Khóa luận khảo sát thành phần hóa học cao ethyl acetate lá cây me rừng phyllanthus emblica

Khóa luận tốt nghiệp

Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo

LỜI MỞ ĐẦU
Ngày nay, bên cạnh sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kĩ thuật, chất lượng
cuộc sống của con người cũng được nâng cao, vấn đề chăm sóc sức khỏe trở thành một
mối quan tâm lớn trong các nghiên cứu khoa học. Các sản phẩm có nguồn gốc thảo
mộc, vốn được dùng từ rất lâu trong những bài thuốc y học cổ truyền, được sử dụng
ngày càng nhiều trong các loại thực phẩm chức năng. Vì vậy, việc nghiên cứu về thành
phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của các chất có trong cây đóng một vai trị
quan trọng trong sự phát triển y học. Kết quả thu được từ các nghiên cứu mở ra hướng
phát triển mới trong việc tổng hợp các hợp chất có những hoạt tính q, có tác dụng
chữa bệnh. Hơn nữa, nghiên cứu về thành phần hóa học từ các loại thảo mộc cịn góp
phần củng cố bằng chứng khoa học cho nền y học cổ truyền.
Cây Me rừng (Phyllanthus emblica L.) là một nguồn thảo dược quý, thuộc chi
Phyllanthus, họ Euphorbiaceae. Me rừng có nhiều ứng dụng trong y học cổ truyền như
chữa cảm mạo, phát sốt, đau cổ họng, viêm ruột, đau bụng đi ngoài, cao huyết áp [1].
Với mong muốn làm sáng tỏ kinh nghiệm sử dụng của dân gian và cũng vì các lồi
thuộc chi Phyllanthus có nhiều hoạt tính sinh học, nên chúng tôi chọn cây Phyllanthus
emblica L. để nghiên cứu thành phần hóa học.

1


Khóa luận tốt nghiệp

Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo

Chương I
TỔNG QUAN

1.1.

ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT
Cây me rừng thuộc họ Thầu dầu Euphorbiaceae, có tên khoa học là Phyllanthus

emblica Linn. Ngồi ra cây cịn có một số tên khác như du cam tử, ngưu cam tử, dư
cam tử [1].
Me rừng là cây nhỡ cao 3 m, phân nhiều cành nhỏ mềm, có lơng, dài 20 cm. Hoa
nhỏ, đơn tính cùng gốc. Cụm hoa thành xim co mọc ở nách lá phía dưới của cành, gồm
rất nhiều hoa đực và vài hoa cái. Lá xếp thành hai dãy trên các cành nhỏ trông giống một
lá kép lông chim, cuống lá rất ngắn. Lá kèm rất nhỏ hình ba cạnh. Quả hình cầu trước
mọng, sau khơ thành quả nang. Hạt hình ba cạnh, màu hồng nhạt. Cây ra hoa từ tháng 3
đến tháng 11 [1].

Hình 1.1. Quả me rừng
Trên thế giới, cây me rừng phân bố chủ yếu ở những khu vực nhiệt đới và cận
nhiệt đới của Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia và bán đảo Malaysia [1].
Ở nước ta, cây me rừng mọc phổ biến trên các đồi trọc, các bãi hoang, trong các
rừng thưa. Cây ưa ánh sáng, chịu được khô hạn [1].
2


Khóa luận tốt nghiệp
1.2.

Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo

CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH

1.2.1. Dược tính theo y học cổ truyền

Ở Việt Nam: quả me rừng tính mát, có tác dụng nhuận phế, hóa đờm, sinh tân,
thường dùng chữa cảm mạo, phát sốt, ho, đau cổ họng, miệng khô khát; rễ me rừng
tính mát, có tác dụng thu liễm và giáng áp, dùng chữa viêm ruột, đau bụng đi ngoài,
cao huyết áp; lá me rừng được dùng nấu nước rửa bên ngoài có tác dụng trị lở loét,
mẩn ngứa [1].
Ở Ấn Độ: cây me rừng là một trong những loài thảo dược được sử dụng phổ
biến ở Ấn Độ cổ xưa. Cây me rừng là nguồn giàu vitamin C, có tác dụng phục hồi
chức năng gan, hạ men gan, tăng hấp thụ thức ăn, cân bằng lượng acid trong dạ dày,
tăng cường phổi và hệ miễn dịch, kích thích nhuận tràng, hỗ trợ hệ tiết niệu, tốt cho da,
mắt và tóc [3].
1.2.2. Một số nghiên cứu về dược tính
+ Hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxi hóa
Theo các nghiên cứu vào năm 2007 của Xiaoli Liu cùng các cộng sự [13] và
nghiên cứu vào năm 2010 của Wei Luo cùng các cộng sự [10], một số hợp chất phenol
như 3-O-galloyl mucic acid 1,4-lactone (33), kaempferol 3-β-D-glucopyranoside (46),
kaempferol (47), quercetin (48), isocorilagin (49), geraniin (50), isomallotusinin (59),
chebulagic acid (60), chebulanin (61) được cô lập chủ yếu từ vỏ và quả me rừng có các
tác dụng kháng khuẩn và kháng oxi hóa hiệu quả.
+ Hoạt tính kháng herpes simplex virus (HSV) loại 1 và loại 2
Năm 2011, Yangfei Xiang và các cộng sự [15] đã thử nghiệm khả năng kháng
viêm nhiễm HSV-1 và HSV-2 của hợp chất 1,2,4,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucose
(1246TGG) (62) được cô lập từ cây me rừng. Kết quả cho thấy 1246TGG ở nồng độ
31.70 µM có khả năng ức chế sự phát triển của virus Herpes và có thể được dùng trong
điều trị HSV.
+ Tác dụng phục hồi chức năng gan và hạ men gan

3


Khóa luận tốt nghiệp

Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo

Dịch chiết ethanol của cây me rừng có tác dụng hạ men gan, phục hồi chức
năng của tế bào gan với liều lượng 75 mg/kg/ngày khi thử nghiệm trên chuột [7].
+ Tác dụng gây độc tế bào ung thư
Năm 2011, Xiaoli Liu cùng với các cộng sự [14] đã tiến hành nghiên cứu khả
năng gây độc tế bào ung thư của một số hợp chất phenol được cô lập từ quả me rừng.
Kết quả cho thấy hai hợp chất isocorilagin (49) và geraniin (50) có khả năng gây độc
tế bào ung thư vú (MCF-7) ở người với IC 50 lần lượt là 13.2 và 80.9 µg/ml. Ngồi ra,
isocorilagin (49) cịn có tác dụng gây độc tế bào ung thư phổi (HELF) ở người với
IC 50 51,4 µg/ml.
+ Tác dụng phục hồi tổn thương tinh hoàn do tác dụng phụ của thuốc động kinh
Valproic acid được sử dụng rộng rãi trong điều trị bệnh động kinh nhưng lại
gây tác dụng phụ ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của nam giới. Theo nghiên cứu vào
năm 2015 của Sitthichai Iamsaard và các cộng sự [8], dịch chiết từ cành me rừng có
tác dụng cải thiện nồng độ tinh dịch của chuột đực đã được tiêm valproic acid.
1.3.

CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC
Các nghiên cứu từ năm 1998 trở về trước cho thấy trong cây me rừng có các

hợp chất: zeatin (1), zeatin nucleotide (2), zeatin riboside (3), chebulic acid (4),
chebulinic acid (5), corilagin (6), 3,6-di-O-galloyl glucose (7), gallic acid (8), ethyl
gallate (9), gluco-gallin (10), ellagic acid (11), gibberellin (A1, A3, A4, A7, A9) (1216), leucodelphinidin (17), rutin (18), β-sitosterol (19) [4].
Từ 1999-2001, Ying-Jun Zhang và các cộng sự đã nghiên cứu thành phần từ
các bộ phận khác nhau của cây me rừng. Kết quả cho thấy nhóm tác giả đã cơ lập và
nhận danh các hợp chất sau: phyllaemblic acid (20), các phyllaemblicin A-C (21-23),
sáu hợp chất phenolic mới là 2-O-galloyl L-malic acid(24), 2-O-galloyl mucic acid
(25) và ba dẫn xuất methyl ester (26-28), 2-O-galloyl mucic acid 1,4-lactone (29) cùng

dẫn xuất methyl ester (30), 5-O-galloyl mucic acid 1,4-lactone (31) cùng dẫn xuất
methyl ester (32), 3-O-galloyl mucic acid 1,4-lactone (33), và 3,5-di-O-galloyl mucic
acid 1,4-lactone (34), phyllaemblic acid B (35) và phyllaemblic C (36), phyllaemblicin
D (37), cùng với hai hợp chất mới, 2-carboxylmethylphenol 1-O-β-D-glucopyranoside

4


Khóa luận tốt nghiệp

Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo

(38) và 2,6-dimethoxy-4-(2-hydroxyethyl)phenol 1-O-β-D-glucopyranoside (39), các
phyllanemblinin A-F (40-45) [9,16,18-20].
Năm 2007, Xiaoli Lin cùng các cộng sự đã cô lập được 5 hợp chất từ cây me
rừng, bao gồm: kaempferol 3-β-D-glucopyranoside (46), kaempferol (47), quercetin
(48), isocorilagin (49) và geraniin (50). Cũng vào năm này, hợp chất mới
phyllanthunin (51) cũng đã được cô lập cùng với các hợp chất đã biết: daucosterol
(52), stearic acid (53), lauric acid (54), cinnamic acid (55) [2][13]
Năm 2008, S. K. EL-DESOUKY và cộng sự đã cô lập được hợp chất mới là
acylated apigenin glucoside (apigenin-7-O-(6”-butyryl-β-glucopyranoside)) (56) và
các hợp chất khác như 1,2,3,4,6-penta-O-galloyglucose (57). Xiaoli Liu và các cộng sự
đã cô lập thêm quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside (58) [5,12].
Từ vỏ quả me rừng, năm 2011, Wei Lou và các cộng sự đã cô lập được
isomallotusinin (59), chebulagic acid (60), chebulanin (61) [9]
Hợp chất 1,2,4,6-tetra-O- galloyl-β-D-glucose (62) đã được cô lập từ lá và cành
của cây me rừng bởi Yangfei Xiang và các cộng sự vào năm 2011 [15].
Năm 2012, Wei-Yan Qi và cộng sự đã cô lập được β-sitosterol (19), daucosterol
(52), cùng 12 hợp chất sterol khác (63-74), trong đó có 2 hợp chất sterol mới là
5α,6β,7α-trihydroxysitosterol (64) và 7α-acetoxysitosterol (65) từ cành và lá của cây

me rừng [11].
Các công thức cấu tạo một số hợp chất trong cây Phyllanthus emblica L.

NH
OH

N

N

OH

N

N
N
HO

N
H
(1)

N
NH

O
HO P O
OH

N

N

O
OHOH

(2)

5

N
N
H

OH
O
HO OH

N

N
(3)


Khóa luận tốt nghiệp

Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo
RO
OR
O

OR

OR
O

HO

HOOC

O
HO

O

O

O

COOH

O

OH

O

OH
HO
OH

HO

HO
OH
R=Galloyl
(6)

OH

OH
HOOC
(4)

O
O

O

HO

O

HO

O

R=Galloyl
(5)

COOH

O

OH

OR

OH
RO
HO
RO

O

OH

HO

OH
R=Galloyl
(7)

R2

O
O
HO

O

H

OR

OH
R=Galloyl
(10)

OH
(8) R=H
(9) R=C2H5

O

O

HO
HO

OH

O

OH
HO
O

OH

OH

O

H

OH

O
H

H
R1

HO

R
(13) R=OH
(15) R=H

(12) R1=R2=OH
(14) R1=H, R2=OH
(16) R1=R2=H

O
O
11
( )

OH

OH

OH
HO

O

HO

O

OH

OH

OR
OH O

OH
OH OH
(17)

R=Rha-glu
(18)
O
HO
O

H

OH

H
H
HO

H
H
(19)

O
OH
(20)

6

O
O

O


Khóa luận tốt nghiệp

Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo
O
HO

O
HO
O
OH

HO
HO

O

O
O

OH

O

OH
O
OH

HO
HO
HO

O
O
(21)

OH
O

HO
HO
O

O
O

O
O

O

OH
(22)

O
HO
O
OH
HO
HO
OH HO
O
HO
OH

O

OH
O

HO
HO

O

O
O

O
O

O

O

(23)

HOOC
RO

H

ORH H OH
R1OOC
COOR2
H OHOHH
R=Galloyl
(25) R1=R2=H
(26) R1=R2=CH3
(27) R1=H, R2=CH3
(28) R1=CH3, R2=H

COOH

R=Galloyl
(24)

O

H OR3
OR4
O

RO H
R1O

HO
R1O
OR2
(29) R1=Galloyl, R2=R3=R4=H
(30) R1=Galloyl, R2=R3=H, R4=CH3
(33) R1=R3=R4=H, R2=G
(34) R1=R4=H, R2=R3=G

7

O

O

O

H

HO

OH

R=Galloyl
(31) R1=H
(32) R1=CH3

O


Khóa luận tốt nghiệp

Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo
OH

OH

O
H H
OH
R1
O

HO

OR2
COOH

O

HOOC
(35) R1=OH, R2=H
(36) R1=R2=H
(37) R1=H, R2=Glu

HO
OH
O

OR

R=Glu
(38)

R=Glu
(39)

HO
HO

OR

O

O

OG

O

O
O

O

O

O

O
HO

HO

OH

OH
O

HO

HO

OH HO

O HO
H

OH

OH

R=Galloyl
(41)

R=Galloyl
(40)

HO

O

OR

OH

HO

OH
O
OR

O
O

O

O
O

O
O

OR4

O
H

HOOC

R3O
R2O

OH

HO

O
COOH

O

OR1

OH
(43) R1=G, R2=neoche, R3=R4=H
(44) R1=G, R3=neoche, R2=R4=H
(45) R1=G, R4= neoche, R2=R3=H

OH

R=Galloyl
(42)

8


Khóa luận tốt nghiệp

Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo
R

OH
HO

OH

O
HO

O

O
OH O

O

HO

OH

OH

OH O

OH
HO
(46)

(47) R=H
(48) R=OH

HO
O
HO
O
HO
O

HO
HO

O

OR

OH
O

HO
HO

R=Galloyl
(49)
HO

OH HO

OH

HO

OH
O
OR

O
O

O

OH OR
OH
O

O
O

O

O

O

O
H

O
HO

HO

OH
O
OHOH

O
OH O
O
O
O

HO

OH

O
HO

OH
OH

O

R=Galloyl
(51)

R=Galloyl
(50)

9

OH


Khóa luận tốt nghiệp

Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo
H
OH
H
O

HO
HO

H

O

OH

(52)
O
O
HO
HO

O
R

COOH

OH

(53) R=n-C17H35
(54) R=n-C11H23

OH
O

O

O

OH
OH O
(56)

(55)

OH
OH
HO

O
O

OR

OH O O
OH
HO

O

RO
RO

OR

OH
HO

OR
R=Galloyl
(57)

(58)

OH HO

HO

OH

HO

HO

OH

O

O

O

O
OR

O
O

O

O

OH
O

O
O

OH

HO

O
OR

O

OH HO

O

HOOC

O

O
O

O

HO

HO
HO

OH
O

O

O

OH
OH

OH

R=Galloyl
(59)

R=Galloyl
(60)

10


Khóa luận tốt nghiệp

Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo
HO
OH
O

O

O
O

O

HOOC

OR

RO
HO
O

OH

O

O

RO
HO

OR

OH

R=Galloyl
(62)

R=Galloyl

(61)

H

H
R1
R2

HO

R
OH
OH
(63) R=H
(64) R=OH

HO

OR

(65) R1=H, R2=CH3COO
(66) R1=H, R2=OH
(67) R1=CH3CH2O, R2=H
(68) R1=R2=O

H

H

O

R1 R2
(69) R1=R2=H
(70) R1=R2=O
(71) R1=H, R2=OH

HO
OH
(72)

11


Khóa luận tốt nghiệp

Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo

H
R2
HO
HO

O

R1

O

OH
(73) R1=H, R2=CH3-(CH2)14COO
(74) R1=OH, R2=CH3-(CH2)14COO

Chú thích:
O

O

HO
H

OH

HOOC H
HO

HOOC

OH
OH
G=Galloyl

OH

HO
O
neoche
OH

HO
HO

O
Ac=Acetyl

O

OH
Glu=Glucopyranosyl
HO

OH
OH

O

O
O

HO
HO

OH

Rha-Glu=α-L-rhamnopyranosyl (1→6) -O-β-D-glucopyranosyl

12


Khóa luận tốt nghiệp

Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo

CHƯƠNG II
THỰC NGHIỆM
2.1.

HỐ CHẤT, THIẾT BỊ, PHƯƠNG PHÁP

2.1.1. Hoá chất
 Silica gel, 0.04-0.06 mm, Merck và silica gel, 0.04-0.06 mm, Himedia dùng cho
cột sắc kí.
 Silica gel pha đảo, RP-18, Merck dùng cho cột sắc kí.
 Sắc ký lớp mỏng loại 25DC – Alufolein 20×20, Kiesel gel 60F

254

, Merck.

 Sắc ký lớp mỏng loại 25DC, RP-18, Merck.
 Dung mơi dùng cho q trình thí nghiệm gồm: hexane, dichloromethane,
chloroform, ethyl acetate, acetone, methanol, acetic acid.
 Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên lớp mỏng: sử dụng H 2 SO 4 20%.

2.1.2. Thiết bị
 Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu.

 Các cột sắc ký.
 Máy cô quay chân khơng.
 Bếp cách thuỷ.
 Đèn soi UV: bước sóng 254 nm.
 Cân điện tử Sartorius Mass 620g.

2.1.3. Phương pháp tiến hành
2.1.3.1. Phương pháp phân lập các hợp chất
Sắc kí cột silica gel pha thường, pha đảo RP-18 và sắc kí lớp mỏng.
Hiện hình sắc ký lớp mỏng bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm hoặc
dùng thuốc thử là dung dịch H 2 SO 4 20%.

2.1.3.2. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz), 2DNMR được ghi trên máy Bruker Avance tại Phịng thí nghiệm phân tích trung tâm, Đại
học Khoa Học Tự Nhiên, 227 Nguyễn Văn Cừ, Q5, Tp.HCM.
13


Khóa luận tốt nghiệp
2.2.

Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo

NGUYÊN LIỆU

2.2.1. Thu hái nguyên liệu
Mẫu cây dùng trong nghiên cứu khoá luận là lá của cây me rừng được thu hái
tại Bình Thuận vào tháng 05/2014.
Mẫu cây đã được TS. Phạm Văn Ngọt nhận danh tên khoa học là Phyllanthus
emblica Linn, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae).

2.2.2. Xử lý mẫu nguyên liệu
Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khô trong bóng
râm, rồi xay thành bột mịn. Sau đó tiến hành ngâm chiết và phân lập các hợp chất.
2.3.

ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO
Lá me rừng được phơi khô và nghiền thành bột mịn, sấy khô đến khối lượng

không đổi (7.2 kg). Nguyên liệu bột mịn được tận trích với ethanol 960 bằng phương
pháp ngâm dầm, lọc và cô quay loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cao ethanol
thô (285.5 g).
Cao ethanol thô được chiết lỏng – lỏng lần lượt với hexane, ethyl acetate thu
được cao hexane lá me (22.1 g), cao ethyl acetate lá me (143.1 g) và phần cao cịn lại
(77.1 g). Q trình thực hiện được tóm tắt theo sơ đồ 2.1.

14


Khóa luận tốt nghiệp

Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo
Sơ đồ 2.1. Qui trình điều chế các loại cao
Bột lá me rừng
(7.2 kg)
-

Ngâm trong ethanol 96
Lọc

Dịch ethanol
- Cô quay thu hồi dung môi

Bã khô

Cao tổng
( 285.5 g)

Ethanol thu hồi

-

Cao hexane lá me
(22.1 g)

o

Cao ethyl acetate lá me
(143.1 g)

15

Chiết lỏng – lỏng với
hexane, ethyl acetate
Cơ quay thu hồi dung mơi

Cao cịn lại
( 77.1 g)


Khóa luận tốt nghiệp
2.4.

Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo

CƠ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO ETHYL ACETATE
Cao ethyl acetate (143.1 g) được sắc kí cột silica gel với hệ dung môi hexane:

ethyl acetate (80-100% ethyl acetate), ethyl acetate : methanol (5-100% methanol).
Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ. Theo dõi q trình giải ly bằng sắc kí lớp
mỏng. Những lọ cho kết quả sắc kí lớp mỏng giống nhau được gộp chung thành 1
phân đoạn. Kết quả thu được 5 phân đoạn (EA1-EA5), được trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate lá me rừng
Phân đoạn Dung môi giải ly

Trọng lượng (g)

Sắc kí lớp mỏng

Ghi chú

EA1

H:EA 2:8

16.50

Vệt dài

Khảo sát

EA2

EA

13.28

Nhiều vết

Chưa khảo sát

EA3

EA:Me 95:5

22.25

Nhiều vết kéo vệt

Đã khảo sát

EA4

EA:Me 8:2

33.40

Nhiều vết

Đã khảo sát

EA5

EA:Me 7:3

14.70

Nhiều vết

Chưa khảo sát

Chú thích:

H: hexane; EA: ethyl acetate; Me: methanol

Phân đoạn EA1 được sắc kí cột silica gel thu được 10 phân đoạn (EA1.1EA1.10), trong đó phân đoạn EA1.9 cho kết quả sắc kí lớp mỏng có sự tách vết rõ
ràng. Quá trình thực hiện được trình bày trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA1 (16.50 g) của bảng 2.1
Phân đoạn Dung mơi giải ly

Trọng lượng (g)

Sắc kí lớp mỏng

Ghi chú

EA1.1

C

0,39

Nhiều vết

Chưa khảo sát

EA1.2

C

0,32

Nhiều vết

Chưa hảo sát

EA1.3

C

0,31

Nhiều vết

Chưa khảo sát

EA1.4

C : Me 9 : 1

0,38

Vệt dài

Chưa khảo sát

EA1.5

C : Me 9 : 1

0,32

Vệt dài

Chưa khảo sát

EA1.6

C : Me 9 : 1

0,22

Vệt dài

Chưa khảo sát

EA1.7

C : Me 85 : 15

0,24

Vệt dài

Chưa khảo sát

EA1.8

C : Me 85 : 15

0,31

Vệt dài

Chưa khảo sát

EA1.9

C : Me 8 : 2

9.73

Vết rõ ràng

Khảo sát

EA1.10

C : Me 8 : 2

0.83

Nhiều vết

Chưa khảo sát

Chú thích:

C: Chloroform
16


Khóa luận tốt nghiệp

Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo

Tiếp tục sắc kí cột pha thường phân đoạn EA1.9, thu được 7 phân đoạn
(EA1.9.1-EA1.9.7), trong đó phân đoạn EA1.9.2 và EA1.9.3 có sự tách vết rõ ràng.
Sắc kí cột silica gel, 0,04-0,06 mm, Merck nhiều lần kết hợp với sắc kí cột silica gel
pha đảo RP-18 trên phân đoạn EA1.9.2 và EA1.9.3 với hệ dung môi hexane : acetone
1 : 4. Dịch giải li qua cột hứng vào các hũ bi. Theo dõi q trình giải li bằng sắc kí lớp
mỏng.thu được 2 hợp chất, kí hiệu PEAT1 và PEAT2. Q trình thực hiện được trình
bày trong bảng 2.3.
Bảng 2.3. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA1.9 (9.73 g) của bảng 2.2
Phân đoạn Dung mơi giải ly

Trọng lượng (g)

Sắc kí lớp mỏng

Ghi chú

EA1.9.1

DCM:Me 95:5

0,41

Vết mờ

Chưa khảo sát

EA1.9.2

DCM:Me 95:5

0,65

Nhiều vết

Khảo sát thu
được PEAT1

EA1.9.3

DCM:Me 95:5

0,54

Nhiều vết

EA1.9.4

DCM:Me 9:1

1.57

Nhiều vết

Khảo sát thu
được PEAT2
Chưa khảo sát

EA1.9.5

DCM:Me 9:1

1.51

Vết rõ ràng

Chưa khảo sát

EA1.9.6

DCM:Me 9:1

0,40

Vết rõ ràng

Đã khảo sát

EA1.9.7

DCM:Me 9:1

1.62

Nhiều vết

Chưa khảo sát

Chú thích:

DCM: dichloromethane

Hợp chất PEAT1 (18 mg) cho sắc kí lớp mỏng (hexane : acetone 2:1), màu nâu
nhạt khi hiện hình bằng thuốc thử H 2 SO 4 20% (R f = 0.38). Hợp chất PEAT2 (5 mg)
cho sắc kí lớp mỏng (hexane : acetone 2:1), màu vàng khi hiện hình bằng thuốc thử
H 2 SO 4 20%, (R f = 0.42).

17


Khóa luận tốt nghiệp

Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo

CHƯƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT PEAT1
Hợp chất PEAT1 thu được sau quá trình sắc kí cột nhiều lần phân đoạn EA1.9.2
của bảng 3 có những đặc điểm sau:
• Hợp chất ở dạng bột màu trắng.

• Sắc kí lớp mỏng với hệ mơi hexane : acetone 2 : 1, hiện hình bằng thuốc thử
H 2 SO 4 20%, nung nóng bảng mỏng thu được 1 vết trịn màu nâu nhạt, R f =
0.38.
• Phổ 1H-NMR (acetone – d 6 , phụ lục 1), δ H ppm: 7.11 (2H, s, H-2 và H-6),
3.78 (3H, s, -OCH 3 ).
• Phổ 13C-NMR (acetone – d 6 , phụ lục 2), δ C ppm: 166.8 (-COOH), 145.6 (C-3
và C-5), 138.3 (C-4), 121.3 (C-1), 109.3 (C-2 và C-6), 51.5 (-CH 3 ).
Biện luận cấu trúc:
Phổ 1H-NMR của hợp chất PEAT1 cho tín hiệu cộng hưởng của hai proton
vịng thơm ở δ H 7.11 (2H, s) và tín hiệu cộng hưởng của proton nhóm methoxy –
OCH 3 ở δ H 3.78 (3H, s).
Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ HSQC cho thấy hợp chất có 8 carbon. Trong đó
có 1 carbon >C=O cộng hưởng ở δ C 166.8. Phổ đồ còn thể hiện tín hiệu cộng hưởng
của 6 carbon vịng thơm ở δ C 145.6 , 138.3, 121.3, 109.3. Ngoài ra, trên phổ cịn xuất
hiện tín hiệu của carbon nhóm methoxy cộng hưởng ở δ C 51,5 (-OCH 3 ).
Phổ HMBC cho thấy tương quan giữa 2 proton ở δ H 7.11 (H-2, H-6) với các
carbon ở δ C 166.8 (>C=O), 145.6, 138.3, 121.3. Bên cạnh đó, trên phổ cịn ghi nhận
tương quan của proton nhóm methoxy ở δ H 3.78 (-CH 3 ) với carbon ở δ C 166,8
(>C=O), cho phép dự đốn nhóm –OCH 3 gắn vào >C=O.
Từ những dữ liệu phổ NMR kết hợp so sánh với số liệu NMR của methyl
gallate [6] cho thấy có sự tương đồng nên cấu trúc của PEAT1 được đề nghị là methyl
gallate

18


Khóa luận tốt nghiệp

Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo

COOCH3

COOCH3

1
6

2
3

5

HO

OH

4

HO

OH

OH
OH

Methyl gallate

Hình 3.1. Một số tương quan HMBC của PEAT1

(PEAT1)

Bảng 3.1. Dữ liệu phổ của hợp chất PEAT1
Vị trí
Cacbon

Hợp chất PEAT1
(acetone - d 6 )
δ H ppm

1
2,6
3,5
4
>C=O
-OCH 3

7.11 (s)
3.78 (s)

Methyl gallate
(CDCl 3 ) [6]

δ C ppm

δ C ppm

121.3
109.3
145.6
138.3
166.8

51.5

118.8
107.9
144.1
137.0
165.6
50.4

3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT PEAT2
Hợp chất PEAT2 thu được từ phân đoạn EA1.9.3 của bảng 3 có những đặc
điểm sau:
• Hợp chất ở dạng bột màu vàng.
• Kết quả sắc kí lớp mỏng với hệ môi hexane : acetone 2 : 1, hiện hình bằng
thuốc thử H 2 SO 4 20%, nung nóng bảng mỏng thu được 1 vết trịn màu vàng,
R f = 0.42.
• Phổ 1H-NMR (acetone - d 6 , phụ lục 5), δ H ppm: 8.16 (2H, d, J=9.0 Hz, H-2’
và H-6’), 7.02 (2H, d, J=8.5 Hz, H-3’ và H-5’), 6.54 (1H, d, J=2.0 Hz, H-8),
6.27 (1H, d, J=2.0 Hz, H-6).
• Phổ

C-NMR (acetone - d 6 , phụ lục 6), δ C ppm: 176.8 (>C=O). Độ dịch

13

chuyển của các carbon khác được trình bày trong bảng 3.2.

19

Khóa luận tốt nghiệp

Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo

Biện luận cấu trúc
Phổ 1H-NMR của hợp chất PEAT2 cho tín hiệu cộng hưởng của sáu proton
vòng thơm trong vùng δ H 8.16 – 6.27. Trong đó, hai proton ghép cặp ortho cộng
hưởng ở δ H 8,16 (2H, d, J=9.0 Hz), hai proton khác cũng ghép cặp ortho cộng hưởng ở
δ H 7.02 (2H, d, J=8.5 Hz). Ngồi ra trên phổ cịn có tín hiệu cộng hưởng của hai
proton ghép cặp meta ở δ H 6.54 (1H, d, J=2.0 Hz) và 6.27 (1H, d, J=2.0 Hz).
Phổ

13

C-NMR kết hợp với phổ HSQC cho thấy hợp chất có 15 carbon cộng

hưởng trong vùng δ C 176.8 – 94.7, trong đó có một carbon >C=O cộng hưởng ở δ C
176.8 cho phép dự đoán PEAT2 là flavonol.
Phổ HMBC cho thấy sự tương quan giữa 2 proton cộng hưởng ở δ H 8.16 (H-2’
và H-6’) với các carbon ở δ C 160.4, 147.2. Hai proton cộng hưởng ở δ H 7.02 (H-3’ và
H-5’) tương quan HMBC với các carbon ở δ C 160.4, 123.5. Như vậy vòng B của cấu
trúc của PEAT2 có 1 nhóm –OH ở vị trí 4’.
Mũi cộng hưởng của –OH kiềm nối cộng hưởng ở δ H 12,17 giúp xác định vị trí
C-5 mang nhóm thế -OH.
Phổ đồ cịn ghi nhận tương quan giữa proton cộng hưởng ở δ H 6.54 (1H, d,
J=2.0 Hz, H-8) với các carbon ở δ C 162.3, 158.0, 99.3; tương quan giữa proton cộng
hưởng ở δ H 6.27 (1H, d, J=2.0 Hz, H-6) với carbon ở δ C 162.3.
Từ những dữ liệu phổ NMR trên kết hợp so sánh với dữ liệu phổ của
kaempferol [21] cho thấy có sự tương đồng nên cấu trúc của hợp chất PEAT2 được đề
nghị là kaempferol

3'

HO

4'

1

8
7

9

OH

OH

2'
O

1'

2

5'

HO

O

6'
3

6

10

4

5
OH

OH

OH

OH

O

Kaempferol
(PEAT2)

O

Hình 3.2. Một số tương quan HMBC của PEAT2

20

Khóa luận tốt nghiệp

Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo
Bảng 3.2. Dữ liệu phổ của hợp chất PEAT2

Vị trí
Cacbon

2
3
4
5
6
7
8
9
10
1’
2’, 6’
3’, 5’
4’

Hợp chất PEAT2
(acetone - d 6 )

Kaempferol
(acetone - d 6 ) [21]

δ H ppm (J, Hz)

δ C ppm

6.27 (d, 2.0)
6.54 (d, 2.0)
8.16 (d, 9.0)
7.02 (d, 8.5)
-

147.2
136.8
176.8
162.3
99.3
165.2
94.7
158.0
104.0
123.5
130.7
116.5
160.4

δ C ppm
147.1
136.7
176.6
162.4
99.2
165.0
94.5

157.8
104.2
123.4
130.5
116.4
160.2

21


Khóa luận tốt nghiệp

Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo

CHƯƠNG IV
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
4.1. KẾT LUẬN
Việc khảo sát thành phần hóa học của cây me rừng thu hái ở Bình Thuận đã thu
được những kết quả như sau:
Từ phân đoạn EA1.9 cao ethyl acetate, sử dụng các phương pháp chiết xuất, sắc
kí đã cơ lập được hai hợp chất được kí hiệu lần lượt là PEAT1 và PEAT2. Sử dụng
các phương pháp phân tích hóa lí hiện đại kết hợp so sánh với dữ liệu trong các tài liệu
tham khảo đã đề nghị cấu trúc của PEAT1 và PEAT2 lần lượt là methyl gallate và
kaempferol
3'
COOCH3
1
6

OH

2'
HO

2

4'

1

8
7

O

9

1'

2

5'
6'

3

HO

5

4

3

6
OH

10

4

5

OH

OH

Methyl gallate

OH

O

Kaempferol

(PEAT1)

(PEAT2)

4.2. ĐỀ XUẤT

Do hạn chế về thời gian nên còn rất nhiều phân đoạn em chưa nghiên cứu.
Trong khóa luận này, em chỉ mới tiến hành phân lập với cao ethyl acetate. Vì vậy,
trong thời gian tới, em sẽ tiếp tục nghiên cứu trên các cao và các phân đoạn khác cũng
như mở rộng nghiên cứu sang các cây khác cùng chi.

22


Khóa luận tốt nghiệp

Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo

TÀI LIỆU THAM KHẢO
 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
[1] Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học,
trang 695-696.

 TÀI LIỆU TIẾNG ANH
[2] Chun-Bin Yanga, Fan Zhang, Mei-Cai Denga, Guang-Yun Hea, Jian-Min Yuec,
Run-Hua Lua (2007), A new ellagitannin from the fruit of Phyllanthus emblica L.,
Journal of the Chinese Chemical Society, 54, 1615-1618.
[3] Ekta Singh, Sheel Sharma, Ashutosh Pareek, Jaya Dwivedi, Sachdev Yadav,
Swapnil Sharma (2011), Phytochemistry, traditional uses and cancer chemopreventive
activity of Amla (Phyllanthus emblica): The sustainer, Journal of Applied
Pharmaceutical Science, 02 (01), 178-183.
[4] João B. Calixto, Adair R. S. Santos, Valdir Cechinel Filho, Rosendo A. Yunes
(1998), A review of the plants of the genus Phyllanthus: their chemistry,
pharmacology, and therapeutic potential, Med Res Rev, 18 (4), 225-258.
[5] S. K. El-Desouky, Shi Young Ryu, Young-Kyoon Kim (2008), A new cytotoxic
acylated apigenin glucoside from Phyllanthus emblica L., Natural Product Research,

22 (1), 91-95.
[6] Samuel Kamatham, Naresh Kumar, Padmaja Gudipalli (2015), Isolation and
characterization of gallic acid and methylgallate from the seed coats of givotia
rottleriformis griff. andtheir anti-proliferative effect on human epidermoidcarcinoma
A431 cells, Toxicology Reports, 2, 520-529.
[7] Sharma Bhawna, Sharma Upendra Kumar (2010), Hepatoprotective activity of
some indigenous plants, International Journal of PharmTech Research, 2(1), 568-572.
[8] Sitthichai Iamsaard, Supatcharee Arun, Jaturon Burawat, Wannisa Sukhorum,
Porntip Boonruangsri, Malivalaya Namking, Nongnut Uabundit, Somsak Nualkaew,
Bungorn Sripanidkulchai (2015), Phyllanthus emblica L. branch extract ameliorates
testicular damage in Valproic acid-induced rats, Int. J. Morphol.,33 (3), 1016-1022.

23


Khóa luận tốt nghiệp

Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo

[9] Wei Luo, Lingrong Wen, Mouming Zhao, Bao Yang, Jiaoyan Ren, Guanglin Shen,
Guohua Rao (2012), Structural identification of isomallotusinin and other phenolics in
Phyllanthus emblica L. fruit hull, Food Chemistry, 132, 1527–1533.
[10] Wei Luo, Mouming Zhao, Bao Yang, Jiaoyan Ren, Guanglin Shen, Guohua Rao
(2011), Antioxidant and antiproliferative capacities of phenolics purified from
Phyllanthus emblica L. fruit, Food Chemistry, 126, 277-282.
[11] Wei-Yan Qi, Ya Li, Lei Hua, Ke Wang, Kun Gao (2013), Cytotoxicity and
structure activity relationships of phytosterol from Phyllanthus emblica, Fitoterapia,
84, 252-256.
[12] Xiaoli Liu, Chun Cui, Mouming Zhao, Jinshui Wang, Wei Luo, Bao Yang,
Yueming Jiang (2008), Identification of phenolics in the fruit of emblica (Phyllanthus

emblica L.) and their antioxidant activities, Food Chemistry, 109, 909-915.
[13] Xiaoli Liu, Mouming Zhao, Jinshui Wang, Wei Luo (2009), Antimicrobial and
antioxidant activity of emblica extracts obtained by supercritical cacrbon dioxide
extraction and methanol extraction, Journal of Food Biochemistry, 33, 307-330.
[14] Xiaoli Liu, Mouming Zhao, Kegang Wua, Xianghua Chai, Hongpeng Yu, Zhihua
Tao, Jinshui Wang (2012), Immunomodulatory and anticancer activities of phenolics
from emblica fruit (Phyllanthus emblica L.), Food Chemistry, 131, 685-690.
[15] Yangfei Xiang, Ying Pei, Chang Qu, Zhicai Lai, Zhe Ren, Ke Yang, Sheng Xiong,
Yingjun Zhang, Chongren Yang, Dong Wang, Qing Liu, Kaio Kitazato, Yifei Wang
(2011), In vitro anti‐herpes simplex virus activity of 1,2,4,6‐Tetra‐O‐galloyl‐β‐D‐
glucose from Phyllanthus emblica L. (Euphorbiaceae), Phytother. Res., 25, 975-982.

[16] Ying-Jun Zhang, Takashi Tanaka, Chong-Ren Yang, Isao Kouno (2001), New
phenolic constituents from the fruit juice of Phyllanthus emblica, Chem. Pharm. Bull.,
49(5), 537-540.
[17] Ying-Jun Zhang, Takashi Tanaka, Yoko Iwamoto, Chong-Ren Yang, Isao Kouno
(2000), Novel norsesquiterpenoids from the roots of Phyllanthus emblica, J. Nat. Prod,
63, 1507-1510.
[18] Ying-Jun Zhang, Takashi Tanaka, Yoko Iwamoto, Chong-Ren Yang, Isao Kouno
(2000), Phyllaemblic acid, a novel highly oxygenated norbisabolane from the roots of
Phyllanthus emblica, Tetrahedron Letters, 41, 1781-1784.

24


Khóa luận tốt nghiệp

Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo

[19] Ying-Jun Zhang, Takashi Tanaka, Yoko Iwamoto, Chong-Ren Yang, Isao Kouno

(2001), Novel sesquiterpenoids from the roots of Phyllanthus emblica, J. Nat. Prod.,
64, 870-873.
[20] Ying-Jun Zhang, Tomomi Abe, Takashi Tanaka, Chong-Ren Yang, Isao Kouno
(2001), Phyllanemblinins A-F, new ellagitannins from Phyllanthus emblica, J. Nat.
Prod., 64, 1527-1532.
[21] Yu-Lan Li, Jun Li, Nai-Li Wang, Xin-Sheng Yao (2008), Flavonoids and a new
polyacetylene from Bidens parviflora Willd, Molecules, 13, 1931-1941.

25