Xác định đột biến trên gen KRAS ở bệnh nhân ung thư trực tràng tại việt nam

VIỆN ĐẠI HỌC Mơ HÀ NỘI

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
-scíGSca---------

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐÈ TÀI:

XÁC ĐỊNH ĐỘT BIÉN TRÊN GEN KRAS
Ỏ BỆNH NHÂN UNG THU ĐẠI TRỤC TRÀNG TẠI VIỆT NAM

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội
Giáo viên hưóng dẫn
Sinh viên thực hiện

Lóp

: TS. NGUN HUY HỒNG
: NGHIÊM THỊ BÍCH HẠNH
:ll-04, CNSH

HÀ NỘI, 5 - 2015


LỊĨ CÁM ƠN
Lời đầu tiên tơi xin bày tó lịng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyền Huy Hồng

- Phó Viện trưởng, Trường phòng Hệ gen học chức năng, Viện Nghiên cứu hệ gen.
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - Người thầy đã tận tình hướng

dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn cho tơi trong

suốt q trình thực hiện nghiên cứu và hồn thành bài khóa luận này.

Tơi cũng xin gứi lời cám ơn dặc biệt đến TS. Nguyền Thị Kim Liên - Phó
phịng Hệ gen học chức năng đã luôn theo sát giúp đỡ và chi bào cho tơi trong suốt
q trình tiến hành thí nghiệm. Qua đây tôi cũng rất biết ơn tất cá các cô, các anh.

chị trong phịng đã dạy báo tơi rất nhiều điều trong thời gian thực tập tại phịng.
Tơi cùng chân thành cám ơn các thầy cô giáo giảng dạy tại Khoa Công

nghệ Sinh học, Viện Dại học Mớ Hà Nội đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý

báu và bố ích trong suốt 4 năm học vừa qua.

Cuối cùng tôi xin gửi lời tri ân tới bố mẹ, những người thân trong gia đình

và bạn bè xung quanh đã chia sẻ những khó khăn thử thách trong cuộc sống và cơng
việc đế tơi có đượclkếtquẳệỉiỳ?'. 1ỌD

Đại học Mơ 1 ỉíl Nọi

Tơi xin chân thành cám ơn!

Hà Nội. ngày 22 tháng 5 năm 2015
Sinh viên

Nghiêm Thị Bích Hạnh

Nghiêm Thị Bích Hạnh

Lóp 11-04

MỤC LỤC
LỜI CÁM ƠN................................................................................................................ i

MỰC LỤC.................................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIÉT TẰT............................................................................. iv
DANH MỤC BANG BIÊU......................................................................................... vi
DANH MỤC HÌNH................................................................................................... vii

MỚ ĐÀU....................................................................................................................... 1
1.1

.Ung thư đại trực tràng........................................................................................ 4

1.1.1

. Khái niệm ung thư......................................................................................... 4

1.1.3.

Các nguyên nhân và yếu tố nguy cơ dẫn đến ung thư đại trực tràng........... 5

1.1.4.

Chẩn đoán và diều trị ung thư đại trực tràng.................................................6

1. 1.4.1. Chấn đoán bằng lâm sàng và sinh hóa........................................................... 6
1.1.4.2.

Chẩn đốn bằng phương pháp sinh học phân tử....................................... 7

1.1.4.3.

Diều trị bệnh ung thư đại trực tràng........................................................... 7

1.
1.2.

1.5.2. Tinh hình ung thư ứạị.trựcỉ ịrànOnýịệt Waịựtó'..Ị.Ul-NợÌ..................... 9

Gen KRAS......................................................................................................... 9

1.2.1.

Cấu trúc gen KRAS...................................................................................... 9

1.2.2.

Chức năng, vai trò của gen KRAS trong việc đáp ứng điều trị với liệu pháp

phân từ đích.................................................................................................................11

1.2.3.

Tinh hình nghiên cứu về đột biến trên gen KRAS ờ bệnh nhân ung thư đại trực

tràng trên thế giới và tại Việt Nam.............................................................................. 12

PHÂN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu.................................. 14

2.1

.Vật liệu và hóa chất.......................................................................................... 14

2.1.1.

Vật liệu...........................................................................................................14

2.1.2.

Hóachất.......................................................................................................... 14

2.1.3.

2.2

Thiết bị...........................................................................................................15
. Phương pháp nghiên cứu................................................................................ 16

2.2.1.

Tách chiết DNAtổng số................................................................................ 16

2.2.2.

Điện di DNAtrên gel agarose........................................................................ 18

2.2.3.

Đo quang phổ DN A...................................................................................... 19

Nghiêm Thị Bích Hạnh

Lớp 11-04


2.2.4.1.
2.2.4.2.

Nguyên lí kỹ thuật PCR............................................................................ 20

Nhân đoạn gen KRAS bàng kỹ thuật PCR................................................21

2.2.5.

Tinh sạch sản phẩm PCR............................................................................. 22

2.2.6.

Giãi và phân tích trình tự gen KRAS............................................................ 23

PHÀN III: KẾT QUẢ VÀ THÀO LUẬN.................................................................. 25
3.1.

Thu thập mẫu máu........................................................................................... 25

3.2.

Tách chiết DNA tống số.................................................................................. 25

3.3.

Xác định nồng độ và độ tinh sạch mẫu DNA................................................. 26

3.4.

Phản ứng PCR nhân gen..................................................................................27

3.5.

Thôi gel tinh sạch sàn phẩm PCR................................................................... 28

PHÀN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................ 35

4.1.

Kết luận............................................................................................................ 35

4.2.

Kiến nghị.......................................................................................................... 36

Thư viện Viện Đại học Mơ Hà Nội

Nghiêm Thị Bích Hạnh

iii

Lớp 11-04

DANH MỤC CÁC TÙ VIÉT TÁT

aa

Amino acid

bp

Base pairs

DNA

Axit deoxyribonucleic

CRC

Colorectal cancer

cDNA

Complementary' DNA

dNTP

Deoxynucleotit triphosphat

ddNTP

Dideoxynucleotide

EGFR

Epidermal growth factor receptor

E.coli

Escherichia coil

EtBr

Ethidium Bromide

EMEA

Europe, the Middle East and Africa

G

Guanine

GDP

Guanosine-5-Diphosphate

GTP

Thư

Kb

Hà Nội
Kilơ bazơ

kDa

Kilơ Dalton

M

Marker

PCR

Polymerase chain reaction

Taq

Thermus aquaticus

Tm

Nhiệt độ nóng cháy

uv

Ultraviolet

WHO

World health oganization

PFS

Progression free survival

KRAS

Kirsten - ras/v - ki - ras 2 kirsten rat

sarcomaviral oncogene homolog
OD

Nghiêm Thị Bích Hạnh

Optical Density

iv

Lớp 11-04


Kí hiệu viết tắt các axit amin

A

Ala

Alanine

D

Asp

Axit aspartic

c

Cys

Cysteine

G

Gly

Glycine

K

Lys

Lysine

M

Met

Methionine

T

Thr

Threonine

V

Vai

Valine

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

Nghiêm Thị Bích Hạnh

Lớp 11-04


DANH MỤC BẢNG BIÊU

Băng 1: Trình tự 3 cặp mồi dùng cho PCR................................................................. 14
Bâng 2: Thành phần phân ứng.................................................................................... 21
Bảng 3: Ket quà đo quang phổ mẫu DNA tổng số..................................................... 26

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

Nghiêm Thị Bích Hạnh

vi

Lớp 11-04


DANH MỤC HÌNH

Hìnhl. Cấu trúc cúa ruột già......................................................................................... 5

Hình 2. VỊ trí gen K-RAS trên nhiễm sắc thể 12........................................................ 10
Hình 3. Mơ hình protein KRAS với các vùng quan trọng được đánh dấu............... 11
Hình 4. Sơ đồ phương pháp nghiên cứu........................................................................... 16

Hình 5. Các bước tách chiết DNA cơ bàn.................................................................. 17

Hình 6. Điện di kiểm tra DNA tổng số trên gel agarose 0.8%.................................. 25
Hình 7. DNA nhân bới cặp mồi KRlcó kích thước 445bp....................................... 27

Hình 8. DNA nhân bời cặp mồi KR2 có kích thước 297bp...................................... 28
Hình 9. DNA nhân bời cặp mồi KR3 có kích thước 375bp...................................... 28
Hình 10. Đột biến dị hợp tứ M67V ờ bệnh nhân KR10. 11, 12, 14.15. 17...............29
Hình 11. Đột biến dị hợp tữ V103D ở bệnh nhân KR7............................................. 30
Hình 12. Đột biến dị hợp tứ M111K ờ bệnh nhân KR7, 9......................................... 30

Hình 13. Anh hirưng cua các dột biến lên cấu trúc 3D cua phântứ protein KRAS. A:
cấu trúc bình thường cùa protein KRAS tại vị trí 67; B: cấu trúc của protein KRAS
khi bị đột biến tại vị trí M67V.................................................................................... 32

Hình 14. Anh hường của các đột biến lên cấu trúc 3D cùa phân từ protein KRAS. A:
Cấu trúc bình thường của protein KRAS tại vị trí 103; B: cấu trúc cúa protein

KRAS khi bị đột biến tại vị trí V103D....................................................................... 32
Hình 15. Anh hướng của các đột biến lên cấu trúc 3D cùa phân tử protein KRAS. A:
Cấu trúc bình thường cùa protein KRAS tại vị trí 111; B: cấu trúc cùa protein
KRAS khi bị đột biến tại vị trí M111K...................................................................... 33

Nghiêm Thị Bích Hạnh

vii

Lớp 11-04


MỞ ĐẦU
Theo báo cáo thường niên cùa Viện nghiên cứu ung thư Hoa Kỳ. hàng năm thế
giới có thêm khoảng 12 triệu ca ung thư mới và khoáng 7,6 triệu ca tử vong, tức
trung bình mồi ngày có hơn 200 nghìn bệnh nhân ung thư tử vong. Riêng khu vực

Đơng và Đơng Nam Á, trong đó có Việt Nam hàng năm có thêm khoảng 3,6 triệu ca

ung thư mới với khoảng 2,5 triệu bệnh nhân từ vong [34],
Ung thư đại trực tràng (Colorectal cancer - CRC) là loại ung thư hay gặp đứng

hàng thứ 2 ờ nữ và hàng thứ 3 ở nam giới trên thế giới [17], Đây là nguyên nhân
gây tứ vong dứng hàng thứ 4 sau ung thư phôi, ung thư dạ dày và ung thư gan trên

thế giới [25], Là một trong những ung thư đường tiêu hóa có tiên lượng tốt. Tuy
nhiên, nếu dược phát hiện muộn thì cũng giống như tất cã các loại ung thư khác,
khả năng điều trị ít hiệu quả. Vì vậy, cần phát hiện khi ung thư còn ở giai đoạn sớm
hoặc các tồn thương tiền ung thư [29],
Theo WHO (năm 2008), mỗi năm có khống 7,6 triệu người chết vì ung thư

trên tồn thế giới, ựong đó có. khống 70%i các.e.a tự vong xạy, ra ờ các nước có thu

nhập thấp và trung bình, trong đó có khoảng 30% các ca ung thư có the được ngăn

chặn.
Một trong những đặc điếm nồi bật của ung thư đại trực tràng là có sự biểu hiện
cao cúa thụ thế tăng trưởng biếu bì (Epidermal Growth Factor Receptor - EGFR).

Nghiên cứu cho thấy việc điều hịa q trình truyền tín hiệu từ thụ thế EGFR tới
nhân tế bào có sự tham gia rất tích cực cúa một nhóm protein mang hoạt tính

GTPase nối bật là KRAS. Nghiên cứu dịch tễ học cho thấy có khống 25 - 40%

bệnh nhân ung thư đại trực tràng mang đột biến gen KRAS. Đồng thời các thứ

nghiệm lâm sàng đã khắng định cetuximab và panitumumab (những thuốc được chi
dịnh điều trị ung thư dại trực tràng hiện nay) chi thật sự có tác dụng kéo dài thời
gian sống và thời gian sống không bệnh cho các bệnh nhân khơng mang đột biến

gen KRAS. Điều này có nghĩa việc chẩn đoán đột biến gen KRAS là điều bắt buộc

trước khi cân nhắc chi định các phác đo điều trị đích sử dụng thuốc ức chế EGFR
(cetuximab và panitumumab) cho bệnh nhân ung thư đại trực tràng [35].

Nghiêm Thị Bích Hạnh

1

Lóp 11-04

Những năm gần đây với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tứ, các bệnh
nhân ung thư ngoài việc được chữa trị bằng các phương pháp điều trị truyền thống

như phẫu thuật, hóa trị. xạ trị... họ cịn được hướng dần điều trị theo một liệu pháp
mới hiệu q hơn, ít độc hại hơn, đó là “ liệu pháp phân tử đích”. Liệu pháp mới
cho thấy có nhiều ưu diem, đặc biệt khi bệnh nhân điều trị bàng hóa học thất bại,

liệu pháp mới này tác dụng phụ ít, khi sư dụng kết hợp liệu pháp mới với phương
pháp hóa học sẽ giúp kéo dài sự sổng hơn cho bệnh nhân.

KRAS là một proto - oncogene liên quan đến nhiều loại bệnh ung thư. KRAS

mã hóa cho một GTPase nhỏ gồm 188 hoặc 189 aa, tham gia vào q trình truyền
tín hiệu nội bào. KRAS nam trong con đường truyền tín hiệu của EGFR. Protein

KRAS hoạt động như một cơng tắc phân từ trong con đường truyền tín hiệu nội bào
trong đó quy định các chức nàng quan trọng cho sự tiến triền của tế bào, bao gồm cà

sự biệt hóa, sự phát triển và chết theo chu trình. Các đột biến trên gen KRAS dẫn

đến hoạt động GTPase cùa protein KRAS bị suy giàm. GTP không bị cắt thành
GDP, khi đó hoạt động truyền tín hiệu của protein KRAS sẽ diễn ra liên tục mà

không cần tới sự có mặt cacjcicih thích qua^ đựờpg tniyen tín hiệu EGFR/HER [27].
Đột biến gen KRAS xuất hiện sớm trong ung thư đại trực tràng và chiếm khoảng 30

- 40% [3]. Vì vậy, bệnh nhân có đột biến gen KRAS có phán ứng kém khi điều trị
với các thuốc ức chc EGFR. Đột bicn gen KRAS thường xuyên nhất ở các codon 12,

13, 61 và 146 [6], Các phương pháp xác định đột biến hiện nay chủ yếu là sinh học
phân tử như: tiến hành khuếch đại đoạn gen mong muốn nhờ những mồi đặc hiệu,
đọc trình tự các đoạn được nhân lên và tìm đột biến.
Trong nghiên cứu cùa đề tài này, với mong muốn hướng tới áp dụng liệu pháp
điều trị đích cho bệnh nhân ung thư đại trực tràng trên người bệnh ờ Việt Nam.

trước hết nghiên cứu cần tìm hiểu về đột biến trên gen KRAS, vùng đột biến thường

xuyên xuất hiện, kiều dột biến, các phương pháp kỳ thuật được áp dụng dể tìm đột

biến, đề từ đó bác sĩ có thề đưa ra phác đồ điều trị thích hợp cho từng bệnh nhân cụ
the giúp giàm thời gian và chi phí điều trị cho bệnh nhân.

Xuất phát từ vấn đề trên, khóa luận: “Xác định đột biến trên gen KRAS ờ bệnh
nhân ung thư đại trực tràng tại Việt Nam" được tiến hành với nội dung nghiên cứu

bao gơm:

Nghiêm Thị Bích Hạnh

2

Lớp 11-04


-

Thu thập mẫu máu của bệnh nhân bị ung thư đại trực tràng.

-

Tách chiết và bão quán DNA tổng số.

-

Xác định đột biến trên gen KRAS bang kỹ thuật PCR và giải trình tự gcn.

-

So sánh và phân tích những thay đoi nucleotide và thay đối amino acid trên

KRAS.
>

Mục tiêu cùa đề tài: Phát hiện những đột biến trên gen KRAS ờ bệnh nhân

ung thư đại trực tràng.
>

Ý nghĩa của đe tài: Ket quà nghiên cứu ở mức độ gen ở bệnh nhân mac ung

thư đại trực tràng sẽ giúp các bác sĩ đưa ra hướng điều trị đúng đắn cũng như tư vấn

di truyền cho bệnh nhân.

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

Nghiêm Thị Bích Hạnh

3

Lớp 11-04


Phần I: TỐNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Ung thư đại trực tràng
1.1.1. Khái niệm ung thư

Theo định nghĩa cùa WHO: Ung thư là một thuật ngừ chung cho một nhóm
lớn các bệnh có thế ánh hướng đến bất kỳ phần nào cùa cơ thế. Các tế bào phân chia

và phát triền khơng kiếm sốt được, hình thành các khối u ác tính và xâm nhập vào
các bộ phận ớ gần hoặc xa cơ thế thông qua hệ thống bạch huyết hoặc máu cùa cơ
thế gọi là di căn. Di căn là nguyên nhân chính gây ung thư.

Ung thư phát sinh từ một tế bào đơn lé. Việc chuyển đồi từ một tế bào bình
thường thành tế bào khối u là một quá trình nhiều giai đoạn, thường là một sự tiến

triển từ một tôn thương tiên ung thư đen các khôi u ác tính. Những thay dơi này là
kết quả cùa sự tương tác giữa các yếu tố di truyền cùa người và các tác nhân bên

ngoài, bao gồm:
Tác nhân vật lý, như bức xạ tử ngoại và bức xạ ion hóa.
Tác nhân hóa học, như amiang, các thành phần cùa khói thuốc lá, aflatoxi
(chất gây ơ nhiễm thực phẩm) vằ thạch ữn-6nột chắt-gầy-ơ Àhìỉtónước uống).
Tác nhân sinh học, như nhiễm trùng virut. vi khuấn hoặc ký sinh trùng.
Cũng theo WHO. ung thư là nguyên nhân hàng đầu trên thế giới dần den tứ

vong và chiếm 7,6 triệu ca từ vong (khoảng 13% trong tất cà các ca tử vong) năm

2008, các loại ung thư chính là:

-

Phổi (1.370.000 trường hợp tứ vong)

-

Dạ dày (736.000 trường hợp tử vong)

-

Gan (695.000 trường hợp tử vong )

-

Đại trực tràng (608.000 trường hợp tử vong)

-

Vú (458.000 trường hợp tử vong)

-

Cổ tứ cung (275.000 trường hợp tư vong)

Khoảng 70% cũa tất cả các ca từ vong do ung thư xáy ra ở các nước có thu
nhập thấp và trung bình. Trường hợp tử vong từ bệnh ung thư trên tồn the giới

được WHO dự đốn sẽ tiếp tục tăng lên hơn 13,1 triệu vào năm 2030.

Nghiêm Thị Bích Hạnh

4

Lớp 11-04


1.1.2. Khái niệm ung thư đại trực tràng
Ung thư đại trực tràng là ung thư phát khới nguyên thúy từ các mô đại
tràng (phần dài nhất cùa ruột già) hoặc trực tràng (vài cm cuối cùng cùa ruột già

trước hậu mơn).
Ung thư đại trực tràng có thể gặp ớ bất cứ vị trí nào của đại tràng: trực tràng,
đại tràng sigma (đại tràng chậu hông), đại tràng xuống, đại tràng ngang, đại tràng

lên và manh tràng. Khoảng 42% ung thư nằm tại vị trí đại tràng phái bao gồm:

manh tràng, đại tràng lên. đại tràng ngang, gần 60% ung thư nam tại đại tràng trái
bao gồm: đại tràng xuống, đại tràng sigma và trực tràng [28].
Đai trang ngang

Đại tráng

trang xuống

Manh tráng

Đai tráng
chău hơng

True

Hìnhl. Cấu trúc của ruột già.

Những khối u lành tính được gọi là polyp, khối u ác tính được gọi là ung thư
đại trực tràng. Những khối u polyp lành tính khơng thế xâm lấn vào những mơ lân

cận và không thế lan tràn đen những cơ quan khác trong cơ thế. Những polyp này
thường có the cat bó dễ dàng trong tiến trình nội soi đại trực tràng và không nguy
hại đến đời sống bệnh nhân. Neu polyp khơng được cắt bó. nó có thể trở thành ác

tính (ung thư hóa polyp) một thời gian sau đó. Ung thư đại trực tràng có thế xâm lấn

và gây tốn hại mô và cơ quan lân cận. Ung thư cũng có thê lan tràn đến các cơ quan

khác trong cơ thề như phổi hay gan.
1.1.3. Các nguyên nhân và yếu tố nguy cơ dẫn đến ung thư đại trực

tràng
Cho tới nay. cũng giống như nhiều loại ung thư khác người ta cũng chưa biết

Nghiêm Thị Bích Hạnh

5

Lớp 11-04


được nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng. Trên 75-95% ung thư đại trực tràng

xuất hiện ớ những người khơng có liên quan tới yếu tố về gen [241. [7],

-

Các polip đại trực tràng: Phần lớn ung thư đại trực tràng xuất hiện từ các

polyp ung thư hóa. Polyp tuyến là loại hay ung thư hóa khi mà kích thước >lcm.
- Viêm loét đại tràng hoặc bệnh Crohn: Người đã bị một bệnh lý gây ra viêm

đại tràng (như viêm loét đại tràng hoặc bệnh Crohn) trong nhiều năm sẽ có nguy cơ
tăng cao [30],

-

Tiền sử gia đình có người mẳc bệnh: Những người có bố mẹ và anh chị em

ruột bị ung thư dại trực tràng thì khít năng người đó bị ung thư dại trực tràng cao

gấp 2-3 lần so với người khơng có tiền sử gia đình bị ung thư đại trực tràng.
-

Tiền sừ cá nhân từng bị ung thư: Người đã bị ung thư đại trực tràng có thề

phát triến ung thư đại trực tràng lần thứ hai. Ngồi ra, phụ nừ có tiến sử ung thư

buồng trứng, tử cung (nội mạc tứ cung) hoặc ung thư vú có nguy cơ cao hơn bị ung

thư đại trực tràng [30].
-

Giới tính: Nam giới hay bị hơn nữ giới, người lớn tuồi hay bị hơn so với

người trétuổi [7], Thư

viện Viện Đại học Mở Hà Nội

- Tuồi: Ưng thư đại trực tràng tăng dần theo tuồi.Tại Hoa Kỳ, chi khoảng
0,1% ung thư đại trực tràng được chấn đoán ờ tuổi 20; 1,1% ờ tuổi 20-34; 4% ờ tuổi
35-44%; 13,4% ở tuổi 45-54; 20,4% ớ tuồi 55-64; 24% ờ tuổi 65-74; 25% ở tuồi 75-

84 và 25% ớ tuối 85. Như vậy 94,9% ung thư đại trực tràng được chấn đoán ở tuối

>45.

- Các yếu tố lối sống: Chế độ ăn nhiều chất béo, ăn nhiều thịt đõ, uống

nhiều rượu, béo phì. hút thuốc lá, ít vận động thể lực [7]. Khoảng 10% số trường
hợp ung thư đại trực tràng liên quan tới ít vận động. Nguy cơ ung thư đại trực tràng
tăng lên khi một ngày uống trên 2 đơn vị cồn với nam và 1 đơn vị cồn với nữ (theo

tiêu chuan 1 đơn vị cồn của Hoa Kỳ tương đương 14g ethnol. bang khoáng 300ml
bia 5 độ và khoảng 120ml rượu vàng 12 độ). Ăn nhiều rau quả tươi và nhiều chất xơ

làm giãm nguy cơ ung thư đại trực tràng [24].
1.1.4. Chẩn đoán và điều trị ung thu- đại trực tràng

1.1.4.1. Chấn đoán bang lâm sàng và sinh hóa

Nghiêm Thị Bích Hạnh

6

Lớp 11-04


- Xét nghiệm máu trong phân: Đôi khi các ung thư hay các u thịt (các polip)
gây chảy máu, và xét nghiệm phân có thề phát hiện một lượng nhị máu. Nếu xét

nghiệm này cho thấy có máu. khi đó các xét nghiệm khác là cần thiết đế tìm nguồn
gốc của máu. Các tình trạng lành tính (như bệnh trì), cũng có thế gây ra máu trong

xét nghiệm này.
- Sự bơm thụt bari tương phản kép: Thủ thuật này liên quan đến việc làm đầy

đại tràng và trực tràng với một chất lóng màu trắng (Bari) đe nâng chất lượng các
hình anh X-quang. Các bất thường (như các bướu thịt- polip) có thế được nhìn thấy
rõ ràng.

- Soi đại trực tràng sigma: Bác sĩ kiếm tra trực tràng và phan dưới cùa đại
tràng với một ống sáng (ống soi đại trực tràng sigma). Sự phát triển tiền ung thư và

ung thư trực tràng và phần dưới cùa đại tràng có thề được tìm thấy và hoặc được lấy
ra hoặc được sinh thiết.
- Nội soi ào đại tràng: Trong xét nghiệm này. thiết bị X-quang đặc biệt được
sử dụng đế đưa ra các hình ảnh của đại tràng và trực tràng. Một máy tính tập hợp

những hình ãnh nàỵ thành các hình ánh chi tiết jna né có thề hiển thị các bướu thịt polip và các bất thường khác [311.

1.1.4.2. Chấn đoán bằng phưong pháp sinh học phân tử

Nen tàng cùa phương pháp này là kỹ thuật PCR dùng những cặp mồi dặc hiệu
đế nhân đoạn gen mong muốn, từ đó giái trình tự tìm ra đột biến. Những đoạn gen

thường dùng để chấn đoán ung thư đại trực tràng Là KRAS, p53 và APC. Thêm vào
đó, ưu diêm của phương pháp này là phát hiện trực tiêp được cũng như kiêm tra

được khá năng mắc bệnh ngay từ bố mẹ để từ đó dự đốn khả năng mắc bệnh ờ con

cái. Trong khóa luận này, chúng tơi sè tập trung vào nghiên cứu trên gen KRAS.
1.1.4.3. Diều trị bệnh ung thư đại trực tràng
Phẫu thuật cát bó khối u vẫn là phương pháp diều trị hiện nay, bên cạnh đó các

phương pháp hóa trị. xạ trị và liệu pháp phân tử đích cũng đang trờ thành một phần
khơng thế thiếu trong diều trị ung thư đại trực tràng. Điều trị đích ung thư đại trực
tràng dựa trên sự phát hiện các đột biến gen. Những đột biến liên quan đến các gen

như KRAS, BRAF, PỈK3CA... đã được phát hiện [4], [10]. [22], Trên gcn KRAS các
đột biến thường xảy ra nhất ở các codon 12, 13, 61, và 146 xảy ra ở 25 - 40% bệnh
Nghiêm Thị Bích Hạnh

7

Lớp 11-04


nhân [5|. Hiện nay, ngày càng nhiều nhà khoa học cơng nhân rằng một số gen bị đột

biến có thể trở thành đích để phát triển các thuốc điều trị đích ung thư đại trực tràng
[10],[9],[24], Điều trị đích chong lại EGFR có cetuximab và panitumumab. Đột

biến điểm ờ codon 12, 13 cũng được xác định là gây ra đáp ứng thấp với việc điều

trị bàng cetuximab và panitumumab ờ bệnh nhân ung thư dại trực tràng [6]. Khoảng
4/10 số bệnh nhân mắc ung thư đại trực tràng có đột bien gen KRAS đã làm cho các
loại thuốc này không hiệu quã. Các bác sĩ hiện nay thường kiếm tra các đột biến này

và chi sử dụng loại thuốc này ở những người khơng có đột biến gen. Trong ung thư
có thể có rất nhiều gen đột biến và loại đột biến khác nhau. Tuy nhiên, không phái

bát kỳ đột biến nào ở các gen có liên quan đen ung thư cũng ánh hướng đến hiệu
q điều trị đích. Vì vậy, việc xác định các đột biến trên các gen có liên quan đến

ung thư là yếu tố quyết định cho điều trị đích thành cơng [36].
Liệu pháp phân từ đích là liệu pháp được sứ dụng rộng rãi trong điều trị ung

thư, dùng các loại thuốc sinh học để khóa sự tăng trường và lan tràn của ung thư.
can thiệp vào các phân tứ đặc hiệu trong cơ chế sinh ung thư và sự tăng trường của
khối u.Kháng thế: đơn tỊòng iChống EGFR ,Ịà ^y^iy^buffirbitux1M, imclone
systems) và panitumumab (Vectibix™, Amgen) đã được FDA ( cục quán lý thực
phấm và dược phấm) chấp nhận cho điều trị ung thư đại trực tràng vào năm 2004 và

2006 [ 14].

Hai tác nhân sinh học này là các kháng thế đơn dòng nhắm mục tiêu là thụ thể
yếu tố tăng trường biểu bì (epidermal growth factor receptor-EGFR). Cetuximab
(Erbitux) là một kháng thế khám đơn dòng (chimeric monoclonal antibody) đã được

phê duyệt như đơn trị liệu hoặc kết hợp với irinotecan (camptosar) ở những bệnh
nhân ung thư đại trực tràng di căn không đáp ứng với điều trị fluoropyrimidine và

oxaliplatin. Panitumumab (vectibix) là kháng thể đơn dịng hồn tồn của người
hiện nay được chi định như một dơn trị liệu cho bệnh nhân ung thư dại trực tràng

không thành công hoặc không dung nạp với hóa trị liệu kết hợp. Một thử nghiệm

gần đây của Hecht và cộng sự [32], đánh giá panitumumab phối hợp với
becvacizumab và hóa trị liệu (dựa trên oxaliplatin và irinotecan) như điều trị bước

dầu cho ung thư đại trực tràng di căn đã kết luận rằng việc bố sung panitumumab

gây tăng độc tính và giám tỷ lệ sống cịn khơng diễn tiến bệnh.

Nghiêm Thị Bích Hạnh

8

Lớp 11-04


1.1.5.1. Tinh hình ung thư đại trực tràng trên thế giói

Theo Tổ chức Y tế thế giới, trong năm 2012, trên thế giới có 1,4 triệu người
được chẩn đốn bị ung thư đại trực tràng, chiếm 9,7% tồng số các loại ung thư, là
loại ung thư phố biến thứ ba trên thế giới sau ung thư phối (1,8 triệu, 13%) và ung
thư vú (1,7 triệu, 11,9%).

Theo số liệu thống kê của Globocan 2008, ung thư đại trực tràng là bệnh ung
thư phổ biến thứ ba ớ nam giới (chiếm 10% tổng các loại ung thư) và thứ hai ở nữ

giới (chiếm 9,4% tổng các loại ung thư). Gần 60% các trường hợp ung thư đại trực

tràng xảy ra ở các nước phát triển (tỷ lệ mắc bệnh cao gấp 10 lan ở cả hai giới so

với toàn thế giới, đứng thứ hai chỉ sau ung thư phổi). Ở các nước đang phát triển tỳ
lệ mắc bệnh đứng hàng thứ 8.Tỷ lệ mắc bệnh cao nhất ước tính ở Australia/New

Zealand và Tây Âu, thấp nhất ở châu Phi (ngoại trừ Nam Phi) và Nam-Trung Á. Có

khoảng 608.000 ca tử vong do ung thư đại trực tràng trên toàn thế giới, chiếm 8%
các ca tử vong do ung thư nói chung.

1.1.5.2. Tinh hình ung thư đại trực tràng ỏ' yiột Nam

Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ ung thư nhiều nhất thế giới. Mồi
năm cả nước có thêm khoảng 150.000 ca mác mới các bệnh ung thư và 75.000 ca từ
vong do ung thư. đứng thử 2 chi sau bệnh tim mạch (Hiệp hội ung thư Việt Nam). 5

loại ung thư hàng đầu ờ nam giới là phổi, gan, đại trực tràng, dạ dày và vòm hầu

(chiếm 58%); còn ớ nữ giới là vú, cố tứ cung, đại trực tràng, phối và tuyến giáp
(chiếm 63%). Đặc biệt, ở nữ giới có sự gia tăng ti lệ ung thư vú, đại trực tràng và

tuyên giáp. Như vậy. ờ Việt Nam ung thư đại tràng cũng được xcp đứng thứ ba ở cả

nam và nữ. Việc điều trị có hiệu quà bệnh ung thư phụ thuộc rất nhiều vào sự đáp

ứng của mỗi bệnh nhân đối với liệu pháp sử dụng, do đó cần có những nghiên cứu
sâu về mặt di truyền những yếu tố có ảnh hướng đến q trình điều trị.

1.2. Gen KRAS
1.2.1. Cấu trúc gen KRAS

KRAS là thành viên cùa gia đình gen RAS mã hóa cho protein G với hoạt động

GTPasc nội bào. KRAS nằm trong con đường truyền tín hiệu của EGFR. Protein

KRAS hoạt động như một cơng tắc phân từ trong con đường truyền tín hiệu nội bào

Nghiêm Thị Bích Hạnh

9

Lớp 11-04


trong đó quy định các chức năng quan trọng cho sự tiến triển của tế bào, bao gồm cả
sự biệt hóa, sự phát triến và chết theo chu trình [3],

Gcn KRAS có tên chính thức là sarcoma rat kirstcn virus homolog oncogene,
được xác định vào năm 1975 từ các nghiên cứu của loại virus gây ung thư là virus
sarcoma kirsten bởi Scolnick và cộng sự [ 3], Gen K-RAS nằm trên cánh ngắn của

nhiễm sắc thế 12, ở vị trí 12.1: (12pl2.1). Cụ thế là các gen K-RAS nam từ nucleotid

25358179 đến nucleotid 25403853 trên nhiễm sắc thề 12.

KRAS

Hình 2. Vị trí gen K-RAS trên nhiễrn sắc thề 'ứ. ( McGrath J?p? (1983))

Sàn phâm của gen KRAS là protein KRAS chứa 188 amino acid có khối lượng
phân từ 21,6 kD, và tham gia dần truyền tín hiệu nội bào [19]. Có hai vùng quan

trọng là Switch 1 (30-38 aa) và Switch 2 (59-67 aa) hình thành nên vịng phán ứng
lại kích thích, diet! khiến bởi dặc trưng liên kết của GTPase với phân từ phàn ứng
kích thích cứa nó. Vùng Switch I và II đóng vai trị quan trọng trong liên kết cúa

yếu tố điều hòa và yếu tố ành hưởng .

Nghiêm Thị Bích Hạnh

10

Lớp 11-04


Hình 3. Mơ hình protein KRAS vói các vùng quan trọng được đánh dấu.

1.2.2. Chức năng, vai trò của gen KRAS trong việc đáp ứng điều trị với

liệu pháp phân tử đích
Gen K-RAS là gen sinh ung thư, gẹọ K-RAS mã hóa cho protein KRAS tham gia

,

,A 11111'yienv lẽn Đại 110Q Mớ Hà NỘI Ể

,

chú yêu trong việc điêu hành phân chia tê bào. Thơng qua một q trình trun tín hiệu

(transduction), protein truyền tín hiệu từ ngồi tế bào vào đen nhân tế bào. Các tín hiệu

này kích hoạt tế bào đề phát triển và phân chia hoặc trường thành với những chức năng

chuyên biệt. Protein K-RAS là một GTPase, enzym có chức năng chuyến đối phân tử
GTP (Guanosine-5'-Triphosphate) thành phân tứ GDP (Guanosine-5-Diphosphate).

Protein K-RAS hoạt động như một chun đơi, nó có thê hoạt động (kích hoạt) hay yên
nghi (bất hoạt). Để truyền tín hiệu, protein K-RAS phải được kích hoạt bằng cách gắn
vào một phân tử cùa GTP. Protein K-RAS bị bất hoạt khi nó chuyên đối các GTP tới

GDP, khi protein kết hợp với GDP, nó khơng truyền tín hiệu tới nhân tế bào. Những

săn phấm protein cúa gen K-RAS đóng vai trị quan trọng trong phân bào, sự khác
biệt tế bào và sự chết tế bào theo chương trình (apoptosis).
Trong tế bào, protein KRAS được giữ cân bằng thơng qua sự hình thành 2

phức hợp tương ứng với các trạng thái cùa protein KRAS: Phức hợp KRAS-GTP
(Protein KRAS được hoạt hóa) và phức hợp KRAS-GDP (Protein KRAS bị bất

hoạt). Protein KRAS được hoạt hóa nhờ yếu tố chuyển nucleotide guanine (guanine
Nghiêm Thị Bích Hạnh

11

Lớp 11-04


nucleotide exchange factors (GEFs)). Việc truyền tín hiệu cùa protein KRAS bị ức
chế khi phức hợp KRAS-GTP bị phân hủy thành phức hợp KRAS-GDP nhờ một
loại protein có chức năng hoạt hóa GTPase (GAPs). Ờ điều kiện sinh lý bình
thường, nong độ KRAS-GTP trong cơ thể được kiểm soát chặt chẽ nhờ sự hoạt

động nhịp nhàng cùa 2 yếu tố GEFs và GAPs.
Khi gen KRAS bị đột biến sẽ mã hóa cho những protein KRAS mới có khã

năng chống lại hoạt tính GTPase cùa GDPs. Do đó, những protein KRAS đột biến

này luôn luôn tồn tại ờ trạng thái hoạt hóa KRAS-GTP. Protein KRAS ờ trạng thái
bình thường ln bị bất hoạt sau một khoảng thời gian rất ngắn, các protein KRAS

đột biến có khá năng kích hoạt vĩnh viễn các con đường truyền tín hiệu nam xi
dịng nó bất kề có sự hoạt hóa cúa thụ thế EGFR/HER nào hay khơng. Đây chính là

cơ chế phân từ lý giải cho tình trạng kháng thuốc điều trị đích ở bệnh nhân ung thư
đại trực tràng có đột biến trên gen KRAS |3|.

1.2.3. Tình hình nghiên cứu về đột biến trên gen KRAS ở bệnh nhân ung
thu đại trực tràng trên thế giói và tại Việt Nam

Trên thế giớipRĨ aiỊi^ềụ, nghịêtt cứu. cho tỊỊấy . đỘỊ biến trên gen KRAS có ảnh

hướng đến hiệu quà điều trị bằng liệu pháp phân tử đích. Đột biến trên gen KRAS
xảy ra vói tần xuất 17 - 25% ờ tất cả các loại ung thư [3]. Tuy nhiên, tần xuất này

thay doi ở mồi loại bệnh ung thư bao gồm: 36% bệnh nhân ung thư đại trực tràng,

20% bệnh nhân ung thư phổi và 65 - 100% bệnh nhân ung thư tuyến tụy [20], Tỷ lệ
này được xác định là 30 - 60% bệnh nhân ung thư đại trực tràng, 60% bệnh nhân

ung thư tuyến tụy, 33% bệnh nhân ung thư mật, 17% bệnh nhân ung thư buồng
trứng, 15% bệnh nhân ung thư màng trong dạ con và 30 - 40% bệnh nhân ung thư

phôi các loại [28].

Gần 90% đột biến làm mất hoạt tính cùa protein KRAS là đột biến tại codon
12-13 trên exon 1 và 5% là đột biến tại codon 61 trên exon 2. Amino acid 12 và
13 là vị trí GTP-binding P-loop và amino acid 61 nằm trên vùng switch-I [21],

Đối với bệnh ung thư dại trực tràng, đột biến ở codon 12 và 13 trên gen KRAS

xảy ra ớ 25 - 40% bệnh nhân [4]. Đột biến điểm ờ codon 12 và 13 cũng được xác

định là gây ra đáp ứng thấp với việc diều trị bang cetuximab và panitumumab ở

Nghiêm Thị Bích Hạnh

12

Lớp 11-04


bệnh nhân ung thư đại trực tràng [6], Vì vậy, đột biến này là một chi thị phân tử
quan trọng cho việc sử dụng liệu pháp phân tử đích với chất ức chế thụ thế EGFR.
Ở Việt Nam. cũng đã có nhiều nghiên cứu về ung thư đại trực tràng, nhưng

chủ yếu về đặc điếm lâm sàng, hình ánh nội soi và mơ bệnh học, cịn ít thấy có

những nghiên cứu về đột biến gen trong ung thư đại trực tràng và trên mẫu máu.
Theo nghiên cứu GS.TS Tạ Thành Văn - Trường Đại Học Y Hà Nội với đề

tài: “Nghiên cứu xác định đột biến gen quyết định tính đáp ứng thuốc trong điều trị

ung thư đại trực tràng và ung thư phối”.Đe tài nghiên cứu nhằm thực hiện các mục

tiêu: xác định tỷ lệ đột biến EGFR. KRAS đối với bệnh nhân ung thư phổi khơng tế
bào nhó và gen KRAS và BRAF đối với bệnh nhân ung thư đại trực tràng: thiết lập
bản đồ đột biến gen, công bố các dạng đột biến và các vùng đột biến trọng điếm,

đánh giá hiệu quá điều trị ung thư ở hai nhóm bệnh nhân sừ dụng liệu pháp điều trị
đích và liệu pháp hóa hoặc xạ trị, chế tạo thừ nghiệm được 2 bộ kít (mồi bộ 100

lest) chấn đoán nhanh đột biến gen EGFR, KRAS ớ các bệnh nhân ung thư phổi
không tế bào nhỏ và ung thư đại trực tràng ờ Việt Nam [331.

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

Nghiêm Thị Bích Hạnh

13

Lớp 11-04


PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.1
2

. Vật liệu và hóa chất
.1.1. Vật liệu

Vật liệu là 15 mẫu máu cúa bệnh nhân mac bệnh ung thư đại trực tràng được

thu thập từ Bệnh viện Hòe Nhai và Bệnh viện Đại học Y Hà Nội.
2

.1.2. Hóachất

Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm :

•

Bộ KIT GeneJET Whole Blood Genomic DNA purification Minikit của

hãng Thermo (Mỹ) dùng đề tách chiết DNA tống số.

•

Bộ KIT GeneJET Gel Extraction của hãng Thermo (Mỹ) dùng để tinh

sạch sán phâm PCR.

•

Nhóm hóa chat dùng cho phàn ứng PCR: Taq DNA polymerase, buffer,

dNTP, mồi đặc hiệu.

•

Nhóm hộa chat dùng pho điệtyli gel agarose: ịtgaro^Ci đệm TAE IX, dye,

ethydium bromide.

Và một số hóa chất khác như nước cất một lần, ethanol,...

•

Các cặp mồi dùng trong phàn ứng PCR nhân đoạn exon trên gen KRAS được

tống hợp ờ HãnglDT (Mỳ) (bảng 1).
Bên cạnh đó. dựa vào trình tự DNA chuấn của đoạn gen KRAS, 3 cặp mồi xuôi

và ngược được thiết kế đế nhân những đoạn exon cứa gen KRAS nhờ kỹ thuật PCR.

Bảng 1: Trình tự 3 cặp mồi dùng cho PCR.
TT

Tên mồi

1

KR1F

5’-A GAC CAT GCT CAG ATC TTC CAT-3’

2

KR1R

5’-G CAA AGT TCA TTA GAA CTG ATC-3’

3

KR2F

5’-TA ATG GAT CAT GGG CCA TGT-3’

4

KR2R

5’-AGG ACA GGA GTA CCA AGA AGT GAG-3’

5

KR3F

5’-TA ATG GAT CAT GGG CCA TGT-3’

6

KR3R

5’-AC AGT GTT GAA TGT GGT GCA-3’

Trình tự

Nghiêm Thị Bích Hạnh

14

Kích thước
445bp

297bp

375bp

Lớp 11-04


2

.1.3. Thiết bị

Các thiết bị sử dụng cho nghiên cứu bao gồm:

-

Tú lạnh -20°C Vestfrost (Đan Mạch);

-

Máy li tâm BioFuge fresco (Đức);

-

Lị vi sóng Sharp (Nhật Bản);

-

Cân điện từ Precisa (Thụy Sỹ);

-

Máy chu trình nhiệt GeneAmp PCR System 9700 (Mỹ);

-

Máy chụp gel BioRad (Đức);

-

Tu lạnh Toshiba (Nhật Bản);

-

Máy điện di Mupid -2plus (Nhật Bán);

-

Máy spin Picofuge (Mỹ);

-

Pipette Gilson (Pháp);

-

Bể ổn nhiệt Memmerl (Hàn Quốc);

-

Bộ dụng cụ điện di (Đài Loan);

-

Máy đoquap^^ctyiện Đại học Mở Hà Nội

Nghiêm Thị Bích Hạnh

15

Lớp 11-04


. Phương pháp nghiên cứu

2.2

Hình 4. Sơ đồ phương pháp nghiên cihi

2.2.1.

Tách chiết DNA tống số

Quá trình tách chiết DNA tồng số từ mầu máu theo phương pháp tách DNA
được mô tá bởi Sambrook và cộng sự f22]. Phương pháp này bao gồm những bước
chính sau:

Nghiêm Thị Bích Hạnh

16

Lớp 11-04


Hình 5. Các bước tách chiết DNA CO’ bản
DNA tống số được tách từ mẫu máu bằng bộ KIT GeneJET Whole Blood

Genomic DNA purification Mini Kit Clia hãng Thermo. Quy trình tách bao gồm
những bước tiến hành sau:
Bước 1: Dùng pipette lấy 20 pl protease K vào ống eppendorf 2 ml, protease

K có tác dụng phá vỡ màng tế bào, thủy phân protein trong mẫu.
Bước 2: Thêm 200 pl mẫu máu vào ống eppendorf nói trên.
Bước 3: Thêm 400 pl lysis solution vào ống rồi spin đế dung dịch trên thành
ống rơi hết xuống đáy.

Bước 4: ú ớ 56 °C trong vòng 10 phút.

Bước5: Tiếp tục spin một lan nữa đế những chất dính trên thành ong rơi hết
xuống dáy.

Bước 6: Thêm tiếp 200 pl ethanol (96%) rồi lại spin.
Bước 7: Bắt đầu tiến hành li tâm đề tách DNA, dùng pipette cho dịch vào cột
rồi li tâm 8000 vòng trong 2 phút ở 4°c. Ly tâm xong bò phần tạp chất dưới đáy,
thu cột, bó ống cù chuyền cột sang ống mới.

Chú ý: Phan dung dịch trong cột phãi được li tâm hết.

Nghiêm Thị Bích Hạnh

17

Lớp 11-04