chiết tách, tinh chế, xác định cấu trúc một số hợp chất alcaloid trong rễ cây Lá ngón (Gelsemium elegans Benth.) ở Việt Nam

CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
H-NMR

: Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng
từ hạt nhân proton)

C-NMR

: Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng
hưởng từ hạt nhân cacbon-13)

1

13

DEPT

: Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer (Phổ DEPT)

H -1H-COSY: 1H -1H- Correlated Spectroscopy ( Phổ tương tác proton)

1

HSQC

: Heteronuclear Single Quantum Coherence

HMBC

: Heteronuclear Multiple Bond Correlation (Phổ tương tác dị hạt nhân
qua nhiều liên kết)

IR

: Infrared Spectroscopy (Phổ hồng ngoại)

ESI-MS

: Electron Spray Ionisation - Mass Spectroscopy (Phổ khối bụi
electron)

SKLM

: Sắc ký lớp mỏng

DMSO

: DiMethylSulfoxide

TMS

: Tetramethylsilan

s

: singulet

s (br)

: singulet tù

d

: dublet

dd

: dublet của dublet

dt

: dublet của triplet

m:

: multiplet

t

: triplet

td

: triplet của dublet

J (Hz)

: Hằng số tương tác tính bằng Hz

δ (ppm)

: Độ dịch chuyển hố học tính bằng ppm


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1: Số liệu các phân đoạn thu được chất tinh khiết........................................13
Bảng 2.2 : Số liệu phổ 1H-NMR của chất A2 (500 MHz, CDCl3)...........................16
Bảng 2.3 : Số liệu phổ 1H-NMR của chất A4 (500 MHz, DMSO)..........................19
Bảng 3.1: Kết quả định lượng alcaloid toàn phần trong rễ cây Lá ngón..................23
Bảng 3.2: Kết quả SKLM hệ dung mơi
Toluen: aceton: ethanol: amoniac đặc [45: 45: 7: 3]................................26
Bảng 3.3: Kết quả phân lập alcaloid bằng sắc ký cột...............................................28


MỞ ĐẦU
Nguồn cây cỏ trên đất nước ta vô cùng phong phú và đa dạng. Nó đã, đang và
sẽ trực tiếp hoặc gián tiếp góp phần giải quyết các nhu cầu của đời sống chúng ta về
ăn, mặc, ở, thuốc chữa bệnh, v.v. Cùng với việc tìm hiểu để sử dụng mặt có lợi của
cây cỏ, từ lâu người ta đã quan tâm đến mặt trái của vấn đề này, đó là những tác hại
của cây độc đối với con người và động vật.
Lĩnh vực nghiên cứu cây độc, có liên quan đến giám định hoá pháp các vụ ngộ
độc và bị đầu độc bằng cây cỏ. Nhưng quan trọng hơn cả là mối liên hệ giữa cây
độc và cây thuốc. Người ta đã sử dụng nhiều cây độc để làm thuốc như cà độc dược,
mã tiền, ô đầu... bởi vì hoạt tính của những cây này có tác dụng chữa bệnh khi dùng
đúng liều lượng và đúng bệnh khi đó cây độc trở thành cây thuốc. Ngược lại, một số
cây thuốc khi dùng khơng đúng chỉ định cũng có thể gây độc cho người bệnh. Sự
nhầm lẫn đó thường xảy ra và dẫn tới những vụ ngộ độc đáng tiếc không chỉ ở
những nước sử dụng rộng rãi cây cỏ để làm thuốc như nước ta, mà còn ở nhiều nơi
trên thế giới.
Cây Lá ngón (Gelsemium elegans Benth.) chứa hàm lượng alcaloid có độc

tính rất mạnh [5]. Hàng năm ở nước ta xảy ra nhiều vụ ngộ độc cây Lá ngón do sử
dụng nhầm lẫn, đầu độc, tự sát. Theo thống kê của Viện Pháp y Quốc gia, từ năm
2000 - 2004 số người tử vong do ngộ độc cây Lá ngón được giám định hóa pháp ở
các tỉnh miền Bắc là 82 người. Để đáp ứng yêu cầu giám định y pháp và phục vụ
công tác cấp cứu nạn nhân ngộ độc cây Lá ngón tại các trung tâm chống độc cần
phải có các chất chuẩn, phục vụ cho các phương pháp phân tích.
Trong luận văn này chúng tơi xin đóng góp một phần vào việc chiết tách, tinh
chế, xác định cấu trúc một số hợp chất alcaloid trong rễ cây Lá ngón (Gelsemium
elegans Benth.) ở Việt Nam.


Chương 1: TỔNG QUAN
1.1 Đại cương về cây độc
1.1.1 Khái niệm về cây độc
Cây độc là cây mà khi người hay động vật ăn phải, có khi chỉ một lượng nhỏ,
đã có thể gây ra những bệnh rối loạn trong cơ thể, nếu nặng có thể chết [5].
Số lượng cây độc trên trái đất khơng phải là ít, đến nay người ta đã biết hàng
nghìn lồi. Số lồi này thường tập trung vào nhóm cây hạt kín và ngành Nấm. Đặc
biệt ở lớp Ngọc lan (cây hai lá mầm) có tỷ lệ cây độc cao hơn ở lớp Hành (cây một
lá mầm). Các họ thực vật có nhiều cây độc như họ Thầu dầu, họ Trúc đào, họ Cà,
họ Đậu, họ Mã tiền v.v… Số loài cây độc ở vùng nhiệt đới nhiều hơn ở các vùng ôn
đới và hàn đới [5].
Nước ta có thảm thực vật phong phú, trong đó cũng có hàng trăm lồi cây
độc và khá nhiều loài nấm độc [5].
Các cây độc được chia làm hai nhóm, nhóm cây có độc tính ổn định kéo dài
suốt cả quá trình sinh trưởng và phát triển của chúng (như lá ngón, trúc đào, cà độc
dược…) và nhóm cây mà tính độc chỉ xuất hiện trong giai đoạn nhất định (như ở củ
khoai tây, chất độc solanin chỉ xuất hiện trong thời gian củ khoai tây nảy mầm và
chỉ tập trung ở mầm) [5].
Các chất thường gặp ở các cây độc rất phong phú và đa dạng, trong đó chủ

yếu là các alcaloid, glycozit, acid hữu cơ, lacton, và còn nhiều chất khác chưa được
nghiên cứu [5].
Sự phân bố của các chất độc trong từng bộ phận của một cây cũng khơng đều
nhau, đơi khi chúng được tích luỹ ở một phần nhất định như: tập trung ở hạt (thầu
dầu, mã tiền), ở quả (thuốc phiện, hồi núi), ở lá (trúc đào, cà độc dược…), ở rễ (ô
đầu, chút chít…), ở nhựa mủ (nhựa sui, nhựa xương rồng…). Cá biệt cịn có sự
tương phản điển hình trong cùng một cây, như ở cây củ đậu: người ta vẫn dùng củ
đậu để ăn, trong khi đó hạt của cây này có chất độc, có thể gây chết người khi ăn
phải một lượng nhỏ [5].


Trong quá trình phơi sấy chế biến cây cỏ cũng làm thay đổi một số tính chất
của chúng, vì có chứa các chất độc dễ bay hơi. Ngược lại, các cây độc chứa
alcaloid, độc tính khơng hề thay đổi khi phơi hoặc sấy. Các cây độc chứa glycozit
khi ủ làm thức ăn cho gia súc thì các quá trình lên men phát triển dẫn tới sự phá huỷ
hoàn toàn các glycozit độc. Trong khi đó ở một số cây, chất độc mới lại được hình
thành trong quá trình phơi sấy, chế biến hay ủ làm thức ăn [5].
1.1.2 Hợp chất alcaloid trong cây độc
Alcaloid là những hợp chất hữu cơ, có chứa nitơ, đa số có nhân dị vịng, có
phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi trong động vật, thường có hoạt
tính sinh học mạnh và cho phản ứng hoá học với một số thuốc thử gọi là thuốc thử
chung của alcaloid [12].
Trong cây, các alcaloid thường ở dạng muối của các acid malic, limonic,
oxalic, sucxinic, … Chúng đều dễ tan trong nước, vì vậy dễ hấp thụ qua bộ máy tiêu
hoá của người và động vật. Khi ở dạng tự do, chúng khó tan trong nước nhưng lại
dễ tan trong các dung môi hữu cơ như ethanol, ether, chloroform [5].
Các alcaloid khi tác dụng với một số acid như acid silicotungstic, acid
photphomolipdic và tanin, dễ dàng bị tủa, trở thành chất khó tan trong nước. Lợi
dụng tính chất này người ta dùng acid tanic hoặc nước sắc các cây có chứa tanin để
giải độc khi bị ngộ độc alcaloid [5].

Hàm lượng của alcaloid trong cây dễ dàng thay đổi. Ngày nay, với những
phương pháp hiện đại người ta có thể phát hiện được vết của chúng trong nhiều lồi,
nhưng chỉ quy ước nói cây có alcaloid khi hàm lượng của chúng lớn hơn một phần
vạn. Tỷ lệ alcaloid trong nhiều cây chiếm từ một phần vạn đến vài phần trăm so với
trọng lượng khô của cây. Đặc biệt, trong vỏ cây canhkina có thể tới 10 phần trăm
[5].
Nhiều tổng kết cho thấy đại đa số cây có chứa alcaloid là cây hai lá mầm.
Theo thống kê đến nay thì cây thuộc thảo và cây bụi có nhiều alcaloid hơn cây gỗ.
Cây một năm thường chứa nhiều alcaloid hơn cây lưu niên [7].


1.2 Cây Lá ngón
1.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bố

Hình 1: Gelsemium elegans Benth.
Cây Lá ngón mọc tại Việt Nam có tên khoa học là Gelsemium elegans
Benth., thuộc họ Mã tiền (Loganiaceae) [6], cịn có tên gọi là: Co ngón, Thuốc r út
ruột, Hồ mạn trường, Đại trà đắng, Hồ mạn đằng, Hoàng đằng, Cầu vẫn [5], Đoạn
trường thảo, Ngón vàng, Khau ngn [11].
Cây Lá ngón là loại cây mọc leo, dài 5 - 7 m. Thân cành hình trụ [11], khơng có
lơng , trên thân hơi có khía dọc. Lá mọc đối, hình trứng thn dài, hơi hình mác,
mép ngun, mặt nhẵn bóng [1]. Hoa mọc hình xim ở đầu cành hay kẽ lá, cánh hoa
màu vàng có thể có hoa trắng [4]. Quả nang, màu nâu. Hạt nhỏ, có rìa mỏng bao
quanh, mép khía rách. Mùa hoa vào tháng 10 - 12, mùa quả vào tháng 1 - 3 [11].
Cây Lá ngón phân bố chủ yếu ở Nam và Đông Nam châu Á như: Ấn Độ,
Thái Lan, Indonesia, Lào, Srilanca, Malaysia, Trung Quốc, và Việt Nam [15]. Ở
Việt Nam cây mọc hoang khá phổ biến ở các vùng núi cao như: Hà Giang, Tuyên
Quang, Lai Châu, Sơn La, Lào Cai, Lạng Sơn, Hồ Bình, Quảng Ninh, Quảng nam,
các tỉnh Tây Nguyên…[2, 11].
Ngoài loài Gelsemium elegans Benth., trên thế giới cịn có 2 lồi cây Lá

ngón mọc tại Bắc Mĩ [11] có tên khoa học là: Gelsemium sempervirens (Linne) [21]
và Gelsemium rankinii [20].


1.2.2 Độc tính và tác dụng
Cây Lá ngón có độc tính rất mạnh, Chất độc chính là các alcaloid có trong
toàn cây. Độc nhất là rễ và lá non, rồi đến lá thường và hoa, thân và quả; thân già
độc hơn thân non. Nguời ta cho rằng chỉ cần ăn 3 lá kèm theo một chén rượu có thể
làm chết một người sau vài giờ. Chính vì vậy nhân dân ta thường khơng dùng cây
Lá ngón để làm thuốc [5, 6, 11].
Triệu chứng ngộ độc cây Lá ngón là khát nước, sốt, đau rát họng, đau bụng,
nôn mửa, tiếp theo là hoa mắt, răng cắn chặt, sùi bọt mép, thân nhiệt hạ, huyết áp
hạ, cuối cúng là chết do ngừng hô hấp [11]. Trong dân gian người ta thường dùng
mỡ lợn, dầu lạc để uống, hoặc dùng dịch chiết rau má và rau muống để làm hồi tỉnh
lại [1].
Theo Võ Văn Chi, cây Lá ngón có vị đắng, cay, tính nóng, rất độc; có tác
dụng thanh nhiệt, tiêu thũng, bạt độc, giảm đau, sát trùng, chống ngứa. Lá cây tươi
giã nhỏ đắp ngoài hoặc nấu nước rửa ngoài để trị các bệnh như: eczema, nấm ở
chân, ở thân; đòn ngã tổn thương, đụng giập; trĩ, tràng nhạc; đinh nhọt, viêm mủ da;
phong hủi [1].
Trong y học cổ truyền của Nhật Bản, người ta cũng sử dụng cây Lá ngón để
trị các bệnh lở loét, viêm da, ung nhọt [16]. Ở Trung Quốc và Bắc Mĩ bên cạnh
những sử dụng tương tự như trên người ta con sử dụng rễ để chữa các bệnh động
kinh và giảm đau [6].
Gần đây đã có nhiều cơng trình khoa học nghiên cứu về tác dụng dược lý
như: giảm đau, chống viêm, chống ung thư từ cây Lá ngón [3, 16, 18].
1.2.3 Các hợp chất alkaloid
Những năm gần đây, các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu nhiều về
cây độc Gelsemium elegans Benth., thu hái tại Bắc Mĩ, Thái Lan, Trung Quốc.
Nhiều alcaloid có nhân indol (1) đã được phân lập và xác định cấu trúc, chủ yếu là

các alcaloid thuộc phân nhóm oxindol và indolenin [3, 19].


(1)
Chúng ta có thể chia các alcaloid có nhân indol trong cây Lá ngón thành 5
phân nhóm [19].
- Nhóm 1: Các alcaloid loại sarpagin
- Nhóm 2: Các alcaloid loại koumin
- Nhóm 3: Các alcaloid loại humantenin
- Nhóm 4: Các alcaloid loại gelsemin
- Nhóm 5: Các alcaloid loại gelsedin và gelselegin
Trong đó các alcaloid thuộc nhóm 1 có nhân indol, thuộc nhóm 3, 4, 5 có
khung oxindol [19], cịn các alcaloid thuộc nhóm 2 có khung indolenin [3].
Nhóm 1 bao gồm các alcaloid: koumidin (2), 19 - (z)- akuammidin (3) [3].

(2) koumidin

(3) 19 - (z) - akuammidin

Nhóm 2 bao gồm các alcaloid: koumin (4) [14], 19 - (R) hydroxydihydrokoumin (5), 19 - (S) - hydroxydihydrokoumin (6) [3].

(4) koumin

(5) 19 - (R) - hydroxydihydrokoumin
(6) 19 - (S) - hydroxydihydrokoumin


Nhóm 3 bao gồm các alcaloid: humantenirin (7), humantenin (8), 11 hydroxyhumantenin (9), 11 - metoxyhumantenin (10), rankinidin (11), N desmetoxyrankinidin (12), 11- hydroxyrankinidin (13) [3], Ngồi ra cịn có 11 hydroxyhuman - humantenine [15].

(7) R1 = OCH3

R2 = H

R3 = OCH3

: humantenirin [19]

(8) R1 = OCH3

R2 = H

R3 = H

: humantenin [19]

(9) R1 = OCH3

R2 = OCH3

R3 = OH

: 11 - hydroxyhumantenin

(10) R1= OCH3

R2 = OCH3

R3 = OCH3

: 11 - metoxyhumantenin

(11) R1 = OCH3

R2 = H

R3 = H

: rankinidin

(12) R1 = H

R2 = H

R3 = H

: N - desmetoxyrankinidin

(13) R1 = OCH3

R2 = H

R3 = OH

: 11 - hydroxyrankinidin

Nhóm 4 bao gồm các alcaloid: gelsemin (14), gelsevirin (15), 21 oxogelsemin (16), 21 - oxogelsevirin (17), 19 - (R) - hydroxydihydrogelsevirin (18),
19 - (R) - acetyldihydrogelsevirin (19), 19 - (S) - hydroxydihydrogelsevirin (20), 19
- (R) - hydroxydihydrogelsemin (21) [3].

(14) R = H

: gelsemin
(16) R = H
: 21 - oxogelsemin
(15) R = OCH3 : gelsevirin(17) R = OCH3 : 21 - oxogelsevirin


(18) R1 = OCH3

R2 = OH

: 19 - (R) - hydroxydihydrogelsevirin

(19) R1 = OCH3

R2 = OAc

: 19 - (R) - hcetyldihydrogelsevirin

(20) R1 = OCH3

R2 = OH

: 19 - (S) - hydroxydihydrogelsevirin

(21) R1 =H

R2 = OH

: 19 - (R) - hydroxydihydrogelsemin

Nhóm 5 bao gồm các alcaloid: gelselegin (22), 11 - metoxy - 19 hydroxygelselegin (23) [19, 3], gelsenicin (24), elegansamin (25), gelsedin (26),
gelsemicin (27), 14 - ß - hydroxygelsedin (28), 14 - ß - hydroxygelsemicin (29) [3],
14,15 dihydroxygelsenicine (30), 14 - hydroxy - 19 - oxogelsenicin (31), 14 acetoxygelsenicin (32), 14 - acetoxy - 15 - hydroxygelsenicin (33), 14 acetoxygelselegin (34) [16, 17], gelsamydin (35), 19 - hyđroxygelsamyin (36), [3].
Ngoài ra cịn có 4 monoterpenoid oxindol alcaloid mới được tách ra từ phần lá, có
liên quan đến Gelsenicin là: gelsedilam C 17H18N2O4, 14 - acetoxygelsedilam
C19H20N2O6, gelsefuranidin C24H25N2O5, và gelseiridon C29H35N2O8 [17].

(22) R1 = H

R2 = H: gelselegin

(23) R1 = OCH3

R2 = OH

: 11 - methoxy - 19 - hydroxygelselegin


(24) R = H

: gelsenicin

(25) R = iridoit

: elegansamin

R = iridoit

(26) R1 = H R2 = H: gelsedin
(27) R1 = H R2 = OCH3

: gelsemicin

(28) R1 = OH R2 = H: 14 - ß - hydroxygelsedin
(29) R1 = OH R2 = OCH3

(30) 14,15 Dihydroxygelsenicin

: 14 - ß - hydroxygelsemicin

(31) 14 - Hydroxy - 19 - oxogelsenicin


(32) R = H

14 - acetoxygelsenicin

(34) 14 - acetoxygelselegin

(33) R = OH 14 - acetoxy - 15 - hydroxygelsenicin

(35) gelsamydin

(36) 19 - hyđroxygelsamyin

Ngồi ra cịn tìm thấy trong cây Lá ngón có các alcaloid: gelsemamit, 11 metoxygelsemamit, sempervirin, ... [3, 11].
Năm 1981, Hoàng Văn Tố và các cộng sự đã phân lập và xác định được cấu
trúc của koumin và gelsemin từ Lá ngón thu hái tại Hồ Bình, Việt Nam [10]. Đến
năm 2004, Lại Thị Kim Dung phân lập và xác định được gelsemin, gelsevirin,
humantenin, gelsenicin, 19 - (Z) - ankuammidin và koumin từ Lá ngón (Gelsemium

elegans Benth.) thu hái tại Lạng Sơn, Việt Nam [3].
1.2.4 Các hợp chất khác
Ngồi các hợp chất alcaloid, trong cây Lá ngón cịn chứa nhiều hợp chất
khác như: coumarin, tinh dầu, các acid béo (palmitic, stearic, oleic, linoleic), npentatriacomtan, tanin [10].


Chương 2: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Trong quá trình chiết tách alcaloid tồn phần, chúng tơi thu được hai phân
đoạn là: cặn chiết alcaloid và một chất alcaloid tương đối sạch ký hiệu là A8. A8
thu được khi kiềm hoá dịch chiết alcaloid trong mơi trường nước - acid, có giá trị R f
= 0,06 khi chạy hệ dung môi toluen: aceton: ethanol: amoniac đặc [45: 45: 7: 3], là
một chất phát quang ở bước sóng 254 nm, khơng tan trong nước, rất ít tan trong
ethanol, tan tương đối trong methanol, tan tốt trong ethanol - H2SO4.
Tiến hành chạy sắc ký cột từ cặn chiết alcaloid chúng tôi thu được 3 phân
đoạn lớn. Phân đoạn II thu được chất dầu. Phân đoạn IV thu được chất bột, màu
trăng. Phân đoạn VII thu được chất rắn, sau khi tiến hành kết tinh lại chúng tôi thu
được chất tinh khiết. Kết quả được tóm tắt ở bảng 2.1.
Bảng 2.1: Số liệu các phân đoạn thu được chất tinh khiết
STT các

Ký hiệu

Rf

phân đoạn lớn

Lượng tách ra

Hàm lượng

(mg)

(%)

II

A1

0,85

246,5

4,740

IV

A2

0,75

106,9

2,056

VII

A4

0,62

447,6

8,607

Các chất sạch A2 và A4 đã được ghi phổ để xác định cấu trúc hoá học. Ngoài
các loại phổ sơ bộ nhận dạng như UV và IR, để xác định cấu trúc của các hợp chất
A1 và A2 chúng tôi đã sử dụng các loại phổ ESI-MS, NMR ( 1H-HNR, 13C-HMR,
DEPT, COSY, HSQC, HMBC).
2.1 Nhận dạng chất A2
Chất A2 là chất bột, không màu.
Chất A2 tan tốt trong các dung môi hữu cơ như ethanol, chloroform, … ,
khơng tan trong nước.
- Nhiệt độ nóng chảy: 2450C
- Phổ UV: đo trong MeOH cho các đỉnh hấp thụ cực đại λ max: 209 nm và 255
nm.


- Phổ IR: đo dưới dạng viên nén KBr cho các đỉnh hấp phụ mạnh ở 3433;
3089; 2931; 2866; 1724; 1620; 1462; 1313; 1230; 1078; 1039; 869; 750 cm-1.
- Phổ khối (ESI-MS): phương pháp ion hoá bằng bụi electron, chất A2 có số
khối của pic phân tử [M+H] = 353, tương ứng với cơng thức cấu tạo C21H24N2O3.
Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton và carbon 1 chiều và 2 chiều
(1D, 2D, 1H, 13C-NMR).
- Phổ công hưởng từ hạt nhân: các tín hiệu của phổ cơng hưởng từ hạt nhân 1
chiều (1D-NMR) như phổ 1H-NMR, cho các thông tin sau :
Phổ proton (1H-NMR) chất A2 được đo trong CDCl 3 (500MHz) cho 24 tín
hiệu proton có độ dịch chuyển hóa học từ 2,00 đến 7,45 ppm, đúng bằng số proton
có mặt trong Gelsevirin. Ở vùng trường thấp từ 6,96 - 7,45 ppm, có tín hiệu của 4
proton thơm, đó là các proton của nhân indol bị thế, trong đó proton H 9 có độ dịch
chuyển hóa học xa nhất (7,45 ppm) về phía trường thấp do hiệu ứng điện tử Nitơ

của nhân oxindol. Ở vùng trường tiếp theo từ 6,23 - 4,98 ppm, có tín hiệu của 3
proton olefin (liên kết đôi). Ở vùng trường cao hơn từ 4,09 - 2,00 ppm, có 17 tín
hiệu proton là các tín hiệu của vịng monoterpen, N-methoxy và N-methyl.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D-MNR), phổ COSY ( 1H-1H, NMR)
cho phép xác định các tương tác giữa proton và proton. Ở vùng dịch chuyển hóa học
của các proton thơm (4 proton: H12, H9, H11 và H10), cho thấy mỗi proton thơm
tương tác với 2 proton gần nó ở vị trí othor (Jor = 7,5 - 8,0 Hz) và meta (Jm = 1
Hz).
Ở vùng dịch chuyển hóa học δ = 5,16 và 4,98 ppm, proton H18 là proton
olefin (H18α và H18β) tương tác với H19 (δ = 6,23)có hằng số tương tác lớn (J = 11 Hz
và J = 17,5 Hz).
Tương tự như vậy, khi xét tương tác từng cặp proton tương tác với nhau dựa
trên phổ COSY và phổ hai chiều HSQC, các proton còn lại được xác định như H 17α
và H17β; H21α và H21β; H3, H5, H15, H16 và H6 cũng như nhóm N-OCH3, N-CH3. Chi tiết
độ dịch chuyển hóa học, dạng pic và hằng số tương tác giữa các proton được tóm tắt
trên bảng 2.2.


Phổ cộng hưởng từ 1 chiều 13C-NMR, DEPT 90 và DEPT 135 cho biết chất
A2 có 21 nguyên tử carbon, trong đó có 2 nhóm CH 3, 4 nhóm CH2, 10 nhóm CH và
5 carbon bậc 4 (Cq).
Phổ hai chiều HSQC cho biết các tương tác 1J của proton với nguyên tử
carbon. Đặc biệt các nhóm methylene (CH 2) có 2 proton tương tác với 1 nguyên tử
carbon như δH 5,16 ; 4,98/δC 113,5 đó là proton H18 - C18; δH 2,77 ; 2,47/δC 65,8 đó là
proton H21 - C12; δH 4,09 ; 3,91/δC 61,4 đó là proton H17 - C17; δH 2,84 ; 2,02/δC 23,0
đó là proton H14 - C14.
Từ phổ HSQC các carbon bậc 1 (CH 3), bậc 2 (CH2) và bậc 3 (CH) được xác
định. Từ các nguyên tử carbon bậc 1, bậc 2 và bậc 3 đã được xác định ở trên kết
hợp với phổ HSBC (cho biết tương tác xa 3J hay 4J giữa proton và nguyên tử
carbon) các carbon bậc 4 (Cq) được xác định.

Gelsevirin

Bảng 2.2 : Số liệu phổ 1H-NMR của chất A2 (500 MHz, CDCl3)


Hằng số tương tác

Độ dịch chuyển

J (Hz)

hóa học δ (ppm)

Vị trí proton

Số proton

Độ bội

H9

1H

d

J = 7,5 Hz

7,45

H11

1H

dt

J = 1 Hz; J = 8 Hz

7,30

H10

1H

dt

J = 1 Hz; J = 7,5 Hz

7,06

H12

1H

d

J = 8 Hz

6,96

H19

1H

dd

J = 11 Hz; J = 17,5 Hz

6,23

H18α

1H

dd

J = 1 Hz; J = 11 Hz

5,16

H18β

1H

dd

J = 1 Hz; J = 18 Hz

4,98

H17α

1H

dd

J = 2 Hz; J = 11 Hz

4,09

N-OCH3

3H

s

H17β

1H

dd

H3

1H

s (br)

3,81

H5

1H

s

3,48

H14α

1H

dd

J = 3 Hz; J = 14,5 Hz

2,84

H21α

1H

d

J = 11 Hz

2,77

H16

1H

d

J = 8,5 Hz

2,51

H21β

1H

d

J = 11 Hz

2,47

H15

1H

t

J = 6,5 Hz

2,34

N-CH3

3H

s

H14β

1H

ddd

3,97
J = 2 Hz; J = 11,5 Hz

3,91

2,30
J = 3Hz; J = 5,5Hz; J =

2,02

14,5Hz
H6

1H

s

2,00

Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3, δ ppm) :

172,7 (C2); 139,5 (C13); 137,6 (C19); 128,4 (C9); 128,2 (C11); 127,8 (C8); 122,9 (C10);
113,5 (C18); 107,2 (C12); 72,4 (C5); 69,4 (C3); 65,8 (C21); 63,2 (OCH3); 61,4 (C17);
54,0 (C20); 52,2 (C7); 50,7 (C6); 40,9 (N-CH3); 38,3 (C16); 35,7 (C15); 23,0 (C14).


Qua phân tích phổ và so sánh với số liệu đã công bố trong tài liệu [3], chất
A2 được xác định cấu trúc là Gelsevirin.
2.2 Nhận dạng chất A4
Chất A4 kết tinh trong acetone, là tinh thể khơng màu, hình khối.
Chất A4 tan tốt trong các dung môi hữu cơ như ethanol, methanol,
chloroform… , không tan trong nước.
- Nhiệt độ nóng chảy: 1700 C.
- Phổ UV: đo trong MeOH cho các đỉnh hấp thụ cực đại λ max: 222 nm và 266
nm.
- Phổ IR: đo dưới dạng viên nén KBr cho các đỉnh hấp phụ mạnh ở 3462;
3261; 3067; 2924; 2852; 2780; 1740; 1627; 1577; 1442; 1320; 1237; 1157; 1074;
988; 927; 852; 778; 753 cm-1.
- Phổ khối (ESI-MS): phương pháp ion hóa bằng bụi electron , chất A4 có số
khối của pic phân tử [M+H] = 307, tương ứng với cơng thức cấu tạo C20H22N2O.

Koumin
Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton và carbon 1 chiều và 2 chiều
(1D, 2D, 1H, 13C-NMR).


- Phổ cơng hưởng từ hạt nhân: các tín hiệu của phổ công hưởng từ hạt nhân 1
chiều (1D-NMR) như phổ 1H-NMR, cho các thông tin sau:
Phổ proton (1H-NMR) chất A4 được đo trong DMSO (500MHz) cho 22 tín
hiệu proton có độ dịch chuyển hóa học từ 1,67 đến 7,57 ppm, đúng bằng số proton
có mặt trong Koumin. Các tín hiệu này có thể được chia làm 2 vùng: ở vùng trường

thấp từ 7,51 - 7,57 ppm, có tín hiệu của 4 proton thơm, đó là các proton của nhân
indolein bị thế, trong đó proton H9 có độ dịch chuyển hóa học xa nhất (7,57 ppm) về
phía trường thấp do hiệu ứng điện tử Nitơ của nhân indolein. Ở vùng trường cao
hơn từ 4,83 - 1,67 ppm, có 18 tín hiệu proton trong đó các tín hiệu proton ở phía
trường thấp là các proton olefin (liên kết đôi), methine (CH-) và đặc biệt là nhóm
methylenoxy, cịn lại là các tín hiệu của proton methylene (CH2-) và methyl (CH3-).
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D-MNR), phổ COSY ( 1H-1H, NMR)
cho phép xác định các tương tác giữa proton và proton. Ở vùng dịch chuyển hóa học
của các proton thơm (4 proton: H12, H9, H11 và H10), cho thấy mỗi proton thơm
tương tác với 2 proton gần nó ở vị trí othor (Jor = 7,5 Hz) và meta (Jm = 1,5 Hz).
Ở vùng dịch chuyển hóa học ở trường cao hơn δ = 4,83 ppm, proton H 18 là proton
olefin (H18α và H18β) tương tác với H19 có hằng số tương tác lớn (J = 11 Hz và J = 18
Hz). Có độ dịch chuyển hóa học δ = 4,81 ppm là proton H 3 có tín hiệu là triplet (t)
tương tác với 2 proton H14α và H14β, proton H3 này đã dịch chuyển mạnh về phía
trường thấp do hiệu ứng điện tử của nguyên tử Oxy.
Ở vùng dịch chuyển hóa học tiếp theo về phía trường cao hơn, 2 proton H 21α
và H21β tương tác với nhau có hằng số tương tác J = 12 Hz.
Tương tự như vậy, khi xét tương tác từng cặp proton tương tác với nhau dựa
trên phổ COSY và phổ hai chiều HSQC, các proton còn lại được xác định như H 17α
và H17β; H6α và H6β; H5, H15 và H16 cũng như nhóm N-CH3. Chi tiết độ dịch chuyển
hóa học, dạng pic và hằng số tương tác giữa các proton được tóm tắt trên bảng 2.3.
Bảng 2.3 : Số liệu phổ 1H-NMR của chất A4 (500 MHz, DMSO)
Vị trí proton Số

Độ bội

Hằng số tương tác

Độ dịch chuyển

proton

J (Hz)

hóa học δ (ppm)

H9

1H

d

J = 7 Hz

7,57

H12

1H

d

J = 7,5 Hz

7,51

H11

1H

dt

J = 1,5 Hz; J = 7,5 Hz

7,33

H10

1H

dt

J = 1,5 Hz; J = 7 Hz

7,24

H18α

1H

dd

J = 1 Hz; J = 18 Hz

4,83

H3

1H

t

J = 1,5 Hz

4,81

H18β

1H

dd

J = 1 Hz; J=11,5 Hz

4,74

H19

1H

dd

J = 11,5 Hz; J = 18

4,57

Hz
H21α

1H

dd

J = 4,5 Hz; J= 11,5

4,14

Hz
H21β

1H

d

J = 11,5 Hz

3,51

H17α

1H

d

J = 11 Hz

3,05

H17β

1H

d

J = 11 Hz

2,96

H5

1H

m

2,74

H16

1H

m

2,71

H14α

1H

td

N-CH3

3H

s

2,48

H15

1H

m

2,26

H6α

1H

m

2,24

H6β

1H

dd

J = 4 Hz; J = 14 Hz

2,13

H14β

1H

td

J = 2 Hz; J = 14,5 Hz

1,67

J = 3,5 Hz; J = 15 Hz

2,58

Phổ cộng hưởng từ 1 chiều 13C-NMR, DEPT 90 và DEPT 135 cho biết chất
A4 có 20 nguyên tử carbon, trong đó có một nhóm CH 3, 5 nhóm CH2, 9 nhóm CH
và 5 carbon bậc 4 (Cq).
Phổ hai chiều HSQC cho biết các tương tác 1J của proton với nguyên tử
carbon. Đặc biệt các nhóm methylene (CH 2) có 2 proton tương tác với 1 nguyên tử


carbon như δH 4,83 ; 4,74/δC 115,74 đó là proton H18 - C18; δH 4,14 ; 3,51/δC 60,5 đó
là proton H21 - C12; δH 3,05 ; 2,96/δC 56,9 đó là proton H17 - C17; δH 2,58 ; 1,67/δC
24,7 đó là proton H14 - C14; δH 2,24 ; 2,13/δC 28,6 đó là proton H6 - C6.
Từ phổ HSQC các carbon bậc 1 (CH 3), bậc 2 (CH2) và bậc 3 (CH) được xác

định. Từ các nguyên tử carbon đã được xác định ở trên kết hợp với phổ HMBC
(tương tác xa 3J hay 4J giữa proton và nguyên tử carbon) các carbon bậc 4 (Cq) được
xác định.
Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO, δ ppm) :
185,5 (C2); 154,5 (C13); 143,8 (C8); 137,5 (C19); 127,9 (C11); 125,8 (C10); 123,1 (C9);
120,4 (C12); 115,7 (C18); 69,9 (C3); 60,5 (C21); 57,4 (C7); 56,9 (C17); 55,8 (C5); 44,8
(C20); 42,2 (N-CH3); 37,9 (C16); 32,4 (C15); 28,6 (C6); 24,7 (C14).
Qua phân tích phổ và so sánh với số liệu đã công bố trong tài liệu [3, 13],
chất A4 được xác định cấu trúc là koumin. Koumin (Kou - Wen) tiếng Trung Quốc
có nghĩa là độc, đã được phân lập từ cây Gelsemium elegans vào năm 1932, nhưng
đến năm 1981 cấu trúc của nó mới được xác định bằng phổ cộng hưởng từ phân giải
cao và khẳng định lại bằng phương pháp phổ nhiễu xạ tia X [13]. Koumin có cấu
trúc của nhóm chất corynanthein alcaloid và có cấu hình tuyệt đối ở C15.

Chương 3: THỰC NGHIỆM