Bước đầu tìm hiểu kỹ thuật sinh học phân tử trong xác định đột biến trên gen HBB gây bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm

B GIÁO DC VẨ ẨO TO
TRNG I HC M TP.HCM



BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

Tên đ tài:

BC U TỊM HIU K THUT SINH HC
PHÂN T TRONG XỄC NH T BIN TRểN
GEN HBB GÂY BNH THIU MỄU HNG CU
HỊNH LIM
KHOA CÔNG NGH SINH HC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH ậ SINH HC PHÂN T


GVHD: ThS. Trng Kim Phng
SVTH: Nguyn Th Thu Ngân
MSSV: 1053012479
Khóa: 2010 - 2014

TP.HCM, tháng 06 nm 2014
Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân ậ 1053012479

LI CM N

Em xin gi lòng tri ơn đn cô Trng Kim Phng, ngi đƣ tn tình hng

dn và truyn đt kin thc cho em trong quá trình hc tp và giúp em hoàn thành
tt chuyên đ khóa lun tt nghip này.
Em cng chơn thƠnh cm n QuỦ Thy Cô khoa Công Ngh Sinh Hc ậ
Trng i hc M TP.HCM đƣ tn tình giúp đ và truyn đt kin thc cho em
trong quá trình hc tp.
Xin chân thành cm n cô Lê Huyn Ái Thúy, thy Lao c Thun đƣ tn tình
giúp đ và to điu kin thun li cho em trong sut thi gian thc hin chuyên đ
khóa lun tt nghip này.
Xin chân thành cm n Trung tơm chn đoán y khoa Medic đƣ to điu kin
thun li vƠ giúp đ em trong thi gian thc hin chuyên đ khóa lun tt nghip
này.
Em cng xin gi li bit n sơu sc đn gia đình, ngi thân và li cm n đn
bn bè đƣ đng viên em trong sut thi gian hc tp.
Sau cùng em xin chân thành cm n QuỦ Thy Cô đƣ dƠnh thi gian đc và
xem xét chuyên đ khóa lun tt nghip này ca em.



Sinh viên thc hin


Nguyn Th Thu Ngân
Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 i

DANH MC CÁC CH VIT TT

ACS Acute chest syndrome
ARMS Amplification refractory mutation system

ASA Allele specific amplification
AS-PCR Allele specific ậ polymerase chain reaction
bp Base pair
ddNTP Dideoxynucleotide triphosphat
dNTP Deoxynucleotide triphosphat
EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid
Glu Glutamic
Hb Hemoglobin
HbA Hemoglobin A
HbA
2
Hemoglobin A
2

HbAS Hemoglobin A ậ hemoglobin S
HBB Beta-hemoglobin
HbC Hemoglobin C
HbD Hemoglobin D
HbE Hemoglobin E
HbF Hemoglobin F
HbS Hemoglobin S
HbSbetathal Hemoglobin S ậ beta thalassemia
HbSC Hemoglobin S - hemoglobin C
Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 ii

HbSD Hemoglobin S - hemoglobin D
HbSS Hemoglobin S - Hemoglobin S
IDT Integrated DNA Technologies

IQ Intelligence Quotient
Lys Lysine
NCBI National Center for Biotechnology Information
NIH National Institutes of Health
NST Nhim sc th
nu Nucleotide
OD Optical Density
PCR Polymerase chain reaction
PMC Pubmed Central
RFLP Restriction fragment length polymorphism
SCA Sickle cell anemia
SCD Sickle cell disease
SNP Single nucleotide polymorphism
SSCP Single strand conformation polymorphism
STT S th t
TAE Tris-acetate-EDTA
Tm Melting temperature
UV Ultraviolet
Val Valine
WHO World Health Organisation

Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 iii

THUT NG DIN GII
Ting Vit Ting Anh
Bnh hng cu hình lim Sickle cell disease
t qu Stroke
Hi chng ngc cp tính Acute chest syndrome

Thiu máu hng cu hình lim Sickle cell anemia
Tn thng c quan mn tính Chronic organ damage


Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 iv


DANH MC CÁC BNG
Bng I.1. Các đc đim lâm sàng ca bnh hng cu hình lim 6
Bng I.β. Các đc đim sinh hc ca bnh hng cu hình lim 7
Bng II.1. Thành phn phn ng PCR vi cp mi HBB1-F và HBB1-R 21
Bng II.2. Chu k nhit cho phn ng PCR vi cp mi HBB1-F và HBB1-R 22
Bng II.3. Thành phn phn ng PCR vi cp mi HBB2-F và HBB2-R 22
Bng II.4. Chu k nhit cho phn ng PCR vi cp mi HBB2-F và HBB2-R 23
Bng III.1. Các dng đt bin trên gen HBB 26
Bng III.2. T l các th đt bin trên gen HBB 27
Bng III.γ. Các phng pháp đc s dng trong xác đnh đt bin 27
Bng III.4. Thông tin trình t gen HBB thu thp trên NCBI 28
Bng III.5. Các h mi thu thp đc 29
Bng III.6. Các thông s vt lý ca mi 31
Bng III.7. Kho sát đ đc hiu ca mi HBB1-F và HBB1-R, HBB2-F và HBB2-
R bng phn mm Annhyb 32
Bng III.8.  đc hiu ca h mi bng công c Blast 33
Bng III.9. Kt qu đo OD DNA b gen ngi ca 3 mu bnh phm 35
Bng 1. Thông tin mu bnh phm s dng trong nghiên cu 55

Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 v

DANH MC HÌNH NH
Hình I.1: Hình nh ca gen HBB[44] 3
Hình I.2: Hình nh mô t các bc trong phn ng PCR (P1 vƠ Pβ: các đon mi-
Primers)[49] 15
Hình III.1: Hình nh mô t v trí khuch đi vùng gen HBB ca b mi HBB1-F và
HBB1-R, HBB2-F và HBB2-R 35
Hình III.2: Kt qu đin di kho sát nhit đ lai ca cp mi HBB1-F và HBB1-R
37
Hình III.3: Kt qu đin di sn phm PCR mu 1 vi cp mi HBB1-F và HBB1-R
38
Hình III.4a: Kt qu đin di sn phm PCR mu 2 vi cp mi HBB1-F và HBB1-
R 39
Hình III.4b: Kt qu đin di sn phm PCR mu 2 vi cp mi HBBβ-F và HBB2-
R 39
Hình III.5a: Kt qu đin di sn phm PCR mu 3 vi cp mi HBB1-F và HBB1-
R 2
Hình III.5b: Kt qu đin di sn phm PCR mu 3 vi cp mi HBBβ-F và HBB2-
R 2
Hình III.6: Kt qu Blast trình t A3-F trên NCBI 42
Hình III.7: Kt qu phơn tích tính tng đng ca trình t A3-F vi trình t gen
HBB và v trí bt cp ca mi HBB1-R 43
Hình 1: Mc đ tng đng ca trình t 7 (AF007546) và trình t 9 (U01317) trên
Seaview 53
Hình 2: Kt qu Blast ca trình t 7 (AF007546) trên NCBI 54
Hình 3: Kt qu kim tra đ đc hiu ca cp mi HBB1-F và HBB1-R bng phn

mm Annhyb 55
Hình 4: Mc đ tng đng ca trình t A3-F và trình t gen HBB 56
Hình 5: Mc đ tng đng ca trình t A3-R và trình t gen HBB 57

Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 vi

MC LC
T VN 
PHN I: TNG QUAN
I.1 TNG QUAN V BNH THIU MÁU HNG CU HÌNH LIM 3
I.1.1 Tng quan v gen HBB (beta-hemoglobin)[44] 3
I.1.1.1 Gen HBB[44] 3
I.1.2 Bnh hng cu hình lim (Sickle cell disease, SCD) 4
I.1.2.1 nh ngha bnh hng cu hình lim (SCD) 4
I.1.2.2 Các th bnh hng cu hình lim 5
I.1.2.3 Du hiu ca bnh hng cu hình lim 5
I.1.3 Bnh hng cu hình lim  th HbSS[24] 7
I.2 TÌNH HÌNH BNH THIU MÁU HNG CU HÌNH LIM 8
I.2.1 Tình hình trên th gii 8
I.2.2 Tình hình bnh  Vit Nam 10
I.3 BIN CHNG CA BNH THIU MÁU HNG CU HÌNH LIM 10
I.3.1 t qu 10
I.3.2 Hi chng ngc cp tính (ACS) 10
I.3.3 Tn thng c quan mn tính 11
I.4 TÁC NG CA BNH THIU MÁU HNG CU HÌNH LIM 11
I.5 CÁC PHNG PHÁP CHN OÁN BNH THIU MÁU HNG CU
HÌNH LIM
13

I.5.1 Xét nghim máu 13
I.5.2 Xét nghim cn lâm sàng 13
I.5.3 in di hemoglobin 13
Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 vii

I.5.4 Phng pháp PCR (Polymerase chain reaction) 14
I.5.5 Phng pháp gii trình t 15
I.5.6 Mt s phng pháp khác 16
PHN II: VT LIU VẨ PHNG PHÁP NGHIÊN CU
II.1 VT LIU 18
II.2 PHNG PHÁP NGHIÊN CU 18
II.2.1 Khai thác d liu 18
II.2.2 Kho sát in silico ậ thit k mi 18
II.2.3 Kho sát thc nghim 19
II.2.3.1 Tách chit DNA 19
II.2.3.2 Kim tra cht lng DNA thu nhn bng phng pháp đo quang
ph 20
II.2.3.3 Phn ng PCR 21
II.2.3.4 Phng pháp đin di 23
II.2.3.5 Phng pháp gii trình t 24
PHN III: KT QU VÀ BÀN LUN
III.1 KHAI THÁC D LIU 26
III.1.1 Thu thp bài báo 26
III.1.2 Thu thp trình t gen HBB 27
III.1.3 Thu thp b mi xác đnh đt bin gen HBB 29
III.2 KHO SÁT IN SILICO 30
III.2.1 Trình t gen HBB 30
III.2.2 Trình t mi 30

III.3 KHO SÁT THC NGHIM 35
III.3.1 Kt qu đo OD 35
Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 viii

III.3.2 Kt qu phn ng PCR vƠ đin di 36
III.3.3 Kt qu gii trình t 41
PHN IV: KT LUN VẨ  NGH
IV.1 KT LUN 45
IV.1.1 Khai thác d liu 45
IV.1.2 Kho sát in silico 45
IV.1.3 Kho sát thc nghim 45
IV.2  NGH 46
TÀI LIU THAM KHO 47
PH LC 53
Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 1

T VN 
Thiu máu hng cu hình lim th HbSS (Sickle Hemoglobin) là mt dng
bnh lý di truyn v máu, tính cht gia đình, th đng hp, do đt bin đim (GAG
 GTG)  exon 1 ca gen  – globin dn đn s thay th ca acid glutamic thành
valine (Glu6Val)  v trí acid amin th sáu ca chui polypeptide  ậ globin làm
bin đi HbA thành HbS. Th HbSS hình thành các t bào hng cu hình lim gây
thiu máu, dn đn s tc nghn mch máu, nhim trùng và tn thng mt s c
quan quan trng trong c th con ngi, có th làm gim tui th và gây t vong
cho ngi bnh.
Hin nay, trên th gii có nhiu công trình nghiên cu v chn đoán bnh

HbSS và các bnh lý khác thuc nhóm SCD (Sickle cell disease). Tuy nhiên,  Vit
Nam vn cha có s liu v tình hình bnh cng nh các công trình nghiên cu
phân t v bnh HbSS. Do vy, nhm góp phn tìm hiu thông tin v bnh di truyn
HbSS  Vit Nam, chúng tôi thc hin chuyên đ nghiên cu:
ắBC U TÌM HIU K THUT SINH HC PHÂN T TRONG
XỄC NH T BIN TRÊN GEN HBB GÂY BNH THIU MÁU HNG
CU HÌNH LIM”.
Mc tiêu nghiên cu tng quát:
Tìm hiu thông tin v bnh di truyn HbSS  Vit Nam.
Ni dung nghiên cu:
Chúng tôi tin hành thu thp tài liu, đánh giá tình hình bnh hng cu hình
lim do đt bin trên gen  – hemoglobin (HBB)  Vit Nam và trên th gii.
Kho sát in silico, thit k mi phù hp nhm phát hin đt bin trên gen HBB
gây bnh thiu máu di truyn
Bc đu xây dng quy trình da trên k thut PCR nhm tìm hiu v đt
bin gây bnh thiu máu hng cu hình lim th HbSS trên gen HBB trên các mu
bnh phm.
Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479

PHN I: TNG QUAN
Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 3

I.1 TNG QUAN V BNH THIU MÁU HNG CU HÌNH
LIM
I.1.1 Tng quan v gen HBB (beta-hemoglobin)
I.1.1.1 Gen HBB [44]
Gen beta-hemoglobin (HBB) mã hóa protein beta-globin, có kích thc 1606
bp (v trí nucleotide 5.246.695 ậ 5.248.300) trên NST 11p15.5.

Hình I.1: Hình nh ca gen HBB[44]
S đt bin trên gen HBB có th dn đn 2 dng bin th chính:
 t bin đim trên trình t gen HBB dn đn s tng hp chui globin bt
thng (HbS, HbC, HbE, HbD, ).
 Nhóm bin th thalassemia dn đn làm gim hoc bt hot s tng hp
chui globin.
Các bin th ca HBB có tn s xut hin khong 1-1,5/1000.
I.1.1.2 Hemoglobin (Hb)
Hemoglobin đc cu to bi bn chui globin bao gm 2 loi hemoglobin: [2]

 Hemoglobin bào thai (HbF) có hai chui  vƠ hai chui  (ββ).
 Hemoglobin ngi ln (HbA) có hai chui  vƠ hai chui  (ββ).
Mi tiu đn v protein ca hemoglobin mang mt phân t heme. Phân t này
cn cho các t bƠo máu đ đ ly oxy t phi và cung cp cho các t bào khp c
Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 4

th. Mt hemoglobin hoàn chnh có kh nng mang bn phân t oxy cùng mt lúc
(mt phân t oxy gn vi mt phân t heme).[44]
I.1.2 Bnh hng cu hình lim (Sickle cell disease, SCD)
I.1.2.1 nh ngha bnh hng cu hình lim (SCD)
Bnh hng cu hình lim (Sickle cell disease - SCD) là mt dng bnh lý di
truyn v máu, th đng hp vi các dng đt bin đim trên gen HBB (HbS, HbC,
HbD, HbE, ầ) dn đn vic tng hp  ậ globin bt thng to ra cu trúc phân t
hemoglobin hình lim làm gim hoc ngn cn quá trình vn chuyn O
2
đn t
bào.[1,24,44]
Các dng bt thng ca  ậ globin thng xy ra vi mt tiu đn v  ậ
globin b bin đi thành hemoglobin S (HbS), tiu đn v  ậ globin còn li b đt
bin thành hemoglobin C (HbC), hemoglobin E (HbE), [44]
Các dng bnh hng cu hình lim:
 Dng bnh HbSS: dng bnh hng cu hình lim HbSS xy ra do s đt bin
trên gen HBB đƣ to nên các tiu đn v  ậ globin  th HbS. Th
hemoglobin S đc hình thƠnh do đt bin đim (GAG  GTG)  exon 1
ca gen  – globin dn đn s thay th ca acid glutamic thành valine  v trí
acid amin th 6 (Glu6Val) dn đn vic to dng bt thng ca  -globin là
HbS (hemoglobin S).[7,25,44]
 Dng bnh HbSC: dng bnh hng cu hình lim HbSC xy ra do s đt

bin trên gen HBB đƣ to nên các tiu đn v  ậ globin  th HbS và HbC.
Th hemoglobin C (HbC) đc hình thành do s thay th ca glutamic bng
lysine  v trí acid amin th 6 (vit là Glu6Lys). Mc đ nghiêm trng ca
dng bnh HbSC khá bin đng, nhng nó cng nghiêm trng nh bnh
thiu máu hng cu hình lim th HbSS.
 Dng bnh HbSE: dng bnh hng cu hình lim HbSE xy ra do s đt bin
trên gen HBB đƣ to nên các tiu đn v  ậ globin  th HbS và HbE. Th
Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 5

hemoglobin E (HbE) hình thành do s thay th glutamic bng lysine  v trí
acid amin 26 (vit là Glu26Lys). Vi dng bnh nƠy, ngi bnh có th có
các du hiu và triu chng nghiêm trng liên quan đn thiu máu hng cu
hình lim nh các đt đau [10,44], thiu máu và chc nng lách bt
thng.[44]
 Dng bnh HbSD: dng bnh hng cu hình lim HbSD xy ra do s đt
bin trên gen HBB đƣ to nên các tiu đn v  ậ globin  th HbS và HbD.
Th hemoglobin D (HbD) hình thành do s thay th glutamic bng glutamin
 v trí acid amin 121.[2]
 Mt dng bnh khác là HbS BetaThal, đc gây ra bi đt bin hemoglobin
S (HbS) và beta thalassemia xut hin cùng nhau. Các du hiu và triu
chng ca HbS betathalassemia thng nghiêm trng hn so vi dng HbSC
và có th bao gm đau nghiêm trng và tn thng c quan [44]. -
thalassemia đc hình thành do s thiu ht chui -globin.[2]
SCD là mt nhóm các ri lon di truyn mn tính Hb trong đó ngi bnh
tha hng hai gen globin đt bin t c cha ln m, mt trong nhng gen này luôn
luôn lƠ đt bin hng cu hình lim.[24]
I.1.2.2 Các th bnh hng cu hình lim [2]
Bnh hng cu hình lim có hai th: th đng hp t và th d hp t. Th d

hp t HbAS không có du hiu lâm sàng. Các th d hp t khác nh HbSC,
HbSD hoc HbS Thalassemie thì có du hiu lâm sàng.
I.1.2.3 Du hiu ca bnh hng cu hình lim [2]
 Du hiu lâm sàng ca bnh hng cu hình lim




Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 6

Bng I.1. Các đc đim lâm sàng ca bnh hng cu hình lim

Th bnh
Du hiu lâm sàng
Th
đng
hp t
HbSS
 St, đau khp, đau bng, đau xng.
 Vàng da, thiu máu, tan máu mn, có cn tan
máu.
 Ri lon nhp tim, nghn mch.
 Lách to, có th b tn thng gan, phi, thn,
mc treo rut hoc võng mc mt.
Th d
hp t
HbSD
 Thiu máu nng, có cn tan máu.

 Lách to.
HbSC
 Thiu máu, tan máu mn tính, có cn tan máu.
 Lách to.
 au xng.
HbS Thalassemia
 Thiu máu nng, có cn tan máu nh.
 Lách to.

 Du hiu sinh hc ca bnh hng cu hình lim




Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 7

Bng I.2. Các đc đim sinh hc ca bnh hng cu hình lim

Th bnh
Du hiu sinh hc
Th
đng
hp t
HbSS
 Huyt đ: thiu máu, tan máu mn. Hng cu
hình li lim: 40 ậ 100%.
 Ty đ: hng cu tng, có hng cu hình lim.
 Lách đ: thy nhiu hng cu lim.

 Bilirubin gián tip gim nh.
 in di Hb: thy HbS t 77 ậ 78%; HbA
2

2,5%; HbF 5 ậ 10% có khi ti 25%; HbA
không có.
Th d
hp t
HbSD
 in di thy HbS và HbD.
HbSC
 in di Hb thy HbS 52,5%; HbC 43,5%; HbF
3,5%.
HbS Thalassemia
 in di Hb thy HbS và HbF.
HbAS
 Hng cu hình li lim 10 ậ 40%.
 in di Hb thy HbA và HbS.

I.1.3 Bnh hng cu hình lim  th HbSS
Thiu máu hng cu hình lim th HbSS là mt bnh di truyn đng hp ln,
do đt bin đim (GAG  GTG)  exon 1 ca gen  – globin dn đn s thay th
ca acid glutamic thành valine (Glu6Val)  v trí acid amin th sáu ca chui
polypeptide  ậ globin làm bin đi HbA thành HbS gây thiu máu hng cu hình
Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 8

lim th HbSS [7,25,44]. Thiu máu hng cu lim là dng bnh lý ri lon liên
quan đn máu, nh hng ti phân t hemoglobin và làm cho toàn b t bào máu

thay đi hình dng. Kt qu ca đt bin này là vic sn xut mt dng bt thng
ca  -globin là HbS.[44]
Ngi b bnh thiu máu hng cu hình lim th HbSS do nhn yu t di
truyn  th HbS t c cha và m. Do đó  ngi bnh có triu chng thiu máu
hng cu hình lim gây ra bi s thay th 2 tiu đn v  ậ globin bng HbS.[25]
I.2 TÌNH HÌNH BNH THIU MÁU HNG CU HÌNH
LIM
I.2.1 Tình hình trên th gii
Bnh hng cu hình lim ln đu tiên đc công nhn là mt ri lon v huyt
hc do Herrick đa ra vƠo nm 1910. Nm 1949, Pauling công b nghiên cu v
mt loi huyt cu t bt thng chit xut t hng cu các bnh nhân thiu máu có
hng cu hình lim [15,25], đơy là mt cn bnh phân t [15].
Theo báo cáo ca T chc y t th gii (World Health Organisation, WHO)
các bnh v ri lon di truyn hemoglobin ban đu đc trng ca vùng nhit đi và
cn nhit đi nhng hin nay ph bin trên toàn th gii do di c [6,25]. Bnh thiu
máu hng cu hình lim là bnh ph bin trên th gii. Bnh thng gp nht 
nhng ngi Châu Phi,  các nc vùng a Trung Hi nh Hy Lp, Th Nh K
vƠ ụ, bán đo  Rp, n  và khu vc ting Tây Ban Nha  Nam M, Trung M
(đc bit là Panama), và các b phn ca vùng bin Caribean.[25]
Bnh hng cu hình lim tác đng ti hn 1γ triu ngi trên toàn th gii và
nh hng đn hn 70.000 ngi ti Hoa K và có ít nht 75.000 ca nhp vin tn
trên 500 triu USD mi nm đ điu tr các bin chng ca bnh hng cu hình
lim (SCD) [19]. c tính có khong 1/500 ngi M gc Phi vƠ 1/1000 đn
1/1400 ngi M gc Tây Ban Nha b mc bnh này [21,24]. Có khong 2 triu
ngi M hoc 1/1β ngi M gc Phi mang đc đim hng cu hình lim [24].
Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 9

 Brazil s ph bin ca bnh thiu máu hng cu hình lim đc c tính t

β5.000 đn γ0.000 trng hp [21].  tui mc bnh  Brazil t nh nhi đn
ngi trng thành vi t l t vong cao nht t 0 ậ 9 tui: 31%, t l nam n mang
bnh tng đng nhau vi t l là nam 47,6% và n 52,4% [31].
SCD là bnh ph bin  Châu Phi ti tiu vùng Sahara ni st rét đc tìm
thy [24,14]. Các kiu gen đc trng lƠ HbSS vƠ HbSC chim u th trong dân s
mang bnh hng cu hình lim ca Ghana. T l th mang bnh trong dân s là 30%
trong khi có 2% tr s sinh Ghana b bnh hng cu hình lim [14].  Tanzania
bnh xut hin  các nhóm tui t tr em đn ngi trng thành và có t l t
vong cao nht  nhóm tui <5 tui (9,1%), tui mc bnh ca nam trung bình là 7
tui và tui mc bnh ca n trung bình là 9 tui [30].
 n , hemoglobin hình lim là ri lon di truyn ph bin nht trong các
b lc  Trung và Nam n . Hemoglobin hình lim ln đu tiên đc phát hin
t mt b lc  min Nam n  vƠo nm 195β [22].  n  mi nm có khong
5.200 tr em sinh ra b bnh hng cu hình lim (SCD) [46].
Ri lon hemoglobin ban đu lu hƠnh  60% ca 229 quc gia, nh hng
đn 75% các ca sinh, nhng bơy gi ph bin  71% quc gia vi 89% ca sinh.
Theo T chc y t th gii (WHO) có ít nht 5,2% dân s th gii vƠ hn 7% ph
n mang thai mang mt bin th hemoglobin bt thng [14]. Hemoglobin S chim
40% ca các th mang nhng gơy ra hn 80% các ri lon: khong 85% các ri
lon hng cu lim, và hn 70% ca tt c các ca sinh b nh hng xy ra  châu
Phi. Ngoài ra, ít nht 20% dân s th gii mang  thalassemia.
Khong 1,1% các cp v chng trên toàn th gii có nguy c có con b mt ri
lon hemoglobin và 2,7/1000 trng hp th thai b nh hng. T l sinh b nh
hng c tính là 2,55/1000 tr em b nh hng nhiu nht  các nc có thu nhp
cao vi mt ri lon mn tính, trong khi tr em đc sinh ra  các nc có thu nhp
thp hu ht cht trc 5 tui: vi t l t vong  tr em di 5 tui trên toàn th
gii là 3,4% hoc 6,4%  châu Phi.
Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 10

I.2.2 Tình hình bnh  Vit Nam
 Vit Nam cho đn nm β014, vn cha có s liu thng kê nào c th v
tình hình bnh thiu máu hng cu hình lim, điu này chng t các công trình
nghiên cu phân t v bnh này ti Vit Nam còn rt ít. Chính vì vy vic nghiên
cu này rt thit thc vƠ nên đc tin hƠnh đ tìm hiu tình hình bnh  Vit Nam.
I.3 BIN CHNG CA BNH THIU MÁU HNG CU
HÌNH LIM
Bnh có ph rng gây ra rt nhiu bin chng. Ph bin nht là bin chng do
các t bào hng cu hình lim làm gim kh nng vn chuyn O
2
.  tr em các
hng cu hình lim không có kh nng di chuyn đn các mô, c quan khác trong
c th ( đng trong lách). Do vy, bnh hng cu hình lim dn đn nguy c thiu
máu đt ngt có th gây t vong  tr em. Tr em t 6 đn 18 tháng tui b bnh
thng b sng đau bƠn tay và/hoc bàn chân (hi chng tay-chân). Ngi trng
thành b bnh hng cu hình lim vi th HbSS có các bin chng nghiêm trng
nh đt qu, hi chng ngc cp tính và tn thng c quan.
I.3.1 t qu
t qu là mt bin chng nghiêm trng ca thiu máu hng cu hình lim
[13]. t qu do thiu máu cc b là mt trong nhng bin chng nghiêm trng
nht ca SCD vi mt t l cao  giai đon sm vào la tui 7 và mt t l cao na
vƠo giai đon cui tui trng thành. Du hiu bao gm co git, tê chân tay, mt ý
thc. Mt cn đt qu có th gây t vong [48].
I.3.2 Hi chng ngc cp tính (ACS) [24]
ACS là mt bnh lý phi ph bin thng gn lin vi st, th nhanh, ho, khò
khè và khó th. Nó là mt quá trình cp tính và bin chng đe da tính mng ca
bnh nhân thiu máu hng cu hình lim. Nguyên nhơn thng gp do nhi máu
phi, các t bào hng cu hình lim chn mch máu, ty xng. ACS lƠ bin chng
ph bin th hai ca SCD, vi t l 1β,8 trng hp trên 100 bnh nhơn/nm. Bin

Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 11

chng dng này gây ra khong β5% trng hp t vong đi vi bnh này.
I.3.3 Tn thng c quan mn tính [24]
ơy lƠ các đt  đng hng cu trong lách, hoi t cp tính  thn, bin chng
mt, hoi t.
  đng hng cu trong lách lƠ cn đau cp tính t s phình to ca lách
do vic tn đng ca mt s lng ln hng cu hình lim. Bng s
phng lên và rt cng. Sau các đt lp đi lp li ca vic  đng hng
cu trong lách, lá lách b so, x, co li và b h vnh vin.
 Hoi t cp tính  thn: du hiu ca tn thng thn có th bao gm
máu trong nc tiu, tiu không t ch, và thn to lên. Ngi ln b
SCD thì chc nng ca thn không tt, có th tin trin đn suy thn 
mt t l nh bnh nhơn ngi ln và có th dn đn hi chng thn h.
 Hoi t  các vùng mang trng lng nh xng đùi ca hông và các
khp ln do kt qu ca thiu máu cc b, lp đi lp li vic nhi máu
khp, xng, vƠ các sn tng trng. Bin chng nƠy có liên quan đn
đau mn tính và tàn tt.
 Bin chng mt: nhi máu trên khuôn mt có th dn đn sa mí mt,
khi nhng mch máu nh cung cp oxy cho võng mc, các mô  mt
sau ca mt b chn bi các t bào hng cu hình lim, dn đn tình
trng gi là bnh võng mc, bnh võng mc tng sinh, xut huyt thy
tinh th và bong võng mc, dn đn mù lòa.
Bên cnh đó mt s bin chng gây ra bi HbSS bao gm: tng áp phi có th
gây ngt, t vong. Bin chng chi có th gây l loét, hoi t, có th dn đn nhim
trùng toàn thân và bin chng x hóa c.
I.4 TỄC NG CA BNH THIU MÁU HNG CU HÌNH
LIM

 i vi tr em
Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 12

Bnh nh hng đn sc khe ca tr em c v th cht ln trí tu. T l t
vong ca tr em di 5 tui  chơu Phi lƠ 5% vƠ 16% trng hp t vong  các
quc gia tây Phi.
Tr em vi SCA thng xuyên ngh hc nh hng đn quá trình tip thu kin
thc cng nh các hot đng khác. Ezenwosu và cng s (2013) đƣ ghi nhn kt
qu hc tp kém  tr em vi SCA sau khi ngh hc thng xuyên do bin chng
hng cu hình lim  M. SCA có th có mt tác đng trc tip vào kh nng trí tu
ca mt s tr em. Tr em vi SCA có nguy c kt qu hc tp kém vì ch s IQ
đc bit đn là nh hng đn kt qu hc tp [16]. T l đt qu do thiu máu
cc b  nhng ngi có SCA lƠ cao hn bn ln  tr em 2-15 tui, cao hn bt c
la tui khác [23,43]. Các trng hp b đt qu do thiu máu cc b chim 12%
các ca t vong  tr em b bnh SCA [24]. Bnh nhân hng cu hình lim di 15
tui có nguy c phát trin tn thng mch máu nƣo hn so vi nhng ngi trên
15 tui [43]. Tr em SCA cng có th phát trin nhi máu não im lng, trong đó liên
quan đn suy gim nhn thc và kt qu hc tp kém [23]. Khong 11% bnh nhân
di 20 tui b đt qu [13]. 75% ca 300.000 ca sinh trên toàn cu b nh hng
[30,41], c tính 50-80% nhng bnh nhân này s cht trc khi trng thành
[30,40].
 i vi ph n mang thai
S phát trin ca t cung chm, sy thai t nhiên và tin sn git có th xy ra.
Nhau thai tin đo và d bong do thiu oxy máu và nhi máu nhau thai. Khi sinh,
tr s sinh thng sinh non hoc có cân nng thp.[24]
 Ngi ln
Khong 30% bnh nhơn ngi ln b thiu máu hng cu hình lim có tng áp
phi.[24]

Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 13

I.5 CỄC PHNG PHỄP CHN OỄN BNH THIU MÁU
HNG CU HÌNH LIM
I.5.1 Xét nghim máu
Xét nghim máu có th kim tra hemoglobin S.  Hoa K, xét nghim máu là
mt phn ca sàng lc s sinh thng đc thc hin ti bnh vin.  ngi ln,
mu máu đc ly t tnh mch  cánh tay.  tr nh và tr s sinh, các mu máu
thng đc thu thp t mt ngón tay hoc gót chân. Mu nƠy đc gi đn phòng
thí nghim đ sàng lc hemoglobin S.
Xét nghim âm tính là không có t bào hng cu hình lim. Nu xét nghim là
dng tính, các xét nghim thêm cn đc thc hin đ xác đnh s có mt ca gen
t bào hng cu hình lim.[48]
I.5.2 Xét nghim cn lâm sàng
Huyt đ: th hin thiu máu hng cu bình thng. Xét nghim phiu đ máu
nhum khô có th nhìn thy vài t bào hng cu hình li lim (hình mt trng li
lim vi hai đu kéo dài và nhn). Thng hay thy tng bch cu trong thi gian
có cn.
Th nghim to hình lim: nhng hng cu hình lim s nhìn thy đc di
nh hng ca mt cht kh (nh mt git Metabisulfit Na 2% vào mt git máu),
cht kh oxy này s làm gim đ hòa tan ca hemoglobin S.
I.5.3 in di hemoglobin [47]
K thut đin di hemoglobin đc áp dng đu tiên vào thp niên 19γ0, sau đó
đc áp dng rng rãi trong chn đoán bnh  ngi trong nhng nm 1950 ậ 1960.
K thut này cho phép phát hin các dng đa hình (polymorphism)  ngi da trên
nguyên tc có s đt bin trên trình t DNA mã hóa cho gen có th dn đn s khác
bit trình t acid amin trong trình t protein.
K thut đin di hemoglobin giúp phân tách các th Hb khác nhau (s khác

bit  mc tng amino acid).
Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 14

I.5.4 Phng pháp PCR (Polymerase chain reaction)
Phng pháp PCR ra đi bi Karl Mullis và cng s vƠo nm 1985.[4,5]
 Nguyên tc ca phng pháp PCR:
S sao chép DNA xy ra khi có s tham gia ca DNA polymerase giúp tng
hp mch DNA mi khi đon mi bt cp vi mch DNA khuôn vi vt liu là các
dNTP trong điu kin phù hp. Phn ng PCR là s khuch đi DNA mch khuôn
theo cp s nhân, mi phn ng PCR gm nhiu chu k ni tip nhau, mi chu k
gm ba bc:
Bc 1: Trong hn hp phn ng có đy đ thành phn (dNTP, Mg
2+
, Taq
polymerase, DNA mch khuôn). DNA mch khuôn b bin tính bi tác nhân nhit
đ thành mch đn. Nhit đ này phi cao hn Tm (melting temperature ậ nhit đ
nóng chy ca DNA) ca phân t DNA khuôn mu, thng vào khong 94 ậ 95
0
C
trong vòng 30 giây ậ 1 phút. ơy lƠ giai đon bin tính (denaturation).[4]
Bc 2: LƠ giai đon lai (hybridization), các mi bt cp đc hiu vi mch
khuôn  nhit đ thích hp (thp hn Tm ca các mi). Nhit đ phn ng  giai
đon này ph thuc vào Tm mi s dng, thng dao đng trong khong 40 ậ 70
0
C,
kéo dài t 30 giây ậ 1 phút.
Bc 3: nhit đ đc tng lên khong 72
0

C, là khong nhit đ thích hp cho
DNA polymerase hot đng giúp tng hp mch sn phm. Thi gian tùy thuc đ
dài ca trình t DNA cn khuch đi, thng kéo dài t γ0 giơy đn nhiu phút.
ơy lƠ giai đon kéo dài (elongation).

Chuyên đ khóa lun tt nghip GVHD: ThS. Trng Kim Phng

Sinh viên thc hin: Nguyn Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 15


Hình I.2: Hình nh mô t các bc trong phn ng PCR (P1 và P2: các
đon mi-Primers) [49Error! Reference source not found.]
K thut PCR dùng đ chn đoán trc sinh ca bnh hng cu hình lim đƣ
đc các nhà khoa hc áp dng t nm 1989 [33] và hin nay vn lƠ phng pháp
thích hp đc la chn trong các phòng thí nghim nghiên cu v bnh lâm sàng.
I.5.5 Phng pháp gii trình t
K thut phân tích trình t gen bng máy t đng da trên nguyên tc Sanger
s dng 4 loi dideoxynucleotide triphosphat (ddNTP) đc đánh du bng 4 màu
hunh quang khác nhau đ kt thúc chui DNA. K thut phân tích trình t gen trc
tip bng máy t đng có th phân tích 300 ậ 1000 nucleotide trong 1 phn ng. K
thut đc ng dng ch yu đ phát hin nhanh đt bin đim hoc xóa đon ngn.
Phn ng gii trình t tng t nh PCR, nhng ch s dng mt mi duy nht
Bin tính
Bt cp
Kéo dài