Tìm hiểu R-plasmid ở một số chủng Salmonella typhi phân lập tại Hà Nội, Huế và thành phố Hồ Chí Minh pdf

TCNCYH 23 (3) 2003
Tìm hiểu R-plasmid ở một số chủng Salmonella typhi
phân lập tại Hà Nội, Huế và thành phố Hồ Chí Minh

Nguyễn Đắc Trung
1
, Lê Văn Phủng
2

và Lê Huy Chính
2

1
Đại học Y Thái Nguyên
2
Đại học Y Hà Nội

Các chủng Salmonella typhi đa đề kháng hiện đã lan tràn tới hầu hết các vùng trong cả nớc.
Nghiên cứu đã dùng 90 chủng Salmonella typhi phân lập từ Hà Nội, Huế và Thành phố Hồ Chí
Minh để nghiên cứu về các plasmid của chúng. Kết quả cho thấy:
Đã tìm thấy hai plasmid 120 Kb và 102 Kb ở các chủng kể trên, plasmid 120 Kb có 2 copy.
Plasmid 120 Kb là một R-plasmid lớn, có khả năng tự truyền cho chủng khác và mang ít nhất 5
gene kháng kháng sinh: chloramphenicol, tetracycline, ampicillin, trimethoprim và
sulphamethoxazole.
Phân tích bằng enzyme hạn chế EcoR I cho thấy, các R-plasmid từ các chủng Salmonella phân
lập ở Hà Nội, Huế và Thành phố Hồ Chí Minh đều giống nhau.

I. đặt vấn đề
Thơng hàn là một bệnh truyền nhiễm hay
gây thành dịch, do một số loài thuộc giống
Salmonella gây nên, trong đó hay gặp nhất là

do Salmonella typhi.
Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy S.
typhi đề kháng kháng sinh chủ yếu qua R-
plasmid- đó là những phân tử ADN mang thông
tin di truyền nằm ngoài nhiễm sắc thể với các
gen mã hoá cho sự đề kháng nhiều kháng sinh
khác nhau.
Cho đến nay, tại Việt Nam, S. typhi kháng
đa kháng sinh đã xuất hiện ở nhiều tỉnh, thành
phố và đã gây nhiều ổ dịch thơng hàn lu
hành trong toàn quốc [1]. Mức độ và kiểu cách
kháng thuốc của vi khuẩn cũng ngày một gia
tăng và phức tạp. Đứng trớc thực trạng đó,
việc giám sát tỷ lệ và mức độ kháng thuốc của
vi khuẩn đã đợc tiến hành thờng xuyên tại
nhiều khu vực. Tuy vậy, những nghiên cứu về
cơ chế đề kháng cũng nh phơng thức lan
truyền tính kháng thuốc của vi khuẩn ở cộng
đồng và trong bệnh viện còn rất hạn chế. Để
góp phần làm rõ thêm về vấn đề này, chúng tôi
tiến hành đề tài với mục tiêu:
1. Tìm hiểu về plasmid ở S. typhi và nghiên
cứu một số đặc điểm của chúng (độ lớn, số
lợng các bản sao).
2. Xác định R-plasmid tự truyền ở các
chủng S. typhi đa đề kháng qua tiếp hợp.
3. So sánh R-plasmid tự truyền của các
chủng S. typhi phân lập từ những vùng khác
nhau trong nớc.
II. Đối tợng và phơng pháp

nghiên cứu
1. Đối tợng nghiên cứu
90 chủng S. typhi đợc phân lập từ các bệnh
nhân thơng hàn:
- Hà Nội : 30 chủng

32
TCNCYH 23 (3) 2003
- Huế : 30 chủng
- Tp Hồ Chí Minh : 30 chủng
Những chủng S. typhi đợc nghiên cứu đều
đã đợc xác định mức độ nhạy cảm với 4
kháng sinh: chloramphenicol (CHL), ampicillin
(AMP), tetracycline (TET) và co-trimoxazole
(SXT). Những chủng kháng CHL đều là những
chủng đa kháng thuốc (kháng với 2 kháng sinh
trở lên).
2. Vật liệu
* Chủng vi khuẩn mẫu: Do trờng đại học
Gifu, Nhật Bản cung cấp (40-Tsukasa-machi,
Gifu, Japan), gồm E.coli V517 (mang 8
plasmid mẫu, đã biết trớc kích cỡ) và E.coli
GGS 75 (nhạy cảm với CHL, kháng với
Nalidixic axit).
* Enzyme hạn chế EcoR I (BioRad, Pháp)
* Kháng sinh bột và khoanh giấy kháng
sinh (Meiji, Nhật Bản).
3. Phơng pháp nghiên cứu
3.1. Xác định lại các chủng S. typhi:
Theo thờng quy chuẩn của WHO [9]

3.2. Kỹ thuật tách chiết ADN và nghiên
cứu về plasmid:
Theo phơng pháp của Kado và Liu [6].
- Xác định kích cỡ plasmid qua điện di trên
gel agarose 0,8% và tính toán bằng đồ thị trên
thang logarit.
- Xác định số lợng bản sao các plasmid
theo công thức:
% ADN plasmid Kích cỡ chromosome
Số lợng bản sao =
% ADN chromosome
x
Kích cỡ plasmid

3.3. Xác định R-plasmid tự truyền qua
tiếp hợp:
Theo Roy Curtiss (1981) [8].
III. Kết quả
1. Tỷ lệ mang plasmid ở 90 chủng S. typhi
phân lập tại Hà Nội, Huế và Tp Hồ Chí
Minh:
Số lợng plasmid
CHL
(n=90)
0 1 2

Nhạy cảm 20 1 0 21
Đề kháng 6 31 32 69

26 32 32 90

% 28,8 35,6 35,6
- 64/ 90 chủng S. typhi (71,1%) có plasmid.
- 63/ 69 chủng S. typhi kháng CHL (91,3%)
có plasmid.
- 6/ 69 chủng S. typhi kháng CHL (8,7%)
không tìm thấy plasmid, 6 chủng này là những
chủng đặc biệt. Chúng đa kháng thuốc (theo hồ
sơ) nhng lại không tìm thấy plasmid nào, vì
vậy, chúng đã đợc kiểm tra lại mức độ nhạy
cảm với 4 kháng sinh CHL, AMP, TET và
SXT. Kết quả cho thấy có 1 chủng trở nên nhạy
cảm với các kháng sinh đợc thử, 5 chủng còn
lại vẫn giữ nguyên khả năng đề kháng.
2. Số lợng và độ lớn plasmid
Sau khi tiến hành tách chiết plasmid theo
quy trình của Kado và Liu và quan sát trên
điện di gel agarose chúng tôi đã xác định đợc
sự xuất hiện của 2 loại plasmid ở các chủng S.
typhi đợc nghiên cứu (Hình 1).

33
TCNCYH 23 (3) 2003







Hình 1 : Hai loại plasmid ở Salmonella typhi

1. S. typhi VCMM 1142 4. S. typhi VCMM 1022 7. S. typhi VCMM 465
2. S. typhi VCMM 250 5. S. typhi VCMM 1024 8. S. typhi VCMM 466
3. S. typhi VCMM 254 6. S. typhi VCMM 463 9. S. typhi VCMM 1048
10. S. typhi VCMM 470 11. S. typhi VCMM 468 (chủng nhạy cảm)
- Loại plasmid thứ nhất xuất hiện ở đa số
những chủng S. typhi đa kháng thuốc phân lập
ở cả ba khu vực đợc nghiên cứu. Qua điện di
trên gel agarose, ở các chủng đa kháng thuốc,
chúng tôi thấy băng ADN plasmid này đều
xuất hiện ở một vị trí giống nhau. Việc lập đồ
thị logarit biểu diễn mối tơng quan giữa kích
cỡ plasmid và khoảng cách điện di tơng đối
của chúng đã cho phép chúng tôi xác định đợc
kích cỡ của plasmid này là khoảng 120 Kb.
Plasmid 120 Kb này đều không thấy xuất hiện
ở bất kỳ một chủng S. typhi nhạy cảm CHL nào
đợc nghiên cứu.
- Ngoài plasmid 120 Kb kể trên, qua nghiên
cứu chúng tôi cũng đã xác định đợc plasmid
thứ 2 với kích cỡ khoảng 102 Kb (Hình 1).
Plasmid 102 Kb không tồn tại riêng rẽ mà
thờng đi kèm với plasmid 120 Kb ở những
chủng đa kháng thuốc này. Tuy nhiên, plasmid
này còn đợc tìm thấy duy nhất ở một chủng S.
typhi nhạy cảm CHL phân lập tại Huế. Nh
vậy, có thể sơ bộ nghĩ rằng plasmid này không
mang gen kháng thuốc.

3. Số lợng bản sao plasmid 120 Kb
Trên cơ sở kết quả tỷ lệ ADN của plasmid

và chromosome tơng ứng qua phép đo mật độ
màu hai thành phần này, kích cỡ plasmid và
chromosome của chủng S. typhi đã biết, cho
phép chúng tôi xác định đợc số bản sao đặc
trng so với chromosome của plasmid 120 Kb
là 2.
4. R-plasmid tự truyền ở S. typhi đa
kháng thuốc
Sự xuất hiện phổ biến của plasmid 120 Kb ở
đa số những chủng S. typhi đa kháng thuốc
phân lập tại Hà Nội, Huế và Tp Hồ Chí Minh,
cũng nh kích cỡ và số lợng bản sao của
plasmid này cho phép hiểu rằng đây có thể là
một plasmid tiếp hợp mang một số gen kháng
thuốc của vi khuẩn (R-plasmid tự truyền).
Để xác định vai trò của plasmid này trong
cơ chế đề kháng cũng nh sự lan truyền của
một số gen kháng kháng sinh ở S. typhi, chúng
tôi đã tiến hành thực nghiệm tiếp hợp giữa một
chủng S. typhi kháng CHL (mang 1 plasmid
120 Kb) nhng nhạy cảm NAL với chủng

34
TCNCYH 23 (3) 2003
E.coli GGS 75 nhạy cảm CHL (không mang
plasmid) nhng kháng NAL.
Kết quả thực nghiệm tiếp hợp cho thấy tính
kháng thuốc của S. typhi đã đợc truyền sang
cho chủng E.coli GGS 75 thông qua R-plasmid
120 Kb. Các gen đề kháng với những kháng

sinh thông thờng (CHL, AMP, TET và SXT)
đợc theo dõi cùng nằm trên plasmid này và
plasmid này đã đợc truyền hoàn chỉnh sang
chủng nhận E.coli (vì ở chủng vi khuẩn lai xuất
hiện một băng ADN có cùng vị trí với băng
plasmid 120 Kb ở chủng S. typhi trớc khi
mang vào tiếp hợp (Hình 2).








Hình 2 : Kết quả tách chiết ADN plasmid sau thực nghiệm tiếp hợp
1. E. coli V517 (chứng plasmid) 2. E. coli GGS 75 3. S. typhi VCMM 250 4. E. coli lai
5. Kết quả phân tích R-plasmid tự truyền
bằng enzyme hạn chế:
Nghiên cứu bớc đầu dùng enzyme hạn chế
EcoR I phân tích R-plasmid 120 Kb ở 3 chủng
S. typhi đa kháng thuốc phân lập tại Hà Nội,
Huế và Tp Hồ Chí Minh đợc trình bày trong
hình 3.
Hình 3. Các mảnh cắt plasmid bằng EcoR I
1. Hà Nội; 2. Huế; 3. Kiên Giang
Có thể thấy, hình ảnh các mảnh cắt các
plasmid ở 3 vùng khác nhau là giống nhau.
Iv. Bàn luận
1. Tỷ lệ mang plasmid ở S. typhi:

Trong số 69 chủng S. typhi đa đề kháng
đợc nghiên cứu, đã tìm thấy 2 loại plasmid.
Có 63 (91,3%) chủng có mang ít nhất 1
plasmid còn 6 chủng không tìm thấy plasmid
nào.
Hiện tợng vi khuẩn đề kháng trở nên nhạy
cảm với các kháng sinh sau một thời gian dài
lu giữ và cấy chuyển đã đợc y văn ghi nhận
từ lâu. Trong nghiên cứu này, 1 chủng S. typhi
đã có hiện tợng nh vậy, hiện tợng này đợc
giải thích là do chúng đã mất các gen đề kháng
với những kháng sinh đó khi giữ chúng trong
những điều kiện không có áp lực chọn lọc. Còn
hiện tợng không tìm thấy plasmid và giữ
nguyên khả năng đề kháng với các kháng sinh
thông thờng (nghĩa là các gen kháng thuốc

35
TCNCYH 23 (3) 2003
vẫn tồn tại trong tế bào vi khuẩn) ở 5 chủng S.
typhi còn lại có thể do các plasmid đã bị phân
ly thành những thành phần có kích cỡ nhỏ hơn
[2], nên với kỹ thuật tách chiết plasmid đã sử
dụng, không phát hiện đợc; hoặc có thể do các
transposon mang các gen kháng thuốc đã
chuyển vị trí từ R-plasmid vào nhiễm sắc thể
của vi khuẩn [3, 5].
2. Đặc điểm của các plasmid:
Plasmid lớn thờng có cấu tạo gồm đầy đủ
các thành phần cần thiết để có thể tự truyền cho

vi khuẩn khác [3, 4]. Plasmid 120 kb trong
nghiên cứu này cũng là một plasmid lớn và đã
đợc chứng minh là có khả năng tự truyền:
plasmid này xuất hiện ở các chủng lai (Hình 2)
sau khi tiếp hợp mà không cần tác động bằng
bất cứ điều kiện nào khác. Số lợng bản sao
plasmid này rất thấp (2 bản sao) phù hợp với
quy luật thờng thấy ở vi khuẩn: kích cỡ
plasmid thờng tỷ lệ nghịch với số các bản sao
và số các bản sao plasmid là hằng định ở một
loài vi khuẩn nhất định, ví dụ 2 plasmid:
pBR322 (kích cỡ 4,36 Kb) có 15-20 bản sao,
pUC (kích cỡ 2,69 Kb) có tới 500-700 bản sao
[7].
Plasmid 120 kb chỉ xuất hiện ở các chủng
đa đề kháng, không thấy ở bất cứ chủng nhạy
cảm nào. Nh vậy, plasmid này có liên quan tới
cơ chế đề kháng cũng nh sự lan truyền của
một số gen kháng thuốc ở những chủng S. typhi
này. Những chủng nhận đợc plasmid này sau
tiếp hợp đều trở nên đề kháng với các kháng
sinh vốn trớc đó chúng vẫn nhạy cảm, đồng
thời, kiểu cách đề kháng của các chủng lai
giống hệt kiểu cách đề kháng của các chủng
cho; vì vậy, plasmid đã truyền này đã mang các
gene đề kháng. Những plasmid nh thế, trong y
văn gọi là các R-plasmid [3].
3. So sánh các plasmid tự truyền:
Trên điện di gel agarose các plasmid 120
Kb sau khi cắt bằng EcoR I đều xuất hiện các

băng (mảnh cắt) với số lợng và vị trí giống
nhau. Tuy cha có điều kiện xác định chính
xác kích cỡ của các mảnh cắt, song có thể thấy
rõ trên Hình 3: 3 plasmid ở 3 chủng S. typhi đa
kháng thuốc phân lập tại ba khu vực khác nhau
đều giống nhau.
Các R-plasmid tự truyền, giống nhau là một
chỉ điểm dịch tễ học phân tử quan trọng để coi
chúng có cùng một nguồn gốc. Nh vậy, với
việc bùng phát dịch thơng hàn kháng thuốc từ
Kiên Giang năm 1993, có thể coi Kiên Giang
đã là nguồn gốc của các chủng S. typhi đa đề
kháng và từ đó, chúng lan tràn ra cả nớc.
Phân tích nh trên, một lần nữa, nhắc nhở
chúng ta phải dùng kháng sinh thận trọng, phải
giữ vệ sinh môi trờng tốt để tránh sự xuất hiện
và lan tràn các chủng vi khuẩn kháng thuốc,
gây ra những hậu quả trầm trọng.
V. Kết luận
1.
2.
3.
Hai plasmid với kích cỡ khoảng 120
Kb và 102 Kb đã đợc tìm thấy ở các chủng S.
typhi phân lập tại ba khu vực đợc nghiên cứu.
Plasmid 120 Kb có 2 bản sao.
Plasmid 120 Kb là một R- plasmid tự
truyền, mang ít nhất các gen đề kháng với
chloramphenicol, ampicillin, tetracycline và
trimethoprim/sulfamethoxazole. Qua tiếp hợp,

toàn bộ kiểu cách đề kháng này của S. typhi đã
đợc truyền sang chủng nhận E. coli thông qua
R-plasmid 120 Kb.
Phân tích bớc đầu R-plasmid tự
truyền ở các chủng S. typhi phân lập tại ba khu
vực bằng enzyme hạn chế EcoRI, sơ bộ cho
thấy các R-plasmid giống nhau.
Tài liệu tham khảo
1. Lê Đăng Hà (1996): Tình hình thơng
hàn đa kháng thuốc tại viện Y học lâm sàng
các bệnh nhiệt đới (1988-1995). Bộ Y tế, Viện
YHLSCBNĐ. Tài liệu tập huấn.
2. Chopra G. S., Basu S. K., Bhattacharya
S. R (1992): Present phage types and antibiotic

36
TCNCYH 23 (3) 2003
susceptibility of Salmonella. Indian J Pathol
Microbiol. 35 (4): 345-350.
3. Fox A. P.: Bacterial Genetics. In:
Medical microbiology. 2nd ed. Edit. by Murray
P. R., Kobayashi G. S., Pfaller M. A.,
Rosenthal K. S. Missouri: Mosby. 1994: 28-45.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Hoa N. T., Diep T. S., Wain J. et al

(1998): Community-acquired septicaemia in
southern Viet Nam: the importance of
multidrug- resistant Salmonella typhi. Trans R
Soc Trop Med Hyg. 92 (5): 503-508.
Holmes R. K. (1986): Genitics. In:
Medical microbiology. 2
nd
ed. Edit. by Baron S.
California: Addison-Wesley. 243: 261-264.
Kado C. I., Liu S. T. (1981): Rapid
procedure for detection and isolation of large
and small plasmids. J Bacteriol. 145: 1365-
1373.
Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T.
(1989): Molecular cloning. A laboratory
manual. 2nd ed, Vol 1. New York: Cold Spring
Harbor Laboratory Press.
Roy Curtiss (1981): Gene Transfer,
Mannal of Methods for General Bacterilogy,
American Society for Microbiology, 14: 243-
265.
WHO (1991). Blood culture. In: Basic
Laboratory Procedures in Clinical
Bacteriology. 21-25.
C¶m ¬n: C«ng tr×nh nµy ®−îc thùc
hiÖn t¹i labo Trung t©m Y sinh häc vµ bé
m«n Vi sinh Y häc tr−êng §¹i häc Y Hµ
Néi.

Summary

r-plasmid in several salmonella typhi strains isolated
from Ha Noi, Hue and Ho Chi Minh city

The multi-antibiotic resistant Salmonella typhi strains have already spread over the country.
Authors analysed 90 Salmonella typhi strains isolated in Ha Noi, Hue and Ho Chi Minh city and
had some observation as follows.
- Two plasmids with size about 120 kilobase (Kb) and 102 Kb had been found in S. typhi strains
isolated in 3 studied areas. Plasmid 120 Kb had two copies.
- Plasmid 120 Kb is a conjugated R-plasmid and carrying at least antibiotic resistant genes to
chloramphenicol, ampicillin, tetracycline and trimethoprim/sulfamethoxazole. By conjugation, all
the resistant genes of S. typhi were transferred to recipient E. coli strains through R-plasmid 120
Kb.
Through the initial analysis on the R-plasmids in S. typhi strains isolated in 3 areas by a restricted
enzyme of EcoR I, we saw that these self-transmitted R-plasmids may have the same origin.

37