Sàng lọc các chủng thực khuẩn thể có khả năng ly giải tế bào vi khuẩn vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy (ahpnd) trên tôm sú (penaeus monodon)

GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh
Ths.Dương Nhật Linh

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
Tên đề tài:

SÀNG LỌC CÁC CHỦNG THỰC KHUẨN THỂ CÓ
KHẢ NĂNG LY GIẢI TẾ BÀO VI KHUẨN VIBRIO
PARAHAEMOLYTICUS GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN
TỤY

(AHPND)

TRÊN

TÔM

SÚ

(PENAEUS

MONODON)
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: MÔI TRƯỜNG
CBHD: THS.NGUYỄN VĂN MINH
THS.DƯƠNG NHẬT LINH

1


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
Tên đề tài:

SÀNG LỌC CÁC CHỦNG THỰC KHUẨN THỂ CÓ
KHẢ NĂNG LY GIẢI TẾ BÀO VI KHUẨN VIBRIO
PARAHAEMOLYTICUS GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN
TỤY

(AHPND)

TRÊN

TÔM

MONODON)
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: MÔI TRƯỜNG

SÚ

(PENAEUS

LỜI CẢM ƠN
Đơi lời đầu dịng con muốn gữi những lời cảm ơn đến các đấng sinh thành của
mình, nhờ có Bố và Mẹ mà con mới có cơ hội được đến trường và học tập như các bạn
cùng trang lứa, nhờ những giọt mồ hôi trong những ngày hè nóng bức mà con mới có
những ngày ngồi trong phịng điều hòa và trao dồi kiến thức ở giảng đường hôm nay,
hai chữ cảm ơn không thể bù đắp được những công lao ấy nhưng com muốn được
thông qua hai từ này để nói lên lịng biết ơn của mình đến hai người “Con cảm ơn Bố
và Mẹ nhờ có cơng lao của hai người mà con mới có được ngày hôm nay”.
Thứ hai em muốn cảm ơn thầy Nguyễn Văn Minh và cô Dương Nhật Linh
người đã hướng dẫn em trong con đường đại học, đã tiếp thêm đam mê cho em để em
có thể bước tiếp trên con đường mà mọi người xung quanh đều bảo khơng có tương
lai, làm em sáng tỏ được những gì mình muốn và sẽ làm mai sau, thầy và cô như những
người truyền lửa giúp ngọn lửa đam mê của em luôn luôn sáng và không bị dập tắt bởi
cuộc đời.
Cuối cùng mình muốn cảm ơn các bạn cùng lớp đã ln giúp đỡ và hỗ trợ mình
những lúc khó khăn, những khi thiếu dụng cụ thí nghiệm phải đi mượn ngũ hồ tứ hải,
hay những lúc bông đùa với nhau đã làm mình nảy ra những ý tưởng mới kỳ lạ mà hiệu
quả, cảm ơn các bạn đã hỗ trợ mình trong lúc làm thực tập của mình.

3


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh
Ths.Dương Nhật Linh

DANH MỤC ẢNH
Hình 1.1 Ảnh minh họa cho con Tơm Sú

13

Hình 2.1 Ảnh mơ tả sự khác nhau giữa tơm bình thường và tơm bị bệnh AHPND

15

Hình 3.1 Cấu trúc của protein Pir A và Pir B

16

Hình 4.1 Ảnh thực khuẩn thể dưới kính hiển vi điện tử

17

Hình 4.2 Sơ đồ các chu trình sống ký sinh của thực khuẩn thể

18

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình thí nghiệm

22

Hình 1.1 Hình ảnh vi khuẩn Vibrio trên môi trường TCBS

26

4


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh
Ths.Dương Nhật Linh

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1 Bảng kết quả phân lập thực khuẩn thể ............................................................. 26
Bảng 2 Bảng mơ tả kết quả thí nghiệm đường cong sinh trường một bước ................ 26

5


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh
Ths.Dương Nhật Linh

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 1 Biểu đồ đường cong sinh trưởng của vi khuẩn ............................................ 28
Biểu đồ 2 Biểu đồ đường cong sinh trưởng dưới sự kiểm soát của thực khuẩn thể..... 28
Biểu đồ 3 Biểu đồ so sánh giữa hai đường cong sinh trưởng ....................................... 29

6


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh
Ths.Dương Nhật Linh

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Sucrose): môi trường đặc hiệu cho hai củng
Vibrio parahaemolyticus và Vibrio cholerae.
ABS: đơn vị đo chỉ số quang hấp thụ.
EMS (Early Mortality Syndrome): bệnh tôm chết sớm
AHPND (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease): Bệnh hoại tử gan tụy trên
tôm
Cs: cộng sự

7


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh
Ths.Dương Nhật Linh

MỤC LỤC
Lời cảm ơn ...................................................................................................................... 3
Danh mục ảnh ................................................................................................................. 4
Danh mục bảng ............................................................................................................... 5
Danh mục biểu đồ ........................................................................................................... 6
Danh mục từ viết tắt ....................................................................................................... 7
Mục lục ........................................................................................................................... 8
Đặt vấn đề ..................................................................................................................... 10
Phần 1: tổng quan tài liệu ............................................................................................. 12
1. Giới thiệu chung về Tôm Sú .................................................................................. 13

2

3

4

1.1

Phân loại khoa học .......................................................................................... 13

1.2

Đặc điểm ......................................................................................................... 13

1.3

Tiềm lực kinh tế .............................................................................................. 13

Bệnh hoại tử gan tụy (AHPND) ............................................................................ 14
2.1

Khái quát về bệnh AHPND............................................................................. 14

2.2

Cơ chế gây bệnh .............................................................................................. 15

Vibrio parahaemolyticus........................................................................................ 15
3.1

Phân loại học ................................................................................................... 15

3.2

Khái quát về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ............................................ 16

3.3

Độc lực Pir AB ................................................................................................ 16

thực khuẩn thể ........................................................................................................ 17
4.1

Khái niệm ........................................................................................................ 17

4.2

Vòng đời.......................................................................................................... 17

4.3

Cơ chế gây độc ................................................................................................ 18

4.4

Endolysin ........................................................................................................ 19

Phần 2: Vật liệu và Phương pháp nghiên cứu .............................................................. 20
1. Thời gian và địa điểm ............................................................................................ 21
2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................... 21
2.2.1.

Sờ đồ thí nghiệm ...................................................................................... 21

2.2.2.

Thí nghiệm 1:Tái phân lập các chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
22
8


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh
Ths.Dương Nhật Linh

2.2.3. Thí nghiệm 2: Phân lập các chủng thực khuẩn thể có khả năng ly giải tế
bào vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus .................................................................. 22
2.2.4. Thí nghiệm 3: khảo sát độc lực của thực khuẩn thể đối với vi khuẩn
Vibrio parahaemolitycus ........................................................................................ 23
Phần 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận ..................................................................... 25
1. Kết quả ................................................................................................................... 26
1.1. Thí nghiệm 1: Tái phân lập các chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
trong phịng thí nghiệm Cơng nghệ vi sinh trường Đại học Mở TP.HCM ............... 26
1.2. Thí nghiệm 2: Phân lập các chủng thực khuẩn thể có khả năng ly giải tế bào
vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ............................................................................ 26
1.3. Thí nghiệm 3: khảo sát độc lực của thực khuẩn thể đối với vi khuẩn Vibrio
parahaemolitycus....................................................................................................... 26
Phần 4: Kết luận và kiến nghị....................................................................................... 30
1. Kết luận .................................................................................................................. 31
2. Kiến nghị................................................................................................................ 31
Tài liệu tham khảo ........................................................................................................ 32
Phụ lục .......................................................................................................................... 35

Phụ lục 1: xử lý thống kê .............................................................................................. 35

9


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh
Ths.Dương Nhật Linh

ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo Bộ Nông Nghiệp Và Phát Triển Nông Thôn, tổng diện tích đất ni Tơm
Sú vào năm 2005 là 551.470ha và đạt 590,315ha vào năm 2014 cũng được dự đoán sẽ
tiếp tục tăng vào năm 2020, Tổng Cục Thủy Sản đã báo cáo vào năm 2014 tổng sản
lượng tôm đạt 657.000 tấn có giá trị xuất khẩu 3.95 tỷ USD.
Tuy nhiên, ngành nuôi tôm đang đối mặt với nhiều trở ngại trong đó phải nhắc
đến bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND), bệnh này lần đầu tiên được phát hiện vào
năm 2009 tại Trung Quốc với 100% độ tử vong trong vịng 35 ngày trên Tơm Sú (Eshik
và cs., 2017) và có nguồn gốc lây nhiễm từ vi khuẩn gram âm ưa mặn phổ biến ở các
vùng nước biển như Vibrio parahaemolyticus (Chung-Te Lee và cs., 2015, Loc Tran
và cs., 2013) chúng có thể tiết ra độc tố Pir ABvp đóng một vai trị quan trọng trong cơ
chế phát bệnh AHPND (Chung-Te Lee và cs., 2015). Tôm bị nhiễm bệnh sẽ có các
biểu hiện bên ngồi bao gồm bị ngất, phát triển chậm, dạ dày và ruột trống khơng, gan
tụy bị teo nhỏ đến khi khơng cịn và cuối cùng dẫn đến tử vong (Xupeng Hong và cs.,
2016). Ngành công nghiệp xuất khẩu tôm chiểm 17,83% tổng kim ngạch GDP xuất
khẩu thủy sản năm 2020 nhưng theo Tổ chức phát triển cơng nghiệp của Liên Hợp
Quốc (UNIDO) thì ở bốn thị trường lớn là EU, Hoa Kỳ, Nhật Bản và Úc thì Việt Nam
là một trong ba nước đứng đầu bị từ chối nhập khẩu thủy sản vào giai đoạn 2006 –
2010 do dư lượng chất kháng sinh.
Hiện nay thực khuẩn thể đang là biện pháp sinh học thay thế cho kháng sinh để

kiểm soát sinh học, chúng là virus ký sinh tế bào nó phụ thuộc vào tế bào vi khuẩn vật
chủ để tổng hợp protein và vỏ hạt (E. Fidelma Boyd và cs., 2001) được phân lập lần
đầu tiên vào đầu thế kỷ 20 bởi Frederick Twort and Félix d’Hérelle (Frits van Charante
và cs., 2019) trước khi phát hiện và sử dụng phổ biến kháng sinh thì đã có ý kiến cho
rằng có thể sử dụng bacteriophages để điều trị các ca nhiễm khuẩn (Alexander
Sulakvelidze và cs., 2001).
Năm 2016, pVp-1 một phage thuộc họ Siphoviridae được báo cáo có khả năng
ức chế sự hoạt động của 5 chung V. parahaemolyticus được phân lập tại Châu Á và
15/17 chủng tại Mexico (Jin Woo Jun và cs., 2016), chủng VPMS1 được xem như là
chủng phage đầu tiên được báo cáo có khả năng ly giải tế bào vi khuẩn V.
10


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh
Ths.Dương Nhật Linh

parahaemolyticus liên kết với AHPND và có khả năng ly giải gần như 100% chủng
VPATCC-17802 (S.F. Martínez-Díaz và cs., 2013, Lina Angelica Zerme no-Cervantes và
cs., 2018) việc phát triển học thuyết dựa trên phage có thể chống lại các mầm bệnh có
tác nhân là vi khuẩn và năng cao sản lượng của ngành cơng nghiệp thủy sản
(Nachimuthu và cs., 2021).
Nhằm tìm kiếm phân lập các chủng bacteriophages và nghiên cứu khả năng ly
giải tế bào vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus tạo tiền đề ứng dụng chủng bacteriophage
phân lập được vào sản xuất chế phẩm vi sinh làm giảm hàm lượng vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus trong q trình chăn ni Tơm Sú ở Việt Nam. Vì vậy, chúng tơi
quyết định thực hiện đề tài “SÀNG LỌC CÁC CHỦNG THỰC KHUẨN THỂ CÓ
KHẢ NĂNG LY GIẢI TẾ BÀO VI KHUẨN VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS
GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY (AHPND) TRÊN TÔM SÚ (PENAEUS

MONODON).”
Mục tiêu nghiên cứu: Sàng lọc các chủng thực khuẩn thể có khả năng ly giải tế
bào vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus.
Nội dung nghiên cứu:
• Tái phân lập các chủng Vibrio parahaemolyticus của phịng thí nghiệm.
• Phân lập thực khuẩn thể trên nền chủng Vibrio parahaemolyticus đã tái
phân lập được.
• Thử nghiệm hoạt tính của các chủng thực khuẩn thể đã phân lập được.

11


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh
Ths.Dương Nhật Linh

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

12


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh
Ths.Dương Nhật Linh

1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ TÔM SÚ
1.1 Phân loại khoa học
Giới: Animalia.

Ngành: Arthropoda.
Lớp: Malacostraca.
Bộ: Decapoda.
Họ: Penaeidae.
Chi: Penaeus.
Lồi: P. monodon.

1.2 Đặc điểm
Tơm Sú có tên khoa học Penaeus monodon thuộc ngành chân khớp (Arthopoda)
phân ngành giáp xác (Crustacea) là một loài động vật giáp xác đại dương được nuôi
dùng làm thực phẩm do có vị ngon và chứa nhiều dinh dưỡng, hiện nay Tôm Sú đang
là giống tôm được nuôi nhiều nhất thế giới với kích thước của tơm đực và cái có thể
lên đến 650g và dài 36cm khi đã trưởng thành.

Hình 1.1 Ảnh minh họa cho con Tơm Sú
(Nguồn: />
1.3 Tiềm lực kinh tế
Việt Nam có bờ biển dài 3,260Km cùng hệ thống sơng suối dày đặt và có cả ba
vùng nước ngọt, lợ và mặn giúp cho hệ sinh thái thủy sinh của việt Nam vô cùng đa
dạng và thuận lợi cho việc nuôi trồng thủy sản đặc biệt là ngành chăn nuôi tôm.
13


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh
Ths.Dương Nhật Linh

Theo Tổng Cục Thủy Sản (Bộ Nông Nghiệp Và Phát Triển Nông Thôn), vào
năm 2020 tổng GDP xuất khẩu thủy sản của Việt Nam đạt 8,41 tỷ USD trong đó ngành

chăn nuôi tôm chiếm 1,5 tỷ USD (17,83%) tổng GDP kể trên, trong đó tổng kim ngạch
xuất khẩu Tơm Sú đạt 200 triệu USD. Cũng theo Tổng Cục Thủy Sản (Bộ Nơng Nghiệp
Và Phát Triển Nơng Thơn), cả nước có 742,483ha diện tích ni tơm trong đó có
629,065ha là diện tích ao để ni Tơm Sú và 113,418ha là diện tích canh tác tôm Thẻ
Chân Trắng với sản lượng Tôm Sú đạt 113,000 tấn và tơm Thẻ Chân Trắng là 238
nghìn tấn tổng kim ngạch xuất khẩu đạt 1,3 tỷ USD.
Mặc dù chiếm diện tích lớn canh tác lớn hơn nhưng sản lượng sản xuất Tơm Sú
vẫn cịn bị hạn chế do vẫn cịn gặp nhiều khó khăn trong việc canh tác trong đó hạn
chế lớn nhất là bệnh hoại tử gan tụy (AHPND) đang gây nguy hại và thất thoát lớn đến
việc gia tăng sản lượng và GDP cho ngành tôm ở Việt Nam cũng như thế giới.

2 BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY (AHPND)
2.1 Khái quát về bệnh AHPND
Bệnh hoại tử gan tụy (AHPND) hay còn gọi là bệnh chết sớm (EMS) là một
dạng bệnh lý mới xuất hiện gần đây trên tôm, kể từ lần đầu phát hiện vào năm 2009 nó
đã gây thất thốt lớn đối ngành cơng nghiệp chăn nuôi tôm (Xiao và cs., 2017), các
triệu chứng bên ngoài của bệnh bao gồm bị ngất, phát triển chậm, dạ dày và ruột trống
không, gan tụy bị teo nhỏ đến khi khơng cịn và cuối cùng dẫn đến tử vong (Xupeng
Hong và cs., 2016),bệnh lần đầu được phát hiện tại Trung Quốc vào năm 2009 và gây
tử vong 100% ở tôm 35 ngày tuổi (Eshik và cs., 2017). Khu vực sông Mê Kông đến
năm 2011 bệnh này lần đầu được phát hiện tại 25 tỉnh khắp cả nước Việt Nam, sau đó
đã truyền ra nhiều nước khác trên thế giới bao gồm Malaysia (2011), Thái Lan (2012),
Mexico (2013) và Philippin (2014).

14


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh

Ths.Dương Nhật Linh

Hình 2.1 Ảnh mơ tả sự khác nhau giữa tơm bình thường và tôm bị bệnh
AHPND
(Nguồn: FAO/MARD Technical Workshop on Early Mortality Syndrome
(EMS) or Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome (AHPNS) of Cultured Shrimp
(under TCP/VIE/3304))

2.2 Cơ chế gây bệnh
Vibrio parahaemolyticus có chứa gen pVA1 mã hóa cho hai độc chất là PirAvp
và PirBvp là tác nhân chính dẫn đến bệnh AHPND trên tơm Thẻ chân trắng (Penaeus
vannamei) và Tôm Sú (Penaeus monodon) dẫn đến 70 – 100% tôm bị chết do mắc bệnh
(Lin và cs., 2017).
Cho đến nay vẫn chưa thể xác định cơ chế gây độc của các chủng Vibrio
parahaemolyticus nhưng có thể xác định rằng Pir Bvp mới là tác nhân ảnh hưởng đến
tế bào biểu mô tuyến gan tụy (Lai và cs., 2015).

3 VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS
3.1 Phân loại học
Phân loại khoa học.
Giới: Bacteria.
Ngành: Proteobacteria.
Lớp: Gamma.
Bộ: Vibrionales.
Họ: Vibrionaceae.
15


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh
Ths.Dương Nhật Linh

Chi: Vibrio.
Loài: V. parahaemolyticus.

3.2 Khái quát về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
Vibrio parahaemolyticus là một chủng vi khuẩn gram âm ưa kiềm thường được
tìm thấy trong mơi trường nước ở cửa sơng, nước vùng biển hay vùng trầm tích và trên
các sinh vật phù du cùng sinh vật giáp xác sống dưới nước, V. parahaemolyticus cịn
là một trong các tác nhân chính dẫn đến bệnh viêm dạ dày ruột hoặc tiêu chảy nhiễm
trùng từ các nguồn hải sản sống (Letchumanan và cs., 2014, Nelapati và cs., 2012),
.theo Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh (CDC) Mỹ mỗi 8028 ca nhiễm
bệnh thì có 57 ca tử vong (Daniels và cs., 2000) giữa những năm 1988 – 1997 có 345
ca nhiễm khuẩn V .parahaemolyticus được báo cáo trong đó: 59% bị viêm dạ dày ruột,
34% là nhiễm trùng, 5% là nhiễm trùng huyết và 2% là mắc các bệnh khác (Daniels và
cs., 2000).

3.3 Độc lực Pir AB
Pir ABVP là phức hợp có khối lượng 250 kDa gồm hai tiểu phần nhỏ là PirAvp
và PirBvp do gen pVA1 mã hóa, rPirBvp có khả năng làm đông máu ở tế bào hồng cầu
của chuột và rPirAvp có khả năng làm đơng máu ở tế bào hồng cầu động vật (Sánchez
và cs., 2020).

Hình 3.1 Cấu trúc của protein Pir A và Pir B
(Nguồn: Structural Insights into the Cytotoxic Mechanism of Vibrio
parahaemolyticus PirAvp and PirBvp Toxins)
Pir ABvp có cấu trúc tương tự như thuốc trừ sâu dạng độc tố Pir A và Pir B (δendotoxins) ở các loài Photorhabdus và Xenorhabdus (Kumar và cs., 2019) và cấu trúc
của độc tố Pir Avp và Pir Bvp cũng có dạng tương tự như độc tố diệt cơn trùng ở các
chủng Bacillus mặc dù độ tương đồng của hai gen này ít hơn 10% có thể sự tương đồng

16


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh
Ths.Dương Nhật Linh

về cấu trúc này sẽ giúp cho chúng ta dự đoán được độc lực của chúng bằng cách só ánh
với cơ chế gây độc ở các cry protein (Lee và cs., 2015).

4 THỰC KHUẨN THỂ
4.1 Khái niệm
Thực khuẩn thể là virus ký sinh tế bào nó phụ thuộc vào tế bào vi khuẩn vật chủ
để tổng hợp protein và vỏ hạt (E. Fidelma Boyd và cs., 2001) được phát hiện lần đầu
tiên bởi hai nhà khoa học là Frederick Twort (1915) và Felix d’Herelle (1917) nhưng
trước đó 20 năm vào 1896 Ernest Hankin đã báo cáo rằng việc uống nước sông đã lọc
được lấy từ sông Hằng và sông Jumma (hoặc Yamuna/Jamuna) có khả năng phịng
ngừa sự lây lan của vi khuẩn V. cholerae (Alexander Sulakvelidze và cs., 2001, Sharp.,
2001, Taylor và cs., 2014).

Hình 4.1 Ảnh thực khuẩn thể dưới kính hiển vi điện tử
(Nguồn: />
4.2 Vòng đời
Vòng đời của một thực khuẩn thể bắt đầu từ việc các chân của chúng bắt liên
kết với các thụ thể và đẩy thông tin di truyền của mình vào trong tế bào vi khuẩn, tại
đây vịng đời của các phages có thể đi theo ba chiều hướng khác nhau được tóm tắt
theo hai chu trình là tan và tiềm tan (Clokie và cs., 2011).

17

GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh
Ths.Dương Nhật Linh

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Chu trình

Thâm nhập vào
tế bào vi khuẩn

Chu trình
tiềm tan

tan

Tổng hợp
protein vỏ và
nhân DNA hoặc
RNA

Ly giải tế bào vi khuẩn
và giải phóng các
phages vừa được
tổng hợp

Tồn tại ở dạng
plasmid trong
tế bào vật chủ

Biểu hiện bộ
gene của bản
thân thành kiểu
hình của vi
khuẩn

Tồn tại ẩn mình
trong tế bào vi
khuẩn đợi điều
kiện thích hợp

Trở thành một
phần bộ gene
của vi khuẩn

hoạt động tổng
hợp protein vỏ
và nhân DNA

Ly giải tế bào vi khuẩn
và giải phóng các
phages vừa được
tổng hợp
Hình 4.2 Sơ đồ các chu trình sống ký sinh của thực khuẩn thể

4.3 Cơ chế gây độc
Các chủng thực khuẩn thể gây độc cho vi khuẩn là các chủng thực thực khuẩn
thể có khả năng ly giải màng tế bào của vi khuẩn, đây là khả năng của một enzyme gọi
là endolysin được tổng hợp bởi bộ gen của thực khuẩn thể ở cuối vịng chu trình của

chúng, nhằm phá vỡ tế bào vi khuẩn và giải phóng các các thể thực khuẩn thể mới được
tổng hợp để chúng tìm mục tiêu mới.

18


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh
Ths.Dương Nhật Linh

4.4 Endolysin
Endolysin, còn được biết đến với nhiều tên gọi khác nhau như phage lysozymes
hoặc lysin cùng enzyme muralytic/mureolytic, là một thuật ngữ chung mô tả những
enzyme thủy phân peptidoglycan được mã hóa bởi các thực khuẩn thể.
Endolysin hoạt động như một cái kéo cắt bỏ các liên kết của peptidoglycan trên
thành tế bào vi khuẩn, đối với vi khuẩn gram dương q trình ly giải tế bào có thể diễn
ra từ bên trong cả bên ngoài màng tế bào các protein holin sẽ oligo hóa với màng tế
bào đến xuất hiện một lỗ thủng giúp endolysin có thể di chuyển vào khoảng khơng gian
giữa màng trong và màng ngồi tế bào nơi đang chứa các peptidoglycan và đối với vi
khuẩn gram âm vì sự xuất hiện của màng tế bào bên ngoài bao bọc lớp peptidoglycan
nên việc để endolysin tự do từ mơi trường ngồi có thể tạo liên kết với lớp
peptidoglycan là điều bất khả thi, liên kết thủy phân của endolysin chỉ xuất hiện đối
với tế bào vi khuẩn do cấu tạo của tế bào vi khuẩn gồm hai lớp là lớp photpho lipid và
lớp peptidoglycan nên sẽ không gây ảnh hưởng đến sức khỏe của con người với cấu
tạo tế bào là một lớp phosphor lipid kép và khơng có sự hiện diện của lớp peptidoglycan
nào (Loessner và cs., 2005).

19
SVTH: Nguyễn Hồng Phúc

GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh
Ths.Dương Nhật Linh

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU

20
SVTH: Nguyễn Hồng Phúc


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh
Ths.Dương Nhật Linh

1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM
Thời gian thực hiện: Từ tháng 6/2021 đến tháng 2/2022.
Địa điểm: Phịng thí nghiệm Cơng Nghệ Vi Sinh của trường Đại học Mở
TP.HCM.
Đối tượng nghiên cứu: Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus.

2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Nguồn gốc mẫu: Mẫu nước và bùn ao nuôi tôm ở huyện Nhà Bè.
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật và hóa chất: Mơi trường TCBS tổng hợp,
peptone, dung dịch NaOH 1M, dung dịch HCl 1M, dung dịch Ringer, ZnSO4.7H2O,

cồn.
Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm sử dụng: Tủ cấy vi sinh vật, nồi hấp, ống nghiệm,
đĩa petri, que cấy trang, que cấy ria, đầu típ, micro pipet, cuvet.

2.2. Bố trí thí nghiệm
2.2.1. Sờ đồ thí nghiệm

21
SVTH: Nguyễn Hồng Phúc


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh
Ths.Dương Nhật Linh

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình thí nghiệm
2.2.2. Thí nghiệm 1:Tái phân lập các chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
Cấy chuyền trực tiếp vi khuẩn từ ống chủng của phòng lên đĩa thạch mơi trường
TCBS.
2.2.3. Thí nghiệm 2: Phân lập các chủng thực khuẩn thể có khả năng ly giải tế
bào vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
Các bước xử lý mẫu:
1. Mẫu bùn được pha loãng với nước máy theo tỉ lệ 1/5 và mẫu nước được
sử dụng thẳng khơng qua pha lỗng.
2. Quay ly tâm 10ml mẫu với tốc độ 4000 vòng trong 20 phút sau đó lấy
phần dịch nổi và bỏ phần lắng.
3. Thêm vào dung dịch nổi nước cất đến khi dung dịch quay lại thể tích ban
đầu là 10ml.

22
SVTH: Nguyễn Hồng Phúc


GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh
Ths.Dương Nhật Linh

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

4. Thêm vào dung dịch mẫu ZnSO4.7H2O với nồng độ 2 mol/L và để tủa
trong nhiệt độ phòng 5 phút.
5. Đem dung dịch đã tủa quay ly tâm với tốc độ 4000 trong 20 phút sau đó
bỏ phần dịch nổi.
6. Thêm vào eppendof 1ml dung dịch Ringer và lắc đều.
Các bước phân lập thực khuẩn thể:
1. Tăng sinh vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus qua đêm.
2. Cấy trang 1ml dịch khuẩn đã tăng sinh lên mơi trường peptone kiềm sau
đó ủ qua đêm.
3. Nhỏ 0,2 ml dung dịch thực khuẩn thể đã được xủ lý trước đó lên bề mặt
đĩa thạch đợi 15 phút sau đó đọc kết quả.
4. Múc các phần thạch bị trống trên đĩa thạch đã có kết quả và lặp lại quá
trình xử lý mẫu và phân lập để làm thuần thực khuẩn thể.
2.2.4. Thí nghiệm 3: khảo sát độc lực của thực khuẩn thể đối với vi khuẩn Vibrio
parahaemolitycus
Độc lực của thực khuẩn thể được tính theo cơng thức (Storms và cs., 2020).
𝑉𝑖 = 1 −

𝐴𝑖
𝐴0

Trong đó Vi là độc lực của vi khuẩn, Ai là chỉ số hấp thụ quang phổ (ABS) lớn
nhất đại diện cho tổng sinh khối vi khuẩn có thể đạt được khi có sự xuất hiện của thực
khuẩn thể, A0 là chỉ số hấp thụ (ABS) lớn nhất đại diện cho tổng sinh khối vi khuẩn có
thể đạt được khi khơng có sự xuất hiện của thực khuẩn thể và giá trị Vi di chuyển từ 0
đến 1 giá trị càng cao thì độc lực càng mạnh.
Sử dụng phương pháp đường cong sinh trường một bước để đo khả đường cong
sinh trưởng của vi sinh vật, các bước thực hiện như sau:
Các bước đo đường cong sinh trưởng của vi khuẩn:
1. Tăng sinh vi khuẩn trong bình serum, ủ ở nhiệt độ phịng và để qua đêm.
2. Pha loãng mật độ đến khi chỉ số OD600 đạt 0,1.
3. Bắt đầu tính giờ và ghi lại kết quả mỗi 5 phút 1 lần trong 2 giờ.
Các bước đo đường cong sinh trưởng của vi khuẩn bị kiểm soát bởi thực khuẩn
thể:
23
SVTH: Nguyễn Hồng Phúc


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh
Ths.Dương Nhật Linh

1. Tăng sinh vi khuẩn trong bình serum, ủ ở nhiệt độ phòng và để qua đêm.
2. Thêm 0,1ml dung dịch thực khuẩn thể đã được làm thuần vào 0,9ml dung
dịch khuẩn đã được tăng sinh và để trong 3,5 giờ.
3. Pha loãng mật độ đến khi chỉ số OD600 đạt 0,1.
4. Theo dõi chỉ số OD mỗi 5 phút trong 2 giờ với cái MOI = 0,1.

24
SVTH: Nguyễn Hồng Phúc

GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh
Ths.Dương Nhật Linh

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO
LUẬN

25
SVTH: Nguyễn Hồng Phúc