(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gene kháng nguyên độc tố bền nhiệt stb của e coli trong tế bào vi khuẩn e coli bl21 (de3) và tối ưu các điều kiện biểu hiện

i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan: Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là
trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ cơng trình nào khác. Các thơng
tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Thành Phố Huế, tháng 6 năm 2016
Tác giả luận văn

Lê Minh Tuấn

Luan van

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn Trường Đại Học Nơng Lâm Huế, Phịng đào tạo
sau đại học, Khoa Chăn nuôi thú y cùng các thầy cô giáo đã nhiệt tình giảng
dạy, truyền đạt kiến thức khoa học kỹ thuật cho lớp cao học khóa 20A chuyên
ngành thú y tại trường Đại học Nông Lâm Huế.
Tôi xin chân thành cảm ơn đặc biệt đến PGS. TS. Đinh Thị Bích Lân đã tận
tình hướng dẫn để tơi hồn thành đề tài.
Tôi xin cảm ơn Chi cục Chăn nuôi và Thú y Thừa Thiên Huế, các cán bộ
Phịng thí nghiệm Miễn dịch học và vắc xin - Viện Công nghệ sinh học, Đại học
Huế, Trạm Chẩn đoán xét nghiệm và điều trị bệnh động vật đã giúp đỡ tạo mọi
điều kiện cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài này.

Đề tài này hoàn thành được sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp Bộ do PGS. TS
Đinh Thị Bích Lân làm chủ nhiệm (Mã số: B2016- DHH-25)
Tơi cũng xin chân thành cảm ơn các bạn đồng nghiệp gần xa đã giúp đỡ và
động viên tôi trong suốt thời gian thực tập.

Thành phố Huế, tháng 6 năm 2016

Lê Minh Tuấn

Luan van

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


iii

TĨM TẮT
E. Coli một trong những nhóm vi khuẩn chính gây ra bệnh tiêu chảy ở lợn con.
Chúng có khả năng sản sinh ra hai loại độc tố đường ruột : độc tố không bền nhiệt
(LT) và độc tố bền nhiệt (ST). Độc tố ST có hai loại là STa và STb. Tuy nhiên cơ chế
gây tiêu chảy của STb chưa được rõ. Nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gene độc tố
trong đó có độc tố STb của E. coli gây ra bệnh tiêu chảy ở lợn con để làm nguyên liệu
chế tạo vắc xin, kháng thể, chế phẩm sinh học dùng trong phòng, trị bệnh tiêu chảy ở
lợn con là hết sức có ý nghĩa và mang tính cấp thiết, giảm thiệt hại kinh tế trong ngành
chăn nuôi lợn nói chung và gia súc nói riêng. Trong nghiên cứu này, gene estB mã hoá
cho kháng nguyên STb được phân lập bằng phản ứng PCR, tạo dòng và biểu hiện
thành công gene estB vào hai vector pGEM-T easy và pET200/D-TOPO và biến nạp
vào trong hai tế bào vật chủ E. coli TOP10 và E. coli BL21 (DE3). Trên đĩa petri,
khuẩn lạc xanh trắng xuất hiện riêng rẽ như vậy việc lựa chọn các khuẩn lạc trắng để
tách plasmid có thể loại bỏ được phần lớn các trường hợp không mong muốn mặc dù

không phải tất cả các khuẩn lạc trắng đều có thể mang vector plasmid tái tổ hợp chứa
đoạn gene estB. Để khẳng định một cách chắc chắn hơn, chúng tơi cần chọn lọc các
khuẩn lạc dương tính (khuẩn lạc màu trắng) để kiểm tra sự hiện diện của gene estB
bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu và cặp mồi M13
Sản phẩm gắn được ủ ở 4°C qua đêm. Sản phẩm này sau đó được biến nạp vào
tế bào khả biến E.coli chủng TOP10 bằng phương pháp sốc nhiệt ở 42°C trong 60
giây. Sau khi biến nạp, nhờ sự trợ giúp của bộ máy tổng hợp của tế bào vi khuẩn,
plasmid tái tổ hợp được tạo ra với số lượng lớn các bản sao. Dịch tế bào được được
nuôi cấy bằng cách dàn đều trên môi trường LB (1% tryptone; 0,5% dịch chiết nấm
men; và 1% NaCl; 1,5% agar, pH 7,0) có thạch, có bổ sung kháng sinh 100 µg/mL
ampicillin, 100 mM IPTG và 20 mg/mL X-Gal. Trong môi trường chọn lọc này, các
khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp sẽ có màu trắng trong khi các khuẩn lạc mang vector
pGEM®-T Easy khơng mang gene estB sẽ có màu xanh. Tế bào E. coli BL21 tái tổ hợp
sinh trưởng tốt trên môi trường TB với tỷ lệ tiếp giống 2% (giống đã được hoạt hóa
sau 8 giờ ni), lắc 220 vịng/phút. Gene estB biểu hiện tốt trong tế bào E. coli BL21
trên môi trường YJ, IPTG (0,8 mM), thời gian 10 giờ, ở thời điểm cảm ứng OD600 =
0,6, nhiệt độ 30-37°C.

Luan van

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


iv

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. ii
TÓM TẮT...................................................................................................................... iii

MỤC LỤC ......................................................................................................................iv
DANH MỤC VIẾT TẮT................................................................................................vi
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................... vii
DANH MỤC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ ................................................................................ viii
MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1
1. TÍNH CẤP THIẾT ......................................................................................................1
2. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI ..........................................................................................2
3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỂN .................................................................3
3.1. Ý nghĩa khoa học ......................................................................................................3
3.2. Ý nghĩa thực tiễn .....................................................................................................3
Chương 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU .....................................................................4
1.1. Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn E. coli gây ra ở lợn ............................................4
1.1.1. Nghiên cứu trong nước ..........................................................................................4
1.1.2. Tình hình nghiên cứu ở nước ngồi ......................................................................7
1. 2. MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH VẬT HỌC CỦA VI KHUẨN E. COLI ....................9
1.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn E. coli .............................................................................10
1.2.2.Phân loại ...............................................................................................................10
1.2.3. Đặc điểm về hình thái của vi khuẩn E. coli .........................................................11
1.2.4. Đặc tính ni cấy của vi khuẩn E. coli ................................................................11
1.2.5. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli ................................................................12
1.2.6. Sức đề kháng của vi khuẩn E. coli ......................................................................13
1.2.7.Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E. coli ........................................................13
1.2.8. Khả năng sản sinh độc tố đường ruột ..................................................................17
Chương 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............20

Luan van

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma

v

2.1. MỤC TIÊU CỤ THỂ..............................................................................................20
2.2. PHẠM VI, ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .............................................................20
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu............................................................................................20
2.2.2. Đối tượng nghiên cứu ..........................................................................................20
2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............................................20
2.3.1. Nội dung nghiên cứu ...........................................................................................20
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu .....................................................................................21
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN...........................................34
3.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP E. COLI TỪ PHÂN LỢN .................................................34
3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP GENE estB .......................................................................34
3.3. KẾT QUẢ TẠO DÒNG GENE .............................................................................36
3.4. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN ........................................................................39
3.5. NUÔI CẤY VI KHUẨN ........................................................................................41
3.6. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN SINH TRƯỞNG CỦA TẾ BÀO E.
COLI TÁI TỔ HỢP .......................................................................................................41
3.6.1. Thành phần môi trường .......................................................................................41
3.6.2. Tỷ lệ tiếp giống ....................................................................................................42
3.6.3. Tốc độ lắc ............................................................................................................43
3.7. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN BIỂU HIỆN CỦA TẾ BÀO E.
COLI TÁI TỔ HỢP .......................................................................................................44
3.7.1. Thời gian cảm ứng ...............................................................................................44
3.7.2. Nồng độ chất cảm ứng .........................................................................................45
3.7.3. Thành phần môi trường biểu hiện .......................................................................46
3.7.4. Mật độ tế bào trước khi bổ sung chất cảm ưng ...................................................47
3.7.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ cảm ứng .......................................................................48
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................49
1. KẾT LUẬN ...............................................................................................................49
2. KIẾN NGHỊ ...............................................................................................................49

TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................50

Luan van

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


vi

DANH MỤC VIẾT TẮT

Amp
ADN
YJ
LB
SOB
SOC
TB
SDS
PC
NC
PCR
OD
IPTG
v/v
kDa
E. coli
DNA
RNA
bp

cDNA
E. coli
kDa
PCR
SDS - PAGE
EPEC
ETEC
EIEC
EHEC
EAEC

Ampicillin
Acid deoxyribonucleic
Yang Jijian
Luria Bertani
Super Optimal Broth
Super Optimal Broth with catabolic repressor
Terrific broth
Sodium Dodecyl
Positive Control (đối chứng dương tính)
Negative Control (đối chứng âm tính)Sulfate
Polymerase Chain Rection
Optical Density
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
volume per volume (thể tích/thể tích)
Kilodalton
Escherichia coli
Deoxyribo Nucleic Acid
Ribonucleic Acid
base pair

complement Deoxyribo Nucleic Acid
Escherichia coli
kilodalton
Polymerase Chain Reaction
Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
enteropathogenic E. coli
enterotoxigenic E. coli
enteroinvasive E. coli
enterohaemorrhagic E. coli
enteroaggregative E. coli

Luan van

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


vii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Các chủng E. coli gây bệnh trên lợn (Fairbrother, 1994) ...............................8
Bảng 2.1. Thành phần các hóa chất cho quá trình chuẩn bị gel polyacrylamide 15% ..32

Luan van

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


viii

DANH MỤC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ

Hình 2.1. Quy trình phân lập vi khuẩn E.coli................................................................23
Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm về khả năng sinh trưởng của E. coli tái tổ hợp .................29
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm tối ưu sự biểu hiện gene kháng nguyên độc tố tái tổ hợp STb.30
Hình 3.1. Ảnh phân lập E. coli trên môi trường MacConkey .......................................34
Hình 3.2. Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gene estB trên
gel agarose 2%.. .............................................................................................................35
Hình 3.3. Kết quả biến nạp trên mơi trường chọn lọc. ..................................................36
Hình 3.4. Ảnh điện di sản phẩm plasmid từ các dịng dương tính và kết quả PCR với cặp
mồi đặc hiệu cho gene estB từ khuôn mẫu DNA plasmid tái tổ hợp thu được trên gel
agarose 2%.. ....................................................................................................................37
Hình 3.5. Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi M13 trên gel agarose 2%.. ..38
Hình 3.8. Kết quả biến nạp trên mơi trường chọn lọc ...................................................40
Hình 3.9. Ảnh điện di thăm dò khả năng biểu hiện của kháng nguyên tái tổ hợp STb
và khả năng liên kết giữa đuôi 6xHis với phối tử Ni2+ trên gel SDS – PAGE 15%.. ...40
Hình 3.10. Đường cong sinh trưởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene estB mã
hóa tạo kháng nguyên STb ............................................................................................41
Hình 3.11. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên sinh trưởng của chủng E. coli
BL21 (DE3) tái tổ hợp ...................................................................................................42
Hình 2.12. Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống lên sinh trưởng của chủng E. coli BL21
(DE3) tái tổ hợp .............................................................................................................43
Hình 3.13. Ảnh hưởng của các tốc độ lắc lên sinh trưởng của chủng E. coli BL21
(DE3) tái tổ hợp .............................................................................................................43
Hình 3.14. Ảnh điện di thăm dị thời gian cảm ứng biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp STb
trên gel 15%.. ..................................................................................................................44
Hình 3.16. Ảnh điện di thăm dị thành phần các mơi trường tối ưu trong biểu hiện gene
kháng nguyên tái tổ hợp STb trên gel 15%.. .................................................................46
Hình 3.17. Ảnh điện di thăm dị thời điểm bổ sung chất cảm ứng tối ưu trong biểu hiện
gene kháng nguyên tái tổ hợp STb trên gel 15%...........................................................47

Luan van

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


1

MỞ ĐẦU

1. TÍNH CẤP THIẾT
Chăn ni gia súc, gia cầm từ lâu đã đóng góp một vị trí vơ cùng quan trọng
đối với đời sống của lồi người nói chung và đời sống của người Việt Nam nói riêng.
Ổ Việt Nam chăn ni gia súc, gia cầm chính là nguồn cung cấp thực phẩm chủ yếu
phục vụ nhu cầu của người dân, hàng năm cung cấp khoảng 30% giá trị sản suất
ngành nông nghiệp.
Tuy nhiên, chăn nuôi lợn theo hướng cơng nghiệp cịn nhiều vấn đề nan giải mà
nổi lên là tình hình dịch bệnh và sử dụng thuốc trong điều trị bệnh tại các cơ sở chăn
ni. Trong đó, bệnh tiêu chảy do E.coli gây ra là phổ biến và gây thiệt hại kinh tế
đáng kể.
Tiêu chảy ở lợn con do nhiều nguyên nhân, nhưng nguyên nhân chính là do các vi
khuẩn đường ruột E. coli gây ra. Dựa vào khả năng gây tiêu chảy, vi khuẩn E.coli được chia
thành 5 loại gồm: E. coli gây bệnh đường ruột (enteropathogenic E. coli-EPEC), E.coli sinh
độc tố ruột (enterotoxigenic E. coli-ETEC), E. coli xâm nhập ruột (enteroinvasive E.coliEIEC), E.coli gây xuất huyết ruột (enterohaemorrhagic E.coli-EHEC) và E.coli bám dính
đường ruột (enteroaggregative E. coli-EAEC) (Kim và cs, 2007).
Độc tố đường ruột là một trong những yếu tố độc lực quan trọng của vi khuẩn
E. coli gây bệnh tiêu chảy ở lợn con. Độc tố đường ruột làm thay đổi nước, chất điện
giải ở ruột non và dẫn tới tiêu chảy. Có 2 loại độc tố đường ruột của vi khuẩn thuộc nhóm
ETEC được xác định là độc tố không chịu nhiệt (LT) và độc tố chịu nhiệt (ST). Bên cạnh
đấy, vi khuẩn thuộc nhóm EAEC sản sinh độc tố chịu nhiệt EAST1 (Enteroaggregative

heat-stable enterotoxin 1) cũng được xem là một trong những nguyên nhân gây tiêu chảy
ở gia súc (Phùng khắc Cam và cs, 2003).
Độc tố chịu nhiệt (độc tố ST) là những đoạn peptide có trọng lượng phân tử
nhỏ, được sản sinh bởi các chủng vi khuẩn thuộc nhóm ETEC. Độc tố này có thể chịu
được nhiệt độ 1000C trong 15 phút. Độc tố ST được chia thành 2 nhóm là STa và STb,
khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt động (Sack, 1975; Sherman và cs, 1983).
Độc tố STb cũng là chuỗi polypeptide được sản sinh chủ yếu bởi các chủng vi
khuẩn ETEC phân lập từ lợn (Nataro và cs, 1998). Độc tố STb gồm có 48 axít amin,
trong đó có 4 axít amin Cystein tạo thành 2 cầu nối disulfide giữa Cys10 – Cys48 và
Cys21 – Cys36. Các cầu nối này có vai trị giúp cho STb bền vững trong chu chất (Fujii
và cs, 1991).
Gene mã hóa cho độc tố ST lần lượt là estA và estB. Gene estA được tìm thấy chủ
yếu trên plasmid cùng mang nhiều gene mã hóa các yếu tố độc lực khác của các chủng

Luan van

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


2

ETEC như yếu tố xâm nhiễm, kháng kháng sinh, sản sinh colicin (Nataro và cs, 1998).
Tương tự, gene estB được tìm thấy trên plasmid cùng mang nhiều yếu tố độc lực khác
như độc tố LT, STa, kháng kháng sinh, yếu tố xâm nhiễm (Harnett và cs, 1985). Độc
tố ST được tổng hợp trong tế bào chất như là tiền polypeptide. Đoạn tiền peptide mang
tín hiệu vận chuyển sẽ bị phân cắt khi chuỗi polypeptide vận chuyển từ tế bào chất đến
periplasm thông qua hệ thống vận chuyển SecA. Trong periplasm, các cầu nối
disulfide của độc tố sẽ được hình thành trước khi độc tố được giải phóng khỏi tế bào vi
khuẩn qua hệ thống TolC dưới tác động của protein DsbA (periplasmic oxidoreductase
protein) (Dubreuil và cs, 1997 và 2006a).

Áp dụng công nghệ DNA và công nghệ protein tái tổ hợp để sản xuất kháng
nguyên tái tổ hợp sẽ tạo được sản phẩm có khả năng chống lại đồng thời nhiều chủng
E.coli gây bệnh tiêu chảy ở lợn con sau cai sữa. Đây là lợi thế của phương pháp tiếp
cận mới có áp dụng cơng nghệ cao so với các phương pháp tách chiết kháng nguyên
truyền thống.
Nước ta là quốc gia có nền kinh tế dựa chủ yếu trên lĩnh vực nơng nghiệp, trong
đó chăn ni là một bộ phận quan trọng. Chăn nuôi lợn theo quy mô công nghiệp đã
bắt đầu phát triển và mang lại hiệu quả kinh tế lớn. Tuy nhiên, cũng giống như các
quốc gia khác trên thế giới, tình hình dịch bệnh tiêu chảy thường xảy ra trên các đàn
lợn con, gây tổn thất không nhỏ cho người chăn ni. Vì vậy, các vấn đề liên quan đến
căn bệnh này cũng như các chủng E. coli gây bệnh, các yếu tố kháng nguyên gây độc
tố cũng đã được nghiên cứu như: Tìm hiểu vai trị E. coli trong bệnh phân trắng của
lợn con và vắc xin dự phòng, xác định các yếu tố độc lực bằng kỹ thuật PCR, nghiên
cứu phân lập và xác định độc tố đường ruột của các chủng E. coli gây bệnh tiêu chảy
cho lợn con, nghiên cứu về khả năng gây bệnh của các chủng E. coli trong lợn con một
ngày tuổi thiếu sữa ở năm tỉnh miền Bắc của Việt Nam.
Xuất phát từ những yếu tố trên, cùng với nhu cầu ngày càng lớn của ngành chăn nuôi,
chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài " Nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gene kháng
nguyên độc tố bền nhiệt STb của E. coli trong tế bào vi khuẩn E. coli BL21 (DE3)
và tối ưu các điều kiện biểu hiện".
2. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI
Nghiên cứu phân lập gene estB , tạo dòng, biểu hiện và khảo sát điều kiện thích hợp để
sản xuất số lượng lớn kháng nguyên tái tổ hợp STb, làm cơ sở cho việc sản xuất và ứng dụng
trong việc phòng trị bệnh do E. coli gây ra ở lợn con bị bệnh tiêu chảy.

Luan van

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma

3

3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỂN
3.1. Ý nghĩa khoa học
Trong những năm gần đây, kháng nguyên tái tổ hợp đang được nhiều nhà khoa học
quan tâm nghiên cứu và ứng dụng ở một số nước trên thế giới, nhưng ở Việt Nam hầu như
có rất ít nghiên cứu được thực hiện. Kết quả nghiên cứu sẽ giúp chúng ta có thể chủ động
sản xuất một lượng lớn protein kháng nguyên tái tổ hợp STb theo mong muốn tạo nguồn
nguyên liệu cho nhiều hướng ứng dụng.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Nội dung nghiên cứu của đề tài giúp chúng ta tiếp cận và ứng dụng được các kỹ
thuật hiện đại của Công nghệ sinh học nhằm rút ngắn thời gian nghiên cứu và hiệu quả
kinh tế.
- Các kết quả này sẽ là cơ sở cho phép nghiên cứu tạo các vacxin hoặc sản xuất kit
chẩn đoán để phục vụ trong cơng tác phịng trị bệnh tiêu chảy do E.coli gây ra ở lợn.

Luan van

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


4

Chương 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

1.1. Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn E. coli gây ra ở lợn
1.1.1. Nghiên cứu trong nước
Ở nước ta, bệnh do E. coli gây ra đã xuất hiện từ lâu và cho đến nay bệnh ngày
càng trở nên phổ biến, rộng khắp ở hầu hết các cơ sở chăn ni. Tìm hiểu về bệnh do
E. coli gây ra đã có nhiều nhà khoa học thú y quan tâm nghiên cứu.

Theo Hoàng Văn Tuấn, Lê Văn Tạo và Trần Thị Hạnh (1998) điều tra tình hình
bệnh tiêu chảy ở lợn con trong một trại lợn giống hướng nạc trong ba năm 1995, 1996,
1997, kết quả cho thấy tỷ lệ hao hụt do dịch bệnh ở lợn con theo mẹ (dưới 45 ngày
tuổi) qua các năm là 25%, 12% và 15%. Trong đó tỷ lệ chết do tiêu chảy chiếm 67%
và 80% trong số lợn con chết (Hoàng Văn Tuấn và cs, 1998).
Trong khi, Đào Trọng Đạt và cs, (1996) cho biết bệnh phân trắng thường gặp ở lợn
con mới sinh, giai đoạn từ 1 - 20 ngày tuổi với tỷ lệ mắc bệnh cao nhất có thể lên tới
100%. Đối với các hộ nơng dân chăn ni lợn nái có tỷ lệ mắc bệnh khá cao 31,3 66% . Ngồi ra, nhóm tác giả này cho biết thêm “khoảng 48% các trường hợp bị bệnh
tiêu chảy ở lợn con là do vi khuẩn E. coli gây ra. Vì vậy bệnh do vi khuẩn E. coli gây
ra có vị trí đặc biệt trong các bệnh nhiễm khuẩn ở lợn con” (Đào Trọng Đạt và cs,
(1996). Trong khi đó, theo nghiên cứu của Nguyễn Văn Kình và cộng sự (1996) cho
biết tỷ lệ mắc bệnh phân trắng ở lợn con cao khoảng 60 - 70% có khi lên tới 100%
nhưng tỷ lệ chết không cao khoảng 15 - 18% (Nguyễn Văn Kình và cs,1996).
Khả năng điều trị bệnh phân trắng lợn con rất khó nên việc phịng bệnh là rất quan
trọng. Nguyễn Thị Nội (1984) đã dựa trên kết quả xác định tần suất của các serotype
có tần suất cao dùng để chế tạo vacxin E. coli vơ hoạt có chất bổ trợ keo phèn trên hai
lần, cho lợn mẹ có chửa để phịng bệnh phân trắng lợn con. Kết quả đã làm giảm tỷ lệ
lợn con mắc bệnh từ 73% xuống còn 27,3% (Nguyễn Thị Nội, 1984). Đến năm 1993,
Nguyễn Thị Nội và cộng sự đã dựa vào kết quả phân lập các vi khuẩn đã chế tạo ra
một loại vacxin có tên “Salsco” gồm E. coli, Salmonella, Streptococcus để phòng bệnh
tiêu chảy cho lợn con. Vacxin Salsco tiêm cho lợn con từ 21 ngày tuổi liều 3 – 5
mL/con, 2 lần cách nhau 10 ngày (Nguyễn Thị Nội và cs, 1993). Kết quả vacxin này
làm giảm tỷ lệ lợn con bị tiêu chảy từ 30-50% và giảm tỷ lệ chết của lợn con do tiêu
chảy từ 10 - 20%. Liên quan đến vacxin, nhóm tác giả Lê Văn Tạo và cộng sự (1993)
dựa trên cơ sở xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E. coli phân lập từ bệnh
phẩm lợn con chết do ỉa chảy phân trắng đã chọn các giống vi khuẩn điển hình để chế
vacxin chết ở dạng Bacterin cho uống. Vacxin sau khi đẻ 2 giờ uống liều 1 mL, liên

Luan van

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


5

tục 3 - 5 ngày làm giảm tỷ lệ lợn con bị phân trắng từ 30 - 35% so với lô đối chứng (Lê
Văn Tạo và cs, 1993).
Từ trước đến nay, hiện tượng kháng thuốc xẩy ra ngày càng phổ biến, gây nhiều
khó khăn cho ngành chăn ni. Chính vì vậy, nhiều nhà khoa học trong và ngồi nước
đã có nhiều nghiên cứu được công bố. Theo Bùi Thị Tho và Phạm Khắc Hiếu (1995)
nghiên cứu theo dõi tính kháng thuốc của vi khuẩn E. coli phân lập từ lợn con phân
trắng đã có kết luận rằng: Số chủng E. coli kháng thuốc từ năm 1978 - 1988 tăng khá
nhanh, nhất là với các loại kháng sinh chloramphenicol, tetracylin. Các tác giả cũng đã
khuyến cáo nếu sử dụng thuốc kháng sinh như một chất kích thích tăng trọng cần phải
được kiểm tra nghiêm ngặt sử dụng trong chăn ni vì nó đã góp phần khơng nhỏ vào
sự hình thành kháng thuốc và truyền kháng của vi khuẩn E. coli (Bùi Thị Tho và Phạm
Khắc Hiếu, 1995). Một giải pháp thây thế cho việc dùng thuốc trong chăn nuôi đã
được tiến hành và có nhiều thử nghiệm. Theo Vũ Đình Hưng và cộng sự (1996) đã sử
dụng globulin chiết tách từ máu gia súc để phòng bệnh phân trắng lợn con. Kết quả thu
được: phòng bệnh sinh sản hay tiêm cho lợn mẹ trước khi đẻ 10 - 15 ngày thì tỷ lệ bảo hộ
là 67,6% và 81,20%, khả năng chữa trị khỏi bệnh là 83,88% (Vũ Đình Hưng và cs, 1996).
Tạ Thị Vịnh và cộng sự, (2002) đã nghiên cứu sử dụng mật lợn để phòng bệnh
phân trắng lợn con và kết hợp với kháng sinh để điều trị bệnh. Kết quả cho thấy, lợn
thí nghiệm có tăng trọng cao hơn so với lợn đối chứng. Lợn mắc bệnh phân trắng ở lơ
thí nghiệm hồn tồn phịng được bệnh trong các hộ gia đình, lợn ở lơ đối chứng qua 2
đàn trên đều mắc bệnh, tỷ lệ từ 33,33% - 66,67% (Tạ Thị Vịnh và cs, 2002).
Trần Thị Hạnh và Đặng Xuân Bình (2002) đã nghiên cứu, thử nghiệm một số chế
phẩm sinh học phòng bệnh tiêu chảy phân trắng lợn con do vi khuẩn E. coli và Cl.
perfringens. Các tác giả đã chế tạo ba chế phẩm sinh học gồm E. coli-Sữa, Cl.
perfringens dùng cho nái chửa và Bacterin EBC (E. coli, Bacterin và Cl. perfringens

toxoid) dùng cho lợn con để phịng bệnh và xây dựng quy trình gây bệnh cho lợn con
ngay từ những ngày đầu (Trần Thị Hạnh và Đặng Xuân Bình, 2002).
Đỗ Trọng Cứ và Nguyễn Quang Tuyên (2002) đã nghiên cứu sử dụng chế phẩm
EM (Effective Microorganism) phòng bệnh tiêu chảy lợn con trước và sau khi cai sữa.
Kết quả cho thấy tỷ lệ tiêu chảy giảm 20%, tỷ lệ tái phát bệnh giảm so với đối chứng
50%, khả năng tăng trọng cao hơn, các chỉ tiêu sinh lý: máu, hồng cầu, bạch cầu và
huyết sắc tố bình thường. Qua kiểm tra tổng số vi khuẩn Salmonella trong 1 g phân
giảm đi rõ rệt từ 20,92 triệu vi khuẩn (1 g phân trước khi thí nghiệm) còn 16,99 triệu
vi khuẩn (1 g phân sau khi kết thúc thí nghiệm) (Đỗ Trọng Cứ và Nguyễn Quang
Tuyên, 2002).
Tạ Thị Vịnh và Đặng Thị Hoè (2002) sử dụng các chế phẩm sinh học để phòng bệnh
tiêu chảy của lợn con. Kết quả thu được như sau (Tạ Thị Vịnh và Đặng Thị Hoè, 2002):

Luan van

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


6

- Dùng chế phẩm VITOM1.1 có tác dụng rất cao đối với giống lợn ngoại, tỷ lệ
khỏi bệnh 100% so với lơ đối chứng là 80,7%; cịn tỷ lệ tái phát khi sử dụng
VITOM1.1 chỉ 25% trong khi lô đối chứng là 52,38%.
- Sử dụng cao mật lợn để phòng và trị bệnh đường tiêu hoá cho lợn con. Kết quả
cho thấy lơ thí nghiệm so với lơ đối chứng: tỷ lệ mắc bệnh giảm 5%, lơ thí nghiệm
khơng có tái phát 100% trong khi lô đối chứng tái phát 25% và chết 25%. Nó cịn kích
thích tăng trọng tốt. Sau 3 tuần tuổi các lơ thí nghiệm so với lô đối chứng là 0,27 kg
tức 13,77%.
Tạ Thị Vịnh và Đặng Khánh Vân (1995) cho rằng E. coli thường trực cả ở cơ thể
lợn khoẻ, từ lợn con đến lợn nái. Ở lợn khoẻ có nhiễm vi khuẩn E. coli K88 nhưng số

lượng và độc lực chưa đầy đủ để gây bệnh. Ở lợn mắc chứng tiêu chảy số lượng và tỷ
lệ vi khuẩn E. coli K88 tăng gấp bội, điều đó chứng tỏ mơi trường trong ruột đã bị thay
đổi thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn E. coli nhất là E. coli độc (Tạ Thị Vịnh và
Đặng Khánh Vân, 1995).
Bùi Thị Tho và Phạm Khắc Hiếu (1996) đã tiến hành nghiên cứu theo dõi, kiểm
tra một số yếu tố ảnh hưởng đến tính mẫn cảm và tính kháng thuốc của vi khuẩn E.
coli phân lập từ bệnh lợn con phân trắng đã cho rằng việc sử dụng thuốc trong phòng,
trị bệnh khác nhau đã dẫn đến tính mẫn cảm và tính kháng thuốc của vi khuẩn này là
khác nhau. Tỷ lệ vi khuẩn E. coli kháng thuốc cao thì tỷ lệ vi khuẩn E. coli đa kháng
cũng cao. Tính kháng thuốc của vi khuẩn E. coli liên quan đến tuổi lợn bị bệnh (lợn
dưới 4 ngày tuổi mắc bệnh có tỷ lệ vi khuẩn E. coli kháng thuốc thấp hơn ở các lứa
tuổi trên 4 ngày tuổi), các chủng E. coli có khuẩn lạc dạng R có tính kháng thuốc cao
hơn dạng S (Bùi Thị Tho và Phạm Khắc Hiếu, 1996).
Cù Hữu Phú và cộng sự, (2000) đã phân lập vi khuẩn E. coli và Salmonella ở lợn
mắc bệnh tiêu chảy xác định một số đặc tính sinh hố của các chủng vi khuẩn phân lập
được và đề ra biện pháp điều trị. Tác giả đã phân lập được 60 chủng E. coli trong đó có 42
chủng gây dung huyết trên thạch máu chiếm tỷ lệ 70%, có 6 chủng E. coli sản sinh ra cả 2
loại độc tố là chịu nhiệt ST và không chịu nhiệt LT, các chủng E. coli mẫn cảm cao nhất
với các loại kháng sinh: nitrofurazolidon (85%), neomycine (80), sulfonamid (75%).
Dùng 4 chủng E. coli dung huyết và 3 chủng Salmonella có độc lực mạnh trên chuột sản
sinh độc tố để sản xuất autovacxin phòng bệnh tiêu chảy, liều tiêm 3 – 5 mL/con đạt tỷ lệ
phòng bệnh 89,22% (Cù Hữu Phú và cs, 2000).
Lý Thị Liên Khai (2001) đã phân lập và xác định độc tố ruột của các chủng E. coli
gây bệnh tiêu chảy cho lợn con, tác giả cho rằng các chủng K88 sinh độc tố ruột LT và
ST; K99 và 987P sinh độc tố ruột ST và độc tố ST trở nên độc khi sức đề kháng của
vật chủ giảm, gây tiêu chảy cho lợn con đang bú mẹ, phổ biến ở lợn 1 - 2 tuần tuổi (Lý
Thị Liên Khai, 2001).

Luan van

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


7

Nghiên cứu của Đoàn Thị Kim Dung và Lê Thị Tài (1997) điều trị hội chứng tiêu
chảy lợn con theo mẹ, sử dụng becberin liều 0,5 - 0,8/ngày cho uống đạt hiệu quả
68%. Sử dụng Oresol cho uống hoặc tiêm dưới da hạn chế được tiêu chảy hiệu quả đạt
trung bình 60%. Phối hợp điều trị becberin và Oresol thêm chất trợ lực B complex
hiệu quả đạt 90% (Đoàn Thị Kim Dung và Lê Thị Tài, 1997).
Để góp phần vào việc giải quyết những thiệt hại của bệnh tiêu chảy cho lợn con,
đã có nhiều tác giả nghiên cứu và thu được nhiều thành cơng ở những khía cạnh khác
nhau. Mặc dù vậy, cho đến nay bệnh tiêu chảy ở lợn con theo mẹ vẫn là bệnh gây thiệt
hại lớn đến các trại chăn ni lợn tập trung do tính chất phức tạp của mầm bệnh, hay
do nhiều nguyên nhân, yếu tố tác động đến con vật và đặc biệt là tình trạng ơ nhiễm
mơi trường, chuồng trại của các cơ sở chăn ni.
1.1.2. Tình hình nghiên cứu ở nước ngồi
Từ lâu trên thế giới đã có rất nhiều nhà khoa học đi sâu nghiên cứu về vi khuẩn E.
coli đặc biệt là trong những thập niên 60, 70 và những năm gần đây.
Vi khuẩn E. coli có 2 loại độc tố và là thành phần chính của enterotoxin được thấy ở
các vi khuẩn E. coli gây bệnh, sự khác biệt giữa chúng là khả năng chịu nhiệt. Độc tố chịu
nhiệt ST (heat-stable toxin) chịu được nhiệt độ 1000C trong 15 phút (Smith và Halls,
1967), độc tố không chịu nhiệt LT (heat-labile toxin) bị vô hoạt ở 600C trong 15 phút.
Các vi khuẩn E. coli gây bệnh đường ruột có khả năng bám dính vào tế bào nhung
mao ruột, sự bám dính này do các pili thực hiện. Có 5 ngoại kháng nguyên K là yếu tố
bám dính trong cấu trúc pili gồm K88ac, K88ab, K88ad, K99 và 987P.
Năm 1975, Smith, năm 1978, Hall và Kokler (dẫn theo Lê Văn Tạo và cs, 1990)
đã đề nghị: Khi lựa chọn những vi khuẩn E. coli để sản xuất vacxin phòng bệnh cần
quan tâm đến các yếu tố gây bệnh mà vi khuẩn tiếp nhận được trong q trình phát
triển và có thể có ở bệnh đường ruột, sinh sản, hơ hấp đều thấy có mặt của vi khuẩn

này. Từ đó đi đến khẳng định vai trò gây bệnh của vi khuẩn E. coli và đi sâu nghiên
cứu những yếu tố gây bệnh của nó (dẫn theo Lê Văn Tạo và cs, 1990).
Theo Sokol và cộng sự (1981) sở dĩ vi khuẩn E. coli từ vai trò cộng sinh thường
trực trong đường ruột trở thành vi khuẩn gây bệnh là vì trong quá trình sống cá thể vi
khuẩn tiếp nhận được các yếu tố gây bệnh mà theo ơng đó là yếu tố gây dung huyết
(Hly), yếu tố cạnh tranh (Colv), yếu tố bám dính (K88, K99), yếu tố độc tố đường ruột
enterotoxin), yếu tố kháng kháng sinh (R). Các yếu tố gây bệnh này không được di
truyền qua ADN của chromosome mà di truyền bằng ADN nằm ngoài chromosome
(nhiễm sắc thể) được gọi là plasmid. Qua hiện tượng trao đổi di truyền bằng tiếp hợp,
chính những yếu tố gây bệnh này đã giúp cho vi khuẩn bám dính vào được tế bào
nhung mao ruột non, xâm nhập vào thành ruột. Từ đây vi khuẩn thực hiện quá trình

Luan van

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


8

gây bệnh là sản sinh độc tố gây phá huỷ tế bào niêm mạc ruột, tế bào nhung mao ruột
non, từ đó gây dung huyết, nhiễm độc huyết (Sokol và cs, 1981).
Bảng 1.1. Các chủng E. coli gây bệnh trên lợn (Fairbrother, 1994)
Type kháng
nguyên O
của E. coli

Loại
Thể bệnh
gây ra của vi khuẩn
E. coli

E. coli

O8K316

Gây bệnh
ỉa chảy ở
lợn sơ sinh
và lợn con

O9K35
O9K30

ETEC

Các yếu tố gây bệnh
ST

STb LT VT

F4
F5
F6
(K88) (K99) (987P)

+

+

+

+

+

+

+

O9K103

+

+

+

+

O9 Group

+

+

+

+

O8K4627
O8 Group

O157 KV17
O147 K89
O149 K91

Gây bệnh
ỉa chảy ở
lợn
sơ
sinh, lợn
con xuất
huyết
đường tiêu
hoá

ETEC

O8 Group
O147 K1285

ETEC

O115KV165
O138 K81
O139 K82
O141 K85
O45KE65

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+
+
+

+

+

+
ETEC và
VTEC
AEEC

+

+

+

+

+

+

+
+

Luan van

+

+

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


9

Sau đó Yangc và Konisky (1984) lại thấy rằng Colv là một yếu tố không bền vững
với nhiệt và men proteinaza (Yangc và Konisky, 1984).
Minshew và cộng sự (1978) đã phát hiện có 48 trong số chủng E. coli phân lập ở
đường ruột có khả năng dung huyết, trong khi đó vi khuẩn E. coli phân lập từ phân chỉ
có 8 - 18% các chủng gây dung huyết (Minshew và cs, 1978).
Evans và cộng sự (1973) cũng thu được kết quả tương tự khi tìm thấy 42% số
chủng E. coli phân lập từ đường tiết niệu, 29% số chủng E. coli phân lập từ máu có
khả năng gây dung huyết (Evans và cs, 1973).
Theo Niconxki (1971) thì khoảng 20 - 50% lợn con bị bệnh chết trong những ngày
sơ sinh, đôi khi tỷ lệ chết lên tới 100%. Thiệt hại do nhiễm khuẩn E. coli còn tăng cao
do con non quá ốm hoặc sử dụng thức ăn không hợp lý, do chi phí chữa trị và phịng
bệnh (Niconxki, 1971).
Căn cứ vào kết quả nghiên cứu các yếu tố gây bệnh ở từng chủng E. coli phân lập
từ các thể bệnh khác nhau, Faibrother (1992) đã nghiên cứu và đặt tên các chủng vi
khuẩn E. coli theo những yếu tố gây bệnh mà chúng có khả năng sản sinh ra như:
Enterotoxingenic E. coli (ký hiệu là ETEC); Enteropathogenic E. coli (EPEC);

Verotoxigenic E. coli (VTEC); Adhesive Enteropathogenic E. coli (AEEC). Từ đó sắp
xếp các serotype cùng mang các yếu tố gây bệnh vào các nhóm gây nên những thể
bệnh đặc trưng cho từng lứa tuổi lợn khác nhau, như trình bày ở bảng dưới đây
(Faibrother, 1992).
1. 2. MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH VẬT HỌC CỦA VI KHUẨN E. COLI
Trực khuẩn ruột già Escherichia coli thuộc họ Enterobacteriaceae nhóm
Escherichae, lồi Escherchia. Trong các vi khuẩn đường ruột, loài Escherichia coli là
loài phổ biến nhất.
Escherichia coli cịn có tên là Bacterium coli commune, Baccillus coli communis
lần đầu tiên được Escherich phân lập vào năm 1885 từ phân trẻ em. Nơi cư trú chính
của chúng thường ở phần sau của ruột, ít khi ở dạ dày hay ở phần trước ruột của các
loài động vật như: ngựa, dê, chó, mèo, bị, gia cầm và người. Chúng theo phân của gia
súc hay người mà gieo rắc ra ngoài. Loài vật ăn thịt và loài hỗn thực bài tiết nhiều vi
khuẩn E. coli hơn loài ăn cỏ. Vi khuẩn E. coli xuất hiện và sinh sống trong động vật
chỉ vài giờ sau khi sinh và tồn tại cho đến khi con vật chết. Ở điều kiện bình thường
các chủng E. coli không gây bệnh, khi các điều kiện ni dưỡng, chăm sóc, vệ sinh thú
y kém dẫn đến sức chống đỡ của con vật suy giảm thì vi khuẩn E. coli trở nên cường
độc và có khả năng gây bệnh. Những chủng E. coli phổ thông về mặt huyết thanh học
được chia thành một số type. Một số của những type này đóng vai trị quan trọng trong
quá trình gây bệnh cho gia súc.

Luan van

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


10

1.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn E. coli
Theo Phạm Hồng sơn (2002), chi Escherichia coli 4 loài khác nhau nhưng loài chủ

yếu là vi khuẩn E. coli. Vi khuẩn này phát triển rất tốt trên môi trường thạch thường ở
35 - 37ºC sau 12 – 18 giờ hành thành khuẩn lạc trịn lồi, khơng trong suốt, bóng láng.
Trên thạch máu, đa số chủng khơng gây dung huyết, nhưng cũng có chủng gây dung
huyết. Để phân lập thường nuôi cấy khởi đầu trên môi trường tuyển lựa như môi
trường Istrati, MacConkey, Endo, Desoxycholat (Phạm Hồng sơn, 2002).
1.2.2.Phân loại
Theo Phạm Hồng Sơn (2013) vi khuẩn E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae (họ
trực khuẩn đường ruột) có nhiều chi khác nhau. Quan niệm phân loại chấp nhận phổ
biến hiện nay thì họ này thuộc bộ Enterobacteriales, thuộc lớp Gammaproteobacteria,
có 51 chi (trước đây gọi là giống), trong đó có các chi gây bệnh ở động vật và người
quan trọng như Escherichia, Salmonella, Shigella, Yersinia, Edwardsiella và
Klebsiella…Chi Escherichia có 4 lồi khác nhau gồm E. coli, E. fergusonii, E.
hermannii và E. Vulneris nhưng loài chủ yếu là E. coli (Phạm Hồng Sơn, 2013).
Căn cứ vào các yếu tố gây bệnh, vi khuẩn E. coli được chia làm 6 nhóm chính;
các nhóm vi khuẩn này mang các yếu tố độc lực điển hình và gây nên các bệnh lý khác
nhau trên động vật và người (Kaper và cs, 2004; Nataro và cs, 1998) .
- Enteropathogenic E. coli (EPEC): Thuộc vào một nhóm huyết thanh học riêng
biệt và có tính bám dính, có khả năng xâm nhiễm vào ruột non, phá hủy lớp tế bào
biểu mô ruột, kèm theo biểu hiện sốt và tiêu chảy. Vi khuẩn nhóm này thường gây
bệnh ở người, thỏ, chó, mèo, lợn và ngựa.
- Enterohaemorrhagic E. coli (EHEC): E. coli sinh độc tố tế bào vero hay còn gọi
là E. coli xuất huyết ruột có năng lực sản sinh độc tố vero gây độc tế bào do
bacteriphage chi phối và gây bệnh cục bộ (Phạm Hồng Sơn, 2013).
- Enterotoxigenic E. coli (ETEC) : E. coli độc tố nguyên đường ruột, vi khuẩn
thuộc nhóm này có năng lực hình thành các kháng ngun lông F2 (tên cũ CFA/I), F3
(CFA/II), F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P), F16, F41 và các độc tố đường ruột
(enterotoxin) do plasmid chi phối.
- Enteroaggregative E. coli (EAEC): Vi khuẩn bám lên thành ruột non và ruột
già, sản sinh độc tố tế bào và độc tố đường tiêu hóa (EAST1); vi khuẩn nhóm này chỉ
có thể tìm thấy ở người và có thể ở lợn, bị.

- Enteroinvasive E. coli (EIEC): E. coli xâm lấn đường ruột có khả năng xâm
nhập đường ruột và do plasmid chi phối; vi khuẩn thuộc nhóm này chủ yếu được phân
lập ở người.

Luan van

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


11

- Diffusely adherent E. coli (DAEC): Có thể tìm thấy trong ruột non, đặc biệt là ở
trẻ em từ 12 tháng tuổi trở lên.
Trong đó, các chủng vi khuẩn thuộc nhóm EHEC và ETEC thường gây bệnh tiêu
chảy cho lợn con sơ sinh và lợn sau cai sữa.
1.2.3. Đặc điểm về hình thái của vi khuẩn E. coli
E. coli là một trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu trịn, kích thước 2 - 3 x 0,4 - 0,6
µm. Trong cơ thể động vật chúng có hình cầu trực khuẩn, đứng riêng lẻ, đơi khi xếp
thành chuỗi ngắn. Có khi trong mơi trường ni cấy thấy có những trực khuẩn dài 4 8 µm, những loại này thường gặp trong canh khuẩn già và phần lớn vi khuẩn E. coli di
động do có lơng ở xung quanh thân, nhưng có một số khơng thấy di động. Vi khuẩn
khơng hình thành nha bào, có thể có giáp mơ (Nguyễn Như Thanh, 1997).
Vi khuẩn bắt màu gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở hai đầu ở giữa bắt màu
nhạt, không hình thành bào tử. Nếu lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc nhày để nhuộm có thể
thấy giáp mơ cịn khi soi tươi sẽ không thấy được. Dưới kinh hiển vi điện tử người ta
còn phát hiện được cấu trúc pili yếu tố mang kháng nguyên bám dính của vi khuẩn
E. coli ( Nguyễn Như Thanh, 1977).
E. coli có sức đề kháng kém với nhiệt độ, vi khuẩn bị tiêu diệt ở 550C trong vòng 1
giờ, 600C trong vòng 15-30 phút, đun sơi 1000C chết ngay. Ở mơi trường bên ngồi,
các chủng E. coli có thể tồn tại được đến 4 tháng. Các hóa chất sát trùng thơng thường:
Acid Phenic, Formol, Hydroperoxit 0,1% diệt vi khuẩn sau 5 phút.

1.2.4. Đặc tính nuôi cấy của vi khuẩn E. coli
Vi khuẩn E. coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thơng thường,
một số chủng có thể phát triển được ở môi trường tổng hợp đơn giản nên người ta đã
chọn chúng để nghiên cứu về sinh vật học (Nguyễn Như Thanh, 1977). E. coli là trực
khuẩn hiếu khí và yếm khí tuỳ tiện, có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ 5 - 400C, nhiệt độ
thích hợp nhất là 370C. pH thích hợp là 7,2 - 7,4 phát triển được ở pH từ 5,5 - 8. Sau
24 giờ nuôi cấy ở 370C, E. coli phát triển ở các môi trường thông thường với các đặc
điểm như sau:
* Trên môi trường thạch thường: Sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, vi khuẩn hình thành
những khuẩn lạc trịn, ướt, bóng láng, khơng trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi,
đường kính 2 – 3 mm. Nuôi lâu khuẩn lạc chuyển màu gần như nâu nhạt và mọc rộng
ra, có thể quan sát thấy cả những khuẩn lạc dạng M và R.
* Trên môi trường thạch thịt pepton: sau 18 - 24 giờ bồi dưỡng trong tủ ấm chúng
mọc thành những khuẩn lạc ẩm ướt, ánh màu xanh, kích thước trung bình, dạng trịn,
mặt khuẩn lạc hơi lồi lên, có nếp nhăn và bề mặt láng.

Luan van

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


12

* Trên môi trường nước thịt: Sau khi nuôi cấy 24 giờ, bồi dưỡng ở tủ ấm 370C vi
khuẩn E. coli phát triển rất nhanh, mơi trường rất đục, có cặn màu tro trắng nhạt lắng
xuống đáy, đơi khi có màng màu xám nhạt trên mặt môi trường, môi trường có mùi
phân thối.
*Trên mơi trường thạch máu: Sau 24 giờ ni cấy ở 370C hình thành khuẩn lạc to,
ướt, lồi, viền khơng gọn, màu sáng có thể gây dung huyết. Kích thước từ 1 – 2 mm tuỳ
thuộc vào chủng và serotype.

* Trên môi truờng thạch MacConkey: Sau khi nuôi cấy 24 giờ, bồi dưỡng tủ ấm
37 C hình thành khuẩn lạc màu đỏ cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, khơng nhầy, rìa gọn,
khơng làm chuyển màu mơi trường.
0

* Trên mơi trường Endo: Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc màu đỏ mận chín, có ánh
kim hoặc khơng có ánh kim.
* Trên mơi trường EMB (Eosin Methylen Blue): Hình thành khuẩn lạc màu tím
đen có ánh kim.
* Trên mơi trường thạch SS: Vi khuẩn E. coli có khuẩn lạc màu đỏ.
* Trên môi trường thạch Brilliant green: Sau 24 giờ nuôi ở 370C hình thành khuẩn
lạc khơng màu trên nền vàng chanh.
1.2.5. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli
E. coli lên men sinh hơi các loại đường fructoza, glucoza, galactoza, lactoza,
manniton, levuloza, xyloza. Trừ đường andonit và inozit thì vi khuẩn E. coli không lên
men. Lên men không chắc chắn các loại đường dulcitol, saccharoza, salicin.
Vi khuẩn E. coli lên men sinh hơi nhanh đường lactoza, đây là đặc điểm quan
trọng để phân biệt E. coli và Salmonella.
Vi khuẩn E. coli được phân biệt dựa vào các đặc tính sinh hóa trên mơi trường 3
ống nghiệm sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C:
Môi trường KIA (Kliglet Iron Agar) cho phép đọc 4 tính chất:
Khả năng lên men đường Glucose (+), làm phần thạch đứng chuyển từ màu hồng
sang màu vàng.
- Khả năng lên men đường Lactose (+), làm phần thạch nghiêng chuyển từ màu
hồng sang màu vàng.
- Khả năng sinh hơi (+), làm phần thạch đứng bị nứt hoặc tạo thành bọt khí bên
trong hoặc có thể đẩy tồn bộ khối thạch lên cao và ở dưới là hơi,
- Khả năng sinh H2S (-): Vi khuẩn E. coli không có khả năng sinh hơi H2S nên
phần thạch đứng khơng có màu đen.

Luan van

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


13

Mơi trường Mannitol-Mobility cho phép đọc 2 tính chất:
- Khả năng lên men đường Mannite (+), làm môi trường chuyển từ màu hồng sang
màu vàng.
- Khả năng di động (+), làm đục điều mơi trường (chủng khơng có khả năng di
động chỉ có một đường cấy vi khuẩn, tồn bộ môi trường vẫn trong).
Môi trường Urea – Indol cho phép đọc 2 tính chất:
-Khả năng sinh ureaza (-): Vi khuẩn E. coli khơng có khả năng sinh ureaza nên
khơng làm biến đổi màu môi trường.
-Khả năng sinh Indol (+), tạo thành một vòng màu đỏ thẫm khi nhỏ thuốc thử
Kowacs vào canh khuẩn.
Các phản ứng khác:
* Sữa: Đông sau 24 đến 72 giờ ở 370c.
* Gelatin, huyết thanh đơng, lịng trắng trứng đơng: khơng tan chảy.
Vi khuẩn E. coli có phản ứng dương tính, methyl red (MR) dương tính, Voges
Proskauer (VP) âm tính, phản ứng citrat âm tính (khơng phát triển trên mơi trường
citrat), phản ứng H2S âm tính, di động, lysin decarboxylaza dương tính. Hàm lượng G
+ C (mol%) là 50 -51 ( Phạm Hồng Sơn, 2002).
1.2.6. Sức đề kháng của vi khuẩn E. coli
Vi khuẩn E. coli không chịu được nhiệt, đun 550C trong một giờ, 600C trong 30
phút diệt được vi khuẩn, ở 1000C chết ngay. Các chất sát trùng thông thường như Axit
phenic (3%), Biclorua thủy ngân, Formon (0,2%), Hyclorperoxit 1% diệt khuẩn sau 5 phút.
Ở mơi trường bên ngồi các chủng E. coli độc tố có thể tồn tại đến 4 tháng. Vi khuẩn E.
coli có khả năng đề kháng với sự sấy khơ và hun khói (Nguyễn Như Thanh, 1997).

1.2.7.Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E. coli
Vi khuẩn E. coli được chia làm các serotype khác nhau dựa theo cấu trúc kháng
nguyên O, K, H và F. Hiện nay người ta xác định được 170 quyết định kháng nguyên
O, 70 quyết định kháng nguyên K, 56 quyết định kháng nguyên H và một số quyết
định kháng nguyên F (Fairbrother và cs, 1992; Carter và cs, 1995).
Bằng phản ứng ngưng kết, các nhà khoa học đã phát hiện tính chất phức tạp các
yếu tố kháng nguyên của vi khuẩn E. coli, bao gồm các loại kháng nguyên sau:
Kháng nguyên O ( kháng nguyên thân – Ohne Hauch):
Đây là thành phần chính của thân vi khuẩn và cũng được coi là một yếu tố độc lực
của vi khuẩn. Theo Zinner và Peter (1983), kháng nguyên O được coi như một nội độc

Luan van

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


14

tố có thể tìm thấy ở màng ngồi vỏ bọc vi khuẩn và thường xun được giải phóng vào
mơi trường ni cấy. Trong trạng thái chiết xuất tinh khiết, nó có bản chất là
lipopolysaccharid bao gồm hai nhóm sau (Zinner và Peter, 1983):
* Polysaccharid có nhóm hydro nằm ở thành ngồi vi khuẩn mang tính đặc trưng
cho kháng ngun từng giống.
* Polysaccharid khơng có nhóm hydro nằm ở phía trong, khơng mang tính đặc
trưng mà chỉ tạo sự khác biệt về khuẩn lạc (từ dạng S sang dạng R).
* Đặc tính của kháng nguyên O: Là kháng nguyên chịu được nhiệt (khơng bị phá
huỷ khi đun nóng ở 1.000C sau 2 giờ); các chất cồn, axit HCl nồng độ 1N chịu được 20
giờ; kháng nguyên O rất độc (chỉ cần 1/20 mg đã đủ giết chết chuột nhắt trắng sau 24
giờ). Tuy nhiãn, cháút naìy bị phá huỷ bởi formol 0,5%.
Kháng nguyên O được cấu trúc bởi các phân tử lớn với thành phần các phân tử

gồm có:
- Protein: làm cho phức hợp có tính kháng ngun.
- Polyozid tạo ra tính đặc hiệu của kháng nguyên.
- Lipit: kết hợp với polyozid và là cơ sở của độc tính.
Khi làm mất dần từng phân tử đường của chuỗi polysaccharid hoặc thay đổi vị trí
của các phân tử này sẽ dẫn đến thay đổi độc lực của vi khuẩn. Tất cả kháng nguyên O
đều cư trú ở bề mặt do đó nó có liên hệ trực tiếp với hệ thống miễn dịch. Kháng
nguyên O khi gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết gọi là
“hiện tượng ngưng kết O”. Thân vi khuẩn ngưng kết với nhau dưới dạng những hạt
nhỏ, rất khó tan khi lắc.
Dựa vào cấu trúc kháng nguyên người ta xác định khả năng miễn dịch và làm phản
ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính để xác định serotyp các giống vi khuẩn.
Kháng nguyên H ( Kháng nguyên lông)
Kháng nguyên H được cấu tạo bởi thành phần lơng của vi khuẩn, có bản chất là
protein giống như chất myosin của cơ và mang có các đặc tính sau:
-Kháng nguyên H dễ bị phá hủy ở 600C trong 1 giờ.
-Bị cồn 50% và các enzym phân giải protein phá hủy.
-Kháng nguyên H vẫn tồn tại khi sử dụng formol 0,5% xử lý.
-Kháng nguyên H khi gặp kháng thể tương ứng sẽ xảy ra hiện tượng ngưng kết H,
trong các vi khuẩn ngưng kết lại với nhau nhờ lơng dính lơng. Các kháng thể H cố
định trên lông và là cầu nối với các lông bên cạnh. Kết quả tạo nên những hạt ngưng
kết như cục bông nhỏ. Các hạt ngưng kết rất dễ tan khi lắc vì lơng rất nhỏ và dài dễ

Luan van

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


15

đứt. Các vi khuẩn di động khi tiếp xúc với kháng nguyên H tương ứng sẽ trở thành
không di động.
Kháng ngun H của vi khuẩn E. coli khơng có vai trị về độc lực, đồng thời
khơng có vai trị trong đáp ứng miễn dịch nên ít được quan tâm nghiên cứu, nhưng nó
có ý nghĩa rất lớn trong xác định giống, loài của vi khuẩn. Các nhà khoa học đã chứng
minh bằng cách sử dụng những giống E. coli có lơng và khơng có lơng có cùng một
serotype kháng ngun O gây cảm nhiễm cho chuột bằng đường miệng với lượng vi
khuẩn bằng nhau. Kết quả cho thấy khả năng gây bệnh cho chuột thí nghiệm hồn tồn
giống nhau.
Như vậy kháng nguyên H (flagella) của vi khuẩn đường ruột bảo vệ cho vi khuẩn
khỏi bị tiêu diệt trong tế bào đại thực bào từ đó giúp vi khuẩn sống lâu và tồn tại lâu
hơn trong đại thực bào.
Kháng nguyên K (Kapsular – Kháng nguyên bề mặt)
Kháng nguyên K còn gọi là kháng nguyên bề mặt, chúng bao quanh tế bào vi
khuẩn và có bản chất hố học là polysaccharid, kháng nguyên này ngăn cản sự ngưng
kết của vi khuẩn trong huyết thanh “O” tương ứng. Khi đun nóng 100 - 1210C kháng
nguyên K sẽ mất tác dụng ngăn cản này. Vai trò của kháng nguyên K chưa được thống
nhất lắm, có người cho rằng nó khơng có ý nghĩa về độc lực vì vậy chủng E. coli có
kháng ngun K cũng như chủng khơng có kháng ngun K (Orskov và cs, 1980).
Cũng có ý kiến khác cho rằng kháng nguyên K có ý nghĩa về độc lực vì nó tham gia
bảo vệ vi khuẩn trước các yếu tố phòng vệ của cơ thể (Evans và cs, 1973).
Kháng nguyên K gồm 3 loại: L, A, B căn cứ vào các đặc tính vật lý, khả năng chịu
nhiệt hoặc khơng chịu nhiệt, khả năng hình thành ngưng kết tố, ức chế ngưng kết để
phân loại kháng nguyên. Hiện nay vi khuẩn E. coli có 89 kháng nguyên K trong đó 31
L, 32 B, 26 A.
Kháng nguyên L: không chịu được nhiệt, bị phân huỷ khi đun sôi 1000C trong 2
giờ, trong điều kiện đó kháng nguyên mất khả năng ngưng kết, kết tủa và khơng lưu
giữ được tính kháng ngun.
Kháng ngun A: Kháng nguyên chịu nhiệt, không bị phân huỷ ở 1000C trong 2 giờ 30
phút, tính kháng nguyên và khả năng gây ngưng kết, kết hợp đều giữa kháng nguyên.

Kháng nguyên B: Không chịu được nhiệt, bị phân huỷ khi đun sơi 1000C trong 1
giờ, mất tính kháng ngun nhưng vẫn giữ được khả năng ngưng kết.
Kháng nguyên K và yếu tố bám dính là yếu tố quyết định q trình bệnh của vi
khuẩn sống ở đường tiêu hoá. Để thực hiện chức năng này, mỗi loại vi khuẩn đều sản
sinh ra một yếu tố đặc trưng, yếu tố này có cấu trúc đặc biệt phù hợp với cấu trúc của
từng điểm tiếp nhận ở trên tế bào nhung mao ruột. Đối với các giống E. coli phân lập

Luan van

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


16

từ lợn con bị bệnh thì kháng ngun K88 đóng vai trị quan trọng trong việc bám dính.
Kháng ngun K88 được cấu tạo bởi các acid amin phân cực và khơng phân cực, trong
đó tỷ lệ khơng phân cực chiếm 52%. Kháng nguyên K88 là yếu tố độc lực của vi
khuẩn E. coli và thường liên kết với một số serotype xếp theo kháng nguyên O sau:
O8K88, O45K88, O138K88, O141K88, O148K88, O147K88, O157K88.
Như vậy kháng nguyên K với bản chất là polysaccharid dù ít hay nhiều đều có
nhiệm vụ nhất định trong khả năng gây bệnh không chỉ với vi khuẩn E. coli mà cả với
các vi khuẩn đường ruột khác khi xâm nhập vào hệ thống tiêu hoá.
Một số vi khuẩn trong quá trình phát triển tiết ra một chất nhầy có khả năng tan
vào nước ở một mức độ nhất định, những chất này bao xung quanh bên ngoài vách vi
khuẩn giúp vi khuẩn chống lại tác động của mơi trường ngoại cảnh, có thể quan sát
được ở trạng thái ướt, dễ bị mất đi khi thay đổi điều kiện phát triển gọi là giáp mô
(capsule).
Chất nhầy giáp mơ phần lớn khơng có tính định hình vì khuếch tán, thường được
cấu trúc bởi hợp chất polysaccharid nhưng cấu trúc của polysaccharid này lại phụ
thuộc vào từng họ vi khuẩn khác nhau thì cấu trúc khác nhau. Do đó mà tính kháng

nguyên của từng loại vi khuẩn khác nhau. Tuy nhiên ở vi khuẩn E. coli nói riêng
kháng nguyên giáp mơ khơng đóng vai trị quan trọng, vì vậy chủ yếu đi sâu tìm hiểu
kháng nguyên K88 (kháng nguyên fimbria).
Kháng nguyên fimbria (Kháng nguyên pili)
Hầu hết các chủng E. coli gây bệnh đều sinh sản ra một hoặc nhiều kháng ngun
bám dính. Các chủng khơng gây bệnh thì khơng có kháng ngun bám dính (Carter và
cs, 1995). Kháng ngun bám dính cho phép vi khuẩn có thể bám vào các thụ thể đặc
hiệu trên bề mặt tế bào biểu mô ruột và trên lớp màng nhầy chống lại khả năng đào
thải vi khuẩn của các tế bào ruột. Kháng nguyên bám dính hay fimbria nằm trên pili một cấu trúc giống sợi lông, xuất phát từ một đĩa gốc trong màng nguyên sinh chất của
tế bào vi khuẩn. Fimbria có bản chất là protein bao phủ trên tồn bộ bề mặt tế bào vi
khuẩn. Dưới kính hiển vi điện tử, chúng có hình ảnh giống một chiếc áo lơng bao bọc
xung quanh vi khuẩn. Pili vi khuẩn đường ruột khác lơng ở chỗ nó cứng hơn, khơng
lượn sóng và không liên quan đến chuyển động. Fimbria được phân loại bởi phản ứng
huyết thanh, thụ thể đặc hiệu hoặc bằng khả năng ngưng kết hồng cầu với các loài
động vật khác nhau (Carter và cs, 1995).
Fimbria bám dính đặc trưng của ETEC (Enterotoxigenic E. coli) chính là kháng
nguyên vỏ được đặt tên là K88 và K99. K88 phổ biến ở ETEC gây tiêu chảy cho lợn,
K99 của ETEC gây tiêu chảy nguyên phát ở trâu bò (Carter và cs, 1995).

Luan van

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


17

Có 4 yếu tố bám dính quan trọng của ETEC là F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P),
F41. Riêng đối với giống vi khuẩn E. coli phân lập từ lợn thì kháng ngun Fimbriae
K88 đóng vai trị quan trọng trong việc bám dính, K88 được chia thành 3 biến chủng
K88ab; K88ac; K88ad dựa trên phản ứng huyết thanh chéo.

Kháng nguyên F4 (K88) có khả năng gây ngưng kết hồng cầu, đặc tính này khơng
bị ngăn cản bởi đường D–mannoza (đề kháng với mannoza). Kháng nguyên thường có
mặt ở các chủng E. coli phân lập được từ lợn con tiêu chảy, đó là một yếu tố gây bệnh
của vi khuẩn đối với lợn và khơng có vai trị gây bệnh đối với các lồi gia súc khác. Vì
nó có cấu trúc phù hợp với điểm tiếp nhận (receptor) đặc hiệu có trên bề mặt tế bào
biểu mô ruột non, mà các điểm tiếp nhận này chỉ cho phép một số serotype E. coli có
F4 gắn được vào tế bào nhung mao ruäüt non mà thôi. Kháng nguyên F4 được sản sinh
khi nuôi cấy vi khuẩn ở nhiệt độ 370C, khi nuôi cấy ở 180C vi khuẩn khơng có khả
năng tạo ra kháng ngun này. Thơng tin di truyền mã hố cho tổng hợp kháng nguyên
F4 nằm ngoài nhiễm sắc thể, trên plasmid (Lê Văn Tạo và cs, 1993).
- Cũng như F4, kháng nguyên F5 (K99) thực hiện chức năng gắn tế bào vi khuẩn
vào các điểm tiếp nhận (receptor) đặc hiệu chủ yếu trên tế bào biểu mô nhung mao
ruột non trâu, bị và một số ở lợn. Nhờ q trình bám dính này vi khuẩn cố định được
trên niêm mạc ruột chống lại quá trình đào thải do nhu động ruột, đây là giai đoạn cần
thiết để sau đó vi khuẩn xâm nhập vào tế bào biểu mô, nhân lên rồi sản sinh
enterotoxin. Vì thế kháng nguyên F5 là một yếu tố gây bệnh phổ biến, hay gặp ở các
chủng ETEC gây tiêu chảy cho bê, nghé, dê, cừu non. Các nhóm huyết thanh O8, O9,
O64, O101 và O149 có khả năng sản sinh kháng nguyên F5, thông tin di truyền tổng
hợp F5 cũng nằm trên plasmid.
- Kháng nguyên F6: cũng giống như F4 và F5 về chức năng sinh học và thành
phần hố học, thường có mặt ở các nhóm kháng nguyên O9, O20, O101 và O141 gây
bệnh bại huyết, xuất huyết cho lợn trước và sau cai sữa.
1.2.8. Khả năng sản sinh độc tố đường ruột
Độc tố đường ruột: Có hai loại độc tố là thành phần chính của Enterotoxin được
tìm thấy ở các vi khuẩn E. coli gây bệnh tiêu chảy, khác nhau ở khả năng chịu nhiệt:
Độc tố chịu nhiệt (Heat Stable Toxin – ST) không bị biến tính ở nhiệt độ 1000C trong
15 phút, độc tố không chịu nhiệt (Heat Labile Toxin – LT) bị vô hoạt ở 600C trong 15
phút. Gene mã hóa cho LT và ST nằm trên Plasmid ETEC có thể đồng thời sản sinh
hai loại độc tố hoặc chỉ một loại, ở người thường là ST (Takeda và cs, 1983).
Nhóm độc tố đường ruột tác động vào chu trình Adenlat làm thay đổi quy trình

trao đổi muối – nước ở ruột gây tiêu chảy. Cả 2 loại độc tố này đều không gây ra
những biến đổi bệnh tích hoặc sự thay đổi về mặt hình thái của lớp niêm mạc ruột non,
chỉ có tác động gây ra những biến đổi mạnh, làm gia tăng quá trình thẩm xuất H2O,

Luan van

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma