(Luận án tiến sĩ) nghiên cứu tạo hạt giả virus lở mồm long móng type o trong hệ biểu hiện baculovirus tế bào côn trùng định hướng sản xuất vaccine

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN PHƯƠNG HOA

NGHIÊN CỨU TẠO HẠT GIẢ VIRUS LỞ MỒM
LONG MÓNG TYPE O TRONG HỆ BIỂU HIỆN
BACULOVIRUS TẾ BÀO CÔN TRÙNG
ĐỊNH HƯỚNG SẢN XUẤT VACCINE

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2020

luan an

1


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GUYỄN P

NGHIÊN CỨU TẠO HẠT VIRUS LỞ MỒM LONG
MÓNG TYPE O TRONG HỆ BIỂU HIỆN BACULOVIRUS
TẾ BÀO CƠN TRÙNG
ĐỊNH HƯỚNG SẢN XUẤT VACCINE

Chun ngành: Hóa sinh học

Mã số: 9 42 01 16
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Thị Kim Cúc
Viện Hóa sinh biển
2. PGS.TS. Đinh Duy Kháng
Viện Cơng nghệ sinh học

Hà nội, 2020

luan an

2


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn sau sắc tới hai thầy hướng dẫn cho
tôi hoàn thành luận án, PGS. TS. Nguyễn Thị Kim Cúc, Viện Hóa sinh biển và
PGS. TS. Đinh Duy Kháng, Viện Công nghệ sinh học. Kết quả đạt được ngày hôm
nay có sự tận tâm dạy dỗ, định hướng cho tơi trong nghiên cứu, truyền cho tôi niềm
say mê và kiến thức khoa học vững chắc. Một lần nữa xin được cảm ơn Thầy cô của
tôi.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Chủ nhiệm đề tài TS. Lê Thị Hồng Minh đã
cho phép và tạo mọi điều kiện cho tôi thực hiện luận án theo hướng nghiên cứu của
đề.
Tôi xin chân thành cảm ơn Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung đã cử tôi
đi học, PGS. TS. Phạm việt Cường, TS. Nguyễn Hoàng Dương, cùng tập thể
đồng nghiệp Trung tâm sinh học phân tử Nghĩa Đô, nơi tôi làm việc đã tạo điều
kiện giúp đỡ cho tơi hồn thành luận án.
Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cơ sở đào tạo, Viện Công nghệ sinh học và

Ths. Bùi Thị Hải Hà cán bộ phụ trách NCS đã hướng dẫn và gúp đỡ tơi trong suốt
q trình học tập này.
Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè, gia đình đã ln bên tơi, cổ vũ
và động viên tơi, hồn thành tốt luận án này.
Tơi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nôi, ngày

tháng năm 2020

Tác giả

NCS. Nguyễn Phương Hoa
i

luan an


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan:
Đây là cơng trình nghiên cứu do chính tơi thực hiện và một số kết quả
có được cùng sự cộng tác với các cộng sự khác.
Tất cả số liệu và kết quả được trình bày trong luận án là trung thực, một
phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên nghành với sự đồng ý
và cho phép của các đồng tác giả.
Phần cịn lại trong luận án chưa được ai cơng bố trong bất kì cơng trình
nào khác
Hà nơi, ngày

tháng

năm 2020

Tác giả

NCS. Nguyễn Phương Hoa

ii

luan an


MỤC LỤC
Lời cảm ơn ........................................................................................................ i
Lời cam đoan ................................................................................................... ii
MỤC LỤC ....................................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................. iv
DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................ v
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ........................................................ vi
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
MỤC TIỂU ....................................................................................................... 2
NỘI DUNG ....................................................................................................... 3
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ................................................. 3
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 4
1.1. Bệnh lở mồm long móng............................................................................ 4
1.1.1. Giới thiệu chung về bệnh lở mồm long móng .......................................... 4
1.1.2. Tình hình dịch bệnh LMLM trên thế giới ................................................ 4
1.1.3. Tình hình dịch bệnh tại Việt Nam ............................................................ 6
1.2. Virus gây bệnh LMLM ............................................................................ 9
1.2.1. Cấu trúc của virus LMLM ..................................................................... 10

1.2.2. Các type huyết thanh của Virus LMLM ................................................. 13
1.2.3. Chẩn đoán bệnh LMLM ........................................................................ 14
1.2.4. Đặc tính của virus LMLM ở mức độ phân type ...................................... 22
1.2.5. Vaccine phòng bệnh LMLM .................................................................. 24
1.3. Hạt giả virus (VLP) và vaccine phát triển bằng công nghệ VLP .......... 29
1.3.1. Khái niệm về VLP .................................................................................. 30
1.3.2. Phương pháp tạo hạt giả virus VLP ........................................................ 30
1.3.3. Các hệ thống biểu hiện tạo VLP ............................................................. 30
1.3.4. Các loại vaccine VLP ............................................................................. 34
1.3.5. Hệ biểu hiện VLP cho virus LMLM ....................................................... 38
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................... 44
2.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................. 44
iii

luan an


2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 46
2.2.1. Phương pháp RT-PCR tạo cDNA ........................................................... 46
2.2.2. Thiết kế các primer để nhân dòng các gen VP0, VP1-2A và VP3 .......... 48
2.2.3. Tách dịng các gen VP0, VP1-2A và VP3, giải trình tự ......................... 49
2.2.4. Thiết kế vector pFastBacTM Dual mang gen VP0 và VP1-2A-VP3 ......... 51
2.2.5. Tạo bacmid tái tổ hợp trong tế bào E. coli DH10Bac .............................. 55
2.2.6. Biểu hiện các cụm gen VP0, VP1-2A-VP3 trong tế bào côn trùng ......... 56
2.2.7. Tối ưu biểu hiện hai cụm gẹn VP0, VP1-2A-VP3 trong tế bào côn trùng
tạo VLP-LMLM lớn nhất ....................................................................... 59
2.2.8. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamid ............................... 60
2.2.9. Phương pháp Western Blot ..................................................................... 61
2.2.10. Phương pháp thu hổi VLP .................................................................... 61
2.2.11. Phương pháp soi kính hiển vi điện tử truyền qua .................................. 62

2.3. Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của VLP-LMLM............... 63
2.3.1. Đánh giá đáp ứng miễn dịch của VLP-LMLM trên chuột ....................... 63
2.3.2. Đánh giá gây đáp ứng miễn dịch của VLP-LMLM trên bê ..................... 65
2.3.3. Kiểm tra độc tính của VLP-LMLM trên chuột thí nghiệm ...................... 67
2.3.4. Đánh giá hiệu giá kháng thể của VLP-LMLM ........................................ 67
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................. 68
3.1 Phân lập các gen cấu trúc VP0, VP1-2A và VP3 .................................... 68
3.1.1. Thiết kế các primer cho 3 gen VP0, VP1-2A và VP3 ............................. 68
3.1.2. Tổng hợp cDNA ..................................................................................... 69
3.1.3. Lựa chọn chủng làm nghuyên liệu nghiên cứu ....................................... 70
3.1.4. Tách dịng và giải trình tự các gen VP0, VP1-2A và VP3 ....................... 71
3.1.5. Tối ưu các gen VP0, VP1-2A và P3 tạo thành hai cụm gen VP0, VP12A-VP3 .................................................................................................... 75
3.2. Thiết kế vector pFastBacTM Dual mang gen VP0 và VP1-2A-VP3 ....... 78
3.2.1. Kết quả tạo vector pFastBacTM Dual mang cụm gen VP1-2A-VP3 ......... 78
3.2.2. Tạo vector pFastBacTM DualVP1-2A-VP3 mang gen VP0 ...................... 80
3.3. Tạo bacmid tái tổ hợp mang gen VP1-2A-VP3 và VP0 trong
tế bào E. coli DH10Bac ......................................................................... 82
iv

luan an


3.4. Biểu hiện gen VP0, VP1-2A-VP3 trong tế bào côn trùng tạo VLP ....... 84
3.4.1. Nuôi cấy tăng sinh lượng lớn tế bào côn trùng........................................ 84
3.4.2. Nhiễm bacmid tái tổ hợp vào tế bào côn trùng tạo Bac stock P1 ............. 85
3.4.3. Biểu hiện Bac stock P2 trong tế bào côn trùng........................................ 87
3.4.4. Kiểm tra sự tạo thành VLP bằng kính hiển vi điện tử TEM .................... 90
3.5. Tối ưu biểu hiện Bac stock P2 trong tế bào côn trùng........................... 91
3.5.1. Xác định dịng tế bào thích hợp nhiễm biểu hiện tạo VLP-LMLM lớn
nhất .......................................................................................................... 91

3.5.2. Xác định nồng độ tế bào cơn trùng và khoảng thời gian thích hợp
để lượng VLP-LMLM thu được lớn nhất ................................................ 92
3.5.3. Kiểm tra protein trên gel polyacrylamid và Western blot ........................ 93
3.6. Đánh giá khả năng gây miên dịch của VP-LMLM trên động vật......... 95
3.6.1. Kết quả gây miễn dịch của VLP-LMLM trên chuột lang ........................ 95
3.6.2. Kết quả kiểm tra độc tính của VLP-LMLM trên chuột thí nghiệm.......... 97
3.7. Kết quả đánh giá đáp ứng miễn dịch của VLP-LMLM trên bê ........... 98
3.7.1. Nghiên cứu thử nghiệm liều sinh miễn dịch trên bê ................................ 98
3.7.2. Đánh giá hiệu giá kháng thể của VLP-LMLM ...................................... 102
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ ......................................................... 103
4.1. Phân lập các gen cấu trúc VP0, VP1-2A và VP3 ................................. 103
4.2. Tối ưu codon trong hai cụm genVP0 và VP1-2A-VP3 ........................ 105
4.3. Biểu hiện hai gen VP0, VP1-2A-VP3 trong tế bào côn trùng .............. 106
4.4. Thử nghiệm VLP-LMLM trên động vật thí nghiệm ........................... 113
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 116
NHỮNG CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CƠNG BỐ ......................... 117
TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH ............................................... 119
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................ 128

v

luan an


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Chú thích

ATP

Adenosine triphosphat

APS

Amonium persulphate

Amp

Ampicillin

ARN

Ribonucleic acid

BSA

Bovine serum albumin

cDNA

Complementary deoxyribonucleic acid

DNA

Deoxyribonucleic acid

CBB

Comassie brillant blu R-250

EtBr

Ethidium bromite

ELISA

Enzyme linked immunosorbent assay

FMD

Foot Mouth Disease

FBS

Phosphat buffered saline

GDP

Gross Domestic Product

ELISA

Enzyme linked immunosorbent assay

IRES

Internal Ribosome Entry Site

Kb

Kilo base

IPTG

Isopropylthio-β-D-galactosita

LB

Lauria Betani

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

LMLM

Lở mồm long móng

mRNA

Messenger Ribonuclease Acid

TTH

Tái tổ hợp

vi

luan an

NEB

Native Elution Buffer

NWB

Native Wash Buffer

NPB

Native purification Buffer

OIE

Organization of International Epizootics

ORF

Open reading frame

OD

Optical Density

PCR

Polymerase Chain Reaction

PBS

Phosphat buffered saline

PVDF

Polyvinylidene difluoride

RNA

Ribonucleic acid

RT

Revesec transcriptase

SDS

Sodium dodecyl sulphat

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulphat- polyacrylamide gel
electrophoresis

TBS

Tris buffered saline

TEDED

N, N, N’, N’- tetramethyl ethylenediamine

TTBS

Tween- Tris Buffered Saline

UTR

Untranslated region

VLP

Virus-like particles

vii

luan an


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Tóm tắt các đợt bùng phát dịch LMLM 2007 đến 2017............................. . 5
Bảng 2.1: Danh sách mẫu bệnh phẩm virus LMLM sử dụng trong nghiên cứu ......... 44
Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR từ cDNA ........................................................ 47
Bảng 2.3: Thông tin cặp mồi FMDV-1F/1R được sử dụng......................................... 47
Bảng 2.4: Chu trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại sản phẩm PCR .......................... 48
Bảng 2.5: Phản ứng gắn gen VP1-2A-VP3 vào vector pFastBacTM Dual ................... 53
Bảng 2.6: Trình tự cặp mồi M13 ... ........................................................................... 55
Bảng 2.7: Chu trình nhiệt phản ứng PCR gen VP0 vàVP1-2A-VP3 .......................... 55
Bảng 2.8: Thành phần gel polyacrylamide12% ......................................................... 60

Bảng 2.9: Bố trí thí nghiệm gây miễn dịch của VPL-LMLM trên huột.................... 63
Bảng 3.1: Kết quả tách chiết AR từ các mẫu LMLM ................................................. 69
Bảng 3.2: Các cặp primer khuếch đại các gen VP0, VP3 và VP1-2A ........................ 87
Bảng 3.3: Trạng thái của tế bào sau khi lây nhiễm .................................................... 95
Bảng 3.4: Kết quả xác định liều tiêm phù hợp kháng nguyênVLP-LMLM ................ 96
Bảng 3.5: Tổng kết sự thay đổi kháng thể (tính theo chỉ số PI) của chuột thử
nghiệm ở nồng độ 400 ng/liều .................................................................. 97
Bảng 3.6: Bảng theo dõi chuột trong 10 ngày sau tiêm VLP-LML ........................... 99
Bảng 3.7: Kết quả kiểm tra huyết thanh bê trước khi thử nghiệm ............................ 100
Bảng 3.8: Tổng hợp kết quả xác định liều sinh miễn dịch ...................................... 101
Bảng 3.9: Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể từ HT bê ......................................... 102

viii

luan an


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Bản đồ tình trạng bệnh LMLM khu vực Đơg Nam Á .............................. 5
Hình 1.2: Tổ chức hệ gen của virus LMLM và cấu trúc của virus ......................... 10
Hình 1.3: Vịng đời của virus lở mồm long móng trịng tế bào chủ ....................... 23
Hình 1.4: Cấu trúc VLP các loại virus sử dụng làm vaccine ................................. 29
Hình 1.5: Cấu trúc virus tự nhiên và hạt giả virus (VLP-virus-like particle) .......... 34
Hình 1.6: Cấu trúc của Baculovirus Mulicapsid nucleopolyhedrovirus ................. 41
Hình 1.7: Mơ tả q trình biểu hiện trong hệ thống Bạc-to-Bac® baculovirus ..... 42
Hình 2.1: Sơ đồ vector pFastBacTM Dual mang hai cụm gen VP0, VP1-2A-P3 ..... 52
Hình 3.1: Kết quả PCR sử dụng cặp mồi định tính LMLM FMD-1F/R ................. 69
Hình 3.2: Ảnh tách dịng gen gel agarose 1% các gen VP3, VP1-2A, VP0 ........... 71
Hình 3.3: Ảnh tách dòng gen gel agarose 1% các gen VP3, VP1-2A, VP0 ........... 72
Hình 3.7: Ảnh kiểm tra DNA trên gel agarose 1%. ............................................... 80

Hình 3.8: Đĩa biến nạp vector pFastBacTM Dual mang gen VP1-2A-VP3 ............ 82
Hình 3.10: Khuẩn lạc mang vector p DualVP1-2A-VP3; pUC57-VP0 ................ 83
Hình 3.12: Đĩa biến nạp pDual-VP1-2A-VP3 gắn gen VP0 và điện di
trên gel agarose1%.................................................................................. 86
Hình 3.13: Tế bào E.coli DH10Bac biến nạp vector pDual VP1-2A-VP3-VP0 ..... 88
Hình 3.15: Hình thái tế bào Sf9 ở các độ phóng đại khác nhau ............................. 91
Hình 3.16: Hình thái tế bào SF9 ở các giai đoạn khác nhau ................................. 92
Hình 3.17: Hình thái tế bào sau khi nhiễm Bac stock P1 ..................................... 93
Hình 3.18: Ảnh kiểm tra biểu hiện protein sau 24 h, 48 h, 72 h, 96 h nuôi cấy ..... 94
ix

luan an


Hình 3.19. Ảnh chụp TEM đánh giá sự hình thành VLP-LMLM .......................... 97
Hình 3.20: Hình thái tế bào sau khi nhiễm vào hai loại tế bào Sf9 và Sf21 ........... 94
Hình 3.21: Hình thái tế bào sau các khoảng thời gian lây nhiễm khác nhau tại các
mật độ khác nhau

...................................................................................... 96

Hình 3.22: Ảnh điện di kiểm tra biểu hiện protein ................................................ 97
Hình 3.23: Kết quả xác định kháng thể sau tiêm kháng nguyên tái tổ hợp

(VLP-

LMLM) ở nồng độ 400 ng/0,5 mL ...................................................... 100

x

luan an


1

MỞ ĐẦU
Bệnh lở mồm long móng (LMLM) là bệnh truyền nhiễm xuyên biên
giới, tấn công vật nuôi và động vật hoang dã. Bệnh lây lan nhanh và mạnh,
làm nhiều gia súc nhiễm bệnh và nhanh chóng lây lan thành dịch. Động vật
mắc bệnh LMLM là các lồi móng guốc chẵn như: trâu, bò, lợn, dê, cừu,
hươu, nai... Bệnh LMLM được đánh giá là bệnh nguy hại nhất ở động vật
trong các trang trại vì nó gây giảm năng suất và thiệt hại kinh tế rất lớn. Theo
Tổ chức Thú y thế giới (Office International des Epizooties - OIE) bệnh
LMLM làm sảy thai khoảng 25 % động vật có chửa, làm giảm tới 25 % sản
lượng thịt, 50 % sản lượng sữa và giảm năng suất lông tới 25 % ở cừu. Vì
vậy, LMLM được Tổ chức Thú y thế giới xếp vào danh mục các bệnh truyền
nhiễm nguy hiểm nhất cho chăn nuôi và tác động rất lớn tới ngành kinh doanh
các sản phẩm ở động vật móng guốc chẵn, đặc biệt là bị và lợn.
Virus gây bệnh LMLM có khả năng biến chủng cao, do đó nhược điểm
của vaccine phịng bệnh LMLM là chỉ có tác dụng phịng bệnh cao khi chủng
virus được dùng để sản xuất vaccine là chủng virus có tương đồng kháng
nguyên với chủng gây bệnh ngoài thực địa. Tất cả các loại vaccine LMLM
hiện đang được sử dụng ở trên thế giới và tại Việt Nam đều là vaccine vô
hoạt. Tuy nhiên, các vaccine này cịn bộc lộ những hạn chế nhất định. Vì vậy,
đã có nhiều hướng đi mới trong cơng nghệ sản xuất vaccine nhằm khắc phục
những nhược điểm trên để đảm bảo tăng cường hiệu lực, tính an tồn và nâng
cao hiệu quả kinh tế. Hiện nay, hướng nghiên cứu tạo các hạt giả virus (Virus
like particle-VLP) đang được xem là một bước đột phá trong công nghệ sản
xuất vaccine thế hệ mới. VLP được tạo ra bởi các protein cấu trúc của virus,
có cấu trúc tương tự như các hạt virus tự nhiên nhưng không mang vật liệu di

1

luan an


2

truyền của virus, do đó khơng có khả năng lây nhiễm. Do có cấu trúc tương tự
virus tự nhiên bao gồm các protein kháng nguyên quan trọng của virus, VLP
sẽ được hệ thống miễn dịch phòng vệ của vật chủ nhận biết và tạo đáp ứng
miễn dịch phòng vệ cao tương tự như khi động vật bị nhiễm virus tự nhiên.
Vaccine viêm gan B và vaccine ung thư cổ tử cung là hai loại vaccine VLP
đầu tiên được sản xuất bằng công nghệ tiên tiến này và đã được thương mại
hóa.
Hiện nay, ở Việt Nam Cơng ty TNHH MTV AVAC thuộc Tổng công ty
RTD đã nghiên cứu sản xuất thành cơng vaccine LMLM type O có tên đầy đủ
AVAC – V6 FMD Emulsion type O bằng công nghệ cổ điển với chủng virus
thực địa do Chi cục thú y vùng VI phân lập, tuyển chọn và cung cấp. Vừa
qua, Công ty AVAC cũng đã tiếp nhận chủng LMLM type A do Chi cục thú y
vùng VI phân lập, tuyển chọn, cung cấp và đang tiếp tục nghiên cứu sản xuất
vaccine LMLM type A. Nhưng, cho tới nay vẫn chưa có một nghiên cứu nào
sử dụng công nghệ tạo hạt giả virus VLP hướng tới mục tiêu sản xuất vaccine
LMLM. Với những lý do nêu trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề
tài:”Nghiên cứu tạo hạt giả virus Lở mồm long móng type O trong hệ
biểu hiện Baculovirus tế bào cơn trùng định hướng sản xuất vaccine”.
MỤC TIÊU
Tạo được hạt giả của virus LMLM (VLP-LMLM) type O ở Việt Nam
trên hệ biểu hiện baculovirus tế bào côn trùng, thử nghiệm được VLP-LMLM
trên động vật thí nghiệm là chuột lang và bê để đánh giá khả năng sinh kháng
thể của VLP-LMLM type O. Xác định được liều tiêm phù hợp và hiệu giá

kháng thể đạt được cao nhất của VLP-LMLM.

2

luan an


3

NỘI DUNG
1. Phân lập các gen VP0, VP1-2A, VP3 mã hóa cấu trúc vỏ của virus
LMLM type O ở Việt Nam. Tối ưu hóa tạo hai cụm gen VP1-2A-VP3 và
VP0 phù hợp biểu hiện trong baculovirus tế bào côn trùng.
2. Thiết kế vector biểu hiện Bacmid mang hai cụm gen VP1-2A-VP3 và
VP0 thông qua vector chuyển pFastBacTM Dual trong tế bào DH10bac
3. Nhiễm biểu hiện các gen VP1-2A-VP3 và VP0 trong tế bào côn trùng
tạo VLP-LMLM.
4. Thử nghiệm VLP-LMLM trên động vật thí nghiệm là chuột và bê.

NHỮNG ĐĨNG GĨP MỚI CỦA LUẬN ÁN
- Nghiên cứu tạo virus dạng giả (VLP) nói chung và VLP-LMLM của
virus LMLM type O ở Việt Nam nói riêng là nghiên cứu đầu tiên sử
dụng cơng nghệ VLP để hướng tới làm vaccine an tồn tuyệt đối cho
động vật, và cho các loại bệnh nguy hiểm do virus gây ra như HIV…
Sau nghiên cứu này chúng tơi đã góp phần làm chủ được quy trình công
nghệ tạo VLP.
- Đã sản xuất được hạt giả virus LMLM làm ứng viên cho chế tạo vaccine
phòng chống LMLM. (Đã đăng kí được bằng độc quyền giải pháp hứu
ích tại cục sở hữu trí tuệ cho quy trình sản xuất hạt giả virus LMLM số:
2017 theo quyết định số 24008/QĐ-SHTT, ngày 02/04/2019).

3

luan an


4

Chương I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Bệnh Lở mồm long móng
1.1.1. Giới thiệu chung về bệnh lở mồm long móng
Bệnh lở mồm long móng (LMLM) là một loại bệnh truyền nhiễm rất
nguy hiểm do virus LMLM gây ra trên động vật móng guốc chẵn như trâu,
bị, lợn, dê, hươu…(Soleimanjahi và cs., 2013; Rashid và cs., 2014; Diaz-San
và cs., 2016). Bệnh này rất nguy hiểm vì bệnh lây lan rất nhanh qua nhiều con
đường khác nhau như tiếp xúc trực tiếp giữa động vật với nhau, truyền qua
khơng khí... (Metcalf và McElvaine, 1995; Donaldson, 1997). Chính vì vậy
mà Tổ chức Thú y thế giới xếp bệnh lở mồm long móng nguy hiểm hàng đầu
trong các bệnh truyền nhiễm ở động vật. Bệnh có các biểu hiện lâm sàng như
sốt, nổi bọng nước ở niêm mạc miệng, da móng, gờ móng, kẽ móng và trên
bầu vú, đầu vú con cái của tất cả các lồi thú có móng chẻ, gia súc cũng như
thú hoang dã (Zamora và cs., 2010; Stenfeldt và cs., 2014). Bệnh có tính chất
gây dịch lớn, lây lan rất nhanh và gây thiệt hại lớn về kinh tế, môi trường của
nhiều nước trên thế giới như đã xảy ra ở Anh vào năm 2001 (Scudamore và
Harris, 2002)
1.1.2. Tình hình dịch bệnh LMLM trên thế giới
Tính đến năm 2018, bệnh LMLM vẫn là loại bệnh gây nguy hại nhất ở
động vật trên khắp lục địa (FAO, 2018). Cũng có một số nước như Singapore,
Brunei Darussalam, Indonesia và Philippines được công nhận là khơng có

bệnh LMLM và khơng cần tiêm phịng (Hình 1.1).
Trong thập kỷ qua (2007- 2015), 4961 ổ dịch LMLM từ Campuchia,
4

luan an


5

Lào, Malaysia, Myanmar, Thái Lan và Việt Nam đã được báo cáo cho Hệ
thống thông tin thú y khu vực ASEAN (ARAHIS) và tổ chức quốc tế (OIE).

Hình1.1: Bản đồ tình trạng bệnh LMLM khu vực Đơng Nam Á

Nguồn: />Hệ thống thông tin Ứng dụng y tế thông báo trực tuyến của WAHIS báo
cáo 5 năm đầu tiên (2007-2011), các ổ dịch tăng gấp bốn lần từ 307 (2007)
đến 1214 (2011). Sự gia tăng này có thể một phần là do thương mại xuyên
biên giới hoặc do nhu cầu thịt từ các sản phẩm động vật gia tăng khi nền kinh
tế quốc gia phát triển (Windsor, 2017). Kể từ năm 2011, khi một dịch bệnh
lớn của serotype O (chủ yếu là topotype Mya-98) xuất hiện trong khu vực và
lan sang Trung Quốc, Hàn Quốc và Nhật Bản (Muroga và cs., 2012), số lượng
các vụ dịch được báo cáo đã giảm, sau đó tăng trở lại khoảng 400 ổ dịch mỗi
năm vào năm 2015. Nhìn chung, trong số 4961 vụ dịch LMLM, 1773 (35,6
%) kết quả xác định type huyết thanh LMLM phần lớn là huyết thanh O
(77,9 %; 1416 vụ dịch), tiếp theo là type huyết thanh A (19,8 %; 351 vụ dịch)
(0,3 %; 6 ổ dịch). Điều thú vị là 3143 ổ dịch (63, 4 %) khơng có các type
virus nêu trên.
5

luan an

6

1.1.3. Tình hình dịch bệnh tại Việt Nam
Tại Việt Nam, bệnh LMLM đã xuất hiện được hơn 100 năm; phân tích
dịch tễ dịch bệnh từ năm 2006 - 2016 cho thấy, trung bình 2 - 3 năm lại xuất
hiện một đợt dịch, gây thiệt hại lớn về kinh tế cho người chăn ni và ngân
sách nhà nước. Chính phủ đã chỉ đạo Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn
phê duyệt, tổ chức thực hiện Chương trình quốc gia phịng, chống bệnh
LMLM qua 3 giai đoạn (giai đoạn 2006 - 2010; 2011 - 2015 và 2016 - 2020);
trong đó có nội dung quan trọng là hằng năm tổ chức tiêm vaccine phòng
bệnh LMLM. Kết quả tổng kết giai đoạn 1 (2006 - 2010) và giai đoạn 2 (2011
- 2015) cho thấy, dịch bệnh trong giai đoạn 2 đã giảm trên 52 %; số xã, số
huyện và số tỉnh đã giảm đi rõ rệt; số lượng gia súc bị bệnh, chết vì bệnh đã
giảm hàng chục nghìn con (Cục Thú y, 174 /QĐ-BNN-TY, 2017). Từ đầu
tháng 12/2018 đến nay, cả nước đã xảy ra 48 ổ dịch bệnh LMLM ở 6 tỉnh,
thành, trong đó có Hà Nội, Bắc Ninh, Hịa Bình, Hà Nam,Yên Bái... (Cục Thú
y, 2019). Tổng số gia súc mắc bệnh gần 2.400 con, chủ yếu trên lợn thịt do
chưa được tiêm phòng vaccine LMLM. Mới đây dịch lại bùng phát trên địa
bàn nhiều tỉnh thành khác trong cả nước. Cụ thể, từ ngày 8/11 đến 5/12/2018,
có 261 con lợn của 19 hộ tại 6 xã huyện Ba Vì bị bệnh LMLM.
Bảng 1: Tóm tắt các đợt bùng phát dịch LMLM được báo cáo cho ARAHIS
(2007 - 2011) / RAHIS (2012- 2015) từ 2007 đến tháng 6 năm 2017

Nguồn: />6

luan an

7

Tuy nhiên, đến ngày 6/12/2018 Cục Thú y chưa nhận được báo cáo tình
hình dịch bệnh của Chi cục Thú y Hà Nội. Kết quả xác định serotype bằng kỹ
thuật ELISA cho thấy: Serotype O và serotype A đều được phát hiện trong số
mẫu của từng năm. Điều này cho thấy hai serotype này đang cùng lưu hành
trong đàn gia súc của Việt Nam trong giai đoạn hiện nay (Van Phan Le và cs.,
2016).
 Loài gia súc mắc bệnh
Trong tự nhiên, tất cả các động vật móng guốc chẵn đều có thể mắc bệnh
LMLM, trong đó nhiều nhất là trâu, bò rồi đến lợn, dê, cừu (OIE, 2018). Con
non mẫn cảm hơn những động vật trưởng thành, bệnh có tỷ lệ mắc bệnh cao
tới 100 % và tỷ lệ tử vong thấp (Woodbury 1995, Salt và cs., 1996, OIE 2007,
Verma và cs., 2009), tuy nhiên tỷ lệ tử vong có thể lên tới 50 % (Woodbury,
1995), virus LMLM này tái tạo trong cơ tim của động vật trẻ (Gulbahar và
cs., 2007). Các loài dã thú như voi, lạc đà, hươu, nai, lợn rừng, bò rừng, sơn
dương, nhiều loại gậm nhấm và loài nhai lại hoang dã mẫn cảm với bệnh và là
nguồn bệnh trong thiên nhiên. Lồi vật một móng như ngựa và chim không
cảm nhiễm với bệnh (Andersen, 1981). Trâu nước (Bubalus bubalis) có thể bị
nhiễm bệnh và lây lan sang các loài khác. Tại châu Phi, trâu là nguyên nhân
chính trong việc mang nguồn bệnh tại khu vực công viên quốc gia ở Uganda.
Các type virus LMLM gồm SAT1 và SAT2 đã được phát hiện từ các mẫu
bệnh phẩm, còn các type O và SAT3 được phát hiện từ mẫu huyết thanh của
đàn trâu nuôi tại công viên này (Ayebazibwe và cs., 2010). Trong thí nghiệm:
tiêm virus cho bê mới đẻ chưa bú sữa mẹ sẽ gây bệnh và có thể làm chết bê
trong vịng 38 giờ, phủ tạng bê chứa nhiều virus. Ngồi ra trong phịng thí
nghiệm người ta có thể dùng chuột nhắt trắng, chuột xám, thỏ, chuột lang
7

luan an

8

(Andersen, 1981).


Thời gian và tần suất mắc bệnh

Trung bình khoảng 2-3 năm lại xuất hiện các đợt dịch LMLM trầm trọng
( 476/QĐ-BNN-TY ngày17/02/2016). Cụ thể, trong nhiều nghiên cứu cho
thấy từ năm 2006 – 2012, dịch trầm trọng xảy ra vào các năm 2006, 2009 và
2011, mặc dù ở các năm khác, dịch vẫn xảy ra ở các tháng trong năm. Lý do
là sau một năm dịch xuất hiện trầm trọng, các biện pháp phòng chống được
triển khai quyết liệt như tiêu độc khử trùng, hạn chế vận chuyển và tiêm
vaccine phịng bệnh, do đó năm liền kề tiếp theo, dịch xảy ra ít trầm trọng
hơn. Sau đó, do virus LMLM lưu hành rộng rãi, thời gian bảo hộ do
vaccinekết thúc và việc vận chuyển gia súc từ nước ngoài vào Việt Nam tăng
mạnh, nhưng cơng tác phịng chống dịch lại không được chú trọng, nên dịch
tái xuất hiện(Cục Thú y, 2016).
Dịch LMLM có xu hướng xảy ra trầm trọng vào các tháng 3-7 và từ
tháng 9 đến tháng 3 năm sau. Nguyên nhân có thể là do việc tăng số lượng
nuôi và tăng lưu lượng vận chuyển gia súc tại thời điểm này, trong khi đó
virus LMLM lưu hành rộng rãi, nên khi có điều kiện thuận lợi thì virus phát
triển và gây bệnh tại các địa phương.Sử dụng biểu đồ lây lan ước tính (EDR)
có thể cho phép chúng ta dự đoán sơ bộ khi nào dịch bắt đầu xảy ra trầm
trọng, khi nào dịch sẽ lên đến đỉnh điểm và khi nào có dấu hiệu dịch giảm
dần. Việc ghi chép số liệu chi tiết, cẩn thận, đầy đủ và chính xác, chắc chắn sẽ
giúp cho việc xác định thời điểm dịch xuất hiện và có các biện pháp phịng
chống phù hợp, khơng để dịch trầm trọng xảy ra, cũng như có cơ sở huy động

các nguồn lực phịng chống phù hợp hơn.
 Phân bố khơng gian gia súc mắc bệnh
8

luan an


9

Dịch LMLM xuất hiện tập trung tại các tỉnh phía Bắc, Nam Trung Bộ,
Tây Nguyên và Đông Nam Bộ, nhất là tại các địa phương giáp biên giới với
Trung Quốc và Lào Cục Thú Y ( Bộ NN &PTNN). Phân tích rà sốt thống kê
cho thấy chùm khơng gian ổ dịch LMLM là rất rõ nét và dịch có tính chất lây
lan cục bộ là chủ yếu. Đặc biệt, dịch LMLM xuất hiện trầm trọng tại các vùng
đã được xác định là vùng khống chế, vùng đệm, do đó, Chương trình Quốc
gia khống chế bệnh LMLM phần lớn dựa trên việc tiêm phịng vaccine nên
được rà sốt, có những điều chỉnh sát với tình hình dịch bệnh để có kết quả
triển khai hiệu quả hơn.
Việc nghiên cứu dịch tễ học phân tử của virus LMLM và tương đồng
kháng nguyên dựa trên giá trị r1 để chọn lựa vắc xin phòng bệnh LMLM
được thực hiện trên các mẫu bệnh phẩm LMLM do các địa phương gửi về
phịng thí nghiệm của Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương
(TTCĐTYTW) và Cơ quan Thú y vùng VI (CQTYV-VI). Sau đó các mẫu sẽ
đươc TTCĐTYTW và CQTYV-VI gửi sang Phịng Thí nghiệm Tham chiếu
quốc tế tại Pirbright (Anh)
1.2. Virus gây bệnh LMLM
Virus gây bệnh LMLM thuộc giống Aphthovirus, họ Picornaviridae
(Ansell và cs., 1994; Carrillo và cs., 2005), có cấu trúc hình đa diện gồm 20
mặt đều. Bộ gen của virus là một ARN đơn dương có kích thước 8,5 kilobase
(Sharma và cs., 2012 ). Virus LMLM thuộc loại virus nhỏ nhất, kích thước

khoảng 25-30 nm và có thể qua được các máy lọc Berkefeld, Chamberland,
màng lọc Seitz (Bachrach, 1968; Fry và cs., 2005). Trọng lượng phân tử của
một virus hoàn chỉnh khoảng 7 KDa, 69 % là protein và 31 % là ARN
(Martinez-Salas & Belsham, 2017).
9

luan an


10

1.2.1. Cấu trúc gen của virus LMLM
Đầu tiên là vùng khơng dịch mã đầu 5’(5’UTR) có khoảng 1300
nucleotide (nt) bao gồm đoạn S chiếm khoảng 360 nt, chức năng của đoạn
này chưa được làm rõ (người ta cho rằng nó có thể liên quan tới việc duy trì
sự ổn định RNA của virus khi xâm nhập vào tế bào vật chủ).

Hình 1.2. Tổ chức hệ gen của virus LMLM và cấu trúc của virus.
(Nguồn: />
Hệ gen của virus LMLM chỉ có một khung đọc mở (ORF) lớn, được thể hiện bằng các
hình chữ nhật nối liền nhau, mỗi hình chữ nhật biểu thị cho một portein riêng biệt. Vùng
không dịch mã đầu 5’ (5’ UTR) chứa các cấu trúc khác nhau, bao gồm: vùng Cn chứa
poly(C), 3 hoặc 4 nút thắt giả (pseudoknots, PK) và vị trí xâm nhập của ribosome (internal
ribosome entry site, IRES). Peptide VPg được tạo ra ở 3 dạng khác nhau (được mã hóa bởi
3B1-3) và và mỗi dạng được hoạt động như primer cho việc tổng hợp RNA, như vậy mỗi hệ
gen RNA, khi được tổng hợp sẽ gắn với một VPg bằng liên kết cộng hóa trị. Sự lắp ráp các
hạt vi rút từ các tiểu đơn vị protomer and pentamer được thể hiện trong hình. Các hạt
virus đã được lắp ráp chứa một bản sao RNA vi rút duy nhất và 60 bản sao của 4 protein
10

luan an


11

capsid khác nhau (VP1-VP4). Có thể có trường hợp lắp ráp khơng hồn hảo, khi đó hạt
virus bị rỗng và khơng có RNA hệ gen. Protein VP4 nằm phía trong nên khơng thấy trên
hình (Jamal và Graham., 2013).

Tiếp theo là đoạn poly (C) có khoảng 80-200 nt, cũng có trường hợp có

tới 400 nt đó là do đoạn poly (C) sẽ dài ra trong q trình ni cấy tế bào.
Tiếp đến là đoạn L chiếm khoảng 700 nt với bộ ba mã mở đầu là AUG. Vùng
không dịch mã đầu 3’(3’UTR) có khoảng 190 nt và đi poly (A) có 10-100
nt (Fry, 2005; Caovà cs., 2010).
Toàn bộ hệ gen của virus LMLM mã hóa cho một protein lớn. Sau khi
dịch mã, protein này phân cắt thành 4 sản phẩm sơ cấp, được đặt tên là: Lpro,
P1-2A, P2 và P3.pro (Leaderprotease) là một protein đầu N-tận cùng (Nterminal) của chuỗi polyprotein. Vùng mã hóa protein L chứa 2 mã khởi đầu
và tạo ra 2 protein riêng biệt gọi là Lab và Lb (Carrillo và cs., 2005; Sangar
và cs., 1987). Lpro có vai trò ức chế việc tổng hợp protein của tế bào chủ nhờ
sự cắt protein IF4G của tế bào chủ, đây là yếu tố khởi đầu cần thiết cho quá
trình phiên mã các mRNA tế bào chủ đã được gắn mũ (capped cellular
mRNAs). Nhờ đó mà RNA của virus LMLM có thể tự do sử dụng bộ máy
tổng hợp protein của tế bào chủ phục vụ cho việc tổng hợp protein của virus
bởi vì vùng IRES của virus LMLM có thể phản ứng với phân đoạn đầu C-tận
cùng (C-terminal fragment) của eIF4G.
Trong virus tự nhiên sự phân tách của polyprotein cấu trúc P1-2A với
polyprotein không cấu trúc P2 của virus LMLM xảy ra tại điểm cuối 2A va
đầu 2B tại cấu trúc đặc trưng là Glycin-Prolin (StopGo) (Belsham, 2005).
Trong phần lớn các picornavirus, sự phân cắt ở điểm nối giữa protein cấu trúc

và phi cấu trúc qua trung gian bởi protein 2A, tuy nhiên kích thước và chức
năng của 2A khác nhau giữa các chi khác nhau (Luke et al., 2008). Trong quá
trình lắp ráp hệ gen của virus tạo lớp vỏ, VP0 sẽ được cắt thành VP4 và VP2.
11

luan an


12

VP4 bị ẩn hoàn toàn vào trong hạt virus (Belsham et al., 1991), trong khi đó
VP1, VP2 và VP3 được bộc lộ ra ngồi hạt virus và góp phần tạo nên tính
kháng nguyên của virus (Jackson và cs., 2002). VP1 chứa tối thiểu 2 quyết
định kháng nguyên quan trọng ở các thịng lọng G-H (G-H loop) thuộc vị trí
của các amino acid 141-160 và 200-213. Thịng lọng G-H có trong motif
arginine-glycine-aspartic acid (RGD) là cực kỳ quan trọng cho việc gắn virus
vào thụ thể tế bào vật chủ (Fox và cs, 1989; Jackson và cs 1997). Tuy nhiên,
virus cũng có thể xâm nhập vào tế bào không qua con đường nhận biết thụ thể
nhờ RGD motif mà có thể nhiễm vào tế bào qua một một phân tử khác ví dụ
như các thụ thể heparan sulphate proteoglycan (HSPG) (Fowler và cs., 2010).
Các trình tự nucleotide của vùng mã hóa VP1 đã được sử dụng để đánh giá
các đặc tính di truyền của các chủng virus LMLM, bởi vì vùng này đóng vai
trị quan trọng nhất trong việc gắn kết và xâm nhập của virus vào tế bào vật
chủ. Phân tích cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự VP1 đã được sử dụng
rộng rãi để đánh giá quá trình tiến hóa cũng như mối liên quan về mặt dịch tễ
học của các dòng di truyền và nguồn gốc của các chủng gây nên những vụ
dịch mới bùng phát. Các vùng P2 và P3 của polyprotein được phân cắt thành
các protein phi cấu trúc (NSPs). Vùng P2 sẽ tạo ra các protein 2B và 2C,
trong khi đó vùng P3 sẽ phân cắt để tạo thành các protein 3A, ba phiên bản
khác nhau của VPg (3B1-3), 3Cpro và 3Dpol. Các protein được mã hóa bởi

P2 và P3 gồm protein liên quan tới quá trình chế biến (3Cpro) và các protein
sao chép hệ gen (2B, 2C, 3A, 3B1-3 (VPg) và 3Dpol). 3Cpro chịu trách
nhiệm phân cắt P1-2A thành VP0, VP1, VP3 cũng như hình thành các protein
phi cấu trúc khác nhau. Vùng đầu 3’ không dịch mã (3′ UTR) ngắn hơn nhiều
so với vùng đầu 5’ khơng dịch mã (5′ UTR). Nó chỉ dài khoảng 90 nt và gấp
nếp để tạo ra một cấu trúc thòng lọng (stem-loop) đặc trưng, tiếp theo là đuôi
12

luan an


13

polyA với độ dài khác nhau. Vùng 3’ không dịch mã (3′ UTR) có thể đóng vai
trị quan trọng trong việc sao chép hệ gen của virus.
1.2.2. Các type huyết thanh (serotype) của virus LMLM
Virus LMLM được xác định là có bảy type huyết thanh riêng biệt, bao
gồm O, A, C, Asia1 và các type huyết thanh Nam Phi (SAT) là SAT1, SAT2
và SAT3 (Rweyemamu và cs., 2008). Virus LMLM type A đã được xác định
là một trong những type đa dạng nhất về mặt kháng nguyên trong số bảy type
huyết thanh (Tosh, 2002; Kitching, 2016). Type huyết thanh A đã được phân
loại thành 10 kiểu gen (genotype) chính (được xác định là I đến X) dựa trên
các cây phát sinh lồi xây dựng trên trình tự gen VP1 (Tosh và cs., 2002;
Kitching và cs., 2016). Virus LMLM type O được phân thành 11 genotype,
được xác định là Châu Âu-Nam Mỹ (Euro-SA), Trung Đông-Nam Á (MESA), Đông Nam Á (ĐNÁ), Cathay(CHY), Tây Phi (WA), Đông Phi 1 (EA-1),
Đông Phi2 (EA-2), Đông Phi 3 (EA-3), Đông Phi 4 (EA-4), Indonesia-1
(ISA-1) và Indonesia-2 (ISA-2) (Knowles và cs., 2005; Ayelet và cs., 2009).
Virus LMLMtype Asia1 được phân thành bảy genotype (được xác định là I
đến VII) (Jamal và cs., 2011). Bệnh LMLM là một bệnh thường gặp và phổ
biến ở châu Phi, châu Á và là mối đe dọa trực tiếp đến các khu vực khơng có

bệnh LMLM như châu Mỹ, châu Âu và Châu Úc (OIE-FAO., 2012).
Ở Việt Nam, Nơng nghiệp đóng một vai trò quan trọng trong nền kinh tế
quốc dân, trong đó sản xuất động vật đóng góp khoảng 32 % vào tổng GDP.
Bệnh LMLM được coi là quan trọng nhất về kinh tế do bệnh truyền nhiễm
ảnh hưởng đến gia súc quan trọng như trâu, bò và lợn. Sự lưu hành đồng thời
của các type huyết thanh O, A và Asia1, trong đó type huyết thanh O là phổ
biến nhất và là nguyên nhân gây ra các vụ dịch bệnh lớn (Kitching và cs.,
13

luan an