Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của kháng nguyên glycolipid trong chẩn đoán huyết thanh học bệnh Lao doc

TCNCYH 22 (2) - 2003
Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu
của kháng nguyên glycolipid trong chẩn đoán
huyết thanh học bệnh lao

Trần Hồng Vân
1
, Văn Đức Hạnh
2
,
Vũ Nguyệt Minh
3
và Lê Văn Phủng
1

1
Labo trung tâm, Đại học Y Hà Nội,

2
Sinh viên Y3 A,
3
Sinh viên Y3 D

Nghiên cứu này tìm hiểu độ nhạy, độ đặc hiệu và phản ứng chéo của 6 loại kháng nguyên
glycolipid tinh chế từ vi khuẩn lao bằng kỹ thuật ELISA trên 168 bệnh nhân. Số bệnh nhân này
đợc chia thành 3 nhóm: nhóm I gồm 62 bệnh nhân lao phổi BK (+); nhóm II gồm 53 ngời lành;
nhóm III gồm 53 ngời bị các bệnh nhiễm trùng khác ngoài lao.
Kết quả cho thấy: Ba loại kháng nguyên tốt nhất là cord factor (DT), trehalose monomycolate
(MT) và phenol glycolypid (PA); độ nhạy từ 66,1%- 74,2%, độ đặc hiệu 69%- 73,6%, phản ứng
chéo từ 22,6%- 39,6%. Các kháng nguyên khác đều có độ nhạy và độ đặc hiệu thấp hơn và phản
ứng chéo cao hơn.

ELISA với kháng nguyên glycolipid đặc hiệu có thể dùng để chẩn đoán lao ngoài phổi và lao
phổi BK (-).


I. Đặt vấn đề
Theo thông báo của Tổ chức Y tế Thế giới
(WHO) về mối nguy cơ bệnh lao đang quay trở
lại cùng với tốc độ gia tăng dân số và đại dịch
HIV/AIDS trên toàn thế giới . Ước tính số
ngời mắc lao mới sẽ là 11,8 triệu vào năm
2005 (tăng 57,8% so với 1990) [2]. Bệnh lao đã
thực sự trở thành mối đe doạ đến sức khoẻ, tính
mạng nhiều ngời. Tử vong do lao chiếm 1/4
số tử vong do nhiễm khuẩn ở ngời lớn. Việt
Nam là 1 trong 22 nớc có bệnh lao trầm trọng
trên thế giới [10].
Chẩn đoán bệnh lao trên lâm sàng sẽ đợc
khẳng định khi tìm thấy vi khuẩn trong bệnh
phẩm bằng các phơng pháp nh nhuộm coi
trực tiếp, nuôi cấy phân lập. Nhng trong nhiều
trờng hợp không tìm thấy vi khuẩn lao bằng
các phơng pháp này do lấy, bảo quản và xử lý
bệnh phẩm không tốt. Vì vậy các phơng pháp
chẩn đoán gián tiếp nh các xét nghiệm miễn
dịch, Mantoux, X quang đã góp phần đáng kể
vào chẩn đoán. Ngày nay, miễn dịch học đã
đợc áp dụng cả trong theo dõi diễn biến bệnh
lao, phòng bệnh và theo dõi khả năng dung nạp
thuốc của cơ thể [4].
Một trong những kỹ thuật miễn dịch đợc

ứng dụng ngày càng rộng rãi là kỹ thuật xét
nghiệm phát hiện kháng thể kháng vi khuẩn lao
bằng kỹ thuật ELISA. Từ thập kỷ 70, đã có
nhiều công trình nghiên cứu của nhiều tác giả
nớc ngoài và gần đây có một số tác giả trong
nớc đã áp dụng kỹ thuật này để phát hiện
kháng thể kháng lao; giúp cho chẩn đoán, phát
hiện bệnh lao, đặc biệt là với các trờng hợp
lao ngoài phổi và lao phổi BK (-) .
Tuy vậy, vấn đề quan trọng nhất trong huyết
thanh học chẩn đoán lao là chất lợng kháng
nguyên; vì Mycobacterium tuberculosis có
nhiều loại kháng nguyên và có nhiều kháng
nguyên chéo với các Mycobacteria khác [1].
Nhờ những tiến bộ về kỹ thuật mà những kháng
nguyên của vi khuẩn cũng dần dần đợc tinh
chế tốt hơn để chẩn đoán bệnh lao.

11
TCNCYH 22 (2) - 2003
Đã có nhiều kháng nguyên đợc dùng để
chẩn đoán lao nh: Protein 38 kDa, protein 30
kDa, lipoarabinomannan (LAM), glicolipid
LDS, DAT, PGL Tb1, kháng nguyên A60 vv
với độ nhậy và độ đặc hiệu rất khác nhau [7].
Các kháng nguyên protein có độ nhạy và đặc
hiệu cao hơn các kháng nguyên glycolopid
nhng bảo quản khó khăn hơn, vì vậy không
đợc áp dụng rộng rãi trên thực tế.
Gần đây, phòng nghiên cứu vaccine BCG ở

Nhật Bản đã đa ra 6 loại kháng nguyên mới,
đợc tinh chế từ vi khuẩn lao, bản chất hoá học
là glycolipid. Để đánh giá giá trị chẩn đoán lao
của kháng nguyên này, chúng tôi tiến hành đề
tài này nhằm 2 mục đích:
So sánh giá trị chẩn đoán của 6 loại
kháng nguyên, tìm ra những kháng nguyên đặc
hiệu, có giá trị nhất trong chẩn đoán huyết
thanh học bệnh lao.
Đánh giá độ nhậy, độ đặc hiệu,
phản ứng chéo của kỹ thuật ELISA với kháng
nguyên glycolipid.

II. Đối tợng, vật liệu và phơng
pháp nghiên cứu
1. Đối tợng
Tiến hành nghiên cứu trên huyết thanh của
168 ngời Việt Nam trong đó gồm:
Nhóm I: 62 bệnh nhân lao phổi tuổi từ
15- 75 đợc chẩn đoán là lao BK (+) tại Viện
lao-Bệnh phổi Hà Nội và bệnh viện Lao Quảng
Ninh.
Nhóm II: 53 ngời lành tuổi từ 15- 75.
Những ngời này đợc coi là lành nếu không
mắc bệnh nhiễm trùng nào vào thời điểm lấy
mẫu nghiên cứu.
Nhóm III: 53 bệnh nhân tuổi từ 15-75,
có mắc ít nhất một bệnh nhiễm trùng (không
phải lao).
2. Vật liệu

Bộ sinh phẩm ELISA lao (BCG Lab,
Tokyo, Nhật Bản). Phiến nhựa 96 giếng có gắn
6 kháng nguyên tinh chế, bản chất hoá học là
lipid:
- Hàng A (P2): Phosphoinositomannoside
- Hàng B (DT): 6, 6 -dimycolyltrehalose
(cord factor)
- Hàng C (MT): Trehalose monomycolate
- Hàng D (PA): Phenol glycolipid
- Hàng E (MI): Glycolipid
- Hàng F (Co): Glycopeptide
- Hàng G: Làm nền (Background) cho kháng
nguyên DT và PA (hàng B và D).
- Hàng H làm nền cho kháng nguyên P2,
MT, MI và Co (các hàng A, C, E, F).
Ngời làm xét nghiệm không đợc biết bản
chất kháng nguyên của từng hàng.
Các hoá chất kèm theo: Đệm PBS (viên
nén)-T (Tween 20), đệm citrate-phosphate;
cộng hợp: (HRP- Goat Anti- Human IgG),
H
2
O
2
và o-phenylendiamine (OPD).
3. Phơng pháp
Huyết thanh: Lấy 2 ml máu tĩnh mạch,
không chống đông. Tách huyết thanh rồi giữ
trong tủ lạnh sâu -70 C cho đến khi làm phản
ứng.

Kỹ thuật ELISA (Enzymed-Linked
Immunosorbent Assay):
Những giếng có sẵn gắn kháng nguyên lao
cho tiếp xúc với kháng thể kháng lao có trong
huyết thanh ngời bệnh, cho thêm chất cộng
hợp (kháng kháng thể gắn enzyme peroxidase)
tạo nên một phức hợp Kháng nguyên-Kháng
thể-Kháng kháng thể-Enzyme. Kết quả đợc
phát hiện nhờ màu sắc đợc tạo ra do phản ứng
của enzyme với cơ chất cho thêm vào. Trong
kỹ thuật này, dung dịch có mầu vàng, phổ hấp
phụ màu của dung dịch đo đợc ở bớc sóng
490/620 nm. Cờng độ màu tỷ
lệ với nồng độ kháng thể kháng lao trong
huyết thanh ngời bệnh.

12
TCNCYH 22 (2) - 2003
Kỹ thuật tiến hành:
- Cố định kháng nguyên: cho 150 àL dung
dịch PBS-T vào mỗi giếng, để 10 phút ở nhiệt
độ phòng.
- Huyết thanh bệnh nhân: cho 50 àl huyết
thanh bệnh nhân đã pha loãng 1/201 vào mỗi
giếng, để ở nhiệt độ phòng 1 giờ sau đó rửa 3
lần bằng dung dịch PBS-T.
- Cộng hợp: thêm 50 àl cộng hợp (1/500)
vào mỗi giếng, để ở nhiệt độ phòng 1 giờ, sau
đó rửa 3 lần bằng dung dịch PBS-T.
- Cơ chất: thêm 50 àl dung dịch OPD (1

mg/ml) có chứa sẵn H
2
O
2
0,06%, để 30 phút ở
nhiệt độ phòng.
- Dừng phản ứng: thêm 50 àl H2SO4 1N.
- Đọc kết quả ở bớc sóng 490/620 nm.
Xử lý số liệu:
Dùng chỉ số mật độ quang để so sánh (OD
này đã đợc trừ đi OD chứng), sử dụng toán
thống kê y học trên máy vi tính bằng chơng
trình Epi.Info 6.4. Công thức tính nh sau:
Số dơng tính thật (I) x 100
Độ nhậy = (%)
Tổng số nhóm bệnh (I)

Số âm tính thật (II) x 100
Độ đặc hiệu = (%)
Tổng số nhóm lành (II)


Số dơng tính giả (III) x 100
Độ phản ứng chéo = (%)
Tổng số nhóm (III)

Giá trị ngỡng dơng tính đợc tính bằng giá trị OD thấp nhất trong bệnh lao (nhóm I) mà từ đó
trở lên tập trung 95% bệnh nhân lao.
III. Kết quả.
Bảng 1. phân bố OD ở 3 nhóm nghiên cứu.

OD (min - max)
Nhóm
P2 DT MT PA MI Co
I (n=62) 0 - 3,092 0-3,392 0-2,733 0-1,961 0-2,130 0-0,882
II (n=53) 0- 1,767 0-0,753 0-0,805 0-0,535 0-0,884 0-0,963
III (n=53) 0-0,626 0-0,249 0-0,129 0-0,432 0-0,991 0-1,227

Nhóm I có OD cao nhất, trong số đó, kháng nguyên DT có OD tập trung nhiều nhất là từ 1 trở
lên; trong khi đó, các kháng nguyên P2, MI và Co cũng có mẫu cho OD cao (3,092), nhng chỉ có 1
mẫu duy nhất, số còn lại, tập trung ở khu vực OD thấp (0,2 trở xuống). ở nhóm II, các kháng
nguyên DT, MT và PA cho kết quả OD thấp nhất so với các kháng nguyên còn lại. ở nhóm III, các
kháng nguyên DT, MT và PA cũng cho kết quả OD thấp nhất so với các kháng nguyên khác.

13
TCNCYH 22 (2) - 2003
Bảng 2. Độ nhậy, độ đặc hiệu và phản ứng chéo của từng kháng nguyên
%
Số (+) trong nhóm
Kháng
nguyên
I (n=62) II (n=53) III (n=53)
Độ nhạy Độ đặc hiệu Phản ứng
chéo
P2 39 13 16 62.9 75.5 30.2
DT 46 9 21 74.2 83.0 39.6
MT 41 14 21 66.1 73.6 39.6
PA 43 16 12 69.4 69.8 22.6
MI 19 15 23 30.6 71.7 43.4
Co 29 20 26 46.8 62.3 49.1

Ba kháng nguyên DT, MT và PA có độ nhạy
cao nhất, đặc biệt là kháng nguyên DT cả hai
chỉ số nhạy và đặc hiệu đều cao nhất.
IV. Bàn luận
Trong nghiên cứu, chúng tôi sử dụng 6 loại
kháng nguyên lipid tinh chế vi khuẩn lao, theo
thông báo của cơ sở sản xuất kháng nguyên, có
3 kháng nguyên đặc hiệu cho M. tubercubosis
(DT, MT và PA) và 3 kháng nguyên khác (P2,
MI và Co) thì ít đặc hiệu hơn. Chúng tôi đã lu
ý nhận xét này sau khi có kết quả nghiên cứu.
1. Kết quả xét nghiệm ELISA với 3 nhóm
đối tợng nghiên cứu
Nồng độ kháng thể của nhóm I tăng hơn
hẳn (
OD
= 1,315) so với nhóm II (0,35) và
nhóm III (0,236). Mặt khác, số bệnh nhân cho
kết quả ELISA dơng tính với từng loại kháng
nguyên cũng lớn và lớn nhất trong số 3 nhóm
nghiên cứu. Điều đó cho thấy, mức độ dơng
tính phụ thuộc vào kháng nguyên và kháng thể
dịch thể trong lao tuy không có vai trò tiêu diệt
vi khuẩn lao [1] nhng có giá trị để chẩn đoán
bệnh lao.
Bảng 2 đã chỉ ra 3 kháng nguyên có độ nhạy
cao nhất (DT, MT và PA) và các kháng nguyên
MI và Co có độ nhạy thấp nhất. Nh vậy, ba
loại kháng nguyên đầu có thể đợc chọn lọc
làm kháng nguyên cho chẩn đoán lao.

Tuy nhiên, một số bệnh nhân nhóm I cho
kết quả âm tính, đây là âm tính giả. Điều này
có thể do đáp ứng miễn dịch kém ở các bệnh
nhân này (suy giảm miễn dịch do quá yếu, do
AIDS). Tuy vậy, trong nghiên cứu này, khi
chọn bệnh nhân, chúng tôi cha có điều kiện
sàng lọc những bệnh nhân này.
2. Xét nghiệm ELISA với nhóm bệnh
nhân lành (nhóm II)
Nồng độ kháng thể (đợc biểu hiện thông
qua OD) của nhóm II, III thấp hơn nhóm I. Tuy
vậy, đối với mỗi loại kháng nguyên, đều có
một số lợng ngời lành cho kết quả dơng
tính (Bảng 2). Điều này có thể lý giải qua tỷ lệ
nhiễm lao cao ở cộng đồng (1/3 nhân loại
nhiễm lao), tuy không có biểu hiện bệnh,
nhng có kháng thể, đó là kết quả của những
lần nhiễm lao trớc. Thứ hai là do phản ứng
chéo với các Mycobacteria không gây bệnh do
có cấu trúc kháng nguyên tơng đồng. Nh
vậy, tìm kiếm một kháng nguyên đặc hiệu hơn
vẫn là cần thiết và chắc chắn là điều khó khăn.
3. Xét nghiệm ELISA với nhóm bệnh
nhân mắc nhiễm trùng khác ngoài lao
(nhóm III)
OD trung bình của nhóm II và III thấp hơn
nhiều so với nhóm I và số lợng bệnh nhân ở
nhóm III cho kết quả dơng tính cao hơn nhóm
II (ngời lành). Đó là do hiện tợng đáp ứng

14
TCNCYH 22 (2) - 2003
miễn dịch chéo của cơ thể với các kháng
nguyên tơng đồng với Mycobacteria hoặc là
do đáp ứng với nhiễm lao từ trớc nh trong
nhóm II (ngời lành). Trong sáu kháng nguyên
đã thử, các kháng nguyên DT, MT và PA có tỷ
lệ phản ứng chéo thấp nhất.
4. So sánh độ nhậy, độ đặc hiệu của xét
nghiệm ELISA với các loại kháng nguyên
nghiên cứu
Kháng nguyên MI và Co có độ nhậy thấp
nhất (30,6-46,8%), độ phản ứng chéo cao nhất
(43,4%-49,1%) trong 6 loại kháng nguyên. Hai
loại kháng nguyên này đặc hiệu hơn cho M.
avium (thông tin cá nhân).
Kháng nguyên DT, MT và PA có độ nhậy,
độ đặc hiệu cao tơng đối đồng đều, độ phản
ứng chéo có phần thấp hơn so với hai loại
kháng nguyên kể trên. Nghiên cứu của Steel
B.A và CS (1991) đã sử dụng 3 loại kháng
nguyên glycolipid LDS, DAT và PGLTb1 của
vi khuẩn lao để chẩn đoán lao phổi bằng
ELISA đợc độ nhậy 50- 60%, độ đặc hiệu
98% [9].
Chiang L. H (1996) nghiên cứu huyết thanh
của 507 bệnh nhân gồm lao BK (+), lao phổi có
vôi hoá, bệnh phổi không phải lao và nhóm
ngời khoẻ mạnh bình thờng ở Đài Loan sử
dụng kháng nguyên 38 kDa đạt độ nhậy 51%

[8]. Theo Sada E. D (1990) khi dùng kháng
nguyên LAM (lipoarabinomannan) để chẩn
đoán lao phổi bằng kỹ thuật ELISA cho thấy,
độ nhậy 72% và độ đặc hiệu 91% [8].
Nghiên cứu của Bùi Đức Luận (1996) về
khả năng đáp ứng miễn dịch bằng xét nghiệm
ELISA để phát hiện kháng thể kháng lao trong
huyết thanh bệnh nhân lao phổi kết hợp lao
ngoài phổi bằng kháng nguyên siêu nghiền và
kháng nguyên tiết thô, tác giả cho thấy, độ
nhậy của các loại kháng nguyên này từ 90-
95%, độ đặc hiệu từ 94-100% [3]. Năm 1997,
Doãn Trọng Tiên, Trần Văn Sáng và các cộng
sự đã sử dụng kháng nguyên tiết và kháng
nguyên siêu nghiền của 2 chủng vi khuẩn lao
(M. avium; M. tubeculosis) đã rút ra kết luận:
nồng độ kháng thể ở ngời già và ngời trởng
thành mắc lao đều cao hơn so với ngời già
không mắc lao; trong lâm sàng có thể dùng
phản ứng ELISA chẩn đoán lao ngời già [5].
Nh vậy ứng dụng kỹ thuật ELISA trong
chẩn đoán các thể bệnh lao ngày càng đợc phổ
biến rộng rãi hơn, do có độ tin cậy cao. Nghiên
cứu của chúng tôi cũng cho kết quả phù hợp
với nghiên cứu kể trên.
V. Kết luận
Với kỹ thuật ELISA dùng kháng nguyên
glycolipid đã góp phần phát hiện sớm bệnh lao
trên lâm sàng đặc biệt là các thể lao ngoài phổi
và lao phổi BK(-). Ba loại kháng nguyên

glycolipid tinh chế từ vi khuẩn lao có thể sử
dụng để làm xét nghiệm ELISA chẩn đoán
bệnh lao là Cord factor DT, MT và PA. Các
kháng nguyên này có độ nhậy từ 66,1%-
74,2%, độ đặc hiệu 69,8%- 83,0% và phản ứng
chéo 22,6%- 39,6%. Hy vọng rằng, 3 loại
kháng nguyên này sẽ đợc nghiên cứu sâu hơn
để có thể thực sự đợc ứng dụng trong xét
nghiệm ELISA chẩn đoán bệnh lao.
Lời cảm ơn: Các tác giả xin chân thành cảm
ơn Labo BCG (Tokyo, Nhật Bản) đã cung cấp
các sinh phẩm cho phản ứng ELISA; Viện Lao
và Bệnh phổi, Bệnh viện Lao Hà Nội, Bệnh
viện Lao Quảng Ninh đã cung cấp huyết thanh
các bệnh nhân lao phổi BK (+).
Tài liệu tham khảo
1. Lê Huy Chính (2001), Họ
Mycobacteriaceae. Vi sinh y học. Nhà xuất
bản Y học, 207-214.
2. N.V Cồ, B.Đ Dơng, H.S Dỡng, Đ. Hứa,
N.T Hơng, N.N Lan, P.D Linh, P.T Quang,
P.T Thiệp, L.B Tung và L.N Vân (1996),
Hớng dẫn thực hiện chơng trình chống lao
quốc gia. Chơng trình chống lao quốc gia
Viện lao và bệnh phổi, Hà nội,
3. Bùi Đức Luận (1996), Nghiên cứu đặc
điểm lâm sàng và miễn dịch học ở bệnh nhân

15
TCNCYH 22 (2) - 2003

lao phổi kết hợp lao ngoài phổi. Luận án tiến sĩ
y học, Học viện Quân y, Hà Nội.
4. Trần Văn Sáng (2000), Sinh học phân tử và
miễn dịch học trong bệnh lý hô hấp, Nhà xuất
bản Y học, 109.
5. Doãn Trọng Tiên (1996), Nghiên cứu một
số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và khả
năng đáp ứng miễn dịch ở ngời già lao phổi.
Luận án tiến sĩ y học, Đại học Y Hà Nội, 104.
6. Chiang I.H, Bai K .J., Suo J. et al (1996),
Serological diagnosis of the tuberculosis by
ELISA with M. tuberculosis antigen (38 kDa).
The 4
th
congress of the Asian Pacific Society of
respiratory. Abstracts handbook, 72.
7. Dautzenberg B (1994), Epidemiologie de
la tuberculose, present et futur proche, 11e
congres de pneumologie de langue Francaise
(22-25 Jun 1994), Volume des rapports,
Nancy- Frace, 165-168.
8. Sada E.D., Daniel T.M., Ferguson L.E
(1990), An ELISA for the serodiagnosis of
tuberculosis using 30 kDa antigen of
Mycobacterium tuberculosis, J Infect Dis, 162:
928-931.
9. Steel B., Daniel T.M (1991), Evaluation of
the potential role of serodiagnosis of
tuberculosis in clinic in Bolivia by decision
analysis, Am. Rev. Respir. Dis, 143: 713-716.

10. World Health Organization (1998),
Epidemiological Review of tuberculosis in the
Western Pacific Region 1998. World Office for
the Western Pacific, Manila, 2-

Summary
sensitivity and specificity of glycolipid antigens
in serodiagnosis of tuberculosis
To find out specific antigens to M. tuberculosis, we searched for sensitivity, specificity and cross
reactions of 6 glycolipid antigens which were extracted and purified from M. tuberculosis with 168
sera by ELISA.
The 168 samples were divided into 3 groups: Group I: 62 lung tuberculosis patients with AFB-
smear positive; group II: 53 healthy persons and group III: 53 infectious other than tuberculosis
patients.
There were 6 glycolipid antigens were used in this study, they were Phosphoinositomannoside
(P2), 6, 6-dimycolyltrehalose (cord factor) (DT), Trehalose monomycolate (MT), Phenol
glycolipid (PA), Glycolipid (MI) and Glycopeptide (Co).
The sensitivity and specificity of DT, MT and PA antigens were 74.2; 66.1; 69, 4% and 83,0;
69,8%; 73.6%, respectively; cross reaction ranging from 22,6% to 39,6%. The sensitivity and
specificity of other antigens were lower and its cross reactions were higher than DT, MT and PA
antigens. ELISA with specific glycolipid antigens can be used to diagnose extra-lung tuberculosis
and lung tuberculosis with AFB (-).


16