Bước đầu khảo sát tần số phân bố alen của gen D13S317 pot

TCNCYH 23 (3) 2003
Bớc đầu khảo sát tần số phân bố alen của gen
D13S317

Nghiêm Xuân Dũng, Trần Minh Đôn, Lơng Thị Yến
Cục Kỹ thuật Hóa-Sinh Bộ Công an

D13S317 là đoạn ADN đa hình có trình tự lặp lại 4 đôi bazơ nitơ nằm trên nhánh dài của nhiễm
sắc thể số 13. Locus này chứa 9 alen, có độ dài từ 242 đến 270bp. Ngời ta đã xác định đợc số
đoạn lặp lại trong quần thể ngời là 7,8,9,10,11,12,13,14 và 15. Trong bài này, bằng kỹ thuật PCR
và điện di trên bản gel polyacrylamide biến tính, chúng tôi đã xác định sơ bộ tần suất các allen của
locus D13S317.

I. Đặt vấn đề
Ngày nay, việc nghiên cứu ứng dụng các
đoạn lặp, đặc biệt là các đoạn lặp ngắn (STR)
trong hệ gen ngời đã trở thành phổ biến trong
việc xác định cá thể ngời, xác định huyết
thống cha con, truy tìm ngời mất tích qua hài
cốt, xây dựng tàng th gen tội phạm để phục
vụ các yêu cầu của tố tụng hình sự và dân sự.
Các đoạn lặp của hệ STR thờng có chiều
dài 2-7 cặp bazơ [4]. ở mỗi cá thể khác nhau,
số lợng đoạn lặp khác nhau, do vậy mà ngời
ta coi đây là đặc điểm cơ bản để xác định sự
khác biệt giữa ngời này với ngời khác [3].
Ưu điểm của các đoạn lặp lại ngắn là khá bền
vững, có thể thực hiện nhân gen tổ hợp của các
đoạn gen khác nhau trong cùng một phản ứng
và phù hợp với các mẫu hình sự [2]. Gen
D13S317 là gen có những đặc điểm nh vậy.

Sử dụng kỹ thuật PCR và điện di chúng tôi
đã xác định đợc các alen của gen D13S317
[1].
Mục tiêu nghiên cứu:
- Nghiên cứu các điều kiện PCR tối u để
nhân bội đoạn gen D13S317.
- Sử dụng kỹ thuật điện di trên gel
Polyacrylamide biến tính để xây dựng thang
allen cho locus di truyền D13S317
- Khảo sát sơ bộ tần xuất allen của locus
D13S17 ở một số ngời Việt Nam.
II. Đối tợng và phơng pháp
nghiên cứu
1. Đối tợng
Máu tơi đợc lấy trực tiếp từ những ngời
khoẻ mạnh, không có quan hệ họ hàng huyết
thống. Các cá thể này là ngời Việt đợc phân
bố ở các vùng địa lý khác nhau.
2. Phơng pháp
a. Tách chiết ADN
Tiến hành tách theo phơng pháp dùng
phenol và chloroform [5].
Sản phẩm ADN sau khi tách đợc xác định
nồng độ bằng quang phổ kế, kết quả cho thấy:
- Nồng độ tối thiểu: 10,5ng/àl
- Nồng độ tối đa: 290,5ng/àl
- Nồng độ trung bình: 150ng/àl

81
TCNCYH 23 (3) 2003

Độ tinh sạch trung bình tính bằng chỉ số OD
trên 1,75; đảm bảo chất lợng cho các nghiên
cứu tiếp theo.
b. Phản ứng nhân gen (PCR)
- Sử dụng đoạn mồi đặc hiệu cho locus
D13S317 do hãng Geneset Singapore Biotech
cung cấp.
- Taq-polymerase, 10X PCR buffer và
dNTPs của hãng Pharmacia.
- Hỗn hợp phản ứng PCR:
10X PCR Buffer : 2,5àl
dNTPs : 2,5àl
Mồi xuôi : 1,0àl
Mồi ngợc : 1,0àl
Taq : 0,2àl
dH
2
O : 16,8àl
ADN khuôn : 1,0àl
- Thực hiện phản ứng nhân gen trên máy
Geneamp-PCR System 9700 của hãng Perkin
Elmer (Mỹ) hoặc máy Eppendorf (Mỹ).
Chu trình nhiệt:
95
o
- 5 phút x 1 chu kỳ
58
o
- 1 phút
72

o
- 1 phút x 35 chu kỳ
94
o
- 1 phút
58
o
- 1 phút x 1 chu kỳ
72
o
- 10 phút
4
o
c. Điện di và xác định alen
* Kỹ thuật điện di:
Các mẫu sau khi thực hiện quá trình PCR
đã đợc kiểm tra trên gel agaroza 2% sau đó
đợc điện di trên gel polyacrylamide 6% sử
dụng ure 7M. Băng ADN đợc phát hiện bằng
phơng pháp nhuộm bạc của Bassam, 1991
[6].







Hình 1: Kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agaroza 2%
* Chọn lọc và xây dựng thang alen-xác định alen:

- Đánh số alen theo quy ớc riêng
: Dựa vào
các alen quan sát đợc của các mẫu khác nhau
trên bản điện di, chúng tôi chọn ra các mẫu
mang các alen khác nhau và đánh số alen theo
thứ tự từ dới lên trên (đánh số alen từ băng
ADN có trọng lợng phân tử thấp nhất đến
băng ADN có trọng lợng phân tử cao nhất).
Việc đánh số ở đây chỉ mang tính quy ớc sao
cho mỗi alen xác định đợc có ký hiệu riêng, vì
đây là quá trình khảo sát ban đầu cha có thang
alen chuẩn để so sánh.

82
TCNCYH 23 (3) 2003
- Xây dựng thang alen:
Trong quá trình đánh
số, chúng tôi đồng thời chọn ra những mẫu
mang những alen khác nhau tập hợp lại để tạo
thang alen. Thang alen đợc tạo bằng phơng
pháp trộn mẫu.
- Chuẩn thang alen:
ký hiệu lại các alen đã
khảo sát đợc theo quy ớc quốc tế. Alen của
locus D13S317 đợc ký hiệu từ 7 đến 15 căn cứ
vào số đoạn lặp của mỗi alen.
Chúng tôi tiến hành chuẩn thang alen nh
sau: lấy kết quả tần suất alen tính đợc so sánh
với tần suất alen đã khảo sát bằng thang alen
chuẩn theo tài liệu nghiên cứu ở một nhóm

ngời Việt Nam sau đó ký hiệu lại các alen dựa
vào tần suất tơng đơng.
III. Kết quả
1. Kết quả chọn lọc alen và tạo thang alen
Sử dụng các phơng pháp đã nêu, bớc đầu
chúng tôi đã tạo đợc thang alen chuẩn cho
locus D13S317. Thang alen này (ký hiệu LD)
bao gồm 8 alen khác nhau (hình 2) đợc ký
hiệu từ alen số 8 đến alen số 15 theo phơng
pháp chuẩn alen đã nêu.







Hình 2. Thang alen chuẩn của locus D13S317 với 8 alen khác nhau đợc phân tách bằng kỹ
thuật điện trên gel PA biến tính.
2. Kết quả tính tần suất alen của locus D13S317
Kết quả khảo sát của chúng tôi
Allen 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Số lợng 0 100 31 24 62 50 12 2 1
Tần suất % 0 35.46 10.99 8.51 21.98 17.73 4.25 0.7 0.35

Kết quả khảo sát của nớc ngoài đối với ngời Việt Nam
Allen 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Tần suất % 0.3 29.5 16.6 12.4 23.0 15.2 2.8 0.3 0

Tổng số mẫu đợc khảo sát : 141

- Số cá thể đồng hợp tử : 29
- Số cá thể dị hợp tử : 112

83
TCNCYH 23 (3) 2003
- Số allen xác định đợc : 8allen ( ký hiệu từ
allen số 8 đến allen số 15)
- Allen có tần suất cao nhất là allen số 8 :
35,46%
- Allen có tần suất nhỏ nhất là allen số 15 :
0.35%
IV. Bàn luận
Sử dụng kỹ thuật PCR và dùng đôi mồi đặc
hiệu chúng tôi đã nhân bội đợc đoạn gen di
truyền D13S317 có độ dài từ 242 đến 270 bp
Sản phẩm PCR đợc điện di trên gel
agaroza 2%. Kết quả điện di cho thấy điện di
trên gel agarose các băng ADN hiện rất rõ
nhng khả năng phân tách các đoạn lặp lại 4 bp
không cao. [5]
Sử dụng kỹ thuật điện di trên gel
polyacrylamide biến tính kết hợp với phơng
pháp nhuộm bạc [6] là phơng pháp thích hợp
để phân tách các đoạn ADN cách nhau 4 bp
của đoạn gen D13S317. Sử dụng phơng pháp
này chúng tôi đã chọn đợc 8 allen khác nhau
để xây dựng thang allen chuẩn theo thang
chuẩn quốc tế [7].
Kết quả khảo sát cho thấy ở gen D13S317
alen số 8 có tần suất cao nhất (35.46%),alen số

15 có tần suất thấp nhất (0.35%), cha thấy
xuất hiện alen số 7. Tuy nhiên số liệu này cũng
tơng đối phù hợp với số liệu khảo sát của các
tác giả [7] khi khảo sát 16 gen hệ STR của
quần thể ngời Việt.
V. Kết luận
1. Đã lựa chọn đợc qui trình PCR tối u
để nhân đoạn gen di truyền D13S317
2. Sử dụng sản phẩm PCR cùng kỹ thuật
điện di trên gel polyacrylamide biến tính xây
dựng đợc thang alen cho locus di truyền
D13S317. Thang alen tạo đợc gồm 8 alen
khác nhau ký hiệu từ alen số 8 đến 15.
3. Đã khảo sát sơ bộ tần suất alen của locus
D13S317 ở 141 mẫu ADN ngời Việt Nam dựa
vào thang alen tạo đợc.
Tần suất khảo sát thu đợc cao nhất ở alen
số 8,alen số 7 cha thấy xuất hiện trong số mẫu
đã khảo sát.
Tài liệu tham khảo
1. Budowle B., Safantila A., Hochmeister
M. N., and Comey C. T. (1994): The
application of PCR to forensic science, The
PCR. 244-256.
2. Hammond H. at al. (1994): Evaluation
of 13 short tandem repeat loci for use in
personal identification application, Am.J. Hum.
Genet, 55: 175.
3. Lewontin R. C., Hartl D.L. (1991):
Population genetics in forensic DNA typing",

Science. 254: 1745-1750.
4. Lygo. J. E., Johnson. P. E. J et al.
(1994): The validation of short tandem repeat
(STR) loci for use in forensic casework.
Int.J.Legal Med. 107: 77-89.
5. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis
T. (1989): Molecular cloning -Vol 3, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, USA. E10 -
E12.
6. Westermeier R. (1997):
Electrophoresis in Practice, VCH A Wiley
company, Federal Republic of Germany. 287-
292
7. Technical manual (1999): Geneprint
fluorescent STR systems, Promega. 2-7, 36 37.


84
TCNCYH 23 (3) 2003
Summary
Primary determination of allele frequencies of D13S317
locus in Vietnamese population
Repeated sequences in human genome especially short tandem repeat (STR) loci is used
increasingly for forensic purpose including individualization, paternity testing, MIA (missing in
action) casework and construction of criminal DNA profile. In comparison with the traditional
methods, STR analysis has many advantages. STR loci consist of short repetitive sequence units of
2-7 base pair in length. The number of repetitive sequence units is usually different between
individuals. This is a very important characteristic for individualization. Another advantages which
makes STR loci become useful for forensic analysis is their stability under changing environmental
conditions because of their short length. In addition, a PCR for multification of 2-3 STR loci of a

DNA sample can be performed well in only one tube.
D13S317 is a STR locus which located on the long hand of the chromosome No 13. The locus
contains 9 alleles singed after their number of repeat units as 7, 8, 9, 10 ,11, 12, 13, 14, 15. In this
report, PCR technique and denaturing polyacrylamide gel electrophoresis were applied for
determination of allele frequencies of D13S317 locus. The data investigated among 141
Vietnamese DNA samples shows the highest frequency at allele No 8 (35.46%). Allele No 7 has
not been observed.

85