1074 ảnh hưởng của aba trong môi trường nuôi cấy lên sự tái sinh chồi trực tiếp từ nuôi cấy mẫu lá cây chè camellia sinensis (l)

KHOA
HOC
KŸTP.HCM
THUAT
TẠP CHÍ KHOA H ỌC TRƯỜNG
ĐẠI
HỌC-MỞ
- SỐ 2 (1) 2007

6t
25

ÀNH HÙƯNG CUA ABA TRONG MƠI TRÙ€ING NI CAY LÊN
SQ TÁI SINH CHÔI TR C TIÊP T”Ù NUÔI CÂY MÂU LÁ CÂY CHÈ
[CAMELLIA SINENSIS (*-) I
NGUYE N THANH
MAI* NGUN SỴ
TN
GIĨI THI U
Chè là mğt trong nh”iJng cây công
nghiep quan trong và tąo ra nhieu viec làm ơ
tät cà các vùng trƯng chè trên the giói
(Mondal et al. 2004). Bên cąnh vai trị là mğt
loąi thúc ng pho bi6n, chè ngày càng diJ c
la chuğng bơi dțac tính kháng ung thiJ và
chƯng Ião hóa (Jankul et al. 1997). Be cåi
thi/en năng suät và nâng cao chät Iu’ğng cây
giÖng, các phiJong cách ti6p clan ve công
nghe sinh hgc nhiJ thao tác gen sé dịi hơi
các he thƯng sinh sàn phù hop và hieu q
(Bhattacharya và Ahuja, 2003), bên cąnh viec

duy trì nhúng dịng cây có năng suät cao dã có
duğc duo tin cây cúa th! triJịng. Vì the, muc
dích cúa cơng bƯ này là khåo sát các nÖng
dğ khác nhau cúa ABA de phát trien mğt he
thÖng sinh sån nham tái sinh cây tù các mơ Iá
giƯng chè Oo-long. MMac dù dã có mğt sƯ cơng
bƯ vë st tái sinh cây tù các loąi mô khác nhau
(Kato, 1982, Abraham và Rahman, 1986,
Bano et at. 1991, Jha et al. 1992, Mondal et
al. 1998, Sandal et al. 2005), cûng chi có mơt
cơng bćỵ ve su' phát sinh phơi vơ tính trac tiep
tù các mơ Iá dòng chè Assamica-SRL 73,
SBs (Kato, 1996) và sql tái sinh chưi gián tiep
tù Iá thơng qua rë bät d!nh có nguÖn gÖc
calli (Sandal et al. 2005). Tuy nhiên, viec
Imap Iąi các cơng bčỵ cúa Kato và Sandal dƯi
vói các giƯng chè cao sàn dang tiêu
” Thac si”, Giàng viên ca hfìu Khoa Cơng nghê
Sinh

hqc, DH Mó TP.HCM

“Sinh vién năm thru to, Khoa Cơng nghe Sinh hgc, DH
Mó TP.HCM


thu tąi Viêt Nam, nhU giÖng Oo-Long, dă
găp phâi nhieu khó khăn.
ABA — mğl chat dieu hịa sinh
trtïơng thÿc vȘat vùa có vai lrị úc ch6, vùa

có vai trị kích thích su phát trien dƯi vói
mơt q trình sinh hoc (Tn et al. 2005).
Chính vai trị rät dac biet này cúa axit
abscisis mà chúng tơi dã nghiên cúu tìm
ra co ch6 trong tác thích hqp giúa mơ và
các giai doąn phát sinh hình thái nham
kích thích st tái sinh chƯi tù mơ sęo lá.
Các guy trình vi nhân giƯng cây
chè (Camellia sinensis) luôn g¿ap phåi
trô ngąi ô giai doąn tąo rë in vitro (Mondal
et al. 2004). Do dó, chúng tơi cüng tien
hành ni cäy chè trong nhúng he thƯng
vùa mói vùa rè tiën (hơp nhi,fa Bąi Bưng
Tien) nhäm thu diJğc cây giƯng có bğ rë
phát trien khơe mąnh.

VAT LIEU VÀ ł•HLtONG PHÁP
Sof khói dau ni cay và tái sinh
Q trình vơ trùng máu dua.c tien
hành
trong erlen 100 ml có bƯ sung 20 ml mơi trDịng
MS vói 8,0 9.1-1 agar, 1,0 mg.I-1 TDZ
(Thidiaruzon) và 30 g.I-1 du'òng succrose.
Các doąn choi nách di ğc thiet Imap tù
nhr”ïng cây chè trU”ong !hành Camellia
sinensis var., Oo- Long duğc trÖng tąi Trung
tâm thÿc nghiem chè Lâm Bóng. Sau 3 Ian
cäy truyen cách mƯi 40 ngày, các lá thú 3
tính tù dỵnh cây xng duğc cat thành mau
cäy vói kích thc (5,0 x 1,0 mm*) disc dùng

Iàm vțat lieu thí nghiêm.


TẠP CHÍ KHOA H ỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM - SỐ 2 (1) 2007
TAP CHI KHOA HQC SO 01(11)-2007

26
62

Các phån úng phát sinh hình thái mơ dcfğc thù
nghiem trên mơi trng MS1 có bƯ sung 30 9.11 dng succrose và các nÖng do khác nhau
cúa to help giúa IBA (0,05; 0,1; 0,5 mg.I-1) và
BA (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg.1-1). pH mơi tr0ịng
dUğc diéu chinh ve 5,6 + 0,2 trrỵóc khi häp khú
trùng trong he thćỵng autoclave.
Trong thí nghiem thú 2, các mơ sęo
du’ğc hình thành sau 20 ngày ni cäy trên
mơi trüịng MS1 dügc chuyen sang mơi trr/ịng
MS2 có bo sung các nong dğ khác nhau cúa
ABA (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg.I-1) và to hop cúa
BA và IBA de tái sinh chói.

Tái sinh rË in vitro và chuyen cây
con ra I

..

...

Trong thí nghiêm thú 3, các chói tái

sinh tù mô sęo lá dUğc tách ra và tien hành
nuôi cäy trên các mơi trng MS3 và MS4
rJrJam itwn inicrł cay iąo ru.
Các chƯi cao khổng 4-5 cm või b /ore
khõe mąnh diJgc chuyen ra trong thú nghiem
ngỗi vn u’om.
Phân tích thong kê
Các thí nghiem diJğc leap Iąi 4 Ian, mịi

Ian 40 mau. Các sÖ lieu doğc xù ly thÖng kê
bang phän mem MSTATC 2004. Tät cå các
q trình ni cäy d0ğc duy trì trong dieu kien
quang chu kÿ 16h/ngày di ánh sáng dèn
huynh quang cUòng do 3000 lux và nhiet duo
phò ng 270C + 20 C.
KET OUA VA THAO LUAN
SJ hình thành mơ sęo và tái sinh
choi Mơ sęo di ğc cãm úng trên lá
thú 3
(tính tù nggn xng) vói kích thc (5,0 x 1,0
mm2) sau 14 ngày ni cäy trên các nƯng duo
khác nhau cúa IBA và BA (Hình 1a). Tuy
nhiên, mô sęo dã không cho thäy bät kÿ phàn
úng phát si
ni cäy trên cùng mơi trng hoțac khi cäy
truyen sang mơi trr/ịng mói có cùng dțac tính.
Mac dù mơ sęo drïğc hinh thành ơ tät cå các
nƯng duo trong tƯ hdp giúa IBA và BA (mơ sęo
phát sinh nhieu nhät ô nghigem thúc L4, 100%
måu cäy tái sinh mơ sęo), các chói chi phát

sinh tù mơ sęo (hình 1b) khi chúng dUğc cäy
truyen sang mơi trr/ịng MS2 Có bo sung ABA ơ
nghiem thúc L4. Tan sƯ tái sinh chưi, sƯ chưi
trung bình/máu và chieu cao chưi dąt tƯt nhät
ô nghiȘem thúc L14, bàng 2, Ian IiJot Ià 100%,
11,18 chƯi và cao 6,26 cm.

fIinh 1. Nhån gióog ệș ebc t’u ni may aim lå và úng
dQDg hop fihȘfì t$Oang Chi và he thóng lóng
rå rao inõ oeo

b iéi einh choi tiï iá

d, e. Cây trong hop Dat done tion
Côy nuô cåy they canh

cT


TẠP CHÍ KHOA H ỌC TRƯỜNG
ĐẠIHOC
HỌC -MỞ
KHOA
KYTPHCM
THUAT- SỐ 2 (1) 2007

27
63

Bàng 1: Ành hiJóng cúa các nóng do IBA và BA lên sim càm iJng mõ seo tU” nuõi câ’y lá

Nghiem
thúc

Chat dieu hồ tãng
trifdng (mgd)
IBA

Lt
L2
L3

0,05

L4

5
L6

0,1

Lt
Lg
L9

Lio
Lt t
Liz

0,5

BA

0,5
1,0
1,5
2,0
0,5
1,0
1,5
2,0
0,5
1,0
1,5
2,0

ABA

Ty le mau hinh thành
mơ s9o (%)

0

78,80
80,00
87,67
100,0
88,90
90,09
93,33

88,00
50,06
49,00
47,47
34,43

Trpng lJtfng tifdi trung

binh mô s9o
(mg)

11,06 + 1,48â
12,33 + 1,58 b
13,67 + 0,29 b
18,67 + 0,45d
15,55 + 0,83

16,47 + 0,78 “
17,05 + 0,12*
b

14,23 + 0,21 ’
09,09 + 0,46 C

08,67 + 0,17‘
07,45 + 0,23"
06,99 + 0,20'

Ghi chú: CV —— 0,01 vá LSD —— 1,556

Bieu do 1. Ánh huõng cúa các chat DHSTTV lên sq hinh thành
và gia tàng sinh khoi mơ seo

120

100
ng
Gi
á
tri.
so
lpu

80
60
40

20
0

L4

L7

—m- Ty le Eu hírih thành mơ seo (%)

Trpng krpng tuoi mô seo (mg)

Cd

L1
2

Nghiem thúc


TẠP CHÍ KHOA H ỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM - SỐ 2 (1) 2007
TAP CHÌ KHOA HQC SƯ 01(11)-2007

28
64

Bång 2. Ánh hUóng cûa ABA Iên src tái sinh chifii tie” mô sęo lá

Chat lieu hoa tăng

Ty le man

trildng (mg.1 1)

hình thành

Nghiem
thif'c

IBA

BA

ABA

So lif ng choi trung

Chieu cao trung

bình (choi

bình cua

/mau)

choi(cm)

choi (%)

LȚ3

0,5

6,322 + 6,32b

L i4

1,0

11,184 + 11,1ã

6,12 + 0,31å
6,26 + 0,94ã

6,099 + 6,1b

5,00 + 0,19å

3,228 + 3,23

2,12 + 1,69 b

0,05

2,0

L i5

1,5

L l6

2,0

100

Ohi chú: CV —— 0,01 vá LED —— 1,456

Bieu do 2. Árih huõng cïia to hip IBA, BA và các nong do ABA lên sq
tái sinh choi tù mô sęo có nguon goc lá

12
H So iu9ng choi trung biríh/måu

10

H Chieu cao choi trung bioh/u

Gi
á
tr1
so
lu
p

L15

Nghiem thúc
Dia vào ket quå phân tfch ANOVA cho
thäy st khác biet giđa các nghìem thúc rät có
ÿ nghïa ơ múc dğ 0,01 cho thäy: Giđa các
nghiem thúc L13 và L15 khơng có ski khác biet
b. Nghiem thúc L14 có su' khác biet có ÿ nghïa
vói tät cã các nghiem thúc cịn lai. nh giã

L16

ket q thí nghiem: nghfelzl thúc L14 cúa thí
nghiem cho ket q sƯ chói/mơ dąt cao nhät
(hình 1b). Nghiem thúc L14 có st khác biet có
ÿ nghïa ơ múc 0,01 nên ta nhân thay rang nên

khuyen cáo áp dung L14 thì sè có hiêu q
kinh te nhät. Ket q thí nghiêm ị bãng 2 cho

TẠP CHÍ KHOA H ỌC TRƯỜNG
ĐẠIHQC
HỌC MỞ
- SỐ 2 (1) 2007
KHOA
- KŸTP.HCM
THUAT
thäy nghiem thúc L14 cho ket quã tái sinh chƯi
tćít nhät, dąt 11,184 + 11,18 chói/mƠ. SLí tái
sinh chói bät d!nh thông qua mô sęo tù nuôi
cäy mô Iá in vitro dUğc báo cáo Ián dau tiên và
duy nhät cho den nay bôi Sandal và cğng st,
2005. Trong nghiên cúu dó, Sandal và cğng sc/
dã sù dung 2,4-D là chät OHSTTV duy nhät
trong q trình ni cäy và thi6t lap duğc quy
trình tái sinh chói bät d!nh tù Iá dąt ket q tƯi
0u là 14 + 1,6 chói/mäu cäy sau 24 tuan ni
căíy. Tuy nhiên, quy trình ni cäy này s”tï dqng
nóng duo 2,4-D rät cao (7,5 — 10 mg/I 2,4-D)
trong thòi gian khá dài (hon 5 tháng) dã khien
tƯc duo phát trien cùa chưi tái sinh b| giãm
mąnh. Chính tác giå dã nghiên cúu và drïa ra
ket luan nêu trên. Hen nđa, quy trình cúa
Sandal và c/ong su' tråi qua gián tiep 2 Ian mô
bät d!nh (Iá tąo re bät d!nh, re bät d!nh phát
sinh mô sęo, mô sęo hình thành choi bät dinh)
có the sé khien tỵ Iê cây b| dơt bi6n gia tăng.
Tri óc tình hình này, chúng tơi nƯ lu'c nghiên

cúu nham dna ra 1 guy trình hițeu q và Ưn
*!nh hon nhieu. Trong nghiên cúu này, chúng
tơi thiet Iâp dr/ğc quy trình tái sinh chƯi bät d|nh
tù ni cäy Iá thơng qua mơ sęo vói tan sƯ tái

29
65

sinh dąt 100% (vän de này khơng thäy de clap
trong nghiên cúu cùa Sandal và cțong st,
2005). M¿ac dù ket q tƯt nhät chúng tơi thu
diJğc là 11,184 + 11,18 chƯi/mơ (thäp hon so
vói 14 + 11,6 chƯi/mơ) nhiJng thịi gian ni cäy
ngan hon nhieu (sau 10 tn ni cäy) và nƯng
dğ các chät diëu hịa sinh triJơng thșc vȘat diJğc
s”Ji dqng ơ nƯng dğ thäp hon nhieu (0,05
mg.l- 1 IBA + 2,0 mg.I-1 BA + 1,0 mg.1-1 ABA).
Có rät
nhieu nhúng nghiên cúu de cap vai trị cûa
ABA trong viec tăng ciJòng khã năng tái sinh
choi tù mô sęo (Liu và công st, 1997, Modal và
cțong st, 2004, Peterson và Smith, 2004, ...).
Trong nghiên cúu này, có Ié ABA dã úc
che st tăng sinh khƯi mơ sęo khi duğc bo sung
vào mơi tru’ịng ni cäy nhiJng dong thịi cúng
kích thích srï phát trien các phát the choi tù mô
sęo. Viec nghiên cúu sâu hon núa ve mat sinh
trac nghiem mô sé dna ra nhúng ket luan thú V!
St tái sinh re in vitro và chuyen cây ra
vUòn u0m

Bâng 3. Các mơi tri ịng dùng khào sát st tái sinh
rè
Nghiem
thif'c

R,

Rø

Rø

R4

Chat kích thích
t3o rë (mg/1)
IBA
1
3
7
1
3
5
7
1
3
5
7
i
3

5
7

Diëu kien nũi cäy
Sáng

Täi

X

Rån

X

Lóng

Than
(' ’

Ty 'e ‘a

hình thành rë

36,04
66,67
50
0
0
22,16
11,3

x

x

0
0
0
37
19,05


30
66

TẠP CHÍ KHOA H ỌC
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM - SỐ 2 (1) 2007
TAP CHI KHOA HQC SƯ 01(11)-2007

ílính Z. Hình thái k6í thou ß eăy chs quan såt düói
KłIV ó do phóng dii 6OO lâ .
n. tó n c›/a i tit nhirn
b tś in vitro, inơ tr0óng ran
Sau 2 tháng ni cäy, tan sƯ tái sinh re
cao nhät thu dcfğc ô nghiem thúc R1 (3 mg/I
IBA + 1 g/I than hoąt tính, mơi tru'ịng d/ac và
ni cäy có chieu sáng), dąt tan sƯ 66,67%
(Hình 1d, e). Các nghiem thúc R2 và R4 (mơi
tr0ịng Iơng) (Hình 1f) cüng cho thäy choi có
khã năng phát sinh re nhtïng vói tán sƯ thäp

hon so vói khi ni cay trên mơi tr0ịng d/ac.
Tän sćỵ tái sinh re khác nhau giúa mơi trtïịng
Iơng và d/ac có Ié liên quan den pH mơi trng
ni cåy và dièu kiên ni cäy thống khí trong
hğp nhÿa Dąi BƯng Ti6n. Ngồi ra, khi có st
hien dien cúa auxin ngoąi sinh ket hgp vd‘i
auxin nKoi sinh tąo nên mğt st cân bang giđa
các hormone mói nghiêng ve phía auxin và tù
dó kích thích st ra re. Ket q này phù hop vói
ket Iucan cúa Mondal và cơng st (2004): st
hình thành re in vitro phu thuğc vào nong dơ
auxin và các diëu kien sinh Iÿ trong q trình
ni cäy.
Nghiên cúu cd quan khí khau

Grodzinxki, 1891, D!Ch: Tân và Huyên), cho
thäy các Iá ex vitro có sćí Indng khí khau it nhät
(Hình 2a), ti6p theo Ià Iá invitro ni cäy trên
mơi trng ran (Hình 2b) và Iá in vitro ni cäy
lơng (Hình 2c) có sƯ khí khau nhieu nhät.
Nhúng Iá ex vitro có Ióp bieu bì sáp bên ngồi
nên phát trien tƯt hon trong khi các Iá in vitro
mgng nr/óc thì khơng có Ióp bieu bì sáp bên
ngồi (Paek và Hahn, 2000). Nhúng Iá mgng
nUóc cüng dã bieu hiȘen st phát trien kém cúa
các t6 bào båo ve và khí khau b! dóng Iąi khi
so sánh vói nhđng Iá bình thU”ong. Khí khau
dóng ị nhúng lá mgng n0óc do cäu trúc khác
thU”ong cúa chúng gây ra bôi áp suät hoi n0óc
bão hịa trong bình ni cäy (Han et al. 1992,

Preece và Sutter, 1991).
Chuyen cây con ra wèn rïdm
Các choi có chiëu cao khồng 5 cm vói
bțo rë khơe mąnh (Hình 1g) diJğc dna ra trưng
thù nghiêm ngồi viJịn uom. Cây có su' sinh
trng và phát trien bình thu"ong sau 2 tháng
(Hình 1h) và sau 4 tháng (Hình 1i).

Khi tien hành nghiên cúu khí khau theo
phLfdng pháp cúa Molotkovxki (Grodzinxki và
TÀI LIEU THAM KHÀO

(1) Abraham GC and Rahman K (1986) Somatic embryogenesis in tissue culture of imma- ture
cotyledons of tea (Camellia spp.). In: Somers DA, Gengenbach BG, Biesboer DD, Hackett WP
and Green CE (eds), Abstr. 6th International Congress of Plant Tissue and GeII Culture.
University of Minnesota, Minneapolis 294 pp.
(2) Bano Z, Rajarathnam S, Mohanty BD (1991) Somatic embryogenesis in cotyledon cul- ture of tea
(Thea sinensis L.). J. Hort. Sci. 66: 465—470.


TẠP CHÍ KHOA H ỌC TRƯỜNG
ĐẠI HQC
HỌC MỞ
TP.HCM
- SỐ 2 (1) 2007
KHOA
- KŸ
THUAT

31

67

(3) Bhattacharya A and Ahuja PS (2003) Prospects of transgenics in tea crop improve- ment. In:
Singh R.P. and Jaiwal P.K. (eds), Plant Genetic Engineering. Improvement of Commercial
Plants -1. Scientific Technology Publishers, LLC, USA, pp. 115—130.

(4) Han BH, Paek KY, Choi JK (1992) Structural characteristics of vitrified and glaucous plantlets
in ypsophila paniculata L. in vitro. J. Korean Soc. Hort. Sci. 33: 177-189.

(5) Preece JE, Sutter EG (1991) Acclaimatization of micropropagated plants to green- house and
field. Debergh PC, Zimmerman RH. Micropropagation: Technology and application. Dordrecht.
The Netherlands Kluwers. 71-93.

(6) Jankun J, Selman SH, Swiercz R, Skrzypczak-Jankun E (1997) Why drinking green tea could
prevent cancer? Nature 387: 561.

(7) Jha TB, Jha S and Sen SK (1992) Somatic embryogenensis from immature cotyledons of an
elite Darjeeling tea clone. Plant Sci. 84: 209—213.

(8) Kato M (1982) Result of organ culture on Camellia japonica and C. sinensis. Jpn. J. Breed. 2
(Supplement 2): 267—277.

(9) Kato M (1996) Somatic embroygenesis from immature leaves of in vitro grown tea shoots.
Plant Cell Rep. 15: 920-923

(10)

Mondal TK, Bhattacharya A, Sood A, A’huija PS (1998) Micropropagation of tea
using thidiazuran. Plant Growth Reg. 26: 57-61.

(11)

Mondal TK, Bhattacharya A, Laxmikumaran M, Ahuja PS (2004) Recent advances of
tea (Camelia sinesis) biotechnology. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 76: 195-254.

(12)

Paek KY, Hahn EJ (2000) Cytokinins, auxins and activated charcoal affect organogenesis and antomical characteristics of shoot-tip cultures of Lisianthus [Eustoma grandiflorum
(RAF.) SHINN]. In vitro cell. Dev. Biol. Plant. 36. 128-132.

(13)

Sandal I, Kumar A, Bhattacharya A, Sharma M, Shanker M, Ahuja PS (2005)
Gradual depletion of 2,4-D “in the culture medium for indirect shoot regeneration from leaf
explants of Camellia sinensis (L.) O. Kuntze. Plant Growth Reg.47:121-127.

(14)

Tuan NS, Mai NT, Thuy DDT, Uyen NV and Nhut DT (2005) Shoot regeneration and
plant formation derived from in vitro root culture of sweet potato (Ipomoea batatas L.). In:
TUYEN BC, GIANG TT, MIEN BV, HIEN PP, HAY N, TRI BM (Eds.) Proc. Vietnam-Korea Int.
Sym. Biotech. Bio-system Eng. pp. 174-180.

TÓM TAT
Su tái sinh choi bät d!nh thông qua mô sęo tù mô Iá in vitro düğc cơng bƯ Ian dau tiên ơ
cây chè. Mơ sęo duğc hình thành trên mơi trng MS (Murashige và Skoog, 1962) có bo sung
các nong dơ khác nhau cúa BA, IBA. Các phát the choi bat d!nh phát trien tù mô giai doąn nuôi
cäy kéo dài trong 8 tuan trên mơi trng có bo sung 0,05 mg.I-1 IBA, 2,0 mg.1-1 BA và 1,0 mg.IABA. Các phát the choi phát trien tù mơ sęo, chỵ khi ABA di ğc thêm vào mơì trng ni cay
nham gây úc ch6 và chuyen hóa. Các choi tái sinh di c cäy truyen sang mơi trr/ịng MS3 có bƯ

32
68

TẠP CHÍ KHOA H ỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM - SỐ 2 (1) 2007
TAP CHÌ KHOA HOC SO 01(11)-2007

sung 3,0 mg.1-1 IBA và 1,0 g.I-1 than hoąt tính và mơi trng MS4 có bƯ sung 5,0 mg.1-1 IBA
và khơng có agar. Sau 4 tn ni cäy, các re bät d|nh diJ c hình thành. Cây con sinh tr0”ong và
phát trien bình thng ngồi vn com.
SUMMARY
Adventitious shoot regeneration via callus phase from in vitro leaf explants is reported for
the first time in tea. Callus was obtained on Murashige and Skoog (MS, 1962) medium supplemented with varied concentrations of BA, IBA. Adventitious shoot bubs developed indirectly on
leaf explants after prolonged culture for 8 weeks on medium supplemented with 0.05 mg.1-1 IBA,
2.0 mg.I-1 and 1.0 mg.I-1 ABA. Shoot bubs developed on calli, only when ABA added in the
medi- um culture probably due to inhibit and metabolism. Shoot bubs regeneration were
subcultured on MS3 medium supplemented with 3.0 mg.I-1 IBA and 1.0 g.I-1 activated charcoal
and MS4 medi- um supplemented with 5.0mg.1-1 IBA and non-agar. Then 4 weeks, adventìtious
roots were formed. Plantlets grew and developed normally in the greenhouse.