Laccase được sữ dụng trong một số ngành công nghiệp giấy để phân húy

lignin trong bột gỗ; tay trang trong công nghiệp dệt nhuộm; xứ lý các hợp
chất polyphenol và loại bó oxy khơng mong muốn trong một số ngành cơng

nghiệp thực phẩm; hóa mỹ phẩm, dược phẩm v.v. ;
-

Laccase có tiềm năng cao trong cơng nghệ nano sinh học đề tạo các
biosensor có độ nhạy cao ;

-

Thự viên Viện f)ại học Mơ Hà Nội

Laccase tham gia xúc tác chuyển hóa phân húy các chất độc, đặc biệt là các

chất có cấu trúc phức tạp, khơng tan như hợp chất (poly) phenol, chất ô

nhiễm chứa phenol và các dẫn xuất clo của phenol khác như các hợp chất

PAH, PCB từ ngành cơng nghiệp dầu mị, thuốc no TNTtrong ngành khai
khoáng, quân sự, thuốc trừ sâu DDT. HCH, thuốc diệt cị (2,4-D. 2,4,5-T)

v.v. dùng trong nơng nghiệp! 17] ;
-

Trong công nghiệp thực phẩm: sữ dụng trong quá trình ồn định hàm lượng

acid, điều chinh các hợp chat phenol trong sản xuất rượu, tăng tuổi thọ bia,
đuổi oxy ra khói dầu ăn. làm tăng hương vị và tuồi thọ của dầu ;

-

Trong y dược: laccase được sử dụng trong quá trình tổng hợp các loại thuốc

phức tạp trong y tế như thuốc mê. thuốc chống viêm, thuốc kháng sinh,

thuốc an thần v.v. [21; 25; 26] ;

Khóa luận tốt nghiệp

Trang 10


SVTH: Nguyền Hồi Thu

1.2

TƠNG QUAN VÈ NẤM SỢI

1.2.1 Nấm sọi

Nấm sợi (filamentous fungi) thuộc nhóm vi nấm, có kích thước hiền vi.
Chúng là một hệ sợi phức tạp, đa bào, có màu sắc phong phú. Nấm sợi có cấu tạo cơ

quan sinh sán với nhiều hình thức sinh sán khác nhau. Đây là một trong những tiêu
chuẩn chủ yếu để phân loại chúng [3; 4],
Nhiều tác già đã đưa ra những hệ thống phân loại khác nhau. Mồi hệ thống

đều có ưu, nhược điếm nhất định. Nhưng đều theo hai hệ thống phân loại chung.

Hệ thống phân loại hình thái: dựa vào đặc điếm hình thái, ni cấy, một số đặc điểm
sinh lý, sinh hoá và phương thức sinh sản. Hệ thống phân loại dựa trên các phương
pháp sinh hoá và sinh học phân từ dược sử dụng rất ít. Khoá phân loại phổ biến hiện

nay thường dùng là khoá phân loại hình thái cùa Robert A. Samson (1984) [38].
1.2.2 Khả năng sinh laccase cùa nấm sợi

Nấm sợi là một trong nhóm vs V eo khã năng sinh nhiều loại enzym có hoạt
tính sinh học cao. Nấm sợi là nhóm vsv có tiềm năng lớn sinh các loại như: Ligno­

cellulose, protease, amylase, kitinase, pectinase, oxygenase, laccase v.v. |5]. Trong

đó, laccase đã và đang được các nhà khoa học trên thế giới đặc biệt quan tâm. Với

nhiều phương pháp khác nhau, một số nhà khoa học đã tìm ra các chúng nam sợi
sinh laccase như: Aspergillus sp. FNA1, Myrothecium sp. FNBLal, Trichoderma

harzianum WL1, M. verrucaria 24G-4, M.melanosporum, M.verrucaria NF-05, v.v.
[1;7;36; 44; 48; 50]

1.3

THUỐC NHUỘM

1.3.1 Khái niệm thuốc nhuộm

Thuốc nhuộm là những chất hữu cơ có màu, hấp thự mạnh một phan nhất

dịnh của quang phố ánh sáng nhìn thay và có khã năng gan kết vào các vật liệu dệt.
Thuốc nhuộm có thể có nguồn gốc thiên nhiên hoặc tống hợp. Hiện nay, chúng ta

hầu như chỉ sừ dụng thuốc nhuộm tống hợp. Đặc điềm nơi bật của thuốc nhuộm là

Khóa luận tốt nghiệp

Trang 11


SVTH: Nguyen Hồi Thu
độ ben màu- tính chat khơng bị phân húy bởi các điều kiện, tác động khác nhau của
môi trường, đây vừa là yêu cầu với thuốc nhuộm lại vừa là vấn đề với xử lý nước

thài dệt nhuộm. Màu sắc của thuốc nhuộm có được là do cấu trúc hóa học cùa nó.
Phân tử thuốc nhuộm bao gồm các nhóm mang màu và nhóm trợ màu.

Thuốc nhuộm tồng hợp rất đa dạng về thành phần hóa học, màu sắc, phạm vi
sứ dụng. Dưới đâylà cách phân loại dựa trên cấu tạo cùa nhóm mang màu, theo đó

thuốc nhuộm được phân thành 20-30 họ thuốc nhuộm khác nhau. Các họ thuốc
nhuộm chính bao gồm:

• Thuốc nhuộm azo: nhóm mang màu là nhóm azo (-N=N-), phân từ

thuốc nhuộm có một (monoazo) hay nhiều nhóm azo (diazo, triazo, polyazo). Đây
là họ thuốc nhuộm quan trọng nhất và có số lượng lớn nhất, chiếm khoáng 60-70%

số lượng các thuốc nhuộm tổng hợp. chiếm 2/3 các màu hữu cơ trong Color Index.

c.l. Acid Red 138

• Thuốc nhuộm anthraquinone: trong phân tứ thuốc nhuộm chứa một

hay nhiều nhóm anthraquinon hoặc các dẫn xuất của nó. Họ thuốc nhuộm này

chiếm đến 15% số lượng thuốc nhuộm tổng hợp. Đây là họ phổ biến thứ 2 sau thuốc

nhuộm azo trong số các loại thuốc nhuộm tổng hợp.

Khóa luận tốt nghiệp

Trang 12


SVTH: Nguyễn Hồi Thu

• Thuốc nhuộm triaryl metan: triaryl metan là dẫn xuất của metan mà
trong đó nguyên tử c trung tâm sẽ tham gia liên kết vào mạch liên kết cùa hệ mang
màu. Họ thuốc nhuộm này phố biến thứ 3, chiếm 3% tổng số lượng thuốc nhuộm.

diaryl metan

triaryl metan

• Thuốc nhuộm phtaloxianin: hệ mang màu trong phân tứ cùa chúng là
hệ liên hợp khép kín. Đặc diem chung của họ thuốc nhuộm này là những nguyên tử
H trong nhóm imin dễ dàng bị thay thế bởi ion kim loại còn các nguyên tứ N khác

tham gia tạo phức với kim loại làm màu sac của thuốc nhuộm thay đổi. Họ thuốc
nhuộm này có độ bền màu với ánh sáng rất cao, chiếm khoảng 2% tồng số lượng
thuốc nhuộm.

Ngoài ra, cịn các họ thuốc nhuộm khác ít phổ biến, ít có quan trọng hơn

như: thuốc nhuộm nitrozo, nitro, polymetyl, arylamin, azometyn, thuốc nhuộm lưu

huỳnh...

Khóa luận tốt nghiệp

Trang 13


SVTH: Nguyen Hoài Thu
Bảng 1.2.Một số loại thuốc nhuộm đại diện

Màu

Nhóm

c.l

Ký

hiệu

Trọng lượng

Độ hịa

phân tứ

tan

^inax
(nin)

(g/mol)

(g/1)

Axit xanh 62

62045

NY3

400,5

40

595

Axit xanh 281

-

NY5

580,6

20

600

61200

RBBR

626,5

-

595

Axit đỏ 299

-

NY1

519,6

10

520

Axil đơ 266

17101

NY7

467,8

15

499

-

NY8

474,5

4

440

Anthraquinone

Remazol

Brilliant Blue
R

Azo

Axit da cam

116

1.3.2 Ơ nhiễm nu'ó'c thải dệt nhuộm và tác hại ơ nhiễm của nó

1.3.2.1 Ơ nhiễm nước thái dệt nhuộm do thuốc nhuộm

Ô nhiễm nước thài dệt nhuộm phụ thuộc vào các hóa chất, chất trợ, thuốc
nhuộm và cơng nghệ sứ dụng. Trong đó ơ nhiễm do thuốc nhuộm trờ thành vấn đề
chủ yếu đối với nước thải dệt nhuộm. Thuốc nhuộm sử dụng hiện nay là các sản
phẩm tổng hợp hữu cơ. Nồng độ thuốc nhuộm trong môi trường nước tiếp nhận đối

với công đoạn dệt-nhuộm phụ thuộc vào một so yeu tố: mức độ sử dụng hàng ngày

cùa thuốc nhuộm.độ gắn màu cúa thuốc nhuộm lên vật liệu dệt, mức độ xử lý trong
các cơng đoạn xứ lý nước thái, hệ số pha lỗng trong nguồn nước tiếp nhận.

Mức độ gắn màu là một yếu tố quan trọng, nó phụ thuộc vào độ đậm màu,
công nghệ áp dụng, tỷ lệ khối lượng hàng nhuộm và dung dịch nước dùng trong

máy nhuộm, vật liệu và thuốc nhuộm sứ dụng. Tồn thất thuốc nhuộm đưa vào nước
trung bình là 10% với màu đậm, 2% với màu trung bình và <2% với màu nhạt.

Khóa luận tốt nghiệp

Trang 14


SVTH: Nguyền Hồi Thu

1.3.2.2 Tác hại cửa ơ nhiễm

Họ thuốc nhuộm azo và các sán phấm phân hùy thứ cấp có vịng thơm mang
nhóm amine[8] độc và gây đột biến đối với các cơ thề sống.
Các thuốc nhuộm hữu cơ nói chung được xếp loại từ ít độc đen khơng độc

đối với con người được đặc trưng bằng chi số LD50. Các kiềm tra về tính kích thích

da, mắt cho thây đa sơ thc nhuộm khơng gây kích thích với vật thừ nghiệm (thở)

ngoại trừ một số cho kích thích nhẹ.
Tác hại gây ung thư và nghi ngờ gây ung thư: khơng có loại thuốc nhuộm
nào nằm trong nhóm gâyung thư cho người. Các thuốc nhuộm azo được sử dụng

nhiều nhất trong ngành dệt, tuy nhiên chì có một số màu azo, chú yếu là thuốc

nhuộm benzidin, có tác hại gây ung thư. Các nhà sàn xuất châu Âu dã ngừng sản
xuất loại này, nhưng trên thực tế chúng vẫn được tìm thấy trên thị trường do giá

thành ré và hiệu quá nhuộm màu cao.
Mức độ độc hại với cá và các loài thúy sinh: các thử nghiệm trên cá của hơn

,

1‘ỉiír viện víẹn ỵạỉ nọệ MQ Ha jNOi

,

3000 thuốc nhuộm được sử dụng thông thường cho thấy thuốc nhuộm nằm trong tất
câ các nhóm từ khơng dộc, dộc vừa, độc, rất độc đen cực dộc. Trong đó có khoảng

37% thuốc nhuộm gây độc vừa đến độc cho cá và thúy sinh, chi 2% thuốc nhuộm ở
mức độ rất dộc và cực độc cho cá và thúy sinh.
Khi đi vào nguồn nước nhận như sông, ho, v.v. với một nồng độ rất nhó

thuốc nhuộm đã cho cám nhận về màu sắc. Thuốc nhuộm hoạt tính sử dụng càng
nhiều thì màu nước thài càng đậm. Màu đậm cùa nước thải cản trở sự hấp thụ oxy
và ánh sáng mặt trời, gây bất lợi cho sự hô hấp. sinh trướng cùa các lồi thúy sinh

vật. Nó tác động xấu đến khà năng phân giãi của vi sinh đối với các chất hữu cơ
trong nước thải. Các nghiên cứu cho thấy khá năng phân giãi trực tiếp thuốc nhuộm
hoạt lính bàng vi sinh rất thấp. Ở Việt Nam. qua số liệu điều tra tại các công ty dệt

may lớn đều cho thấy màu nước thài dệt nhuộm chú yếu do thuốc nhuộm hoạt tính

và một phần do các loại thuốc nhuộm khơng tan hết khác gây ra.

Khóa luận tốt nghiệp

Trang 15


SVTH: Nguyền Hoài Thu
1.3.3 Khả năng xử lý thuốc nhuộm bằng phương pháp sinh học
Ở nước la hiện nay, phương pháp xử lý nước thải dệt nhuộm được áp dụng

phố biến chủ yếu theo 3 phương pháp: phương pháp hóa lý ( keo tụ- tạo bông, hấp
thụ và lọc), phương pháp oxy hóa bậc cao (sứ dụng các chất oxy hóa như chloride

(Cb), hydroxyl peroxide (H2O2) và ozone (O3)) và phương pháp sinh học. Trong đó,
xử lý sinh học nước thài dệt nhuộm bằng bùn hoạt tính hiếu khí và kỵ khí cho hiệu
quả cao.

Cơ che loại màu gồm: hấp phụ sinh học, phân húy bang enzyme, keo tụ tạo
bông sinh học hoặc kết hợp cà ba [49]. Hiệu quà loại màu phụ thuộc vào lớp thuốc

nhuộm cũng như các nhóm the khác nhau của mồi loại thuốc nhuộm và các đặc tính
hóa lý của nước thài, chẳng hạn như nguồn carbon, nitơ, pH, nhiệt độ, hàm lượng

muối và sự hiện diện của các chất ô nhiễm hữu cơ.

Dưới điều kiện phù hợp, thuốc nhuộm có thế bị chuyến hóa. phân húy bời
các enzyme reductase nội bào và ngoại bào. Các enzyme reductase nội bào xúc tác

cho phan ứng phân húy thuốc nhuộm khi có sự hiện diện cáccờíactor như FADH2,
NADH, NADPH[12]. Hầu hết các loại thuốc nhuộm azo có nhóm the sulfonate và

trọng lượng phân từ cao khơng thê đi qua màng tê bào. Do đó, các hoạt dộng khừ
thuốc nhuộm azo không phụ thuộc nhiều vào sự hấp thu nội bào. Sự oxy hóa thuốc

nhuộm được xúc tác bời các enzyme ngoại bào là peroxidase và phenoloxidase như
laccase (Lac), manganese peroxidase (MnP), lignin peroxidase (LiP), tyrosinase

(Tyr). N-demethylase và cellobiose dehydrogenase [211.

Khóa luận tốt nghiệp

Trang 16