Nghiên cứu ứng dụng phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào trong nhân nhanh in vitro cho một số giống địa lan có giá trị doc

nghiên cứu ứng dụng phơng pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào trong
nhân nhanh in vitro cho một số giống địa lan có giá trị
Study on application of thin cell layer culture for in vitro propagation of some valuable
cymbidium varieties
Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Nga,
Nguyễn Thị Lý Anh, Vũ Thị Hoài
Summary
The thin cell layer method was suggeted by Tran Thanh Van K. We use this method to complete
micropropagation of Cymbidium.
Experiments were carried out on varieties Miss Kim, Xanh Chieu and Hong Bet originated from China
and Viet Nam. The tissue culture was done in artificial conditions (adjustable light, temperature,
humidity). There ware 15-50 explants in each variant of experiments. In optimal medium: MS + 150ml
coconut water + 1mg kinetin + 10g sucrose + 6,5g agar per lit (for variety Miss Kim) and MS + 150ml
coconut water + 1mg BA + 10g sucrose + 6,5g agar per lit (for variety Xanh chieu), the thin layers with
size 0,3 0,5 mm gave best rate of protocorm formation. Number of protocorms per thin cell layer ware
6,23 (Miss Kim) and 4,21 (Xanh Chieu).
Above results show that, the thin cell layer culture is successful method for rapid multiplication of
Cymbidium.
Key words: Cymbidium, thin cell layer, protocorm

1. Đặt vấn đề
Phơng pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào đã đợc Trần Thanh Vân đề xuất (2000) và trở thành một trong
những phơng pháp nhân nhanh in vitro có hiệu quả. Trong vài năm trở lại đây, phơng pháp này đợc
nghiên cứu ứng dụng tại một số phòng nuôi cấy mô ở Việt Nam và đã đem lại kết quả đáng kể trong quá
trình nhân nhanh một số đối tợng nh: phong lan (Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Nga, 2000), dứa
(Nguyễn Quang Thạch và CS, 2004) và các cây trồng khác (Dơng Tấn Nhật, 2001).
Nhằm cải tiến và hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cho cây địa lan, chúng tôi đã tiến hành Nghiên
cứu ứng dụng phơng pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào trong nhân nhanh in vitro cho một số giống địa lan
có giá trị. .
2. vật liệu, phơng pháp nghiên cứu
2.1. Vật liệu nghiên cứu

Các giống địa lan dùng trong nghiên cứu là: Miss Kim (nguồn gốc từ Trung Quốc), Xanh chiểu, Hồng
Bệt (2 giống đợc a chuộng và phổ biến ở Đà Lạt) .
2.2. Phơng pháp nghiên cứu
+ Điều kiện nuôi cấy: các thí nghiệm nuôi cấy in vitro đợc thực hiện trong điều kiện nhân tạo cho phép
chủ động điều chỉnh các chế độ ánh sáng, nhiệt độ, ẩm độ.
+ Các thí nghiệm đợc bố trí ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, mỗi công thức theo dõi 15 - 50 cá thể.
+ Thí nghiệm đợc quan sát, theo dõi thờng xuyên 10 - 15 ngày/lần
+ Số liệu đợc xử lý thống kê theo chơng trình IRRISTAT.
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Nghiên cứu ảnh h
ởng của kích thớc lát cắt mỏng đến sự hình thành protocorm
Với mục đích để tăng nhanh số lợng protocorm, chúng tôi đã tiến hành các nghiên cứu nuôi cấy lát
mỏng cắt từ thể protocorm ban đầu với độ dày từ 0,1mm 1mm trên môi trờng MS +1% saccarose +
1ppm kinetin (K) + 0,65% agar. Đây là môi trờng phù hợp cho nhân nhanh các thể protocorm nguyên vẹn
đã đợc xác định đợc trong các nghiên cứu trớc (Nguyễn Quang Thạch và cs, 2000; 2004). Kết quả thí
nghiệm trình bày trong bảng 1.
Bảng 1. ảnh hởng của kích thớc lát mỏng đến khả năng tạo protocorm (sau 8 tuần )
Giống địa lan Kích thớc
lát cắt (mm)
Tỷ lệ sống (%) Protocorm/lát
cắt
0,1 16,60 2,00
0,3 63,65 3,00
0,5 75,41 2,83
0,7 87,45 2,50
Xanh chiểu
1,0 92,18 2,30
0,1 33,67 2,25
0,3 57,61 3,33
0,5 69,56 3,00

0,7 81,64 2,57
Hồng bệt
1,0 94,28 2,37
Nh vậy, kích thớc của lát cắt có ảnh hởng rõ rệt đến tỷ lệ sống và sự hình thành protocorm. Nếu
độ dày của lát cắt tăng thì tỷ lệ sống tăng nhng tỷ lệ tạo protocorm lại giảm và ngợc lại. ở kích thớc từ
0,3 - 0,5mm kết quả đạt đợc là cao nhất với tỷ lệ sống là 63,65 - 75,41% và số protocorm/lát cắt là 3,00
2,83 protocorm cho giống Xanh chiểu, còn đối với giống Hồng bệt các chỉ tiêu tơng tự là: 57,61- 69,56%
và 3,33 - 3,00 protocorm. Nh vậy, các lát cắt với độ dày 0,3 - 0,5 mm là phù hợp cho việc nuôi cấy để tạo
protocorm.
3.2. Nghiên cứu ảnh hởng của phơng thức nuôi cấy đến khả năng tạo protocorm
Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng môi trờng nuôi cấy: MS +1% đờng + 1ppmK + 0,65%
agar/ 1lít môi trờng. Các lát mỏng tế bào đã đợc nuôi cấy tĩnh trên môi trờng đặc, môi trờng lỏng và
nuôi cấy lắc trong môi trờng lỏng.
Bảng 2. ảnh hởng của phơng thức nuôi cấy đến khả năng tạo protocorm (sau 8 tuần )
Xanh chiểu Hồng bệt
Phơng thức
nuôi cấy
Kích thớc
lát cắt
(mm)
Tỷ lệ sống (%) Protocorm /lát
cắt
Tỷ lệ sống (%) Protocorm /lát
cắt
0,3 63,65 3,00 57,61 3,33 Đặc
0,5 75,41 2,83 69,56 3,00
0,3 37,21 2,67 37,43 2,88
Lỏng + không
lắc
0,5 42,16 2,50 47,28 2,50

0,3 43,54 4,67 49,24 4,00
Lỏng + lắc
0,5 59,82 3,30 57,37 3,25
Số liệu thực nghiệm ở bảng 2 cho thấy: không chỉ độ dày của lớp cắt mà phơng thức nuôi cấy cũng
là nhân tố tác động mạnh mẽ đến tỷ lệ sống và khả năng tạo protocorm của lát cắt nuôi cấy. Trong cả ba
phơng thức nuôi cấy, lát cắt có độ dày 0,3mm đều có tỷ lệ sống thấp hơn nhng số protocorm tạo thành
/lát cắt nhiều hơn so với lát cắt dày 0,5mm. Phơng thức nuôi cấy tĩnh trong môi trờng lỏng có hiệu quả
kém nhất do tỷ lệ mẫu chết cao và số protocorm/lát cắt thấp nhất. Phơng thức nuôi cấy lắc trong môi
trờng lỏng tuy có số protocorm/lát cắt cao nhất nhng tỷ lệ sống của lát cắt không cao nên tổng số
protocorm tạo đợc vẫn ít hơn so với phơng thức nuôi cấy tĩnh trên môi trờng đặc. Vì vậy, với các lát
mỏng tế bào phơng thức nuôi cấy tĩnh trên môi trờng đặc là hiệu quả hơn cả. Quy luật này thể hiện trên
cả hai giống nghiên cứu (Xanh chiểu và Hồng bệt).
3.3. Nghiên cứu ảnh hởng của chất điều tiết sinh trởng đến khả năng tạo protocorm
Khi đã xác định đợc độ dày lát cắt và phơng thức nuôi cấy phù hợp, chúng tôi cũng đã bổ sung các
chất điều tiết sinh trởng khác nhau ở trạng thái riêng rẽ cũng nh dạng tổ hợp vào môi trờng nuôi cấy
nhằm tìm ra tổ hợp và nồng độ thích hợp nhất vừa đảm bảo kích thích lát mỏng hình thành nhiều thể
protocorm vừa đảm bảo đợc chất lợng của nguồn mẫu. Nhng kết quả khả quan nhất chỉ đạt đợc khi sử
dụng riêng rẽ các xytokinin. Điều này đợc trình bày ở bảng 3 và 4.
Bảng 3. ảnh hởng của Benzyl adenin (BA) đến khả năng tạo protocorm (sau 8 tuần)
Số protocorm / 1 protocorm ban
đầu
Giống
địa lan
Công thức
thí nghiệm
Tỷ lệ mẫu
tạo
protocorm
(%)
Tỷ lệ mẫu

tạo chồi
(%)
protocorm
/lát mỏng
Số protocorm % so với đối
chứng
I (Đ/C) 57,44 42,54 2,85 11,12 100
I + 0,3mg BA 70,86 29,14 4,50 20,25 182,1
I + 0,5mg BA 81,42 18,58 5,70 27,01 242,9
I + 1mg BA 76,67 23,33 4,00 17,95 161,4
I + 1,5mg BA 85,00 25,00 3,50 15,77 141,8
I + 2mg BA 86,19 13,81 3,40 13,36 120,1
Miss
Kim
LSD (5%) 0,18
I (Đ/C) 90,40 9,60 2,90 10,25 100
I + 0,3mg BA 89,30 10,70 3,25 12,23 119,3
I + 0,5mg BA 100 0 3,88 15,01 146,4
I + 1mg BA 100 0 4,21 19,05 185,9
I + 1,5mg BA 90,90 9,10 3,88 18,52 180,7
I + 2mg BA 100 0 3,51 15,90 155,1
Xanh
chiểu
LSD (5%)
0,10
Ghi chú: I (ĐC): MS + 15% nớc dừa + 10g saccarosa + 6,5g aga /1 lít môi trờng
Từ các kết quả bảng 3 và 4 cho thấy việc bổ sung chất điều tiết sinh trởng vào môi trờng nuôi cấy
có khả năng kích thích sự phát sinh hình thái của lát mỏng rất rõ rệt. Đối với giống Miss Kim, trên các
môi trờng có bổ sung BA tổng số protocorm tạo đợc/1 protocorm ban đầu cao hơn đối chứng từ 20,1-
142,9% và khi bổ sung kinetin chỉ tiêu này là 41,6-144,5 %. ở môi trờng có nồng độ BA bằng 0,5ppm

hay kinetin bằng 1ppm có thể thu đợc 27 hay 30 thể protocorm từ một protocorm ban đầu sau 8 tuần nuôi
cấy. Trên giống Xanh chiểu quy luật cũng diễn ra tơng tự. Nhng với giống này nồng độ thích hợp của
BA và kinetin đều là 1mg/l. Trên các môi trờng có bổ sung BA và kinetin ở nồng độ 1mg/l, sau 8 tuần
nuôi cấy có thể thu đợc 16-19 protocorm từ 1 protocorm ban đầu. Vì vậy sau khi tạo đợc nguồn vật liệu
khởi đầu (protocorm) từ đỉnh chồi hay các mắt ngủ của chồi bên, để tăng nhanh nguồn mẫu cho quá trình
nhân tiếp theo thì việc sử dụng nuôi cấy lát mỏng tế bào là phơng pháp tối u nhất.






Bảng 4. ảnh hởng của kinetin đến khả năng tạo protocorm (sau 8 tuần)
Số protocorm / 1
protocorm ban đầu
Giống
địa lan
Công thức thí
nghiệm
Tỷ lệ mẫu
tạo
protocorm
(%)
Tỷ lệ
mẫu tạo
chồi (%)
protocorm
/lát mỏng
Số
protocorm

% so với
đối chứng
I (Đ/C): 60,50 39,50 2,60 12,17 100
I + 0,3mg K 67,27 32,73 4,07 19,47 160,0
I + 0,5mg K 78,26 21,74 4,60 20,65 169,7
I + 1mg K 80,98 19,02 6,23 29,76 244,5
I + 1,5mg K 86,19 13,81 4,25 17,25 141,7
I + 2mg K 83,35 16,65 4,09 17,24 141,6
Miss
Kim
LSD (5%) 0,07
I (Đ/C): 94,43 5,57 2,71 9,58 100
I + 0,3mg K 89,27 10,73 3,08 11,85 123,7
I + 0,5mg K 91,18 8,82 3,12 14,11 147,3
I + 1mg K 92,76 7,24 3,70 15,95 166,5
I + 1,5mg K 82,31 17,69 3,18 12,52 130,7
I + 2mg K 90,90 9,10 3,14 11,93 124,5
Xanh
chiểu
LSD (5%)

0,06
Ghi chú: I(ĐC): MS + 15% nớc dừa + 10g saccarosa + 6,5g aga /1lít môi trờng
4. Kết luận
Các lát cắt protocorm có chiều dày 0,3- 05mm là thích hợp cho nuôi cấy lớp mỏng để nhân nhanh
protocorm.
Phơng thức nuôi cấy phù hợp nhất để nuôi cấy lát mỏng protocorm là nuôi cấy tĩnh trên môi trờng
đặc.
Môi trờng nuôi cấy cho hệ số nhân và số protocorm tạo thành cao nhất:
+ Đối với giống Miss Kim là: MS+ 150mlND + 1mgKinetin + 10g Saccaroza + 6,5g agar/lít. Trên

môi trờng này số protocorm/lát cắt đạt: 6,23 và tổng số protocorm/1 protocorm ban đầu đạt: 29,76.
+ Đối với giống Xanh chiểu là: MS+ 150mlND + 1mg BA + 10g Saccaroza + 6,5g agar/lít. Trên môi
trờng này số protocorm/lát cắt đạt: 4,21 và tổng số protocorm/1 protocorm ban đầu đạt: 19,05.

Tài liệu tham khảo
Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Nga, 2000. Nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy lát mỏng trong nhân nhanh
các giống Vanda, Cattleya và Phaleanopsis. Tạp chí Nông nghiệp, Công nghiệp thực phẩm, số
12/2000, trang 546 548.
Nguyễn Quang Thạch, Đinh Trờng Sơn, Nguyễn Thị Hơng, 2004. Nhân nhanh giống dứa Đài nông 4
bằng kỹ thuật nuôi cấy mô. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp, Trờng Đại học Nông nghiệp
I. Tập II , số 3/2004, trang: 185-190.
Nhut D.T., Bui V.L., Teixeira da Silva J.A., Aswth C.R., 2001. Thin cell layer culture system in Lilium:
regeneration and transformation perspectives. In vitro Cell Dev Biol. 37, p: 516-523.
Tran Thanh Van K., Bui V.L., 2000. Curent status of thin cell layer method for the induction of
organogenesis or somatic embryogenesis. In: somatic embryogenesis in woodly plants. Mohan S.J.,
Gupta P.K., Newton R.J. (eds.) Kluwer Academic Publishers, Dordrecht 6, p: 51-92